细菌类

胶 体 金 的 制 备 及 其 应 用 胶 体 金 溶 液 是 指 分 散 相 粒 子 直 径 在 l 150 nm 之 间 的 金 溶 胶, 属 于 多 相 不 均 匀 体 系, 颜 色 呈 桔 红 色 到 紫 红 色. 胶 体 金 作 为 标 记 物 用 于 免 疫 组 织 化 学 始 于 1971 年,Faulk 等 应 用 电 镜 免 疫 胶 体 金 染 色 法 (IGS) 观 察 沙 门 氏 菌, 此 后 他 们 把 胶 体 金 与 多 种 蛋 白 质 结 合.1974 年 Romano 等 将 胶 体 金 标 记 在 第 二 抗 体 ( 马 抗 人 IgG) 上, 建 立 了 间 接 免 疫 胶 体 金 染 色 法 1978 年 geoghega 发 现 了 胶 体 金 标 记 物 在 光 镜 水 平 的 应 用 胶 体 金 在 免 疫 化 学 中 的 这 种 应 用, 又 被 称 为 免 疫 金. 之 后, 许 多 学 者 进 一 步 证 实 胶 体 金 能 稳 定 又 迅 速 地 吸 附 蛋 白 质, 而 蛋 白 质 的 生 物 活 性 无 明 显 改 变. 它 可 以 作 为 探 针 进 行 细 胞 表 面 和 细 胞 内 多 糖 蛋 白 质 多 肤 抗 原 激 素 核 酸 等 生 物 大 分 子 的 精 确 定 位, 也 可 以 用 于 日 常 的 免 疫 诊 断, 进 行 免 疫 组 织 化 学 定 位, 因 而 在 临 床 诊 断 及 药 物 检 测 等 方 面 的 应 用 已 受 到 广 泛 的 重 视. 目 前 电 镜 水 平 的 免 疫 金 染 色 (IGS), 光 镜 水 平 的 免 疫 金 银 染 色 (IGSS), 以 及 肉 眼 水 平 的 斑 点 免 疫 金 染 色 技 术 日 益 成 为 科 学 研 究 和 临 床 诊 断 的 有 力 工 具. 一 免 疫 胶 体 金 技 术 的 基 本 原 理 氯 金 酸 (HAuCl4) 在 还 原 剂 作 用 下, 可 聚 合 成 一 定 大 小 的 金 颗 粒, 形 成 带 负 电 的 疏 水 胶 溶 液 由 于 静 电 作 用 而 成 为 稳 定 的 胶 体 状 态, 故 称 胶 体 金 胶 体 金 颗 粒 由 一 个 基 础 金 核 ( 原 子 金 Au) 及 包 围 在 外 的 双 离 子 层 构 成, 紧 连 在 金 核 表 面 的 是 内 层 负 离 子 (AuC12-), 外 层 离 子 层 H+ 则 分 散 在 胶 体 间 溶 液 中, 以 维 持 胶 体 金 游 离 于 溶 胶 间 的 悬 液 状 态 胶 体 金 颗 粒 的 基 础 金 核 并 非 是 理 想 的 圆 球 核, 较 小 的 胶 体 金 颗 粒 基 本 是 圆 球 形 的, 较 大 的 胶 体 金 颗 粒 ( 一 般 指 大 于 30nm 以 上 的 ) 多 呈 椭 圆 形 在 电 子 显 微 镜 下 可 观 察 胶 体 金 的 颗 粒 形 态 胶 体 金 标 记, 实 质 上 是 蛋 白 质 等 高 分 子 被 吸 附 到 胶 体 金 颗 粒 表 面 的 包 被 过 程 吸 附 机 理 可 能 是 胶 体 金 颗 粒 表 面 负 电 荷, 与 蛋 白 质 的 正 电 荷 基 团 因 静 电 吸 附 而 形 成 牢 固 结 合 用 还 原 法 可 以 方 便 地 从 氯 金 酸 制 备 各 种 不 同 粒 径 也 就 是 不 同 颜 色 的 胶 体 金 颗 粒 这 种 球 形 的 粒 子 对 蛋 白 质 有 很 强 的 吸 附 功 能, 可 以 与 葡 萄 球 菌 A 蛋 白 免 疫 球 蛋 白 毒 素 糖 蛋 白 酶 抗 生 素 激 素 牛 血 清 白 蛋 白 多 肽 缀 合 物 等 非 共 价 结 合, 因 而 在 基 础 研 究 和 临 床 实 验 中 成 为 非 常 有 用 的 工 具 免 疫 金 标 记 技 术 (Immunogold labelling techique) 主 要 利 用 了 金 颗 粒 具 有 高 电 子 密 度 的 特 性, 在 金 标 蛋 白 结 合 处, 在 显 微 镜 下 可 见 黑 褐 色 颗 粒, 当 这 些 标 记 物 在 相 应 的 配 体 处 大 量 聚 集 时, 肉 眼 可 见 红 色 或 粉 红 色 斑 点, 因 而 用 于 定 性 或 半 定 量 的 快 速 免 疫 检 测 方 法 中, 这 一 反 应 也 可 以 通 过 银 颗 粒 的 沉 积 被 放 大, 称 之 为 免 疫 金 银 染 色 二 胶 体 金 的 特 性 热 线 电 话 :021-6485 8053 8009881995 E-mail:master@shinegene.org.cn 网 址 :www.shinegene.org.cn 1

1 胶 体 性 质 胶 体 金 颗 粒 大 小 多 在 1~100nm, 微 小 金 颗 粒 稳 定 地 均 匀 地 呈 单 一 分 散 状 态 悬 浮 在 液 体 中, 成 为 胶 体 金 溶 液 胶 体 金 因 而 具 有 胶 体 的 多 种 特 性, 特 别 是 对 电 解 质 的 敏 感 性 电 解 质 能 破 坏 胶 体 金 颗 粒 的 外 周 永 水 化 层, 从 而 打 破 胶 体 的 稳 定 状 态, 使 分 散 的 单 一 金 颗 粒 凝 聚 成 大 颗 粒, 而 从 液 体 中 沉 淀 下 来 某 些 蛋 白 质 等 大 分 子 物 质 有 保 护 胶 体 金 加 强 其 稳 定 性 的 作 用 2 呈 色 性 微 小 颗 粒 胶 体 呈 红 色, 但 不 同 大 小 的 胶 体 呈 色 有 一 定 的 差 别 最 小 的 胶 体 金 (2~5nm) 是 橙 黄 色 的, 中 等 大 小 的 胶 体 金 (10~20nm) 是 酒 红 色 的, 较 大 颗 粒 的 胶 体 金 (30~80nm) 则 是 紫 红 色 的 根 据 这 一 特 点, 用 肉 眼 观 察 胶 体 金 的 颜 色 可 粗 略 估 计 金 颗 粒 的 大 小 3. 近 10 多 年 来 胶 体 金 标 记 已 经 发 展 为 一 项 重 要 的 免 疫 标 记 技 术. 胶 体 金 免 疫 分 析 在 药 物 检 测 生 物 医 学 等 许 多 领 域 的 研 究 已 经 得 到 发 展, 并 越 来 越 受 到 相 关 研 究 领 域 的 重 视. 光 吸 收 性 胶 体 金 在 可 见 光 范 围 内 有 一 单 一 光 吸 收 峰, 这 个 光 吸 收 峰 的 波 长 (λmax) 在 510~550nm 范 围 内, 随 胶 体 金 颗 粒 大 小 而 变 化, 大 颗 粒 胶 体 金 的 λmax 偏 向 长 波 长, 反 之, 小 颗 粒 胶 体 金 的 λmax 则 偏 于 短 波 长 3 胶 体 金 的 稳 定 性 及 免 疫 胶 体 金 的 贮 存 胶 体 金 具 有 很 高 的 动 力 学 稳 定 性, 在 稳 定 因 素 不 受 破 坏 时 自 身 凝 聚 极 慢, 可 放 置 数 年 不 发 生 凝 聚 影 响 稳 定 的 因 素 主 要 有 电 解 质 溶 胶 浓 度 温 度 非 电 解 质 等 金 溶 胶 必 须 有 少 量 电 解 质 作 稳 定 剂, 但 浓 度 不 宜 过 高 高 浓 度 亲 水 性 非 电 解 质 能 剥 去 胶 粒 外 面 的 水 化 膜 使 其 凝 聚 少 量 的 高 分 子 物 质 促 使 溶 胶 凝 聚, 但 一 定 量 的 高 分 子 物 质 反 而 可 增 加 溶 胶 稳 定 性, 如 蛋 白 质 葡 萄 糖 PEG20000 等 的 加 入 有 良 好 的 稳 定 效 果 当 金 溶 胶 吸 附 蛋 白 质 后, 溶 胶 的 稳 定 性 随 溶 液 ph 而 变 化, 而 这 种 变 化 又 取 决 于 吸 附 蛋 白 质 的 等 电 点, 如 ConA, 过 氧 化 物 酶 等, 当 ph 较 低 时 保 持 稳 定, 提 高 ph 则 显 得 不 稳 定, 接 近 等 电 点 或 略 高 时 又 变 得 稳 定 了 标 记 后 的 胶 体 金 溶 液 可 用 0.2~ 0.5mg/ml PEG20000 作 为 稳 定 剂 在 4~10 贮 存 数 月 有 效, 不 宜 冰 冻 贮 存 中 可 能 会 发 生 程 度 不 同 的 凝 聚, 可 离 心 除 去 三 胶 体 金 的 制 备 方 法 胶 体 金 的 制 备 一 般 采 用 还 原 法, 常 用 的 还 原 剂 有 柠 檬 酸 钠 鞣 酸 抗 坏 血 酸 白 磷 硼 氢 化 钠 等 下 面 介 绍 最 常 用 的 制 备 方 法 及 注 意 事 项 1 玻 璃 容 器 的 清 洁 : 玻 璃 表 面 少 量 的 污 染 会 干 扰 胶 体 金 颗 粒 的 生 成, 一 切 玻 璃 容 器 应 绝 对 清 洁, 用 前 经 过 酸 洗 硅 化 硅 化 过 程 一 般 是 将 玻 璃 容 器 浸 泡 于 5% 二 氯 二 甲 硅 烷 的 氯 仿 溶 液 中 1 分 钟, 室 温 干 燥 热 线 电 话 :021-6485 8053 8009881995 E-mail:master@shinegene.org.cn 网 址 :www.shinegene.org.cn 2

后 蒸 馏 水 冲 洗, 再 干 燥 备 用 专 用 的 清 洁 器 皿 以 第 一 次 生 成 的 胶 体 金 稳 定 其 表 面, 弃 去 后 以 双 蒸 馏 水 淋 洗, 可 代 替 硅 化 处 理 2 试 剂 水 质 和 环 境 : 氯 金 酸 极 易 吸 潮, 对 金 属 有 强 烈 的 腐 蚀 性, 不 能 使 用 金 属 药 匙, 避 免 接 触 天 平 称 盘 其 1% 水 溶 液 在 4 可 稳 定 数 月 不 变 实 验 用 水 一 般 用 双 蒸 馏 水 实 验 室 中 的 尘 粒 要 尽 量 减 少, 否 则 实 验 的 结 果 将 缺 乏 重 复 性 金 颗 粒 容 易 吸 附 于 电 极 上 使 之 堵 塞, 故 不 能 用 ph 电 极 测 定 金 溶 液 的 ph 值 为 了 使 溶 液 ph 值 不 发 生 改 变, 应 选 用 缓 冲 容 量 足 够 大 的 缓 冲 系 统, 一 般 采 用 柠 檬 酸 磷 酸 盐 (ph3~5.8) Tris-HCL (ph5.8~8.3) 和 硼 酸 氢 氧 化 钠 (ph8.5~10.3) 等 缓 冲 系 统 但 应 注 意 不 应 使 缓 冲 液 浓 度 过 高 而 使 金 溶 胶 自 凝 3 柠 檬 酸 三 钠 还 原 法 制 备 金 溶 胶 : 取 0.01% 氯 金 酸 水 溶 液 100ml 加 热 至 沸, 搅 动 下 准 确 加 入 1% 柠 檬 酸 三 钠 水 溶 液 0.7ml, 金 黄 色 的 氯 金 酸 水 溶 液 在 2 分 钟 内 变 为 紫 红 色, 继 续 煮 沸 15 分 钟, 冷 却 后 以 蒸 馏 水 恢 复 到 原 体 积, 如 此 制 备 的 金 溶 胶 其 可 见 光 区 最 高 吸 收 峰 在 535nm,A1cm/535=1.12 金 溶 胶 的 光 散 射 性 与 溶 胶 颗 粒 的 大 小 密 切 相 关, 一 旦 颗 粒 大 小 发 生 变 化, 光 散 射 也 随 之 发 生 变 异, 产 生 肉 眼 可 见 的 显 著 的 颜 色 变 化, 这 就 是 金 溶 胶 用 于 免 疫 沉 淀 或 称 免 疫 凝 集 试 验 的 基 础 金 溶 胶 颗 粒 的 直 径 和 制 备 时 加 入 的 柠 檬 酸 三 钠 量 是 密 切 相 关 的, 保 持 其 他 条 件 恒 定, 仅 改 变 加 入 的 柠 檬 酸 三 钠 量, 可 制 得 不 同 颜 色 的 金 溶 胶, 也 就 是 不 同 粒 径 的 金 溶 胶, 见 附 表 表 1 四 种 粒 径 胶 体 金 的 制 备 及 特 性 胶 体 金 粒 径 1% 柠 檬 酸 三 钠 胶 体 金 特 性 (nm) 加 入 量 (ml)* 呈 色 λmax 16 2.00 橙 色 518nm 24.5 1.50 橙 红 522nm 41 1.00 红 色 525nm 71.5 0.70 紫 色 535nm 4 柠 檬 酸 三 钠 - 鞣 酸 混 合 还 原 剂 : 热 线 电 话 :021-6485 8053 8009881995 E-mail:master@shinegene.org.cn 网 址 :www.shinegene.org.cn 3

用 此 混 合 还 原 剂 可 以 得 到 比 较 满 意 的 金 溶 胶, 操 作 方 法 如 下 : 取 4ml1% 柠 檬 酸 三 钠 (Na3C6H5O7.2H2O), 加 入 0~5ml1% 鞣 酸,0~5ml 25mmo/L K2CO2( 体 积 与 鞣 酸 加 入 量 相 等 ), 以 双 蒸 馏 水 补 至 溶 液 最 终 体 积 为 20ml, 加 热 至 60 取 1ml1% 的 HAuCl4, 加 于 79ml 双 蒸 馏 水 中, 水 浴 加 热 至 60, 然 后 迅 速 将 上 述 柠 檬 酸 - 鞣 酸 溶 液 加 入, 于 此 温 度 下 保 持 一 定 时 间, 待 溶 液 颜 色 变 成 深 红 色 ( 约 需 0.5~1 小 时 ) 后, 将 溶 液 加 热 至 沸 腾, 保 持 沸 腾 5 分 钟 即 可 改 变 鞣 酸 的 加 入 量, 制 得 的 胶 体 颗 粒 大 小 不 同 5 白 磷 还 原 法 : 在 120ml 双 蒸 馏 水 中 加 入 1.5ml1% 氯 金 酸 和 1.4ml 0.1mol/L K2CO3, 然 后 加 入 1ml 五 分 之 一 饱 和 度 的 白 磷 乙 醚 溶 液, 混 匀 后 室 温 放 置 15 分 钟, 在 回 流 下 煮 沸 直 至 红 褐 色 转 变 为 红 色 此 法 制 得 的 胶 体 金 直 径 约 6nm, 并 有 很 好 的 均 匀 度, 但 白 磷 和 乙 醚 均 易 燃 易 爆, 一 般 实 验 室 不 宜 采 用 要 得 到 大 小 更 均 匀 的 胶 体 金 颗 粒, 可 采 用 甘 油 或 蔗 糖 密 度 梯 度 离 心, 经 分 级 后 制 得 胶 体 金 颗 粒 直 径 的 变 异 系 数 (CV) 可 小 于 15% 四 胶 体 金 的 鉴 定 胶 体 金 的 制 备 并 不 难, 但 要 制 好 高 质 量 的 胶 体 金 却 也 并 非 易 事 因 此 对 每 次 制 好 的 胶 体 金 应 加 以 检 定, 主 要 检 查 指 标 有 颗 粒 大 小, 粒 径 的 均 一 程 度 及 有 无 凝 集 颗 粒 等 肉 眼 观 察 是 最 基 本 也 是 最 简 单 和 方 便 的 检 定 方 法, 但 需 要 一 定 的 经 验 良 好 的 胶 体 金 应 该 是 清 亮 透 明 的, 若 制 备 的 胶 体 金 混 浊 或 液 体 表 面 有 漂 浮 物, 提 示 此 次 制 备 的 胶 体 金 有 较 多 的 凝 集 颗 粒 在 日 光 下 仔 细 观 察 比 较 胶 体 金 的 颜 色, 可 以 粗 略 估 计 制 得 的 金 颗 粒 的 大 小 当 然 也 可 用 分 光 光 度 计 扫 描 λmax 来 估 计 金 颗 粒 的 粒 径 结 制 备 的 胶 体 金 最 好 作 电 镜 观 察, 并 选 一 些 代 表 性 的 作 显 微 摄 影, 可 以 比 较 精 确 地 测 定 胶 体 金 的 平 均 粒 径 五 免 疫 胶 体 金 制 备 1 蛋 白 质 的 处 理 : 由 于 盐 类 成 分 能 影 响 金 溶 胶 对 蛋 白 质 的 吸 附, 并 可 使 溶 胶 聚 沉, 故 致 敏 前 应 先 对 低 离 子 强 度 的 水 透 析 必 须 注 意, 蛋 白 质 溶 液 应 绝 对 澄 清 无 细 小 微 粒, 否 则 应 先 用 微 孔 滤 膜 或 超 速 离 心 除 去 一 般 情 况 下 应 避 免 磷 酸 根 离 子 和 硼 酸 根 离 子 的 存 在, 因 为 它 们 都 可 吸 附 于 颗 粒 表 面 而 减 弱 胶 体 金 对 蛋 白 质 的 吸 附 2 蛋 白 质 最 适 用 量 的 选 择 : 将 待 标 记 的 蛋 白 质 储 存 液 作 系 列 稀 释 后, 分 别 取 0.1ml( 含 蛋 白 质 5~40ug) 加 到 1ml 胶 体 金 溶 液 中, 另 设 一 管 不 加 蛋 白 质 的 对 照 管,5 分 钟 后 加 入 0.1ml 10% 热 线 电 话 :021-6485 8053 8009881995 E-mail:master@shinegene.org.cn 网 址 :www.shinegene.org.cn 4

NaCl 溶 液, 混 匀 后 静 置 2 小 时, 不 稳 定 的 金 溶 胶 将 发 生 聚 沉, 能 使 胶 体 金 稳 定 的 最 适 蛋 白 量 再 加 10% 即 为 最 佳 标 记 蛋 白 量 3 标 记 : 在 接 近 并 略 为 高 于 蛋 白 质 等 电 点 的 条 件 下 标 记 是 比 较 合 适 的, 在 此 情 况 下 蛋 白 质 分 子 在 金 颗 粒 表 面 的 吸 附 量 最 大 下 述 标 记 步 骤 最 为 常 见 : 1 用 0.1mol/L K2CO3 或 0.1mol/L HCl 调 节 金 溶 胶 至 所 需 ph( 标 记 SPA 时 调 到 ph6.0) 2 于 100ml 金 溶 胶 中 加 入 最 佳 标 记 量 的 蛋 白 质 溶 液 ( 体 积 为 2~3ml), 搅 拌 2~3 分 钟 3 加 入 5ml1%PEG20000 溶 液 4 于 10000~100000g 离 心 30~60 分 钟 ( 根 据 粒 径 大 小 选 择 不 同 离 心 条 件 ), 小 心 吸 去 上 清 液 ( 切 忌 倾 倒 ) 5 将 沉 淀 悬 浮 于 一 定 体 积 含 0.2~0.5mg/ml PEG20000 的 缓 冲 液 中, 离 心 沉 淀 后, 再 用 同 一 缓 冲 液 恢 复, 浓 度 以 A1cm/540nm=1.5 左 右 为 宜, 以 0.5mg/ml 叠 氮 钠 防 腐, 置 4 保 存 6 包 被 后 的 金 溶 胶 也 可 浓 缩 后 于 Sephadex G-200 柱 进 行 凝 胶 层 析 分 离 纯 化, 以 含 0.1%B SA 的 缓 冲 溶 液 洗 脱 通 常 用 IgG 包 被 的 金 溶 胶 洗 脱 液 ph 为 8.2, 以 A 蛋 白 包 被 的 金 溶 胶 洗 脱 液 为 ph7.0 以 上 操 作 中 应 注 意, 一 切 溶 液 中 不 应 含 杂 质 微 粒, 可 用 高 速 离 心 或 微 孔 滤 膜 预 处 理 六 免 疫 胶 体 金 的 应 用 1 胶 体 金 在 电 镜 水 平 的 应 用 胶 体 金 应 用 电 镜 水 平 的 研 究 最 早, 发 展 最 快, 应 用 最 广 泛 其 最 大 优 点 是 可 以 通 过 应 用 不 同 大 小 的 颗 粒 或 结 合 酶 标 进 行 双 重 或 多 重 标 记 直 径 为 3~15nm 胶 体 金 均 可 用 作 电 镜 水 平 的 标 记 物 3~15nm 的 胶 体 金 多 用 于 单 一 抗 原 颗 粒 的 检 测, 而 直 径 15nm 多 用 于 检 测 量 较 多 的 感 染 细 胞 热 线 电 话 :021-6485 8053 8009881995 E-mail:master@shinegene.org.cn 网 址 :www.shinegene.org.cn 5

胶 体 金 用 于 电 镜 水 平 的 研 究, 主 要 包 括 :1 细 胞 悬 液 或 单 层 培 养 中 细 胞 表 面 抗 原 的 观 察 2 单 层 培 养 中 细 胞 内 抗 原 的 检 测 3 组 织 抗 原 的 检 测 金 标 记 在 电 镜 水 平 的 应 用, 主 要 方 法 包 括 : 包 埋 前 染 色 包 埋 后 染 色 免 疫 负 染 色 双 标 记 技 术 和 原 位 杂 交 技 术 等 实 验 证 明, 该 法 样 本 用 量 少 检 测 速 度 快 对 比 明 显 操 作 简 单 敏 感 性 和 特 异 性 高, 既 可 用 于 抗 原 检 测, 也 可 用 于 抗 体 检 测, 因 此, 可 同 时 适 用 于 科 研 和 诊 断 2 胶 体 金 在 光 镜 水 平 的 应 用 胶 体 金 同 样 可 用 做 光 镜 水 平 的 标 记 物, 取 代 传 统 的 荧 光 素 酶 等 各 种 细 胞 涂 片 切 片 均 可 应 用 主 要 用 于 :1 用 单 克 窿 抗 体 或 抗 血 清 检 测 细 胞 悬 液 或 培 养 的 单 层 细 胞 的 膜 表 面 抗 原 2 检 测 培 养 的 单 层 细 胞 胞 内 抗 原,3 组 织 中 或 亚 薄 切 片 中 抗 原 的 检 测 缺 点 胶 体 金 用 于 光 镜 水 平 的 研 究, 可 以 弥 补 其 它 标 记 物 不 可 避 免 的 本 底 过 高 和 内 部 酶 活 性 干 扰 等 3 胶 体 金 在 流 式 细 胞 仪 中 的 应 用 : 应 用 荧 光 素 标 记 的 抗 体, 通 过 流 式 细 胞 仪 计 数 分 析 细 胞 表 面 抗 原, 是 免 疫 学 研 究 中 的 重 要 技 术 之 一 但 由 于 不 同 荧 光 素 的 光 谱 相 互 重 叠, 区 分 不 同 的 标 记 困 难, 因 此 必 须 寻 找 一 种 非 荧 光 素 标 记 物, 用 于 流 式 细 胞 计 数 这 样 可 以 同 时 进 行 几 种 标 记 该 标 记 物 必 须 能 够 改 变 散 射 角, 胶 体 金 可 以 明 显 地 改 变 红 激 光 散 射 角, 因 而 可 以 作 为 流 式 细 胞 仪 的 标 记 物 之 一 4 凝 集 试 验 : 单 分 散 的 免 疫 金 溶 胶 呈 清 澈 透 明 的 溶 液, 其 颜 色 随 溶 胶 颗 粒 大 小 而 变 化, 当 与 相 应 抗 原 或 抗 体 发 生 专 一 性 反 应 后 出 现 凝 聚, 溶 胶 颗 粒 极 度 增 大, 光 散 射 随 之 发 生 变 化, 颗 粒 也 会 沉 降, 溶 液 的 颜 色 变 淡 甚 至 变 成 无 色, 这 一 原 理 可 定 性 或 定 量 地 应 用 于 免 疫 反 应 5 免 疫 印 迹 技 术 (immunoblotting): 免 疫 印 迹 是 一 种 较 新 的 免 疫 化 学 技 术 用 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 电 泳 将 蛋 白 质 分 离, 得 到 的 区 带 转 移 至 硝 酸 纤 维 素 膜, 然 后 用 酶 免 疫 法 ( 或 免 疫 荧 光 RI A) 进 行 定 量 热 线 电 话 :021-6485 8053 8009881995 E-mail:master@shinegene.org.cn 网 址 :www.shinegene.org.cn 6

免 疫 胶 体 金 也 可 用 于 该 法 的 定 量 转 移 后 的 硝 酸 纤 维 素 膜 与 某 特 异 性 的 抗 体 保 温 后, 再 与 经 葡 萄 球 菌 A 蛋 白 致 敏 的 胶 体 金 温 育, 彻 底 洗 去 多 余 的 胶 体 金, 根 据 膜 上 胶 体 金 颗 粒 颜 色 深 浅 可 测 知 样 品 中 的 特 异 性 抗 原 利 用 金 颗 粒 可 催 化 银 离 子 还 原 成 金 属 银 这 一 原 理, 采 用 银 显 影 剂 增 强 金 颗 粒 的 可 见 性, 更 可 大 大 提 高 测 定 灵 敏 度, 检 测 下 限 可 低 至 0.1ng, 这 种 免 疫 金 银 染 色 法 应 用 已 日 趋 广 泛 由 于 胶 体 金 免 疫 印 迹 技 术 简 便 快 速, 且 有 相 当 的 高 的 灵 敏 度, 在 临 床 免 疫 诊 断 上 有 很 大 的 应 用 潜 力 6 胶 体 金 在 肉 眼 水 平 的 应 用 胶 体 金 取 代 传 统 三 大 标 记 物, 用 于 肉 眼 水 平 的 免 疫 检 测 中 除 了 胶 体 金 本 身 具 有 的 特 点 外, 还 有 以 下 优 点 :1 试 剂 和 样 本 用 量 极 小, 样 本 量 可 低 至 1~2ul;2 不 需 γ- 计 数 器 荧 光 显 微 镜 酶 标 检 测 仪 等 贵 重 仪 器, 更 适 于 现 场 应 用 ; 3 没 有 诸 如 放 射 性 同 位 素 邻 苯 二 胺 等 有 害 物 质 参 与 ;4 实 验 结 果 可 以 长 期 保 存 ;5 时 间 大 大 缩 短, 提 高 了 检 测 速 度 金 标 过 程 中, 无 共 价 键 形 成, 是 一 定 离 子 浓 度 下 的 物 理 吸 附 因 此 几 乎 所 有 的 大 分 子 物 质 都 可 被 金 标 记, 标 记 后 大 分 子 物 质 活 性 不 发 生 改 变 实 验 结 果 表 明, 胶 体 金 的 敏 感 性 可 达 到 ELISA 的 水 平 而 结 合 银 染 色 时, 检 测 的 敏 感 性 更 大 大 提 高 七 胶 体 金 在 免 疫 层 析 快 速 诊 断 技 术 中 的 应 用 免 疫 层 析 法 (immunochromatography) 是 近 几 年 来 国 外 兴 起 的 一 种 快 速 诊 断 技 术, 其 原 理 是 将 特 异 的 抗 体 先 固 定 于 硝 酸 纤 维 素 膜 的 某 一 区 带, 当 该 干 燥 的 硝 酸 纤 维 素 一 端 浸 入 样 品 ( 尿 液 或 血 清 ) 后, 由 于 毛 细 管 作 用, 样 品 将 沿 着 该 膜 向 前 移 动, 当 移 动 至 固 定 有 抗 体 的 区 域 时, 样 品 中 相 应 的 抗 原 即 与 该 抗 体 发 生 特 异 性 结 合, 若 用 免 疫 胶 体 金 或 免 疫 酶 染 色 可 使 该 区 域 显 示 一 定 的 颜 色, 从 而 实 现 特 异 性 的 免 疫 诊 断 早 孕 诊 断 用 的 免 疫 层 析 试 纸 条 ( 通 常 又 叫 尿 妊 纸 条 ) 的 装 配 结 构 见 图 一 热 线 电 话 :021-6485 8053 8009881995 E-mail:master@shinegene.org.cn 网 址 :www.shinegene.org.cn 7

装 配 方 法 : 在 塑 料 底 板 上 分 别 将 吸 尿 用 玻 璃 纤 维 冻 干 金 标 记 抗 α-hcg 玻 璃 纤 维 已 固 定 有 抗 β-hcg 抗 体 的 NC 膜 及 硬 质 吸 水 滤 纸 按 图 装 配, 配 件 与 塑 料 底 板 的 结 合 可 用 双 面 胶 或 其 它 粘 性 材 料 粘 接 装 配 好 的 纸 板 按 纵 向 剪 切, 裁 成 宽 度 为 4mm 的 条 状, 即 为 尿 妊 用 纸 条 本 法 检 测 速 度 快, 一 般 一 两 分 钟 可 出 结 果 ; 灵 敏 度 高, 可 达 50IU/L; 好 的 试 纸 条 结 果 也 是 准 确 可 靠 的, 这 是 其 所 以 能 在 尿 妊 诊 断 中 得 到 广 泛 应 用 的 主 要 原 因 尿 妊 试 纸 条 的 快 速 特 性 来 源 于 胶 体 金 免 疫 层 析 法 的 固 有 特 性, 但 与 原 材 料 选 择 特 别 是 NC 膜 的 孔 径 大 小 密 切 相 关, 准 确 性 取 决 于 抗 β-hcg 的 特 异 性 金 标 尿 妊 纸 条 虽 然 好 用, 但 在 使 用 中 也 必 须 注 意 以 下 几 个 方 面 : 一 是 温 度, 试 纸 条 虽 然 可 在 室 温 保 存, 但 大 批 暂 时 不 用 的 试 纸 条 还 是 应 该 放 在 4 保 存, 以 免 抗 体 失 效, 从 冰 箱 刚 取 出 的 试 纸 条 则 应 待 其 恢 复 至 室 温, 然 后 才 打 开 密 封, 可 避 免 反 应 线 模 糊 不 清 二 是 正 确 操 作, 一 般 的 操 作 方 法 是 在 试 纸 条 的 吸 尿 玻 璃 端 滴 入 2 滴 ( 约 100 微 升 ) 尿 液, 或 将 吸 尿 端 直 接 插 入 标 本 中, 深 度 约 10~15 毫 米 20 秒, 取 出 后 平 放, 这 种 方 法 比 较 麻 烦 且 容 易 造 成 污 染 我 们 的 方 法 是 取 尿 标 本 约 0.5ml 加 入 小 试 管 中, 然 后 插 入 试 纸 条, 待 1~2 分 钟 反 应 带 清 晰 后 观 察 结 果 八 胶 体 金 在 快 速 斑 点 渗 滤 技 术 中 的 应 用 热 线 电 话 :021-6485 8053 8009881995 E-mail:master@shinegene.org.cn 网 址 :www.shinegene.org.cn 8

ELISA 法 在 临 床 实 验 室 已 得 到 普 遍 的 应 用, 特 别 是 用 于 各 型 肝 炎 标 志 物 的 检 测 但 EL ISA 法 由 于 操 作 程 序 复 杂, 时 间 较 长, 给 实 验 室 带 来 不 便 因 此 出 现 一 步 法 快 速 检 测 试 剂 盒, 虽 可 提 高 检 测 速 度, 但 有 出 现 假 阴 性 结 果 的 弊 端 ELISA 法 需 时 较 长 的 主 要 原 因, 是 由 于 液 相 中 的 抗 原 ( 或 抗 体 ) 需 经 扩 散 才 能 与 固 相 上 的 抗 原 或 抗 体 反 应 不 适 当 地 缩 短 反 应 时 间, 将 使 灵 敏 度 降 至 临 床 要 求 以 下 为 满 足 临 床 快 速 检 测 的 需 要, 近 年 来 发 展 了 多 种 简 便 快 速 的 免 疫 学 检 测 方 法, 快 速 斑 点 渗 滤 法 即 为 其 中 一 种, 其 标 记 物 质 用 胶 体 金 即 称 为 快 速 斑 点 免 疫 金 渗 滤 法 Dot-immunogold filtration assay), 又 称 滴 金 免 疫 法 快 速 斑 点 渗 滤 法 的 基 本 原 理 仍 是 间 接 法 或 夹 心 法 间 接 法 测 抗 体 : 固 定 于 膜 上 的 特 异 性 抗 原 + 标 本 中 的 相 应 抗 体 + 金 标 记 的 抗 抗 体 或 SPA 显 色 夹 心 法 测 抗 原 : 固 定 于 膜 上 的 多 克 隆 抗 体 + 标 本 中 待 测 抗 原 + 金 标 记 的 特 异 性 单 克 隆 抗 体 显 色 结 果 判 断 : 快 速 斑 点 免 疫 金 渗 滤 法 在 操 作 完 成 后 即 可 直 接 观 察 结 果 根 据 测 定 模 式 的 不 同 可 有 以 下 不 同 的 判 定 结 果 热 线 电 话 :021-6485 8053 8009881995 E-mail:master@shinegene.org.cn 网 址 :www.shinegene.org.cn 9

快 速 斑 点 免 疫 金 渗 滤 法 检 测 速 度 快, 结 果 观 察 一 目 了 然, 已 应 用 于 多 种 临 床 检 测 项 目 以 上 分 析 可 以 看 出, 胶 体 金 标 记 技 术 是 继 三 大 标 记 技 术 之 后, 又 一 较 为 成 熟 且 已 得 到 广 泛 应 用 的 免 疫 标 记 技 术 上 海 闪 晶 分 子 生 物 科 技 有 限 公 司 地 址 : 上 海 市 宜 山 路 705 号 B 座 18 楼 邮 编 :200233 联 系 : 市 场 部 电 话 :64858053 800-988-1995 E-mail:master@shinegene.org.cn 网 址 :www.shinegene.org.cn 热 线 电 话 :021-6485 8053 8009881995 E-mail:master@shinegene.org.cn 网 址 :www.shinegene.org.cn 10