水 产 动 物 疾 病 学 大 实 验 讲 义 ( 嗜 水 气 单 胞 菌 的 人 工 感 染 和 分 离 以 及 疾 病 的 常 规 检 查 和 诊 断 ) 陆 宏 达 张 庆 华 编 上 海 海 洋 大 学 水 产 与 生 命 学 院 动 物 医 学 系 2009.5 0
一 嗜 水 气 单 胞 菌 的 人 工 感 染 及 分 离 大 实 验 ( 一 ) 概 况 主 要 淡 水 养 殖 鱼 类 暴 发 性 流 行 病 是 我 国 养 鱼 史 上 危 害 鱼 的 种 类 最 多 危 害 鱼 的 年 龄 范 围 最 大 流 行 地 区 最 广 流 行 季 节 最 长 危 害 养 鱼 水 域 类 别 最 多 造 成 的 损 失 最 大 的 一 种 急 性 传 染 病 临 床 症 状 表 现 为 全 身 出 血, 是 典 型 的 败 血 症 病 变 嗜 水 气 单 胞 菌 (Aeromonas hydrophlia, Ah) 是 该 病 的 主 要 病 原 之 一 嗜 水 气 单 胞 菌 为 革 兰 氏 阴 性 短 杆 菌, 有 运 动 力, 氧 化 酶 阴 性, 发 酵 葡 萄 糖 产 酸 产 气, 对 新 生 霉 素 或 弧 菌 抑 制 剂 0/129 不 敏 感, 过 氧 化 氢 ( 接 触 ) 酶 阴 性, 兼 性 厌 氧,4~10 下 能 生 长,30 左 右 生 长 繁 殖 最 快,43 不 生 长 ;ph 值 5.5~10 生 长 ; DNA 的 GC mol% 为 58.3%; 有 的 具 有 强 烈 的 β- 溶 血 性 ; 有 的 产 HEC" 毒 素, 即 溶 血 性 (hemolytic activity) 肠 毒 素 毒 性 (enterotoxigenicity) 以 及 细 胞 毒 性 (cytotoxicity) 三 个 英 文 词 的 第 一 个 字 母 ( 二 ) 目 的 要 求 通 过 对 嗜 水 气 单 胞 菌 的 人 工 感 染 及 分 离 实 验 课 的 学 习, 了 解 致 病 菌 的 培 养 和 稀 释 人 工 感 染 方 法 观 察 疾 病 的 发 生 和 发 展 过 程 掌 握 无 菌 操 作 条 件 下 进 行 致 病 菌 分 离 的 程 序 观 察 致 病 菌 的 分 离 结 果 熟 悉 菌 落 形 态 特 征 以 及 培 养 特 点 对 结 果 进 行 分 析 比 较, 总 结 出 致 病 菌 人 工 感 染 及 分 离 的 特 点 ( 三 ) 实 验 材 料 嗜 水 气 单 胞 菌 菌 株 纯 培 养 物 水 族 箱 气 泵 控 温 仪 实 验 用 鲫 鱼 (100g 左 右 ) 温 度 计 饵 料 捞 网 普 通 营 养 琼 脂 平 板 无 菌 蒸 馏 水 无 菌 生 理 盐 水 (0.85% 的 NaCI 溶 液 ) 吸 管 灭 菌 试 管 记 号 笔 一 次 性 注 射 器 玻 璃 注 射 器 针 头 解 剖 盘 解 剖 剪 解 剖 刀 剪 刀 镊 子 纱 布 酒 精 棉 球 洁 净 的 玻 片 光 学 显 微 镜 蒸 馏 水 三 角 烧 瓶 天 平 称 量 纸 药 匙 接 种 环 麦 氏 比 浊 管 ( 四 ) 实 验 内 容 及 操 作 程 序 1. 致 病 菌 的 培 养 和 实 验 前 的 准 备 工 作 1) 实 验 鱼 的 驯 养 : (1) 实 验 材 料 : 1
养 鱼 的 塑 料 箱, 异 育 银 鲫, 控 温 加 温 箱, 冲 气 泵, 气 管, 气 头, 温 度 表 (2) 实 验 方 法 : 实 验 用 的 健 康 异 育 银 鲫, 在 加 网 罩 的 塑 料 箱 中 驯 养 约 一 个 星 期, 充 气 增 O 2, 在 驯 养 期 间 水 温 逐 渐 升 高, 每 天 温 度 升 高 2~4 左 右, 最 终 温 度 达 28 左 右, 及 时 吸 污 和 换 水, 保 持 水 质 清 新 2) 致 病 菌 ( 嗜 水 气 单 胞 菌 ) 的 扩 大 培 养 (1) 实 验 材 料 : 营 养 琼 脂 培 养 基 斜 面 ( 每 组 2 支 ), 接 种 环 (1 支 ), 嗜 水 气 单 胞 菌 斜 面 菌 种 (1 支 ) (2) 实 验 方 法 : 按 微 生 物 实 验 方 法 把 菌 种 接 种 到 营 养 琼 脂 培 养 基 斜 面 上, 放 在 28 培 养 箱 中 培 养 24 小 时 后 备 用 3) 营 养 琼 脂 培 养 基 平 板 (1) 实 验 材 料 : 灭 菌 空 培 养 皿 ( 每 组 4 支 ),100ml 量 筒 (1 只 ), 天 平 (1 台 ), 营 养 琼 脂 培 养 基, 称 量 纸, 搅 拌 玻 璃 棒 (2) 实 验 方 法 : 配 制 200ml 营 养 琼 脂 培 养 基 称 取 8.2 克 营 养 琼 脂 培 养 基 ( 或 按 照 说 明 书 上 的 要 求 进 行 配 制 ), 倒 入 三 角 烧 瓶 中, 加 入 量 筒 量 取 的 200ml 蒸 馏 水, 用 玻 璃 棒 搅 拌 溶 解 后 ( 或 通 过 适 当 加 温 进 行 溶 解 ), 用 棉 塞 塞 住 三 角 烧 瓶, 将 培 养 基 置 高 压 灭 菌 锅 内,121 灭 菌 15~30min, 培 养 基 灭 菌 后 待 温 度 下 降 至 40~50 时 ( 以 手 掌 感 触, 若 将 瓶 紧 握 手 中 觉 得 烫 手, 但 仍 能 握 持 着, 此 即 为 倾 倒 平 面 的 合 适 温 度 ) 倒 入 已 灭 菌 的 空 培 养 皿, 每 个 灭 菌 培 养 皿 倒 入 15-20ml 左 右, 将 皿 盖 盖 上, 并 将 培 养 皿 于 桌 面 上 轻 轻 回 转, 使 培 养 基 平 铺 于 皿 底, 即 成 普 通 琼 脂 平 板 凝 固 后 翻 转 倒 置 保 存 备 用 4) 致 病 菌 人 工 感 染 和 分 离 器 械 准 备 (1) 实 验 材 料 : 每 组 1 个 铝 合, 所 用 器 械 放 在 铝 合 中 进 行 灭 菌 包 括 剪 刀 ( 每 组 3 把 ) 镊 子 ( 每 组 3 把 ) 注 射 器 ( 每 组 3 支 ) 针 灭 菌 头 ( 每 组 5 支 ) 滴 管 ( 每 组 3 个 ) 试 管 ( 每 组 4 个 ) 铝 合 灭 菌 后 备 用 2. 致 病 菌 的 人 工 感 染 2
1) 实 验 材 料 : 嗜 水 气 单 胞 菌 斜 面 ( 每 组 3 支 ), 试 管 架 (1 个 ),75% 的 酒 精 棉 球 (1 瓶 ), 无 菌 生 理 盐 水, 灭 菌 铝 合 中 的 [ 灭 菌 空 试 管 (4 个 ) 灭 菌 注 射 器 ( 每 组 3 支 ) 灭 菌 针 头 ( 每 组 5 支 ) 滴 灭 菌 管 ( 每 组 3 个 )] 麦 氏 比 浊 管 2) 实 验 方 法 : 试 验 鱼 人 工 感 染 的 接 种 方 法 目 前 最 常 用 的 有 浸 泡 口 服 注 射 涂 抹 等, 究 竟 选 用 哪 一 种 方 法 最 合 适, 需 要 根 据 不 同 的 疾 病 类 型 和 可 能 的 侵 入 途 径 而 定 如 体 表 的 病, 可 采 用 浸 泡 法 : 是 体 内 的 病, 可 采 用 口 服 注 射 等 本 试 验 采 用 注 射 法 进 行 人 工 感 染 (1) 菌 悬 液 的 制 备 : 用 装 有 针 头 的 注 射 器 ( 或 无 菌 吸 管 ), 吸 取 无 菌 生 理 盐 水, 滴 注 到 培 养 有 嗜 水 气 单 胞 菌 的 斜 面 上, 振 荡 使 斜 面 上 的 菌 落 洗 下 ( 或 用 灭 菌 接 种 环 轻 轻 刮 下 ), 倒 入 灭 菌 空 试 管 中, 用 无 菌 生 理 盐 水 稀 释 调 节 菌 浓 度, 麦 氏 比 浊 管 进 行 比 浊, 使 菌 浓 度 达 到 0.6 10 9 个 细 菌 /ml(6 亿 ) (2) 注 射 方 法 : 用 灭 菌 注 射 器 抽 取 菌 悬 液 注 射 部 位 在 鱼 的 背 鳍 前 端 与 侧 线 之 间 的 中 部 区 域, 用 酒 精 棉 球 在 注 射 部 位 擦 拭 进 行 体 表 消 毒 后 进 行 肌 肉 注 射 针 尖 斜 向 鱼 的 头 部, 与 鱼 体 呈 30º 左 右 的 角 度 插 入 肌 肉, 注 射 深 度 在 1~1.5cm, 每 尾 鱼 注 射 量 为 0.6ml 左 右, 抽 出 针 尖 时 需 用 75% 的 的 酒 精 棉 球 按 住 针 尖, 防 止 菌 液 漏 出 观 察 鱼 的 发 病 及 症 状 等 情 况 并 作 好 记 录 3. 致 病 菌 分 离 1) 实 验 材 料 : 灭 菌 铝 合 中 的 [ 灭 菌 剪 刀 ( 每 组 3 把 ), 灭 菌 镊 子 ( 每 组 3 把 ), 灭 菌 解 剖 刀 ], 接 种 环, 营 养 琼 脂 培 养 基 平 板 (4 只 ) 2) 实 验 方 法 : (1) 无 菌 操 作 打 开 病 鱼 的 腹 腔 : 将 经 人 工 感 染 后 具 有 病 状 的 鱼 或 刚 死 的 鱼, 放 在 瓷 盘 中, 用 拧 干 的 酒 精 棉 球 在 病 鱼 体 表 进 行 消 毒, 用 灭 菌 剪 刀 从 靠 近 肛 门 的 地 方 向 上 剪 开 再 沿 侧 线 向 前 剪 开, 至 鳃 腔 后 缘, 向 下 剪 至 胸 鳍 基 部 用 无 菌 镊 子 揭 开 腹 壁, 暴 露 腹 腔 和 内 脏 器 官 (2) 无 菌 操 作 取 材 : 解 剖 刀 的 刀 片 在 火 焰 上 烧 灼 后, 迅 速 压 印 在 鱼 的 肝 ( 或 肾 ) 表 面, 3
在 组 织 上 烫 之 杀 死 表 面 的 杂 菌, 随 即 在 肝 ( 或 肾 ) 烧 灼 部 刺 一 小 孔 再 用 烧 灼 后 的 接 种 环 ( 待 冷 2~5 秒 ) 伸 向 烧 灼 部 小 洞 中, 用 手 指 将 接 种 环 轻 轻 旋 转 1~2 圈 后 抽 出, 取 足 材 料 后 在 营 养 琼 脂 平 板 上 进 行 划 线 分 离 (3) 划 线 分 离 方 法 : 左 手 持 握 普 通 ( 鲜 血 ) 琼 脂 平 板 ( 平 皿 盖 留 在 桌 上 ), 使 之 尽 量 垂 直, 以 免 空 气 中 杂 菌 落 入, 并 靠 近 火 焰, 右 手 持 带 有 细 菌 材 料 的 接 种 环 在 琼 脂 平 板 上 分 区 划 线 划 线 时 接 种 环 面 与 平 板 表 面 成 30~40 度 的 角 轻 轻 接 触, 在 平 板 表 面 轻 快 地 移 动, 接 种 环 不 应 嵌 入 培 养 基 内, 且 不 要 重 复, 否 则 形 成 菌 苔 划 线 完 毕, 盖 上 皿 盖, 接 种 环 灭 菌 后 放 下, 并 在 平 皿 底 部 用 记 号 笔 注 明 接 种 材 料 ( 脏 器 名 称 ) 日 期 及 操 作 者 代 号 放 在 28 培 养 箱 中 培 养 24h 后 观 察 菌 落 形 态 等 特 征 在 占 比 例 高 的 菌 落 形 态 一 致 的 菌 落 中 挑 选 一 个 菌 落, 用 接 种 环 接 种 到 斜 面, 作 为 致 病 菌 株 的 候 选 对 象 ( 分 离 出 的 菌 株 再 进 行 人 工 感 染, 观 察 鱼 是 否 发 病 以 及 是 否 与 原 分 离 出 该 病 菌 的 病 鱼 症 状 一 致, 如 一 致, 分 离 的 该 菌 株 为 致 病 菌 再 次 人 工 感 染 与 初 次 人 工 感 染 的 实 验 方 法 相 同, 实 验 略 ) 4. 致 病 菌 鉴 定 ( 实 验 略 ) 按 常 规 细 菌 鉴 定 方 法 进 行 ( 参 照 有 关 书 籍 ) 简 单 地 说 : 需 进 行 形 态 学 观 察 生 理 生 化 反 应 运 动 性 检 查 致 病 性 测 定 血 清 学 试 验 API-20E 或 API-50E 检 测 试 剂 盒 从 病 鱼 分 离 到 的 细 菌 不 一 定 是 病 原 菌, 必 须 证 实 其 是 否 有 致 病 性, 应 遵 循 柯 霍 原 则 (Koch Law), 取 其 纯 培 养 回 归 动 物, 动 物 应 发 病 且 表 现 出 与 自 然 发 病 相 似 的 症 状, 再 从 动 物 分 离 培 养, 如 得 到 与 接 种 的 纯 培 养 相 同 的 细 菌, 则 可 证 实 此 种 病 菌 为 病 原 菌 如 果 是 一 种 新 发 现 的 细 菌, 为 慎 重 起 见, 须 经 多 次 反 复 试 验 ( 包 括 再 分 离 再 感 染 ) 后 根 据 其 出 现 的 症 状, 便 可 知 分 离 的 细 菌 是 否 有 致 病 性, 然 后 经 一 系 列 的 形 态 和 培 养 特 征 观 察, 生 理 生 化 反 应 的 测 定 来 确 定 其 分 类 地 位 *: 嗜 水 气 单 胞 菌 检 验 程 序 图 见 附 录 一 4
二 疾 病 的 常 规 检 查 和 诊 断 ( 一 ) 目 的 要 求 通 过 对 实 验 课 的 学 习, 了 解 常 规 的 肉 眼 检 查 和 显 微 镜 检 查 疾 病 的 方 法 对 检 查 结 果 进 行 分 析 比 较, 作 出 疾 病 的 诊 断 ( 二 ) 实 验 材 料 实 验 用 鲫 鱼 显 微 镜 解 剖 盘 剪 刀 镊 子 纱 布 载 玻 片 蒸 馏 水 水 族 箱 ( 四 ) 实 验 方 法 1. 体 外 检 查 1). 肉 眼 检 查 : 检 查 鱼 有 无 疾 病 的 症 状 有 无 大 型 寄 生 虫 以 及 寄 生 虫 引 起 的 胞 囊 等 情 况 并 对 出 现 部 位 寄 生 虫 的 种 类 数 量 等 情 况 作 好 记 录 2). 显 微 镜 检 查 : 对 鱼 体 表 主 要 部 位, 如 鳃 鳍 体 表 刮 一 些 粘 液 或 用 剪 刀 剪 下 少 量 鳃 鳍 组 织, 放 在 滴 有 一 滴 蒸 馏 水 的 载 玻 片 上, 加 盖 玻 片 后 在 显 微 镜 下 检 查, 并 作 好 记 录 2. 体 内 检 查 1) 肉 眼 检 查 : 打 开 腹 腔, 观 察 每 个 脏 器 有 无 异 常 及 其 它 症 状, 有 无 大 型 寄 生 虫 以 及 寄 生 虫 引 起 的 胞 囊 等 情 况 并 对 出 现 部 位 寄 生 虫 的 种 类 数 量 等 情 况 作 好 记 录 2) 显 微 镜 检 查 : 实 质 器 管 如 肝 肾 等 组 织 切 下 一 小 块, 放 在 干 净 的 两 块 载 玻 片 之 间 挤 压, 组 织 压 碎 后 移 开 一 块 载 玻 片, 在 有 压 碎 的 组 织 一 片 载 玻 片 上 加 一 滴 水 后, 加 盖 盖 玻 片, 在 显 微 镜 下 观 察, 异 常 情 况 作 好 记 录 ( 五 ) 诊 断 对 检 查 结 果 进 行 分 析, 比 较 做 出 诊 断 *: 疾 病 的 检 查 和 诊 断 详 细 的 方 法 见 附 录 二 5
附 录 一 嗜 水 气 单 胞 菌 检 验 程 序 图 : 检 样 水 样 碱 性 蛋 白 胨 水 病 料 菌 株 普 通 肉 菌 普 通 平 板 纯 菌 AHM 培 养 基 氧 化 酶 RS 培 养 基 污 染 病 料 初 定 为 嗜 水 气 单 胞 菌 - G 染 色 运 动 性 糖 发 酵 全 菌 凝 集 实 验 5min 28 24h 葡 萄 糖 甘 露 醇 七 叶 苷 / 水 杨 苷 阿 拉 伯 糖 蔗 糖 鸟 氨 酸 脱 羧 酶 - 判 定 为 嗜 水 气 单 胞 菌 普 通 肉 汤 血 平 板 改 良 产 毒 素 肉 汤 脱 脂 奶 平 板 蔗 糖 胰 蛋 白 胨 肉 汤 28 摇 床 180rpm,24h 28 摇 床 300rpm,48h 溶 蛋 白 圈 () 溶 菌 圈 () HEC 毒 素 蛋 白 酶 S 蛋 白 Dot-ELISA Dot-ELISA Dot-ELISA 5h 5h 5h 产 毒 素 产 蛋 白 酶 有 S 蛋 白 判 定 为 致 病 性 嗜 水 气 单 胞 菌 6
附 录 二 疾 病 的 检 查 和 诊 断 详 细 方 法 水 产 动 物 疾 病 的 种 类 很 多, 引 起 的 原 因 也 是 非 常 复 杂 的, 有 非 生 物 因 素, 也 有 生 物 因 素, 为 了 有 效 地 预 防 水 产 动 物 疾 病, 必 须 对 这 些 因 素 加 以 综 合 考 虑, 才 能 对 症 下 药 除 了 因 为 病 原 体 敌 害 等 的 感 染 和 侵 袭, 引 起 水 产 动 物 发 病 和 死 亡 外, 还 有 许 多 非 生 物 因 素, 如 周 围 环 境 和 水 体 物 理 化 学 状 况 的 恶 化 等, 因 此 单 纯 从 水 产 动 物 机 体 进 行 检 查, 就 很 难 得 出 正 确 的 诊 断, 必 须 对 发 病 现 场 进 行 调 查 现 以 鱼 类 为 例, 叙 述 疾 病 的 检 查 和 诊 断 详 细 方 法 : ( 一 ) 了 解 病 鱼 在 池 子 中 出 现 的 各 种 异 常 现 象 1. 根 据 鱼 病 发 生 的 过 程, 有 慢 性 和 急 性 两 种 类 型, 这 两 种 类 型 所 表 现 的 现 象 病 鱼 在 水 中 是 不 同 的 急 性 型 鱼 病 : 病 鱼 一 般 在 体 色 外 观 和 体 质 上 与 正 常 的 差 别 不 大, 仅 仅 在 病 变 部 位 出 现 轻 微 的 变 化, 但 是 一 旦 出 现 死 亡, 死 亡 率 急 剧 上 升, 常 在 短 期 内 出 现 死 亡 高 峰 例 如 : 中 毒, 常 会 引 起 大 批 死 亡, 尤 其 在 江 河 中 这 种 情 况 常 会 发 生, 上 游 工 厂 排 放 污 水, 有 些 工 业 污 水 中 含 有 较 多 重 金 属 等 毒 物, 当 这 些 污 水 顺 流 而 下, 到 达 养 鱼 地 区, 常 引 起 大 批 的 鱼 急 性 死 亡, 尤 其 在 江 河 中 网 箱 养 殖 的 鱼 会 受 到 直 接 的 危 害 慢 性 型 鱼 病 : 病 鱼 体 色 发 黑, 体 质 瘦 弱, 离 群 独 游, 在 水 面 上 缓 慢 地 游 动, 死 亡 率 一 般 缓 慢 地 逐 渐 上 升, 死 亡 的 高 峰 不 明 显 2. 不 同 的 病 原 体 敌 害 引 起 的 病 鱼 在 水 中 出 现 现 象 也 是 不 同 的 鱼 类 受 到 寄 生 虫 侵 袭 和 刺 激, 往 往 出 现 不 安 的 状 态, 比 如 : 受 到 鲺 的 侵 袭 后, 表 现 为 上 跳 下 窜, 但 是 体 色 体 质 变 化 不 大 受 到 鲢 碘 泡 虫 侵 袭 的 白 鲢, 鱼 在 水 中 狂 游 乱 窜, 抽 搐 地 打 圈 子, 尾 巴 上 翘 受 工 业 废 水 中 毒 时 候, 短 时 间 里 出 现 大 批 死 亡 无 论 是 家 鱼 还 是 野 杂 鱼 都 不 例 外 因 此, 到 现 场 调 查, 了 解 鱼 种 的 表 现 和 周 围 环 境 情 况, 是 正 确 诊 断 鱼 病 的 首 要 环 节 ( 二 ) 了 解 饲 养 管 理 情 况 池 鱼 发 病, 常 常 与 放 养 密 度 过 大, 饲 养 管 理 不 善 有 关 施 放 肥 料 过 大, 在 池 中 直 接 沤 肥, 投 喂 的 饲 料 变 质 或 者 腐 败, 投 喂 过 多 等 都 容 易 引 起 水 质 恶 化, 产 生 缺 氧, 引 起 鱼 类 浮 头 或 者 窒 息 希 望 有 机 物 多, 肮 脏 发 臭 的 池 水, 常 给 病 原 体 以 及 其 他 敌 害 创 造 了 有 利 的 条 件, 引 起 他 们 大 量 繁 殖, 造 成 鱼 发 病 死 亡 7
放 养 过 密, 鱼 苗 互 相 拥 挤, 摄 食 不 足, 生 长 不 良, 削 弱 了 对 疾 病 的 抵 抗 能 力, 有 利 于 病 原 体 的 侵 袭 ( 三 ) 鱼 体 的 肉 眼 检 查 鱼 病 可 以 分 为 病 毒 性, 细 菌 性 和 寄 生 虫 性 三 大 类 检 查 的 时 候, 一 些 大 型 的 寄 生 虫 ( 蠕 虫 甲 壳 动 物 软 体 动 物 幼 虫 ) 真 菌 ( 水 霉 等 ), 用 肉 眼 可 以 识 别 出 来 有 些 病 原 体 ( 病 毒 细 菌 体 型 较 小 的 原 生 动 物 等 ) 用 眼 睛 是 看 不 见 的, 就 需 要 根 据 其 症 状 进 行 大 致 的 辨 别 为 诊 断 鱼 病 提 供 依 据 1. 目 检 步 骤 : (1) 体 表 : 将 病 鱼 或 者 刚 死 亡 的 鱼 置 于 白 糖 瓷 盘 重, 对 鱼 的 体 表 进 行 仔 细 的 观 察, 在 体 表 上 的 一 些 大 型 病 原 体 ( 水 霉, 线 虫, 锚 头 蚤, 鲺, 钩 介 幼 虫 等 ) 很 容 易 看 到 有 些 用 肉 眼 看 不 出 来 的 病 原 体, 则 根 据 表 现 的 症 状 来 辨 别 : 口 丝 虫, 车 轮 虫, 斜 管 虫, 三 代 虫 等 引 起 的 症 状, 一 般 会 引 起 鱼 体 分 泌 大 量 粘 液, 鳍 条 末 端 腐 烂, 但 是 鳍 条 基 部 一 般 无 充 血 现 象 复 口 吸 虫 病 后 期, 鱼 的 眼 球 出 现 浑 浊, 有 白 内 障 细 菌 性 鱼 病 有 其 本 身 的 特 征 : 赤 皮 病, 烂 鳃 病, 肠 炎 病, 打 印 病 等 等 (2) 鳃 : 观 察 鳃 丝 末 端 是 否 肿 大 和 腐 烂 现 象, 鳃 片 的 颜 色 是 否 正 常, 粘 液 是 否 较 多 细 菌 性 烂 鳃 病 : 鳃 片 颜 色 比 正 常 鱼 的 鳃 片 颜 色 较 白, 略 带 有 红 色 小 点 或 者 小 块 常 常 附 有 污 泥 严 重 时 候, 鳃 丝 末 端 腐 烂, 并 有 大 量 粘 液 微 小 的 原 虫 常 引 起 许 多 粘 液 中 华 蚤, 双 身 虫, 指 环 虫 以 及 粘 孢 子 虫 病 等 寄 生 虫, 常 表 现 为 鳃 肿 大 鳃 上 有 白 色 虫 体 或 者 胞 囊 (3) 内 脏 : 解 剖 方 法 : 首 先 观 察 有 否 有 腹 水 和 肉 眼 观 察 内 脏 外 表 是 否 有 可 见 的 大 型 寄 生 虫, 然 后 取 出 内 脏, 剪 开 肠 道, 一 般 大 型 寄 生 虫 肉 眼 可 见, 如 吸 虫, 绦 虫, 线 虫 等 肠 炎 会 出 现 充 血, 发 炎 球 虫 和 粘 孢 子 虫 病 则 在 肠 壁 上 一 般 有 成 片 或 者 稀 散 的 小 白 点 胞 囊 其 他 内 脏 器 官 如 果 外 表 上 没 有 发 现 病 状, 可 不 再 检 查 8
2. 镜 检 : 仅 仅 凭 目 检, 对 病 的 正 确 诊 断 是 不 够 的, 除 了 一 些 明 显 而 情 况 又 比 较 单 纯, 凭 目 检 可 以 有 把 握 地 诊 断 外, 一 般 来 说, 都 有 必 要 进 行 镜 检 例 : 白 嘴 白 头 病 由 细 菌 引 起, 车 轮 虫 病 有 时 同 样 会 引 起 白 嘴 白 头, 这 时 候 就 必 须 用 镜 检 来 作 出 正 确 判 断 ( 四 ) 检 查 时 候 应 该 注 意 的 事 项 1. 要 用 活 的 或 者 刚 死 的 病 鱼 进 行 检 查 : 死 了 很 久 的 鱼, 由 于 腐 败 分 解, 原 来 表 现 的 症 状 已 无 法 辨 认, 寄 生 虫 也 随 着 很 快 地 死 亡, 死 后 往 往 会 改 变 形 状 和 崩 解 腐 烂 2. 用 过 的 工 具 要 洗 干 净 再 用 : 为 了 防 止 诊 断 时 候 产 生 寄 生 虫 部 位 的 混 乱, 检 查 完 一 个 器 官 的 时 候, 都 要 把 用 过 的 剪 刀 镊 子 和 吸 管 之 类 工 具 洗 干 净 后, 再 用 它 进 行 另 外 一 个 器 官 的 检 查 3. 解 剖 的 鱼 体 和 取 出 的 器 官 不 能 干 燥 : 检 查 过 程 中, 需 要 经 过 相 当 长 的 时 间, 因 此 取 出 的 各 个 器 官 以 及 解 剖 开 的 鱼 体, 不 要 让 它 干 燥, 最 好 用 湿 布 或 者 洁 净 的 白 纸 盖 在 上 面 保 持 一 定 的 湿 度 ( 五 ) 检 查 方 法 在 检 查 比 较 大 的 病 原 体, 如 蠕 虫 蛭 类 软 体 动 物 幼 虫, 寄 生 甲 壳 动 物 等, 一 般 使 用 解 剖 镜, 双 目 解 剖 镜 视 野 大 容 易 操 作 在 检 查 时 候 比 较 小 的 病 原 体, 一 定 要 用 显 微 镜 不 可, 有 些 很 小 ( 如 : 鞭 毛 虫 类, 纤 毛 虫 类, 孢 子 虫 类 ) 如 原 生 动 物 类 还 需 要 放 大 到 比 较 高 的 倍 数, 才 能 看 清 楚 1. 玻 片 压 缩 法 取 两 片 载 玻 片, 把 要 检 查 的 器 官, 组 织 一 部 分 或 者 将 虫 体 表 刮 下 的 粘 液, 肠 里 取 出 的 内 含 物, 放 在 玻 片 上, 滴 入 适 量 清 水 或 者 生 理 盐 水, 另 外 一 片 玻 片 将 它 压 成 透 明 的 薄 层, 即 可 放 在 低 倍 显 微 镜 上 检 查 发 现 病 原 体 后, 慢 慢 地 将 上 面 的 玻 片 一 点 一 点 地 单 行 移 开 不 要 把 器 官 组 织 和 内 含 物 的 薄 层 捣 乱, 然 后 用 镊 子 将 刚 才 发 现 的 病 原 体 所 在 位 置 中 取 出 病 原 体, 然 后 放 在 盛 有 水 或 者 生 理 盐 水 培 养 皿 里, 以 后 加 以 进 一 步 处 理 2. 载 玻 片 法 : 它 适 用 于 低 倍 镜 和 高 倍 显 微 镜 检 查, 用 小 剪 刀 或 者 镊 子 取 出 一 小 块 组 织 或 者 一 小 点 内 含 物 或 者 一 些 粘 液 放 在 载 玻 片 上, 加 入 适 量 的 清 水 或 者 生 理 盐 水, 滴 入 的 水 以 盖 上 盖 玻 片 后 水 分 不 溢 出 盖 玻 片 周 围 为 度, 然 后 轻 轻 9
的 压 盖 玻 片, 先 在 低 倍 镜 进 行 观 察, 后 在 高 倍 镜 进 行 观 察 ( 六 ) 检 测 步 骤 1. 编 号 2. 记 录 时 间 地 点 3. 称 重 量 4. 测 量 大 小, 全 长, 标 准 长, 体 高 各 部 分 检 查 如 下 : (1) 粘 液 (2) 鼻 腔 (3) 鳃 (4) 体 腔 (5) 内 脏 ( 七 ) 病 原 体 的 计 数 标 准 在 鱼 病 的 诊 断 过 程 中, 除 了 肯 定 病 原 体 之 外, 并 要 进 一 步 辨 认 疾 病 的 轻 重, 因 此 对 病 原 体 的 数 量 必 须 加 以 计 数 有 许 多 病 原 体 特 别 是 原 生 动 物, 肉 眼 无 法 看 到, 即 使 在 显 微 镜 下 面, 也 不 可 能 把 所 有 的 病 原 体 逐 个 数 清, 只 能 采 用 估 计 法 计 数 标 准 : 1. 技 术 符 号 表 示 有, 表 示 多, 表 示 很 多 2. 各 种 病 原 体 的 计 数 细 菌 性 : 病 毒 性 : 肠 炎, 烂 鳃, 赤 皮, 疥 疮, 均 被 所 表 现 的 症 状 用 文 字 描 述 鞭 毛 虫, 变 形 虫, 球 虫, 粘 孢 子 虫, 微 孢 子 虫, 单 孢 子 虫 : 在 高 倍 镜 视 野 下, 约 有 1-20 个 以 下 的 虫 体 或 者 孢 子 时 候 记,20~ 50 个 记,50 个 以 上 为 纤 毛 虫 或 者 毛 管 虫 : 在 低 倍 镜 下 面 有 1~20 个 记,21-50 个 记,51 个 以 上 记 蠕 虫 类, 蛭 类, 甲 壳 动 物, 软 体 动 物 的 幼 虫 : 在 50 个 以 下 均 为 数 字 说 明,50 个 以 上 者 用 估 计 数 字 注 意 : 1. 使 用 的 目 镜 以 及 物 镜 的 倍 数 都 应 该 说 明, 一 般 目 镜 10 为 准 2. 计 数 病 原 体 的 数 量, 都 是 以 同 一 片 中 观 察 3 个 视 野 平 均 数 为 准 10