工 程 科 技 與 教 育 學 刊 第 10 卷 第 1 期 第 83~88 頁 民 國 102 年 3 月 以 兩 相 流 動 提 高 超 過 濾 濃 縮 醱 酵 液 玻 尿 酸 之 回 收 率 蘇 芳 儀 陳 樹 人 * 國 立 高 雄 應 用 科 技 大 學 化 學 工 程 與 材 料 工 程 系 通 訊 作 者 電 子 郵 件 :E-mail : biochen@kuas.edu.tw 摘 要 以 100 kd 超 過 濾 膜 從 鏈 球 菌 醱 酵 液 (ph 7.0) 回 收 分 子 量 為 1,200 kd 玻 尿 酸 時, 回 收 率 僅 有 88%; 如 果 將 醱 酵 液 調 整 到 ph 2.5, 回 收 率 可 以 提 高 至 96% 雖 然 降 低 酸 鹼 值 有 助 於 增 加 玻 尿 酸 分 子 間 的 作 用 力, 促 使 玻 尿 酸 分 子 纏 繞 形 成 分 子 團, 因 而 不 容 易 穿 越 濾 膜 ; 但 伴 隨 而 來 的 濃 度 極 化 現 象, 卻 明 顯 地 降 低 超 過 濾 操 作 的 過 濾 通 量 本 研 究 發 現 利 用 氣 液 兩 相 超 過 濾 系 統, 配 合 模 組 放 置 角 度 的 改 變, 可 產 生 適 當 型 態 的 氣 泡 氣 泡 上 升 之 浮 力 能 有 效 地 擾 動 液 體, 降 低 濃 度 極 化 現 象, 因 而 提 高 過 濾 通 量 關 鍵 詞 : 鏈 球 菌 玻 尿 酸 超 過 濾 濃 度 極 化 1. 前 言 玻 尿 酸 (hyaluronic acid, HA) 主 要 存 在 於 動 物 眼 球 玻 璃 體 [1] 臍 帶 [2] 關 節 滑 液 [3] 皮 膚 [4] 與 公 雞 雞 冠 [5] 等 組 織 除 了 動 物 之 外,1937 年 Kendall 等 人 [6] 發 現 鏈 球 菌 莢 膜 主 要 的 成 分 即 是 玻 尿 酸 ; 玻 尿 酸 生 產 菌 多 隸 屬 於 藍 士 菲 耳 特 氏 A 群 與 C 群 鏈 球 菌, 常 見 者 有 Streptococcus equi S. equisimilis S. dysgalactiae S. pyrogenes; 目 前 學 術 界 與 產 業 界 多 以 獸 疫 鏈 球 菌 S. zooepidemicus 作 為 玻 尿 酸 生 產 菌 玻 尿 酸 水 溶 液 呈 現 擬 塑 性 流 體 的 特 性, 具 有 良 好 的 黏 彈 性 [7], 在 關 節 疾 治 療 生 醫 材 料 與 保 濕 化 粧 品 的 開 發 上 有 廣 泛 的 應 用 [8-10] 傳 統 生 產 玻 尿 酸 的 方 法 是 自 公 雞 雞 冠 萃 取 ; 然 而, 以 微 生 物 醱 酵 生 產 玻 尿 酸, 不 僅 可 以 免 除 未 知 動 物 病 毒 的 污 染, 也 可 以 在 分 離 純 化 程 序 中 避 免 使 用 氯 彷 丙 酮 等 危 害 性 溶 劑 [10] 自 鏈 球 菌 醱 酵 液 純 化 玻 尿 酸 通 常 使 用 先 以 離 心 去 除 細 胞, 再 以 硫 酸 銨 沈 澱 出 玻 尿 酸, 沈 澱 物 以 鹽 水 回 溶 之 後, 反 覆 以 酒 精 沈 澱 去 除 殘 留 的 蛋 白 質, 最 後 再 經 過 層 析 得 到 高 純 度 的 產 物 [11] 為 了 簡 化 純 化 流 程, 以 超 過 濾 回 收 玻 尿 酸 是 值 得 探 討 的 分 離 程 序 超 過 濾 可 以 自 醱 酵 液 直 接 回 收 產 物, 免 除 硫 酸 銨 沈 澱 的 步 驟, 並 可 移 除 大 部 分 蛋 白 質, 卻 難 以 避 免 濃 度 極 化 現 象 因 此, 本 研 究 除 了 探 討 超 過 濾 的 操 作 條 件 與 方 法 之 外, 也 提 出 降 低 濃 度 極 化 現 象 的 操 作 策 略 2. 材 料 與 方 法 本 研 究 使 用 之 玻 尿 酸 生 產 菌 為 獸 疫 鏈 球 菌 Streptococcus zooepidemicus ATCC 39920 批 次 醱 酵 生 產 是 在 2.5-L 醱 酵 槽 (M-100, Tokyo Rikakikai, Tokyo) 進 行, 醱 酵 條 件 為 溫 度 37 C 與 ph 7, 通 氣 量 1.0 vvm, 攪 拌 速 率 600 rpm 培 養 基 組 成 為 20 g/l glucose 10 g/l yeast extract 2.5 g/l K 2 HPO 4 2 g/l NaCl 與 1.5 g/l MgSO 4 H 2 O 過 濾 裝 置 使 用 100 kda MWCO 的 過 濾 膜, 過 濾 面 積 為 63.65 cm 2, 模 組 內 渠 道 高 度 為 0.5 cm 超 過 濾 系 統 裝 置 如 Fig. 1 所 示, 操 作 步 驟 為 : (1) 通 入 去 除 菌 體 的 醱 酵 液, 調 整 液 相 流 速, 將 管 內 及 模 組 內 的 空 氣 趕 出 (2) 通 入 空 氣, 調 整 氣 相 流 速 (3) 緩 慢 增 加 透 膜 壓 力, 此 時 需 注 意 控 制 調 整 氣 液 兩 相 的 流 速 Journal of Engineering Technology and Education, ISSN 1813-3851
84 蘇 芳 儀 陳 樹 人 在 兩 相 流 動 超 過 濾 實 驗 中, 空 氣 的 注 入 因 子 定 義 為 : UG ε = U + U L G (1) 其 中,U L 為 液 相 醱 酵 液 在 模 組 內 的 表 面 流 速,U G 為 空 氣 在 模 組 內 的 表 面 流 速, 透 膜 壓 力 則 由 濾 出 端 的 控 制 閥 調 整 玻 尿 酸 濃 度 分 析 以 carbazole 法 [12] 分 析, 先 以 濃 硫 酸 水 解 玻 尿 酸 得 到 葡 萄 糖 醛 酸, 加 入 carbazole 試 劑 與 葡 萄 糖 醛 酸 反 應 產 生 粉 紅 色 基 團, 再 以 分 光 光 譜 儀 測 定 波 長 525 nm 之 吸 收 度, 經 由 檢 量 線 換 算 即 可 得 知 玻 尿 酸 濃 度 Back-pressure Valve Gauge Plate Membrane Module Reservoir Pump Flow Meter Filtrate Flow Meter Air 流 體 流 動 方 向 Pump Fig. 1 超 過 濾 裝 置 3. 結 果 與 討 論 研 究 用 菌 株 所 生 產 之 玻 尿 酸 分 子 量 為 1,100 kda 是 吾 人 採 用 100 kda 的 超 過 濾 膜, 直 接 回 收 於 醱 酵 液 中 的 玻 尿 酸 實 驗 操 作 條 件 控 制 在 壓 力 為 10 psi 液 相 流 速 為 75 ml/min 從 Table 1 可 以 看 出 : 在 ph 6.8 下, 有 12% 的 玻 尿 酸 可 通 過 100 kda 的 濾 膜,100 kda 的 濾 膜 無 法 完 全 回 收 1,100 kda 的 玻 尿 酸 分 子 之 原 因 可 能 在 於 玻 尿 酸 為 一 線 性 高 分 子, 在 超 過 濾 操 作 下, 容 易 被 拉 伸 成 線 性, 因 而 通 過 100 kda 的 濾 膜 為 了 減 少 玻 尿 酸 的 損 失, 本 研 究 將 醱 酵 液 ph 調 整 為 2.5, 以 便 增 加 玻 尿 酸 分 子 間 作 用 力, 彼 此 之 間 較 為 聚 集 而 形 成 一 較 為 剛 性 的 高 分 子 超 過 濾 回 收 的 實 驗 結 果 發 現, 在 ph 2.5 的 條 件 下 玻 尿 酸 的 損 失 約 只 有 4%, 但 殘 留 在 濾 膜 的 玻 尿 酸 卻 增 加 了, 亦 即 濃 度 極 化 效 應 較 為 明 顯 雖 然 在 ph 2.5 下, 玻 尿 酸 的 損 失 明 顯 減 少 ; 但 濃 度 極 化 效 應 卻 明 顯 地 降 低 濾 速, 濃 縮 時 間 比 ph 6.8 的
以 兩 相 流 動 提 高 超 過 濾 濃 縮 醱 酵 液 玻 尿 酸 之 回 收 率 85 操 作 條 件 多 了 200 min 為 改 善 此 嚴 重 的 極 化 現 象, 本 研 究 擬 進 一 步 探 討 以 氣 液 兩 相 流 動 超 過 濾, 降 低 極 化 現 象 的 可 行 性 Table 1 ph 值 對 超 過 濾 回 收 玻 尿 酸 之 影 響 ph HA (g) Filtrate Recovered Fouled Loss 6.8 0.42 0.056 g 0.21 g 0.16 g 12% 2.5 0.42 g 0.19 g 0.22 g 4% Fig. 2 顯 示 在 不 同 透 膜 壓 力 下, 進 行 單 一 路 徑 流 向 的 濾 出 液 通 量 可 以 發 現 : 透 膜 壓 力 愈 大, 濾 出 液 通 量 也 隨 之 增 加, 然 而 當 壓 力 達 到 30 psi 後, 濾 出 液 通 量 已 接 近 最 大 值, 因 此 後 續 的 實 驗 皆 於 30 psi 的 壓 力 下 進 行 由 此 圖 亦 可 看 出 : 隨 著 時 間 增 加, 濾 速 逐 漸 下 降, 尤 其 以 前 20 分 鐘 最 為 明 顯, 之 後 逐 漸 緩 和, 這 是 由 於 玻 尿 酸 會 附 在 膜 上 而 造 成 薄 膜 阻 塞, 使 得 過 濾 阻 力 上 升, 而 隨 著 時 間 操 作, 膜 上 的 玻 尿 酸 濃 度 增 加, 於 是 造 成 逆 向 擴 散 的 情 形 發 生, 隨 後 溶 質 再 對 流 於 溶 液 中, 達 到 一 穩 定 值 於 是 後 續 的 實 驗, 均 將 透 膜 壓 力 固 定 在 30 psi, 操 作 時 間 為 100 min J v (m 3 /m 2 h) 0.002 0 20 40 60 80 100 120 Fig. 2 不 同 透 膜 壓 力 對 濾 出 液 通 量 的 影 響 兩 相 流 動 過 濾 系 統 之 原 理 在 於 藉 由 注 入 空 氣 造 成 邊 界 層 擾 動, 降 低 極 化 層 的 現 象 研 究 首 先 將 薄 膜 與 桌 面 垂 直 的 角 度 調 整 為 90 [13], 如 Fig. 3 所 示, 箭 頭 指 向 為 流 體 流 動 方 向 操 作 條 件 為 : 透 膜 壓 力 30 psi 液 相 流 速 35 ml/min 氣 相 流 速 30 ml/min 注 入 因 子 為 0.46 然 而 實 驗 發 現 導 入 的 空 氣 易 受 到 管 壁 的 阻 礙, 而 降 低 氣 體 的 流 速, 且 渠 道 的 寬 度 為 1.2 cm, 高 度 為 0.5 cm, 但 注 入 空 氣 與 醱 酵 液 的 管 徑 卻 只 有 0.3 cm, 相 形 之 下, 氣 泡 更 顯 微 小, 不 易 壓 縮 邊 界 層
86 蘇 芳 儀 陳 樹 人 θ = 180 ο θ = 90 ο Fig. 3 θ = 45 ο 不 同 角 度 的 模 組 操 作 示 意 圖 因 此, 吾 人 欲 利 用 空 氣 向 上 的 浮 力 及 液 體 向 下 之 重 力, 使 得 導 入 模 組 的 氣 泡 可 以 壓 縮 邊 界 層 ; 於 是 在 將 同 的 操 作 條 件 下, 將 模 組 旋 轉 45 及 180 結 果 發 現 氣 泡 大 小 明 顯 增 大, 而 模 組 偏 轉 180 度 的 氣 泡 幾 乎 占 據 整 個 模 組, 如 Fig. 4 所 示 這 是 因 為 當 模 組 偏 轉 之 後, 注 入 的 空 氣 會 受 到 斜 放 或 平 放 模 組 底 部 的 阻 力, 使 得 原 本 可 以 快 速 進 入 模 組 的 空 氣 在 進 口 端 聚 集, 於 是 得 到 形 狀 較 大 的 氣 泡 θ = 90 o θ = 45 o θ = 180 o Fig. 4 不 同 角 度 模 組 的 氣 泡 型 態 比 較 在 不 同 模 組 操 作 方 式 下 的 濾 出 液 通 量 可 以 看 出 (Fig. 5), 模 組 角 度 旋 轉 180 可 顯 著 提 高 濾 出 液 通 量, 由 氣 泡 的 類 型 判 斷 taylor bubble 的 形 成 可 能 是 提 高 濾 速 的 關 鍵 條 件 研 究 進 一 步 探 討 導 入 氣 體 流 率 比 例 對 於 濾 出 液 通 量 之 影 響 由 Fig. 6 可 發 現, 在 相 同 的 液 體 流 速 35 ml/min, 導 入 空 氣 10 ml/min( 注 入 因 子 為 0.22), 其 效 果 反 而 比 不 通 氣 來 的 差 由 實 驗 觀 察, 此 時 由 於 氣 體 流 速 較 慢, 所 以 容 易 堆 積 在 模 組 內, 氣 泡 流 動 不 易, 且 氣 泡 直 徑 約 0.5 cm, 均 勻 分 散 於 渠 道 中 此 時 氣 泡 的 存 在, 反 而 降 低 了 液 體 過 濾 的 有 效 面 積 而 注 入 因 子 為 046 的 操 作 則 有 較 明 顯 的 氣 泡 擾 亂 邊 界 層, 濾 出 液 通 量 也 略 有 提 高 0.018 J v (m 3 /m 2 h) 0.002 0 20 40 60 80 100 120 Fig. 5 不 同 角 度 模 組, 通 透 量 與 時 間 關 係 圖 模 組 角 度 :( ) 90 ( ) 45 ( ) 180
以 兩 相 流 動 提 高 超 過 濾 濃 縮 醱 酵 液 玻 尿 酸 之 回 收 率 87 0.018 J v (m 3 /m 2 h) 0.002 0 20 40 60 80 100 Fig. 6 注 入 因 子 對 濾 出 液 通 量 的 影 響 注 入 因 子 :( ) 0 ( ) 0.22 ( ) 0.36 ( ) 0.46 固 定 注 入 因 子, 同 時 增 加 氣 液 兩 相 的 流 速 的 實 驗 結 果 顯 示 於 Fig. 7 比 較 不 同 氣 液 流 速 以 及 單 相 流 動 超 過 濾, 發 現 固 定 注 入 因 子 而 同 時 提 高 氣 液 兩 相 流 速, 濾 速 並 沒 有 因 此 而 有 顯 著 的 增 加 觀 察 此 時 的 氣 泡 型 態, 若 液 相 流 速 75 ml/min, 氣 相 流 速 65 ml/min, 此 時 氣 泡 大 約 形 成 直 徑 0.5 cm 的 大 小, 均 勻 且 分 散 於 整 個 模 組 內, 主 要 是 因 為 氣 泡 是 藉 由 液 相 帶 入 模 組, 所 以 當 液 相 流 速 增 加, 氣 泡 也 會 隨 之 快 速 進 入 模 組, 所 以 不 容 易 聚 集 成 較 大 顆 的 氣 泡 型 態 ; 而 液 相 流 速 35 ml/min, 氣 相 流 速 30 ml/min, 其 氣 泡 則 是 以 更 大 顆 的 子 彈 型 均 勻 分 布 於 模 組 內 由 此 數 據 可 更 進 一 步 證 明 : 氣 泡 形 態 才 是 增 進 濾 速 的 主 因, 並 以 形 成 子 彈 型 的 Taylor bubble 造 成 管 壁 的 剪 應 力 影 響 較 大 4. 結 論 在 中 性 環 境 裡, 玻 尿 酸 的 線 性 結 構 較 為 鬆 散, 若 直 接 利 用 100 kda 的 超 濾 膜 濃 縮 回 收, 則 會 有 12% 的 損 失 如 果 將 醱 酵 液 調 為 ph 2.5, 則 玻 尿 酸 分 子 彼 此 之 間 較 為 聚 集, 不 易 因 被 拉 伸 而 通 過 濾 膜, 回 收 率 僅 有 4% 在 超 過 濾 系 統 中,pH 2.5 的 玻 尿 酸 聚 集 於 薄 膜 表 面, 造 成 極 化 現 象, 使 得 濾 速 明 顯 降 低, 即 使 通 入 約 與 液 相 體 積 流 速 相 當 的 空 氣 流 速, 亦 無 法 擾 亂 邊 界 層 若 使 用 兩 相 流 動 超 過 濾 系 統 中, 藉 由 調 整 操 作 模 組 的 角 度, 可 利 用 氣 體 向 上 之 浮 力 與 液 體 向 下 之 重 力, 通 入 的 空 氣 可 聚 集 形 成 Taylor bubble, 壓 縮 邊 界 層, 通 透 量 可 提 高 13% 由 此 可 知, 以 兩 相 流 動 超 過 濾 系 統 濃 縮 醱 酵 液 玻 尿 酸 時, 有 助 於 形 成 Taylor bubble 的 操 作 條 件, 可 有 效 地 降 低 濃 度 極 化 現 象, 提 高 產 物 的 回 收 率
88 蘇 芳 儀 陳 樹 人 0.018 J v (m 3 /m 2 h) 0 20 40 60 80 100 Fig. 7 不 同 氣 體 流 速 對 濾 出 液 通 量 的 影 響 ( ) 液 相 流 速 35 ml/min, 未 通 氣 ;( ) 液 相 流 速 75 ml/min, 氣 相 流 速 65 ml/min;( ) 液 相 流 速 35 ml/min, 氣 相 流 速 30 ml/min 參 考 文 獻 [1] K. Meyer and J. W. Palmer, The polysaccharide of the vitreous humor, J. Biol. Chem., 107, 629-634 (1934). [2] K. Meyer and J. W. Palmer, On glycoproteins: II. The polysaccharides of vitreous humor and of umbilical cord, J. Biol. Chem., 114, 689-703 (1936). [3] K. Meyer, E. M. Smyth, and M. H. Dawson, The isolation of a mucopolysaccharide from synovial fluid, J. Biol. Chem., 128, 319-327 (1939). [4] K. Meyer and E. Chaffee, The mucopolysaccharides of skin, J. Biol. Chem., 138, 491-499 (1941). [5] N. F. Boas, Isolation of hyaluronic acid from the cock's comb, J. Biol. Chem., 186, 573-575 (1950). [6] Kendall, F. E., M. Heidelberger, and M. H. Dawson, A serologically inactive polysaccharide elaborated by mucoid strains of group A hemolytic streptococcus, J. Biol. Chem., 118, 61-69 (1937). [7] T. J Liesegang, Viscoelastic substance in ophthalmology, Survey Ophthalmol., 34, 268-293 (1990). [8] I. F. Radaeva, G. A. Kostina, and A. V. Zmievskii, Hyaluronic acid: biological role, structure, synthesis, isolation, purification, and applications, Appl. Biochem. Microbiol., 33, 111-115 (1997). [9] L. Lapčik Jr, L. Lapčik,, S. De Smedt, J. Demeester, and P. Chabreček, Hyaluronan: preparation, structure, properties, and applications, Chem. Rev., 8, 2663-2684 (1998). [10] B. Fong Chong, L. M. Blank, R. Mclaughlin, and L. K. Nielsen, Microbial hyaluronic acid production, Appl. Microbiol. Biotechnol., 66, 341-351 (2005). [11] Kakehi, K., M. Kinoshita, and S.-I. Yasueda, Hyaluronic acid: separation and biological implications, J. Chromatogr. B, 797, 347-355 (2003). [12] T. Bitter and H. M. Muir, A modified Uronic acid carbazole reation, Anal. Biochem. 4, 330-334 (1962). [13] T.-W. Cheng, H.-M. Yeh, and J.-H. Wu, Effects of gas slugs and inclination angle on the ultrafiltration flux in tubular membrane module, J. Membr. Sci. 158, 223-234 (1999).