C215

Mut Express MultiS Fast Mutagenesis Kit V2 C215 使用说明书 Version 20.1

目录 Contents www.vazyme.com 01/ 产品概述... 02 02/ 产品组分... 02 03/ 保存条件... 02 04/ 适用范围... 02 05/ 自备材料... 02 06/ 实验原理与流程概要... 03 07/ 实验流程... 04 07-1/ 多碱基定点突变引物设计... 04 07-2/ 目标质粒扩增... 04 07-3/ 扩增产物 Dpn I 消化... 05 07-4/ 消化产物浓度测试... 05 07-5/ 消化产物用量... 06 07-6/ 重组反应... 06 07-7/ 重组产物转化... 07 07-8/ 重组产物鉴定... 07 08/ 常见问题与解决方案... 07 * 所有商标均属于各自商标所有者的财产 某些商标并未在全部行政区注册

01/ 产品概述 Mut Express MultiS Fast Mutagenesis Kit V2 是基于 ClonExpress 快速克隆技术, 可一次性向目标质粒上三至五个不连续位点同时引入定点突变的试剂盒 该试剂盒整合了 Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase 扩增模块和 ClonExpress 快速克隆模块 Phanta Max 超高的保真度, 显著降低了扩增过程中引入新突变的可能性, 其卓越的长片段扩增能力, 广泛适用于小于 20 kb 的任何质粒扩增 ClonExpress 快速克隆系统利用高效的同源重组反应替代了传统的退火成环反应 使用 Mut Express MultiS 定点突变试剂盒进行定点突变时, 引物设计更加灵活, 模板使用量极低, 有利于原始甲基化模板的彻底降解 试剂盒中配有高度优化的重组反应缓冲液以及专门针对多碱基定点突变而优化的重组酶 Exnase MultiS, 如扩增产物特异, 其 Dpn I 消化产物可不进行 DNA 纯化而直接用于重组反应, 是 DNA 多点突变的首选试剂盒 02/ 产品组分 组分 2 Max Buffer dntp Mix (10 mm each) Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase Dpn I (10 U/μl) 5 CE MultiS Buffer Exnase MultiS C215-01 (10 rxns) 1.25 ml 50 μl 50 μl 50 μl 40 μl 20 μl C215-02 (25 rxns) 3 1.25 ml 125 μl 125 μl 125 μl 100 μl 50 μl 03/ 保存条件 - 30 ~ - 15 保存, 0 运输 使用过程中避免反复冻融 04/ 适用范围 突变 :3-5 个不连续位点定点突变 ( 相距 50 bp 以内的多个碱基可计为 1 个突变位点 ) 删除 : 对载体上特定序列进行删除 使用本试剂盒对质粒进行定点突变时, 请使用甲基化酶无缺陷的宿主菌 ( 如 XL10 DH5α JM109) 扩增原始质粒! 05/ 自备材料原始质粒 突变引物 ; 感受态细胞 : 克隆菌株制备的化学感受态细胞 DH5α Competent Cell(Vazyme #C502) 常规克隆, 适用于 <15 kb 质粒 ; XL10 Competent Cell(Vazyme #C503) 大片段克隆, 适用于 >10 kb 质粒 ; Fast-T1 Competent Cell(Vazyme #C505) 快速克隆 ; 其他材料 :ddh 2O PCR 管 PCR 仪等 01/ 02

06/ 实验原理与流程概要 Mutation Point A Mutation Point B Mutation Point C A Forward B Forward Primer Primer A Reverse Primer B Reverse Primer C Forward Primer C Reverse Primer Original Vector (Methylated) I Amplification(Phanta) Methylated Templates Digestion(Dpn I) Linear Amplification (Non-Methylated) II Homologous Recombination (Exnase MultiS) Mutated Vector (Non-Methylated) III Transformation into Competent Cell Mutated Vector (Methylated) Fig 1. 不连续三碱基定点突变流程示意图 www.vazyme.com I. 扩增引入突变 : 在 A B C 三个待突变位点分别设计部分反向互补的引物 将两对引物交叉使用, AF+BR 扩增得到 AB 段,BF+CR 扩增得到 BC 段,CF+AR 扩增得到 CA 段, 使用 Dpn I 消化扩增产物 II. 重组反应 : 将 AB BC CA 段按比例混合, 在 Exnase MultiS 催化下,37 反应 30 min 即可完成重组反应, 实现线性化 DNA 的体外环化 III. 转化感受态细胞 : 重组产物直接进行转化, 平板上会形成数百个单克隆供后期阳性筛选

07/ 实验流程 07-1/ 多碱基定点突变引物设计 ( 以不连续三碱基定点突变为例 ) 向质粒三个不连续位点引入定点突变, 只需设计三对引物将质粒分段扩增即可 引物设计方式为 :5-15 - 21 bp 反向互补区域 + 至少 15 bp 的非互补区域 - 3 反向互补区域 GC 含量 40% - 60% 为佳, 避免选择有重复序列的区域, 待突变位点至引物 3 端 Tm 值 >60 为佳, 待突变位点至引物 5 端区域内碱基不应参与计算 ; 待突变位点可置于互补区域内 ( 需要两条引物上均引入点突变 ), 也可置于任一条引物的非互补区域 ( 只需在一条引物上引入点突变 ), 请勿将突变位点置于引物末端 推荐登陆诺唯赞官网下载引物设计软件 CE Design(http://www.vazyme.com), 自动生成扩增引物 若手动设计, 可参照以下实例 : Mutation Point A B C vector A 5 ------GAATCCATCATCAGTCATTTCTCGCACCCGGATCTGTA-CAC-ATGTAACGCCCGCTCAGACGTGCTTCAGCAAGCGACGCACGT-------3 3 ------CTTAGGTAGTAGTCAGTAAAGAGCGTGGGCCTAGACAT-GTG-TACATTGCGGGCGAGTCTGCACGAAGTCGTTCGCTGCGTGCA-------5 非互补区域 15-21 bp 互补区域 Reverse Primer Forward Primer 15-21 bp 互补区域非互补区域 Fig 2. 不连续多碱基定点突变引物设计示意图 07-2/ 目标质粒扩增 使用 Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase 对目标质粒进行扩增 反应各组分解冻后请充分 摇匀, 使用完毕后及时放回 -20 推荐反应体系如下 : 组分模板 DNA a 2 Max Buffer dntp Mix (10 mm each) b 引物 1 (10 μm) 引物 2 (10 μm) Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase c ddh 2O 体积 Optional 25 μl 1 μl 2 μl 2 μl 1 μl Up to 50 μl a. 请勿使用 dutp 和带有尿嘧啶的引物或模板 ; b. 在质粒能正常扩增的前提下, 应尽量减少使用量, 推荐使用 1 ng 新鲜提取的质粒作模板 ; c. 推荐酶的终浓度为 1 U/50 μl 反应 可将 Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase 在 0.5-2 U/50 μl 之间进行优化, 但不要超过 2 U/50 μl, 尤其当扩增子长度大于 5 kb 时 03/ 04

推荐 PCR 反应条件如下 : 循环步骤预变性变性 a 退火 温度 95 95 60 ~ 72 时间 30 sec 15 sec 15 sec b 延伸 72 彻底延伸 72 5 min 30-60 sec/kb 循环数 1 30 c 1 a. Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase 能够促进模板和引物高效退火 一般来说, 退火温度设置为引物 Tm 值即可 如需要, 可设置不同温度梯度寻找引物模板结合的最适温度 退火时间太长可能导致扩增产物在胶上呈现弥散状 ; b. 延长延伸时间有助于提高扩增产量 ; c. 为了防止扩增过程中引入非目标突变, 强烈建议扩增循环数 35 如扩增效率良好, 推荐扩增循环数应 30 反应结束后取少量扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测 如目标质粒正确扩增, 则可进行下步实验 } 07-3/ 扩增产物 Dpn I 消化因 07-2/ 扩增产物中包含原始模板质粒, 为防止其在转化后形成假阳性转化子, 必须在进行重组环化之前进行 Dpn I 消化, 去除甲基化模板质粒 推荐反应体系如下 : 组分体积 Dpn I 1 μl 扩增产物 40-50 μl 轻轻吸打混匀后, 短暂离心收集至管底, 置于 37 恒温反应 1-2 h 如 07-2 步骤扩增特异, 产物条带单一,Dpn I 消化产物无需纯化, 可直接用于后续重组反应, 但消化产物加入总体积不应超过重组反应体积的 1/5 如扩增不特异,Dpn I 消化结束后应胶回收纯化目标扩增产物 07-4/ 消化产物浓度测定浓度测定 : 若消化产物已通过高质量的试剂盒进行胶回收纯化, 且经电泳检测无明显杂带或 Smear 残留时, 可使用 Onedrop 等基于吸光值的仪器进行浓度测定, 但只有当 A260/A280 在 1.8-2.0 之间时浓度值可信 推荐使用 Nanodrop Onedrop Qubit PicoGreen 等进行浓度测定 www.vazyme.com

07-5/ 消化产物用量 Exnase MultiS 不连续多碱基定点突变重组反应最适 DNA 使用量为每个片段 0.03 pmol, 对应的 DNA 质量可由以下公式粗略计算获得 : Dpn I 消化产物使用量 = [0.02 片段碱基对数 ] ng(0.03 pmol) 例如,AB 段长度为 1 kb,bc 段长度为 2 kb,ca 段长度为 5 kb 则 Dpn I 消化产物最适使用量为 : AB 段 0.02 1,000 = 20 ng;bc 段 0.02 2,000 = 40 ng;ca 段 0.02 5,000 = 100 ng a. DNA 量太多或者太少都将降低环化效率, 请尽量严格按照推荐量配制反应体系 b. Dpn I 消化产物使用量应在 20-200 ng 之间 当使用上述公式计算 DNA 最适使用量超出这个范围时, 直接选择最低 / 最高使用量即可 c. Dpn I 消化产物不纯化直接用于重组反应时, 加入总体积不应超过反应体积的 1/5, 即 4 μl 07-6/ 重组反应 Mut Express 独特的引物设计方案 ( 参见 07-1/ 引物设计 ) 使得扩增消化产物在 Exnase MultiS 催化下, 可将待突变位点进行高效重组, 实现线性 DNA 的体外环化 1. 对于不连续多碱基定点突变, 于冰上配制以下反应体系 : 组分 a n 个 Dpn I 消化产物 5 CE MultiS Buffer Exnase MultiS ddh 2O 重组反应 X 1 - X n μl 4 μl 2 μl Up to 20 μl b 阴性对照 X 1 - X n μl 0 μl 0 μl Up to 20 μl a. X 为根据公式计算得到的各消化产物用量 b. 扩增模板量过高或 Dpn I 消化不完全易造成较高的假阳性背景, 因此推荐设置阴性对照 2. 使用移液器轻轻吸打混匀 ( 请勿振荡混匀 ), 短暂离心将反应液收集至管底 3. 37,30 min; 降至 4 或立即置于冰上冷却 推荐在 PCR 仪等温控比较精确的仪器上进行反应 重组效率在反应 30 min 左右达到最高, 反应时间不足或太长都将会降低克隆效率 重组产物可于 -20 存放一周, 待需要时解冻转化即可 05/ 06

07-7/ 重组产物转化 1. 在冰上解冻克隆感受态细胞 ( 如 :DH5α Competent Cell,Vazyme #C502) 2. 取 10 μl 重组产物加入到 100 μl 感受态细胞中, 轻弹管壁混匀 ( 请勿振荡混匀 ), 冰上静置 30 min 重组产物转化体积最多不应超过所用感受态细胞体积的 1/10; 3. 42 水浴热激 45 sec 后, 立即置于冰上冷却 2-3 min 4. 加入 900 μl SOC 或 LB 液体培养基 ( 不添加抗生素 ),37 摇菌 1 h( 转速 200-250 rpm) 5. 将相应抗性的 LB 固体培养基平板在 37 培养箱中预热 6. 5,000 rpm 离心 5 min, 弃掉 900 μl 上清 用剩余培养基将菌体重悬, 用无菌涂布棒在含有正确抗性的平板上轻轻涂匀 7. 37 培养箱中倒置培养 12-16 h 07-8/ 重组产物鉴定 过夜培养后, 若重组反应转化平板上的克隆数目显著高于阴性对照, 可挑取若干个单克隆接 种至含有适当抗生素的 LB 液体培养基中培养过夜, 提取质粒进行一代测序 08/ 常见问题与解决方案 质粒各段无法正常扩增 1. 推荐引物设计软件 CE Design, 选择相应模块进行设计 2. 引物设计有误 : 核对引物设计方案 3. 扩增体系配制错误 : 重复实验 4. 扩增反应条件不优化 : 调整 Mg 2+ 浓度 酶量 扩增程序 5. 模板质粒质量偏差 : 长期放置 反复冻融会导致模板质粒断裂 开环或降解, 应使用新鲜制备的质粒作为模板 平板上长不出克隆或克隆数目很少 www.vazyme.com 1 加入的 DNA 使用量不足 / 过量, 或者比例不佳 : 尽量按照说明书中推荐的量和比例配制重组反应体系 2. 重组环化反应体系中 DNA 不纯, 抑制反应 : 未纯化 DNA 使用体积不应超过 4 μl( 反应体系体积的 1/5); 建议将产物进行凝胶回收纯化, 纯化产物溶解在 ddh 2O 中 3. 感受态细胞效率低 : 感受态细胞的转化效率需大于 10 8 cfu/μg 可进行简单检测, 转化 0.1 ng 质粒, 取 1/10 进行涂板, 生长 1,000 个菌斑, 估算转化效率为 10 8 cfu/μg; 重组产物的转化体积不应超过感受态细胞体积的 1/10, 否则会降低转化效率 ; 选择克隆用感受态细胞 ( 如 DH5α/XL10/Fast-T1), 不能选择表达感受态细胞

定点突变未正确完成 1. 引物设计错误 : 核对引物设计方案 2. 扩增反应所用模板为非甲基化的质粒 :Dpn I 只能识别甲基化 DNA, 请务必使用从甲基化酶无缺陷的宿主菌中扩增的质粒作为 PCR 模板 3. 扩增反应使用过多的模板质粒 : 对于大多数质粒,1 ng 模板量已足以使扩增反应正常进行, 过多的质粒模板将会导致 Dpn I 消化不完全, 降低突变成功率 非目标位点突变 1. 模板质粒携带未知位点突变 : 测序确认模板质粒序列正确性 2. 扩增循环数过多 : 为了防止扩增过程中引入非目标突变, 扩增循环数不宜超过 35 如果扩增效率良好的话, 推荐扩增循环数应不超过 30 特别提醒! 在选择引物反向互补区时, 应避免选择有重复序列的区域 当这一区域内 GC 含量在 40% - 60% 范围之内时, 重组环化效率将达到最大 如这部分区域 GC 含量高于 70% 或者低于 30%, 重组环化效率会受到较大影响 07/ 08

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