2 目 录 试 验 项 目 : 淡 紫 拟 青 霉 FJAT-9041 生 物 肥 药 在 不 同 基 质 和 营 养 下 的 固 体 发 酵... 1 试 验 人 员 : 肖 马 云... 1 试 验 项 目 : 淡 紫 拟 青 霉 FJAT-9041 不 同 固 体 发 酵 载 体 的 筛 选.

1 福 建 省 生 物 农 药 工 程 研 究 中 心 福 建 省 农 业 生 物 药 物 工 程 技 术 研 究 中 心 编 号 :FJAT-1106-REP 主 编 : 刘 波 博 士 研 究 员 副 主 编 : 唐 建 阳 研 究 员 朱 育 菁 博 士 蓝 江 林 博 士 林 营 志 博 士 福 建 省 农 业 科 学 院 农 业 生 物 资 源 研 究 所 农 业 微 生 物 研 究 中 心 农 业 微 生 物 科 技 创 新 团 队 电 话 : 0591-87882571, 传 真 : 0591-87882571 2011 年 8 月 fjat.yzxz.com

2 目 录 试 验 项 目 : 淡 紫 拟 青 霉 FJAT-9041 生 物 肥 药 在 不 同 基 质 和 营 养 下 的 固 体 发 酵... 1 试 验 人 员 : 肖 马 云... 1 试 验 项 目 : 淡 紫 拟 青 霉 FJAT-9041 不 同 固 体 发 酵 载 体 的 筛 选... 5 试 验 人 员 : 肖 马 云... 5 试 验 项 目 : 淡 紫 拟 青 霉 FJAT-9041 在 不 同 处 理 香 蕉 根 基 土 壤 的 定 殖 动 态 ( 一 )... 11 试 验 人 员 : 肖 马 云... 11 试 验 项 目 : 淡 紫 拟 青 霉 FJAT-9041 在 不 同 处 理 香 蕉 根 基 土 壤 的 定 殖 动 态 ( 二 )...18 试 验 人 员 : 肖 马 云... 18 试 验 项 目 : 获 菌 量 为 60 毫 克 时 脂 肪 酸 检 测 及 结 果 分 析...25 试 验 人 员 : 王 子 旋... 25 试 验 项 目 : 获 菌 量 为 50 毫 克 时 脂 肪 酸 检 测 及 结 果 分 析...30 试 验 人 员 : 王 子 旋... 30 试 验 项 目 : 获 菌 量 为 40 毫 克 时 脂 肪 酸 检 测...34 试 验 人 员 : 王 子 旋... 34 试 验 项 目 : 河 南 土 壤 标 本 中 芽 孢 杆 菌 的 分 离 与 保 存 (13824-13849)...38 试 验 人 员 : 王 子 旋... 38 试 验 项 目 : 模 式 芽 胞 杆 菌 真 空 冷 冻 干 燥 保 存 (14201~14205)...47 试 验 人 员 : 王 子 旋 刘 国 红... 47 试 验 项 目 : 大 肠 杆 菌 荧 光 定 量 PCR 标 准 曲 线 的 制 备...53 试 验 人 员 : 刘 云 浩... 53 试 验 项 目 : 枯 草 芽 孢 杆 菌 荧 光 定 量 PCR 标 准 曲 线 的 制 备...62 试 验 人 员 : 刘 云 浩... 62 试 验 项 目 : 垫 料 中 所 分 离 的 益 生 菌 对 致 病 菌 的 抑 制 效 果 试 验 2...66 试 验 人 员 : 刘 云 浩... 66 试 验 项 目 : 葡 萄 球 菌 质 粒 标 准 品 的 制 作 和 荧 光 定 量 PCR 标 准 曲 线 的 制 备...74 试 验 人 员 : 刘 云 浩... 74 试 验 项 目 : 荧 光 定 量 PCR 测 定 枯 草 芽 孢 杆 菌 大 肠 杆 菌 葡 萄 球 菌 的 数 量 变 化... 80 试 验 人 员 : 刘 云 浩... 80 试 验 项 目 :Co 60 照 射 后 无 致 病 力 的 尖 孢 镰 刀 菌 菌 落 形 态 观 察 及 保 存...88 试 验 人 员 : 詹 洪... 88 试 验 项 目 : 从 三 种 不 同 植 株 上 分 离 到 的 真 菌 的 分 子 鉴 定...97 试 验 人 员 : 詹 洪... 97 试 验 项 目 : 漳 州 香 蕉 枯 萎 病 植 株 根 际 土 壤 中 芽 孢 杆 菌 的 分 离 与 保 存...103 试 验 人 员 : 詹 洪... 103 试 验 项 目 : 福 建 省 不 同 地 区 发 酵 床 垫 料 的 含 水 量 比 较...114 试 验 人 员 : 宋 泽 琼... 114 试 验 项 目 : 高 温 条 件 下 发 酵 床 的 微 生 物 生 物 量 的 测 定 ( 四 )...119 试 验 人 员 : 宋 泽 琼... 119 试 验 项 目 : 不 同 产 量 和 施 肥 方 式 下 葡 萄 的 CAT 酶 活 性 比 较... 123 试 验 人 员 : 宋 泽 琼... 123 试 验 项 目 : 宁 德 市 九 都 镇 示 范 点 水 质 中 的 细 菌 脂 肪 酸 鉴 定 ( 六 )...130 ( 编 号 12927-12932 13032)... 130

3 试 验 人 员 : 宋 泽 琼... 130 试 验 项 目 : 发 酵 床 养 猪 垫 料 的 酸 碱 度 与 电 导 率 的 测 定...136 试 验 人 员 : 宋 泽 琼... 136 试 验 项 目 : 灰 黄 霉 素 缩 甘 氨 酸 的 合 成 ( 二 )...144 试 验 人 员 : 于 晓 杰 李 智 聪 朱 育 菁... 144 试 验 项 目 : 灰 黄 霉 素 缩 甘 氨 酸 的 合 成 ( 三 )...155 试 验 人 员 : 于 晓 杰 李 智 聪 朱 育 菁... 155 试 验 项 目 : 灰 黄 霉 素 的 结 构 改 造 ( 九 ):5 - 氯 灰 黄 霉 素 的 合 成...161 试 验 人 员 : 于 晓 杰 李 智 聪 朱 育 菁... 161 试 验 项 目 : 灰 黄 霉 素 的 结 构 改 造 ( 十 ):5 - 醛 基 灰 黄 霉 素 的 还 原...167 试 验 人 员 : 于 晓 杰 李 智 聪 朱 育 菁... 167 试 验 项 目 : 灰 黄 霉 素 的 结 构 改 造 ( 十 一 ): 灰 黄 霉 素 缩 苯 基 氨 基 硫 脲 的 合 成...173 试 验 人 员 : 于 晓 杰 李 智 聪 朱 育 菁... 173 试 验 项 目 : 无 致 病 力 尖 孢 镰 刀 菌 FJAT-9290 在 番 茄 上 的 定 殖 特 性 研 究 ( 二 )...178 试 验 人 员 : 杨 莹 莹... 178 试 验 项 目 : 无 致 病 力 尖 孢 镰 刀 菌 FJAT-9290 在 香 蕉 上 的 定 殖 特 性 研 究 ( 三 )...185 试 验 人 员 : 杨 莹 莹... 185 试 验 项 目 : 师 大 双 安 楼 紫 外 诱 变 青 枯 雷 尔 氏 菌 FJAT-1458 致 死 率...190 试 验 人 员 : 孙 大 光... 190 试 验 项 目 : 师 大 双 安 楼 紫 外 诱 变 青 枯 雷 尔 氏 菌 FJAT-1458 效 果...195 试 验 人 员 : 孙 大 光... 195 试 验 项 目 : 师 大 双 安 楼 紫 外 诱 变 青 枯 雷 尔 氏 菌 FJAT-91 效 果...200 试 验 人 员 : 孙 大 光... 200 试 验 项 目 : 师 大 双 安 楼 紫 外 诱 变 青 枯 雷 尔 氏 菌 FJAT-91 致 死 率 摸 索...204 试 验 人 员 : 孙 大 光... 204 试 验 项 目 : 青 枯 雷 尔 氏 菌 transposase 验 证 (RS982695)... 209 试 验 人 员 : 林 海 云... 209 试 验 项 目 : 青 枯 雷 尔 氏 菌 peptidase U35 phage prohead HK97 验 证 (RS983416)...219 试 验 人 员 : 林 海 云... 219 试 验 项 目 : 青 枯 雷 尔 氏 菌 bacteriophage protein GP46 验 证 (RS983442)... 229 试 验 人 员 : 林 海 云... 229 试 验 项 目 : 青 枯 雷 尔 氏 菌 Integrase catalytic region 验 证 (RS980089)... 239 试 验 人 员 : 林 海 云... 239 试 验 项 目 : 青 枯 雷 尔 氏 菌 DNA-dependent RNA polymerase 验 证 (RS980192)...249 试 验 人 员 : 林 海 云... 249 试 验 项 目 : 青 枯 雷 尔 氏 菌 HK97 family phage protein 验 证 (RS980373)...259 试 验 人 员 : 林 海 云... 259 试 验 项 目 : 青 枯 雷 尔 氏 菌 caudovirus prohead protease 验 证 (RS980384)... 269 试 验 人 员 : 林 海 云... 269 试 验 项 目 : 青 枯 雷 尔 氏 菌 hypothetical protein Bmul_0496 验 证 (RS980442)... 279 试 验 人 员 : 林 海 云... 279 试 验 项 目 : 青 枯 雷 尔 氏 菌 PBCV-1 DNA ligase(rs98orf00203) 验 证... 288 试 验 人 员 : 林 海 云... 288 试 验 项 目 : 两 个 未 知 基 因 的 注 释 及 在 青 枯 雷 尔 氏 菌 中 搜 索 同 源 基 因...298

4 试 验 人 员 : 林 爱 婷... 298 试 验 项 目 : 短 短 芽 孢 杆 菌 JK-2 全 基 因 组 SNP 的 预 测 和 分 析...308 试 验 人 员 : 林 爱 婷... 308 试 验 项 目 : 苯 酚 硫 酸 法 测 定 胞 外 多 糖 标 准 曲 线 的 测 定...318 试 验 人 员 : 张 文 州 郑 雪 芳... 318 试 验 项 目 : 苗 立 鲜 对 金 石 王 1 号 番 茄 种 苗 保 鲜 效 果...322 试 验 人 员 : 张 文 州... 322 试 验 项 目 : 苗 立 鲜 对 农 友 长 茄 种 苗 保 鲜 效 果...329 试 验 人 员 : 张 文 州... 329 试 验 项 目 : 平 潭 花 生 4 级 病 株 青 枯 雷 尔 氏 菌 的 分 离 检 测...336 试 验 人 员 : 张 文 州 郑 雪 芳 林 抗 美... 336 试 验 项 目 : 莆 田 辣 椒 4 级 病 株 青 枯 雷 尔 氏 菌 的 分 离 检 测...341 试 验 人 员 : 张 文 州 郑 雪 芳 林 抗 美... 341 试 验 项 目 : 土 壤 芽 胞 杆 菌 的 分 离 纯 化 及 保 种 (14132-14199)... 346 试 验 人 员 : 田 潇 娜... 346 试 验 项 目 : 土 壤 中 芽 胞 杆 菌 的 脂 肪 酸 测 定...353 试 验 人 员 : 田 潇 娜... 353 试 验 项 目 : 土 壤 芽 胞 杆 菌 的 分 离 纯 化 及 保 存 (14378-14423)... 357 试 验 人 员 : 田 潇 娜... 357 试 验 项 目 : 土 壤 中 芽 胞 杆 菌 的 脂 肪 酸 测 定...365 试 验 人 员 : 田 潇 娜... 365 试 验 项 目 : 土 壤 中 芽 胞 杆 菌 的 脂 肪 酸 鉴 定...369 试 验 人 员 : 余 谦... 369 试 验 项 目 : 耐 高 温 芽 孢 杆 菌 的 分 离... 373 试 验 人 员 : 余 谦... 373 试 验 负 责 : 刘 国 红... 373 试 验 项 目 : 垫 料 堆 肥 实 验 总 微 生 物 量 的 测 定 ( 二 )...378 试 验 人 员 : 王 洁... 378 试 验 项 目 : 垫 料 堆 肥 实 验 总 微 生 物 量 的 测 定 ( 三 )...387 试 验 人 员 : 王 洁... 387 试 验 项 目 : 垫 料 堆 肥 实 验 总 微 生 物 量 的 测 定 ( 四 )...394 试 验 人 员 : 王 洁... 394 试 验 项 目 : 不 同 施 肥 方 式 和 施 肥 量 对 葡 萄 叶 绿 素 的 影 响...402 试 验 人 员 : 王 洁... 402 试 验 项 目 : 微 波 诱 变 后 强 致 病 力 青 枯 雷 尔 氏 菌 的 弱 化 指 数 的 测 定...406 试 验 人 员 : 周 游... 406 试 验 项 目 : 苗 立 鲜 对 农 友 长 茄 种 苗 保 鲜 效 果...415 试 验 人 员 : 周 游 郑 雪 芳... 415 试 验 项 目 : 莆 田 辣 椒 1 级 病 株 青 枯 雷 尔 氏 菌 的 分 离 检 测...420 试 验 人 员 : 周 游 郑 雪 芳 林 抗 美... 420 试 验 项 目 : 青 枯 雷 尔 氏 菌 FJAT-91 微 波 诱 变 条 件 摸 索... 425 试 验 人 员 : 周 游 郑 雪 芳... 425 试 验 项 目 : 青 枯 雷 尔 氏 菌 无 致 病 力 突 变 体 的 PCR 检 测... 431 试 验 人 员 : 马 桂 美... 431

5 试 验 项 目 : 短 短 芽 孢 杆 菌 FJAT-0809-GLX 抗 生 素 敏 感 性 检 测...436 试 验 人 员 : 马 桂 美... 436 试 验 项 目 : 青 枯 雷 尔 氏 菌 的 无 致 病 力 突 变 株 的 形 态 和 分 子 检 测...447 试 验 人 员 : 马 桂 美... 447

1 编 号 : 农 业 微 生 物 研 究 中 心 [20110823] 共 4 页 承 担 单 位 : 福 建 省 农 科 院 农 业 生 物 资 源 研 究 所 试 验 设 计 : 试 验 项 目 : 淡 紫 拟 青 霉 FJAT-9041 生 物 肥 药 在 不 同 基 质 和 营 养 下 的 固 体 发 酵 试 验 人 员 : 肖 马 云 试 验 负 责 : 史 怀 报 告 日 期 :2011-09-23 计 数 月 份 :2011 年 08 月 研 究 资 格 系 数 (0.5-1.0) 实 验 设 计 系 数 (0.9-1.0 0.9-1.0) 报 告 得 分 总 分 实 验 设 计 实 验 记 载 实 验 分 析 实 验 简 报 实 验 文 章 1-20% 21-40% 41-60% 61-80% 81-100% 1%-5% 设 计 不 足, 实 施 错 误 6%-10% 设 计 不 全, 实 验 无 果 11%-15% 设 计 可 以, 实 施 不 全 16%-20% 设 计 完 整, 分 布 实 施 21%-25% 实 验 不 全, 记 载 无 果 26%-30% 实 验 不 足, 记 载 不 全 31%-35% 独 立 实 验, 记 载 不 全 36%-40% 分 布 实 验, 记 载 完 整 41%-45% 目 的 明 确, 实 验 完 成 46%-50% 实 验 完 整, 记 载 清 晰 51%-55% 实 验 系 统, 结 果 可 信 56%-60% 实 验 创 新, 分 析 清 晰 61%-65% 实 验 创 新, 结 论 清 晰 66%-70% 实 验 完 整, 统 计 清 晰 71%-75% 实 验 系 统, 数 据 可 靠 76%-80% 报 告 完 整, 文 章 雏 形 81%-85% 结 构 合 理, 分 析 有 据 86%-90% 逻 辑 清 晰, 统 计 合 理 91%-95% 图 表 完 整, 写 作 流 畅 96%-100% 文 献 完 整, 发 表 水 平 福 建 省 农 业 科 学 院 农 业 生 物 资 源 研 究 所 农 业 微 生 物 研 究 中 心 电 话 : 0591-87882571, 传 真 : 0591-87882571 fjat.yzxz.com

2 1. 试 验 目 的 香 蕉 枯 萎 病 又 名 香 蕉 巴 拿 马 病 黄 叶 病, 是 由 尖 孢 镰 刀 菌 古 巴 专 化 型 (Fusarium oxysporum [1] f.sp.cubense) 引 起 的 维 管 束 坏 死 的 一 种 毁 灭 性 真 菌 病 害 和 典 型 的 土 传 病 害, 是 国 际 检 疫 对 象 香 蕉 [2] 枯 萎 病 是 目 前 香 蕉 栽 培 品 种 的 主 要 威 胁, 我 国 香 蕉 枯 萎 病 主 要 由 生 理 小 种 4 号 侵 染 引 起 淡 紫 拟 青 霉 [Paecilomyces lilacinus (Thom) Samson] 属 于 半 知 菌 亚 门 (Deu-teromycotina), 丝 孢 纲 (Hyph 本 试 验 室 筛 [3] 选 的 淡 紫 拟 青 霉 FJAT-9041 菌 株 对 对 香 蕉 枯 萎 病 菌 有 较 好 的 抑 制 作 用 成 功 的 生 物 防 治 依 赖 于 对 生 防 菌 病 原 物 和 寄 主 植 物 相 互 关 系 的 彻 底 了 解 在 植 物 病 害 生 防 实 践 中, 生 防 菌 被 引 人 土 壤 时, 往 往 会 受 到 土 壤 抑 菌 作 用 及 生 防 菌 与 植 物 根 部 亲 和 能 力 的 影 响, 这 是 生 防 菌 防 治 植 物 病 害 防 效 不 稳 定 的 重 要 原 因 之 一 因 此, 作 为 生 防 因 子 的 生 防 菌 能 否 在 靶 植 物 根 际 定 殖 生 长 已 成 为 筛 选 评 定 土 传 病 害 生 防 菌 的 一 个 重 要 指 标, 并 最 终 决 定 该 生 防 菌 的 开 发 利 用 潜 [4] 力 成 儒 萍 以 淡 紫 拟 青 霉 孢 子 液 和 固 体 发 酵 物 的 的 形 式 施 入 土 壤 中, 淡 紫 拟 青 霉 固 体 发 酵 物 较 孢 子 液 浇 灌 的 施 入 方 式 能 使 菌 株 在 土 壤 中 有 相 对 高 的 存 活 量, 而 液 体 流 状 物 的 形 式 容 易 在 土 壤 中 淋 溶 散 失, 不 利 于 长 期 存 活 可 能 由 于 淡 紫 拟 青 霉 固 体 发 酵 物 的 形 式 提 供 给 菌 株 以 介 质 的 固 着, 相 对 稳 定 的 留 存 在 土 壤 基 质 中, 这 样 有 利 于 淡 紫 拟 青 霉 对 土 传 病 害 的 长 效 控 制 本 试 验 研 究 淡 紫 拟 青 霉 FJAT-9041 在 不 同 基 质 的 发 酵, 研 究 淡 在 拟 青 霉 的 固 体 发 酵 能 力, 为 提 高 淡 紫 拟 青 霉 FJAT-9041 的 活 菌 数 提 供 参 考 2. 试 验 方 法 2.1. 供 试 材 料 垫 料 : 由 谷 壳 锯 末 和 猪 粪 等 在 猪 场 沉 积 几 年 制 成 的 垫 料, 玉 米 粉 菇 菌 草 硫 酸 铵 蔗 糖 2.2 试 验 方 法 2.2.1 淡 紫 拟 青 霉 FJAT-9041 的 发 酵 淡 紫 拟 青 霉 在 GUJS-50 AUTOBIO 型 自 动 机 械 搅 拌 不 锈 钢 发 酵 罐 发 酵 8 天, 发 酵 后 发 酵 液 孢 子 浓 度 为 1.26 10 8 cfu/ml 2.2.2 试 验 处 理 试 验 设 以 下 处 理 : 1 玉 米 粉 40g+ 淡 紫 拟 青 霉 FJAT-9041 发 酵 液 40g 2 玉 米 粉 40g+ 淡 紫 拟 青 霉 FJAT-9041 发 酵 液 10g 3 玉 米 粉 35g+ 淡 紫 拟 青 霉 FJAT-9041 发 酵 液 15g 4 菇 菌 草 320g+ 淡 紫 拟 青 霉 FJAT-9041 发 酵 液 80g 5 菇 菌 草 100g+ 淡 紫 拟 青 霉 FJAT-9041 发 酵 液 50g 6 垫 料 200g+ 菇 菌 草 200g+ 淡 紫 拟 青 霉 FJAT-9041 发 酵 液 100g 7 垫 料 100g+ 玉 米 粉 100g+ 淡 紫 拟 青 霉 FJAT-9041 发 酵 液 50g 8 垫 料 200g+ 硫 酸 铵 6g+ 蔗 糖 10g + 淡 紫 拟 青 霉 FJAT-9041 发 酵 液 50g 2.2.2 分 离 培 养

3 3. 试 验 结 果 各 个 不 同 处 理 放 在 常 温 下 10 天, 用 平 板 计 数 法 分 离 淡 紫 拟 青 霉 FJAT-9041, 并 计 数 7 天 后 各 个 处 理 图 片 处 理 1 处 理 2 处 理 3 处 理 3 处 理 5 处 理 6 处 理 7 处 理 8 图 1 7 天 后 各 个 处 理 图 片 处 理 后 第 7 天, 处 理 7 处 理 8 和 处 理 6 淡 紫 拟 青 霉 FJAT-9041 生 长 情 况 较 好, 但 第 10 天, 处 理 8 有 些 污 染, 其 他 各 个 处 理 淡 紫 拟 青 霉 FJAT-9041 生 长 情 况 不 够 好 10 天 用 平 板 计 数 法 分 离 各 个 处 理, 涂 板 为 10 8 和 10 9 计 数 各 个 处 理 的 淡 紫 拟 青 霉 FJAT-9041. 结 果 为, 常 温 下 处 理 2 活 菌 数 为 3.0 10 8 cfu/g, 处 理 4 为 5.0 10 7 cfu/g, 其 他 处 理 没 有 分 离 到 淡 紫 拟 青 霉 FJAT-9041, 可 见 加 硫 酸 铵 为 氮 源 和 蔗 糖 为 碳 源 的 垫 料 淡 紫 拟 青 霉 可 以 发 酵 以 下 是 10 天 后 分 离 处 理 2 和 处 理 4 的 照 片

4 处 理 2 处 理 4 图 31 15 天 后 各 个 处 理 图 片 4. 试 验 讨 论 为 了 筛 选 工 业 上 更 好 的 固 体 发 酵 配 方, 不 同 的 处 理 没 有 灭 菌, 处 理 后 第 7 天, 处 理 7 处 理 8 和 处 理 6 淡 紫 拟 青 霉 FJAT-9041 生 长 情 况 较 好, 但 第 10 天, 处 理 8 有 些 污 染, 其 他 各 个 处 理 淡 紫 拟 青 霉 FJAT-9041 生 长 情 况 不 够 好, 试 验 有 待 进 一 步 优 化 15 天 用 平 板 计 数 法 分 离 各 个 处 理, 涂 板 为 10 8 和 10 9 计 数 各 个 处 理 的 淡 紫 拟 青 霉 FJAT-9041. 结 果 为, 常 温 下 处 理 2 活 菌 数 为 3.0 10 8 cfu/g, 处 理 4 为 5.0 10 7 cfu/g, 其 他 处 理 没 有 分 离 到 淡 紫 拟 青 霉 FJAT-9041, 可 见 加 硫 酸 铵 为 氮 源 和 蔗 糖 为 碳 源 的 垫 料 淡 紫 拟 青 霉 可 以 发 酵, 其 他 处 理 可 能 是 碳 源 和 氮 源 不 够, 进 行 进 一 步 不 同 发 酵 物 的 筛 选 和 营 养 物 质 的 筛 选 5.. 参 考 文 献 [1] 卓 国 豪, 黄 有 宝, 吴 运 新 等. 香 蕉 枯 萎 病 的 综 合 防 治 技 术 [ J]. 植 物 检 疫, 2003, 17( 5) : 279-280. [2] 王 文 华, 王 葵 娣, 曾 会 才. 香 蕉 枯 萎 病 的 危 害 及 其 防 治 策 略 [J]. 广 西 热 带 农 业, 2007, 3: 19-21. [3] 李 晓 杰, 徐 树 兰, 汤 历. 香 蕉 枯 萎 病 拮 抗 菌 的 筛 选 及 盆 栽 防 效 的 测 定 [J]. 广 东 农 业 科 学,2005 年 第 5 期 [4] 成 儒 萍, 肖 炎 农. 淡 紫 拟 青 霉 在 作 物 根 围 及 土 壤 中 的 定 殖 研 究, 植 物 病 理 学. [5] 陈 谦, 张 新 雄, 赵 海, 官 家 发. 生 物 有 机 肥 中 几 种 功 能 微 生 物 的 研 究 及 应 用 概 况 [J]. 应 用 与 环 境 生 物 学 报 2010,16 ( 2 ): 294~300. [6] 张 志 红, 李 华 兴, 韦 翔 华, 刘 序, 彭 桂 香. 生 物 肥 料 对 香 蕉 枯 萎 病 及 土 壤 微 生 物 的 影 响, 生 态 环 境 2008,17(6):2421 2425. [7] 张 志 红, 冯 宏, 肖 相 政, 李 华 兴. 生 物 肥 防 治 香 蕉 枯 萎 病 及 对 土 壤 微 生 物 多 样 性 的 影 响. 果 树 学 报 2010,27(4): 575~579. 试 验 负 责 史 怀 试 验 人 员 肖 马 云

5 编 号 : 农 业 微 生 物 研 究 中 心 [20110923] 共 6 页 承 担 单 位 : 福 建 省 农 科 院 农 业 生 物 资 源 研 究 所 试 验 设 计 : 试 验 项 目 : 淡 紫 拟 青 霉 FJAT-9041 不 同 固 体 发 酵 载 体 的 筛 选 试 验 人 员 : 肖 马 云 试 验 负 责 : 史 怀 报 告 日 期 :2011-09-23 计 数 月 份 :2011 年 08 月 研 究 资 格 系 数 (0.5-1.0) 实 验 设 计 系 数 (0.9-1.0 0.9-1.0) 报 告 得 分 总 分 实 验 设 计 实 验 记 载 实 验 分 析 实 验 简 报 实 验 文 章 1-20% 21-40% 41-60% 61-80% 81-100% 1%-5% 设 计 不 足, 实 施 错 误 6%-10% 设 计 不 全, 实 验 无 果 11%-15% 设 计 可 以, 实 施 不 全 16%-20% 设 计 完 整, 分 布 实 施 21%-25% 实 验 不 全, 记 载 无 果 26%-30% 实 验 不 足, 记 载 不 全 31%-35% 独 立 实 验, 记 载 不 全 36%-40% 分 布 实 验, 记 载 完 整 41%-45% 目 的 明 确, 实 验 完 成 46%-50% 实 验 完 整, 记 载 清 晰 51%-55% 实 验 系 统, 结 果 可 信 56%-60% 实 验 创 新, 分 析 清 晰 61%-65% 实 验 创 新, 结 论 清 晰 66%-70% 实 验 完 整, 统 计 清 晰 71%-75% 实 验 系 统, 数 据 可 靠 76%-80% 报 告 完 整, 文 章 雏 形 81%-85% 结 构 合 理, 分 析 有 据 86%-90% 逻 辑 清 晰, 统 计 合 理 91%-95% 图 表 完 整, 写 作 流 畅 96%-100% 文 献 完 整, 发 表 水 平 福 建 省 农 业 科 学 院 农 业 生 物 资 源 研 究 所 农 业 微 生 物 研 究 中 心 电 话 : 0591-87882571, 传 真 : 0591-87882571 fjat.yzxz.com

6 1. 试 验 目 的 香 蕉 枯 萎 病 又 名 香 蕉 巴 拿 马 病 黄 叶 病, 是 由 尖 孢 镰 刀 菌 古 巴 专 化 型 (Fusarium oxysporum [1] f.sp.cubense) 引 起 的 维 管 束 坏 死 的 一 种 毁 灭 性 真 菌 病 害 和 典 型 的 土 传 病 害, 是 国 际 检 疫 对 象 香 蕉 [2] 枯 萎 病 是 目 前 香 蕉 栽 培 品 种 的 主 要 威 胁, 我 国 香 蕉 枯 萎 病 主 要 由 生 理 小 种 4 号 侵 染 引 起 淡 紫 拟 青 霉 [Paecilomyces lilacinus (Thom) Samson] 属 于 半 知 菌 亚 门 (Deu-teromycotina), 丝 孢 纲 (Hyph 本 试 验 室 筛 [3] 选 的 淡 紫 拟 青 霉 FJAT-9041 菌 株 对 对 香 蕉 枯 萎 病 菌 有 较 好 的 抑 制 作 用 成 功 的 生 物 防 治 依 赖 于 对 生 防 菌 病 原 物 和 寄 主 植 物 相 互 关 系 的 彻 底 了 解 在 植 物 病 害 生 防 实 践 中, 生 防 菌 被 引 人 土 壤 时, 往 往 会 受 到 土 壤 抑 菌 作 用 及 生 防 菌 与 植 物 根 部 亲 和 能 力 的 影 响, 这 是 生 防 菌 防 治 植 物 病 害 防 效 不 稳 定 的 重 要 原 因 之 一 因 此, 作 为 生 防 因 子 的 生 防 菌 能 否 在 靶 植 物 根 际 定 殖 生 长 已 成 为 筛 选 评 定 土 传 病 害 生 防 菌 的 一 个 重 要 指 标, 并 最 终 决 定 该 生 防 菌 的 开 发 利 用 潜 [4] 力 成 儒 萍 以 淡 紫 拟 青 霉 孢 子 液 和 固 体 发 酵 物 的 的 形 式 施 入 土 壤 中, 淡 紫 拟 青 霉 固 体 发 酵 物 较 孢 子 液 浇 灌 的 施 入 方 式 能 使 菌 株 在 土 壤 中 有 相 对 高 的 存 活 量, 而 液 体 流 状 物 的 形 式 容 易 在 土 壤 中 淋 溶 散 失, 不 利 于 长 期 存 活 可 能 由 于 淡 紫 拟 青 霉 固 体 发 酵 物 的 形 式 提 供 给 菌 株 以 介 质 的 固 着, 相 对 稳 定 的 留 存 在 土 壤 基 质 中, 这 样 有 利 于 淡 紫 拟 青 霉 对 土 传 病 害 的 长 效 控 制 本 试 验 研 究 淡 紫 拟 青 霉 FJAT-9041 在 不 同 固 体 载 体 的 发 酵, 筛 选 出 淡 紫 拟 青 霉 固 体 发 酵 的 最 佳 载 体, 为 提 高 淡 紫 拟 青 霉 FJAT-9041 的 活 菌 数 提 供 参 考 2. 试 验 方 法 2.1. 供 试 材 料 垫 料 : 由 谷 壳 锯 末 和 猪 粪 等 在 猪 场 沉 积 几 年 制 成 的 垫 料, 玉 米 粉 花 生 饼 粉 米 糠 地 瓜 干 粉 菜 籽 粉 米 粉 2.2 试 验 方 法 2.2.1 种 子 液 淡 紫 拟 青 霉 FJAT-9041 的 发 酵 淡 紫 拟 青 霉 FJAT-9041 摇 床 发 酵 5 天, 转 速 110rpm/min,28, 发 酵 后 发 酵 液 孢 子 浓 度 为 1.0 10 6 cfu/ml 2.2.2 试 验 处 理 试 验 设 以 下 处 理 : 1. 垫 料 200g+ 米 糠 60g 接 入 种 子 液 40ml 2. 垫 料 200g+ 花 生 饼 粉 60g 接 入 种 子 液 40ml 3. 垫 料 200g+ 玉 米 粉 60g 接 入 种 子 液 40ml 4. 垫 料 200g+ 地 瓜 干 粉 60g 接 入 种 子 液 40ml 5. 垫 料 200g+ 菜 籽 粉 60g 接 入 种 子 液 40ml 6. 垫 料 200g+ 米 粉 60g 接 入 种 子 液 40ml 7. 垫 料 200g+ 麸 皮 30g+ 米 糠 30g 接 入 种 子 液 40ml 8. 垫 料 200g+ 菜 籽 粉 30g+ 大 米 粉 30g 接 入 种 子 液 40ml

7 9. 垫 料 200g+ 花 生 饼 粉 30g+ 玉 米 粉 30g 接 入 种 子 液 40ml 10. 垫 料 200g+ 淀 粉 30g+ 玉 米 粉 30g 接 入 种 子 液 40ml 11. 垫 料 200g 接 入 种 子 液 40ml 2.2.2 分 离 培 养 各 个 不 同 处 理 放 在 常 温 下 7 天, 用 平 板 计 数 法 分 离 淡 紫 拟 青 霉 FJAT-9041, 并 计 数 3. 试 验 结 果 7 天 后 平 板 计 数 分 离 各 个 处 理 淡 紫 拟 青 霉 FJAT-9041 活 菌 数 表 1 7 天 后 试 验 各 个 处 理 淡 紫 拟 青 霉 FJAT-9041 活 菌 数 试 验 处 理 活 菌 数 (cfu/g) 处 理 1 1.0 10 7 处 理 2 1.0 10 7 处 理 3 1.0 10 7 处 理 4 7.5 10 8 处 理 5 5.0 10 6 处 理 6 1.5 10 7 处 理 7 5.0 10 6 处 理 8 5.0 10 6 处 理 9 1.0 10 7 处 理 10 3.0 10 7 处 理 11 1.0 10 6 由 上 表 可 以 看 出 以 上 处 理 淡 紫 拟 青 霉 活 菌 数 都 有 所 上 升, 处 理 4 淡 紫 拟 青 霉 FJAT-9041 活 菌 数 最 高 为 7.5 10 8 cfu/g, 处 理 3 处 理 6 也 有 较 多 的 活 菌 菌 数 分 别 为 3.0 10 7 和 1.5 10 7, 处 理 5 处 理 7 处 理 8 活 菌 数 较 少 为 5.0 10 6, 可 见 淡 紫 拟 青 霉 FJAT-9041 在 以 上 不 同 的 固 体 载 体 中 均 有 发 酵 能 力, 其 中 在 处 理 4 垫 料 200g+ 地 瓜 干 粉 60g 中 发 酵 能 力 最 强 以 下 是 7 天 后 分 离 平 板 计 数 分 离 各 个 处 理 淡 紫 拟 青 霉 FJAT-9041 活 菌 数

8 处 理 1 1.0 10 7 cfu/g 处 理 2 1.0 10 7 cfu/g 处 理 3 1.0 10 7 cfu/g 处 理 4 7.5 10 8 处 理 5 5.0 10 6 cfu/g 处 理 6 1.5 10 7 cfu/g 处 理 7 5.0 10 6 cfu/g 处 理 8 5.0 10 6 cfu/g

9 处 理 9 1.0 10 7 cfu/g 处 理 10 3.0 10 7 cfu/g 处 理 11 1.0 10 6 cfu/g 图 2 10 天 后 各 个 处 理 图 片 4. 试 验 讨 论 以 上 结 果 表 明 以 上 处 理 淡 紫 拟 青 霉 活 菌 数 都 有 发 酵 能 力, 处 理 4 淡 紫 拟 青 霉 FJAT-9041 活 菌 数 最 高 为 7.5 10 8 cfu/g, 处 理 3 处 理 6 也 有 较 多 的 活 菌 菌 数 分 别 为 3.0 10 7 和 1.5 10 7, 处 理 5 处 理 7 处 理 8 活 菌 数 较 少 为 5.0 10 6, 可 见 淡 紫 拟 青 霉 FJAT-9041 在 以 上 不 同 的 固 体 载 体 中 均 有 发 酵 能 力, 其 中 在 处 理 4 垫 料 200g+ 地 瓜 干 粉 60g 中 发 酵 能 力 最 强, 地 瓜 干 粉 和 垫 料 是 最 佳 的 固 体 发 酵 载 体, 下 一 步 进 行 进 一 步 营 养 配 比 的 筛 选 5.. 参 考 文 献 [1] 卓 国 豪, 黄 有 宝, 吴 运 新 等. 香 蕉 枯 萎 病 的 综 合 防 治 技 术 [ J]. 植 物 检 疫, 2003, 17( 5) : 279-280. [2] 王 文 华, 王 葵 娣, 曾 会 才. 香 蕉 枯 萎 病 的 危 害 及 其 防 治 策 略 [J]. 广 西 热 带 农 业, 2007, 3: 19-21. [3] 李 晓 杰, 徐 树 兰, 汤 历. 香 蕉 枯 萎 病 拮 抗 菌 的 筛 选 及 盆 栽 防 效 的 测 定 [J]. 广 东 农 业 科 学,2005 年 第 5 期 [4] 成 儒 萍, 肖 炎 农. 淡 紫 拟 青 霉 在 作 物 根 围 及 土 壤 中 的 定 殖 研 究, 植 物 病 理 学.

10 [5] 陈 谦, 张 新 雄, 赵 海, 官 家 发. 生 物 有 机 肥 中 几 种 功 能 微 生 物 的 研 究 及 应 用 概 况 [J]. 应 用 与 环 境 生 物 学 报 2010,16 ( 2 ): 294~300. [6] 张 志 红, 李 华 兴, 韦 翔 华, 刘 序, 彭 桂 香. 生 物 肥 料 对 香 蕉 枯 萎 病 及 土 壤 微 生 物 的 影 响, 生 态 环 境 2008,17(6):2421 2425. [7] 张 志 红, 冯 宏, 肖 相 政, 李 华 兴. 生 物 肥 防 治 香 蕉 枯 萎 病 及 对 土 壤 微 生 物 多 样 性 的 影 响. 果 树 学 报 2010,27(4): 575~579. 试 验 负 责 史 怀 试 验 人 员 肖 马 云

11 编 号 : 农 业 微 生 物 研 究 中 心 [201123] 共 6 页 承 担 单 位 : 福 建 省 农 科 院 农 业 生 物 资 源 研 究 所 试 验 设 计 : 试 验 项 目 : 淡 紫 拟 青 霉 FJAT-9041 在 不 同 处 理 香 蕉 根 基 土 壤 的 定 殖 动 态 ( 一 ) 试 验 人 员 : 肖 马 云 试 验 负 责 : 史 怀 报 告 日 期 :2011-09-23 计 数 月 份 :2011 年 08 月 研 究 资 格 系 数 (0.5-1.0) 实 验 设 计 系 数 (0.9-1.0 0.9-1.0) 报 告 得 分 总 分 实 验 设 计 实 验 记 载 实 验 分 析 实 验 简 报 实 验 文 章 1-20% 21-40% 41-60% 61-80% 81-100% 1%-5% 设 计 不 足, 实 施 错 误 6%-10% 设 计 不 全, 实 验 无 果 11%-15% 设 计 可 以, 实 施 不 全 16%-20% 设 计 完 整, 分 布 实 施 21%-25% 实 验 不 全, 记 载 无 果 26%-30% 实 验 不 足, 记 载 不 全 31%-35% 独 立 实 验, 记 载 不 全 36%-40% 分 布 实 验, 记 载 完 整 41%-45% 目 的 明 确, 实 验 完 成 46%-50% 实 验 完 整, 记 载 清 晰 51%-55% 实 验 系 统, 结 果 可 信 56%-60% 实 验 创 新, 分 析 清 晰 61%-65% 实 验 创 新, 结 论 清 晰 66%-70% 实 验 完 整, 统 计 清 晰 71%-75% 实 验 系 统, 数 据 可 靠 76%-80% 报 告 完 整, 文 章 雏 形 81%-85% 结 构 合 理, 分 析 有 据 86%-90% 逻 辑 清 晰, 统 计 合 理 91%-95% 图 表 完 整, 写 作 流 畅 96%-100% 文 献 完 整, 发 表 水 平 福 建 省 农 业 科 学 院 农 业 生 物 资 源 研 究 所 农 业 微 生 物 研 究 中 心 电 话 : 0591-87882571, 传 真 : 0591-87882571 fjat.yzxz.com

12 1. 试 验 目 的 香 蕉 枯 萎 病 又 名 香 蕉 巴 拿 马 病 黄 叶 病, 是 由 尖 孢 镰 刀 菌 古 巴 专 化 型 (Fusarium oxysporum f.sp.cubense) 引 起 的 维 管 束 坏 死 的 一 种 毁 灭 性 真 菌 病 害 和 典 型 的 土 传 病 害, 是 国 际 检 疫 对 象 [1] 尖 孢 镰 刀 菌 古 巴 专 化 型 (Fusarium oxysporum f.sp.cubense) 属 于 半 知 菌, 肉 座 目, 镰 刀 菌 属 香 蕉 枯 萎 病 菌 有 4 个 生 理 小 种, 生 理 小 种 4 号 几 乎 能 侵 染 所 有 香 蕉 品 种, 是 目 前 香 蕉 栽 培 品 种 的 主 要 威 胁, 我 [2] 国 香 蕉 枯 萎 病 主 要 由 生 理 小 种 4 号 侵 染 引 起 淡 紫 拟 青 霉 [Paecilomyces lilacinus (Thom) Samson] 属 于 半 知 菌 亚 门 (Deu-teromycotina), 丝 孢 纲 (Hyphomycetes), 丝 孢 目 (Hyphomycetales), 丛 梗 孢 科 (Moniliaceae), 拟 青 霉 属 (Paecilomyees Balnier), 国 内 外 很 多 研 究 人 员 对 这 种 生 防 菌 的 生 物 防 治 应 用 作 了 广 泛 研 究, 史 怀 等 报 道 淡 紫 拟 青 霉 多 糖 对 尖 孢 镰 刀 菌 有 明 显 抑 制 作 用, 他 们 筛 选 到 的 淡 紫 拟 青 霉 菌 株 NH - PL -03, 其 胞 内 外 多 糖 对 尖 孢 镰 刀 菌 的 菌 丝 生 长 及 孢 子 萌 发 均 有 明 显 的 抑 制 作 用, 抑 制 能 力 随 多 糖 浓 度 的 提 高 而 增 强, 显 示 了 良 好 的 生 防 潜 力, 这 为 尖 孢 镰 刀 的 生 物 防 治 提 供 了 新 3 思 路 本 试 验 室 筛 选 的 淡 紫 拟 青 霉 FJAT-9041 菌 株 对 对 香 蕉 枯 萎 病 菌 有 较 好 的 抑 制 作 用 [3], 但 缺 乏 对 该 菌 株 在 香 蕉 根 际 和 根 围 定 殖 能 力 和 对 香 蕉 枯 萎 病 防 治 应 用 的 了 解, 类 似 的 研 究 也 少 见 报 道 成 功 的 生 物 防 治 依 赖 于 对 生 防 菌 病 原 物 和 寄 主 植 物 相 互 关 系 的 彻 底 了 解 在 植 物 病 害 生 防 实 践 中, 生 防 菌 被 引 人 土 壤 时, 往 往 会 受 到 土 壤 抑 菌 作 用 及 生 防 菌 与 植 物 根 部 亲 和 能 力 的 影 响, 这 是 生 防 菌 防 治 植 物 病 害 防 效 不 稳 定 的 重 要 原 因 之 一 因 此, 作 为 生 防 因 子 的 生 防 菌 能 否 在 靶 植 物 根 际 定 殖 生 长 已 成 为 筛 选 评 定 土 传 病 害 生 防 菌 的 一 个 重 要 指 标, 并 最 终 决 定 该 生 防 菌 的 开 发 利 用 潜 力 [4] 本 研 究 通 过 评 价 淡 紫 拟 青 霉 FJAT-9041 在 香 蕉 根 基 定 殖 能 力, 为 香 蕉 枯 萎 病 菌 提 供 理 论 依 据 2. 试 验 方 法 2.1. 供 试 材 料 供 试 菌 株 : 生 防 菌 淡 紫 拟 青 霉 FJAT-9041 香 蕉 枯 萎 病 病 原 菌 FJAT-3076 为 尖 孢 镰 刀 菌, 由 福 建 省 农 科 院 农 业 生 物 资 源 研 究 所 微 生 物 中 心 提 供 香 蕉 苗, 生 长 情 况 一 致 的 4-5 叶 期 的 香 蕉 苗 2.2 试 验 方 法 2.2.1 淡 紫 拟 青 霉 FJAT-9041 的 发 酵 淡 紫 拟 青 霉 在 GUJS-50 AUTOBIO 型 自 动 机 械 搅 拌 不 锈 钢 发 酵 罐 发 酵 8 天, 发 酵 后 发 酵 液 孢 子 浓 度 为 3.0 10 8 cfu/ml 2.2.2 淡 紫 拟 青 霉 FJAT-9041 生 物 肥 药 的 制 备 发 酵 淡 紫 拟 青 霉 9041 发 酵 10 天 的 发 酵 液 与 锯 末 和 谷 壳 混 合 成 的 基 质 混 合, 淡 紫 拟 青 霉 9041 与 基 质 的 比 例 为 1:4, 混 合 均 匀 后 常 温 下 保 存 2.2.3 镰 刀 菌 FJAT-3076 菌 液 的 制 备 活 化 培 养 用 PDA 培 养 基, 菌 液 用 PDA 液 体 培 养 基,30 度 摇 床 180 转 2.2.4 试 验 处 理

13 试 验 设 以 下 处 理 处 理 1 只 施 生 物 肥 药 淡 紫 拟 青 霉 FJAT-9041 处 理 2 先 施 生 物 肥 药 淡 紫 拟 青 霉 FJAT-9041,7 天 后 接 种 香 蕉 镰 刀 菌 FJAT-3076 处 理 3 同 时 施 用 淡 紫 拟 青 霉 FJAT-9041 生 物 肥 药 和 接 种 香 蕉 枯 萎 病 菌 FJAT-3076 处 理 6 只 接 淡 紫 拟 青 霉 FJAT-9041 菌 液 接 种 淡 紫 拟 青 霉 FJAT-9041 孢 子 悬 浮 液 浓 度 为 3.0 10 8 cfu/ml, 生 物 肥 药 中 淡 紫 拟 青 霉 FJAT-9041 浓 度 为 6.0 10 7 cfu/g, 与 施 用 淡 紫 拟 青 霉 FJAT-9041 生 物 肥 药 后 8 天 开 始 分 离 不 同 处 理 的 根 际 土 壤, 每 7 天 分 离 一 次 每 个 处 理 25 株 香 蕉 苗, 每 株 一 盆 香 蕉 枯 萎 病 菌 FJAT-3076 制 好 的 发 酵 液, 浓 度 为 6.0 10 7 cfu/ml, 生 物 肥 药 淡 紫 拟 青 霉 9041 浓 度 生 物 肥 药 中 淡 紫 拟 青 霉 FJAT-9041 浓 度 为 6.0 10 7 cfu/g, 镰 刀 菌 用 伤 根 法 接 入, 每 株 苗 接 40-50ml 菌 液, 生 物 肥 药 淡 紫 拟 青 霉 9041 和 土 壤 的 比 例 为 1:10, 混 合 均 匀 后 施 入 每 隔 7 天 后 分 离 淡 紫 拟 青 霉 的 定 殖 动 态 2.2.5 菌 株 定 殖 测 定 方 法 每 次 取 样 采 用 5 点 取 样 法, 随 机 取 5 株, 采 取 5 株 的 根 际 土 壤 混 合 在 一 起, 称 量 10g, 各 处 理 平 板 测 定 设 四 次 重 复 2.2.6 淡 紫 拟 青 霉 在 香 蕉 根 基 土 壤 中 的 定 殖 测 定 挖 取 植 株 根 围 附 近 土 壤 作 为 根 基 土, 称 取 1 份 10g 土 样, 将 土 样 加 10ml 无 菌 水 振 荡 混 匀, 稀 释 适 当 倍 数 后 取 200ul 涂 板 菌 落 形 成 单 位 数 ( 个 /g)= 每 平 皿 菌 落 平 均 数 * 稀 释 倍 数 *5/ 土 壤 重 量 3. 试 验 结 果 表 1 淡 紫 拟 青 霉 FJAT-9041 在 香 蕉 不 同 处 理 根 基 土 壤 的 定 殖 不 同 1 天 7 天 14 天 21 天 28 天 处 理 (cfu/g) (cfu/g) (cfu/g) (cfu/g) (cfu/g) 1 5.0 10 7 4.6 10 7 2.0 10 7 1.0 10 7 1.8 10 7 2 5.5 10 7 8.0 10 6 2.5 10 6 2.0 10 6 5.0 10 5 3 5.0 10 7 9.0 10 7 7.0 10 6 6.5 10 6 3.0 10 6 6 6.5 10 7 7.0 10 7 1.8 10 8 5.5 10 6 5.0 10 6

14 处 理 1 处 理 2 处 理 3 处 理 6 200000000 定 殖 量 (cfu/g) 150000000 100000000 50000000 0 1 天 7 天 14 天 21 天 28 天 时 间 ( 天 ) 图 1 淡 紫 拟 青 霉 FJAT-9041 在 香 蕉 不 同 处 理 根 基 土 壤 的 定 殖 香 蕉 移 栽 前 分 离 土 壤, 没 有 分 离 到 淡 紫 拟 青 霉 FJAT-9041, 香 蕉 移 栽 后 1 天 在 接 种 淡 紫 拟 青 霉 FJAT-9041 的 各 处 理 中 分 离 到 淡 紫 拟 青 霉 FJAT-9041, 分 离 到 的 淡 紫 拟 青 霉 菌 落 初 期 呈 白 色 隆 起, 菌 丝 致 密, 后 菌 落 变 粉 红 色, 经 形 态 鉴 定 为 淡 紫 拟 青 霉 FJAT-9041 处 理 1 处 理 2 处 理 3 处 理 6 移 栽 1 天 后 淡 紫 拟 青 霉 FJAT-9041 在 各 个 处 理 香 蕉 根 基 土 定 殖 量 分 别 为 5.0 10 7 5.5 10 7 5.0 10 7 cfu/g 6.5 10 7 cfu/g;28 天 后 淡 紫 拟 青 霉 FJAT-9041 在 各 个 处 理 香 蕉 根 基 土 定 殖 量 分 别 为 1.8 10 7 cfu/g 5.0 10 5 cfu/g 3.0 10 6 cfu/g 5.0 10 6 cfu/g,14 天 处 理 6 中 淡 紫 拟 青 霉 的 定 殖 量 最 高,14 天 后 处 理 1 中 淡 紫 拟 青 霉 FJAT-9041 的 定 殖 量 开 始 高 于 其 他 处 理 以 下 是 淡 紫 拟 青 霉 在 不 同 处 理 香 蕉 盆 栽 苗 不 同 时 间 的 照 片 处 理 1 1 天 5.0 10 7 cfu/g cfu/g 处 理 2 1 天 5.5 10 7 cfu/g cfu/g 处 理 3 1 天 5.0 10 7 cfu/g

15 处 理 6 1 天 6.5 10 7 cfu/g 处 理 1 7 天 4.6 10 7 cfu/g 处 理 2 7 天 8.0 10 6 cfu/g 处 理 3 7 天 9.0 10 6 cfu/g 处 理 6 7 天 7.0 10 7 cfu/g cfu/g 处 理 1 14 天 2.0 10 7 cfu/g 处 理 2 14 天 2.5 10 6 cfu/g 处 理 3 14 天 7.0 10 6 cfu/g cfu/g 处 理 6 14 天 1.8 10 8 cfu/g 处 理 1 21 天 1.0 10 7 cfu/g 处 理 2 21 天 2.0 10 6 cfu/g cf 处 理 3 21 天 6.5 10 6 cfu/g 处 理 6 21 天 5.5 10 6 cfu/g 处 理 1 28 天 1.8 10 7 cfu/g 处 理 2 28 天 5.0 10 5

16 处 理 3 28 天 3.0 10 6 cfu/g 处 理 6 28 天 5.0 10 6 cfu/g 图 2 淡 紫 拟 青 霉 FJAT-9041 在 香 蕉 不 同 处 理 根 基 土 壤 的 定 殖 4. 试 验 讨 论 处 理 1 处 理 2 处 理 3 处 理 6 移 栽 1 天 后 淡 紫 拟 青 霉 FJAT-9041 在 各 个 处 理 香 蕉 根 基 土 定 殖 量 分 别 为 5.0 10 7 5.5 10 7 5.0 10 7 cfu/g 6.5 10 7 cfu/g;28 天 后 淡 紫 拟 青 霉 FJAT-9041 在 各 个 处 理 香 蕉 根 基 土 定 殖 量 分 别 为 1.8 10 7 cfu/g 5.0 10 5 cfu/g 3.0 10 6 cfu/g 5.0 10 6 cfu/g,14 天 处 理 6 中 淡 紫 拟 青 霉 的 定 殖 量 最 高,14 天 后 处 理 1 中 淡 紫 拟 青 霉 FJAT-9041 的 定 殖 量 开 始 高 于 其 他 处 理 淡 紫 拟 青 霉 FJAT-9041 菌 液 和 生 物 肥 药 的 的 形 式 施 入 土 壤 中, 淡 紫 拟 青 霉 FJAT-9041 生 物 肥 药 较 孢 子 液 浇 灌 的 施 入 方 式 能 使 菌 株 在 围 香 蕉 土 壤 中 有 相 对 高 的 存 活 量, 而 液 体 流 状 物 的 形 式 容 易 在 土 壤 中 淋 溶 散 失, 不 利 于 长 期 存 活 可 能 由 于 淡 紫 拟 青 霉 FJAT-9041 生 物 肥 药 的 形 式 提 供 给 菌 株 以 介 质 的 固 着, 相 对 稳 定 的 留 存 在 土 壤 基 质 中, 这 样 有 利 于 淡 紫 拟 青 霉 FJAT-9041 对 土 传 病 害 的 长 效 控 制 5. 参 考 文 献 [1] 卓 国 豪, 黄 有 宝, 吴 运 新 等. 香 蕉 枯 萎 病 的 综 合 防 治 技 术 [ J]. 植 物 检 疫, 2003, 17( 5) : 279-280. [2] 王 文 华, 王 葵 娣, 曾 会 才. 香 蕉 枯 萎 病 的 危 害 及 其 防 治 策 略 [J]. 广 西 热 带 农 业, 2007, 3: 19-21. [3] 李 晓 杰, 徐 树 兰, 汤 历. 香 蕉 枯 萎 病 拮 抗 菌 的 筛 选 及 盆 栽 防 效 的 测 定 [J]. 广 东 农 业 科 学,2005 年 第 5 期 [4] 祝 明 亮, 夏 振 远, 张 克 勤, 李 天 飞, 刘 杏 忠. 淡 紫 拟 青 霉 在 烤 烟 根 际 定 殖 能 力 分 析 [J]. [5] 炳 欣, 张 平, 陈 晓 斌. 影 响 引 入 微 生 物 根 部 定 殖 的 因 素 J]. 应 用 生 态 学 报,2000, 11(6):951 一 953. [6] 成 儒 萍, 肖 炎 农. 淡 紫 拟 青 霉 在 作 物 根 围 及 土 壤 中 的 定 殖 研 究, 植 物 病 理 学. [7] 刘 杏 忠, 文 敏, 张 东 升. 定 殖 于 大 豆 胞 囊 线 虫 的 淡 紫 拟 青 霉 生 物 学 特 性 研 究 [J] 中 国 生 物 防 治, 1995,11(2):70 一 74. [8] 孙 漫 红, 刘 杏 忠. 淡 紫 拟 青 霉 在 大 豆 根 际 的 定 殖 对 根 际 微 生 物 的 影 响 [l]. 微 生 物 学 通 报,1995,

17 25(3):133 一 136 [9] 罗 明, 单 娜 娜, 文 起 凯 等. 几 种 固 沙 植 物 根 际 土 壤 微 生 物 特 性 研 究 [l]. 应 用 与 环 境 生 物 学 报, 2002,8(6):618 一 622 [10] 苏 涛, 司 美 茹, 马 宗 琪. 不 同 土 地 利 用 方 式 对 根 际 土 壤 微 生 物 数 量 的 影 响. 农 业 环 境 科 学 学 报, 2006,25( 增 刊 ):136 一 139 [11] 徐 瑞 富, 陆 宁 海, 张 定 法 等. 土 壤 不 同 微 生 物 量 对 木 霉 菌 定 殖 的 影 响 和 木 霉 菌 生 态 学 习 性 研 究 [J]. 中 国 生 态 农 业 学 报,2007,15(1):207 一 2008 试 验 负 责 史 怀 试 验 人 员 肖 马 云

18 编 号 : 农 业 微 生 物 研 究 中 心 [20110923] 共 6 页 承 担 单 位 : 福 建 省 农 科 院 农 业 生 物 资 源 研 究 所 试 验 设 计 : 试 验 项 目 : 淡 紫 拟 青 霉 FJAT-9041 在 不 同 处 理 香 蕉 根 基 土 壤 的 定 殖 动 态 ( 二 ) 试 验 人 员 : 肖 马 云 试 验 负 责 : 史 怀 报 告 日 期 :2011-09-23 计 数 月 份 :2011 年 08 月 研 究 资 格 系 数 (0.5-1.0) 实 验 设 计 系 数 (0.9-1.0 0.9-1.0) 报 告 得 分 总 分 实 验 设 计 实 验 记 载 实 验 分 析 实 验 简 报 实 验 文 章 1-20% 21-40% 41-60% 61-80% 81-100% 1%-5% 设 计 不 足, 实 施 错 误 6%-10% 设 计 不 全, 实 验 无 果 11%-15% 设 计 可 以, 实 施 不 全 16%-20% 设 计 完 整, 分 布 实 施 21%-25% 实 验 不 全, 记 载 无 果 26%-30% 实 验 不 足, 记 载 不 全 31%-35% 独 立 实 验, 记 载 不 全 36%-40% 分 布 实 验, 记 载 完 整 41%-45% 目 的 明 确, 实 验 完 成 46%-50% 实 验 完 整, 记 载 清 晰 51%-55% 实 验 系 统, 结 果 可 信 56%-60% 实 验 创 新, 分 析 清 晰 61%-65% 实 验 创 新, 结 论 清 晰 66%-70% 实 验 完 整, 统 计 清 晰 71%-75% 实 验 系 统, 数 据 可 靠 76%-80% 报 告 完 整, 文 章 雏 形 81%-85% 结 构 合 理, 分 析 有 据 86%-90% 逻 辑 清 晰, 统 计 合 理 91%-95% 图 表 完 整, 写 作 流 畅 96%-100% 文 献 完 整, 发 表 水 平 福 建 省 农 业 科 学 院 农 业 生 物 资 源 研 究 所 农 业 微 生 物 研 究 中 心 电 话 : 0591-87882571, 传 真 : 0591-87882571 fjat.yzxz.com

19 1. 试 验 目 的 香 蕉 枯 萎 病 又 名 香 蕉 巴 拿 马 病 黄 叶 病, 是 由 尖 孢 镰 刀 菌 古 巴 专 化 型 (Fusarium oxysporum f.sp.cubense) 引 起 的 维 管 束 坏 死 的 一 种 毁 灭 性 真 菌 病 害 和 典 型 的 土 传 病 害, 是 国 际 检 疫 对 象 [1] 尖 孢 镰 刀 菌 古 巴 专 化 型 (Fusarium oxysporum f.sp.cubense) 属 于 半 知 菌, 肉 座 目, 镰 刀 菌 属 香 蕉 枯 萎 病 菌 有 4 个 生 理 小 种, 生 理 小 种 4 号 几 乎 能 侵 染 所 有 香 蕉 品 种, 是 目 前 香 蕉 栽 培 品 种 的 主 要 威 胁, 我 [2] 国 香 蕉 枯 萎 病 主 要 由 生 理 小 种 4 号 侵 染 引 起 淡 紫 拟 青 霉 [Paecilomyces lilacinus (Thom) Samson] 属 于 半 知 菌 亚 门 (Deu-teromycotina), 丝 孢 纲 (Hyphomycetes), 丝 孢 目 (Hyphomycetales), 丛 梗 孢 科 (Moniliaceae), 拟 青 霉 属 (Paecilomyees Balnier), 国 内 外 很 多 研 究 人 员 对 这 种 生 防 菌 的 生 物 防 治 应 用 作 了 广 泛 研 究, 史 怀 等 报 道 淡 紫 拟 青 霉 多 糖 对 尖 孢 镰 刀 菌 有 明 显 抑 制 作 用, 他 们 筛 选 到 的 淡 紫 拟 青 霉 菌 株 NH - PL -03, 其 胞 内 外 多 糖 对 尖 孢 镰 刀 菌 的 菌 丝 生 长 及 孢 子 萌 发 均 有 明 显 的 抑 制 作 用, 抑 制 能 力 随 多 糖 浓 度 的 提 高 而 增 强, 显 示 了 良 好 的 生 防 潜 力, 这 为 尖 孢 镰 刀 的 生 物 防 治 提 供 了 新 3 思 路 本 试 验 室 筛 选 的 淡 紫 拟 青 霉 FJAT-9041 菌 株 对 对 香 蕉 枯 萎 病 菌 有 较 好 的 抑 制 作 用 [3], 但 缺 乏 对 该 菌 株 在 香 蕉 根 际 和 根 围 定 殖 能 力 和 对 香 蕉 枯 萎 病 防 治 应 用 的 了 解, 类 似 的 研 究 也 少 见 报 道 成 功 的 生 物 防 治 依 赖 于 对 生 防 菌 病 原 物 和 寄 主 植 物 相 互 关 系 的 彻 底 了 解 在 植 物 病 害 生 防 实 践 中, 生 防 菌 被 引 人 土 壤 时, 往 往 会 受 到 土 壤 抑 菌 作 用 及 生 防 菌 与 植 物 根 部 亲 和 能 力 的 影 响, 这 是 生 防 菌 防 治 植 物 病 害 防 效 不 稳 定 的 重 要 原 因 之 一 因 此, 作 为 生 防 因 子 的 生 防 菌 能 否 在 靶 植 物 根 际 定 殖 生 长 已 成 为 筛 选 评 定 土 传 病 害 生 防 菌 的 一 个 重 要 指 标, 并 最 终 决 定 该 生 防 菌 的 开 发 利 用 潜 力 [4] 本 研 究 通 过 评 价 淡 紫 拟 青 霉 FJAT-9041 在 香 蕉 根 基 定 殖 能 力, 为 香 蕉 枯 萎 病 菌 提 供 理 论 依 据 2. 试 验 方 法 2.1. 供 试 材 料 供 试 菌 株 : 生 防 菌 淡 紫 拟 青 霉 FJAT-9041 香 蕉 枯 萎 病 病 原 菌 FJAT-3076 为 尖 孢 镰 刀 菌, 由 福 建 省 农 科 院 农 业 生 物 资 源 研 究 所 微 生 物 中 心 提 供 香 蕉 苗, 生 长 情 况 一 致 的 4-5 叶 期 的 香 蕉 苗 2.2 试 验 方 法 2.2.1 淡 紫 拟 青 霉 FJAT-9041 的 发 酵 淡 紫 拟 青 霉 在 GUJS-50 AUTOBIO 型 自 动 机 械 搅 拌 不 锈 钢 发 酵 罐 发 酵 8 天, 发 酵 后 发 酵 液 孢 子 浓 度 为 3.0 10 8 cfu/ml 2.2.2 淡 紫 拟 青 霉 FJAT-9041 生 物 肥 药 的 制 备 发 酵 淡 紫 拟 青 霉 9041 发 酵 10 天 的 发 酵 液 与 锯 末 和 谷 壳 混 合 成 的 基 质 混 合, 淡 紫 拟 青 霉 9041 与 基 质 的 比 例 为 1:4, 混 合 均 匀 后 常 温 下 保 存 2.2.3 镰 刀 菌 FJAT-3076 菌 液 的 制 备 活 化 培 养 用 PDA 培 养 基, 菌 液 用 PDA 液 体 培 养 基,30 度 摇 床 180 转 2.2.4 试 验 处 理

20 试 验 设 以 下 处 理 处 理 1 只 施 生 物 肥 药 淡 紫 拟 青 霉 FJAT-9041 处 理 2 先 施 生 物 肥 药 淡 紫 拟 青 霉 FJAT-9041,7 天 后 接 种 香 蕉 镰 刀 菌 FJAT-3076 处 理 3 同 时 施 用 淡 紫 拟 青 霉 FJAT-9041 生 物 肥 药 和 接 种 香 蕉 枯 萎 病 菌 FJAT-3076 处 理 6 只 接 淡 紫 拟 青 霉 FJAT-9041 菌 液 接 种 淡 紫 拟 青 霉 FJAT-9041 孢 子 悬 浮 液 浓 度 为 3.0 10 8 cfu/ml, 生 物 肥 药 中 淡 紫 拟 青 霉 FJAT-9041 浓 度 为 6.0 10 7 cfu/g, 与 施 用 淡 紫 拟 青 霉 FJAT-9041 生 物 肥 药 后 8 天 开 始 分 离 不 同 处 理 的 根 际 土 壤, 每 7 天 分 离 一 次 每 个 处 理 25 株 香 蕉 苗, 每 株 一 盆 香 蕉 枯 萎 病 菌 FJAT-3076 制 好 的 发 酵 液, 浓 度 为 6.0 10 7 cfu/ml, 生 物 肥 药 淡 紫 拟 青 霉 9041 浓 度 生 物 肥 药 中 淡 紫 拟 青 霉 FJAT-9041 浓 度 为 6.0 10 7 cfu/g, 镰 刀 菌 用 伤 根 法 接 入, 每 株 苗 接 40-50ml 菌 液, 生 物 肥 药 淡 紫 拟 青 霉 9041 和 土 壤 的 比 例 为 1:10, 混 合 均 匀 后 施 入 每 隔 7 天 后 分 离 淡 紫 拟 青 霉 的 定 殖 动 态 2.2.5 菌 株 定 殖 测 定 方 法 每 次 取 样 采 用 5 点 取 样 法, 随 机 取 5 株, 采 取 5 株 的 根 际 土 壤 混 合 在 一 起, 称 量 10g, 各 处 理 平 板 测 定 设 四 次 重 复 2.2.6 淡 紫 拟 青 霉 在 香 蕉 根 基 土 壤 中 的 定 殖 测 定 挖 取 植 株 根 围 附 近 土 壤 作 为 根 基 土, 称 取 1 份 10g 土 样, 将 土 样 加 10ml 无 菌 水 振 荡 混 匀, 稀 释 适 当 倍 数 后 取 200ul 涂 板 菌 落 形 成 单 位 数 ( 个 /g)= 每 平 皿 菌 落 平 均 数 * 稀 释 倍 数 *5/ 土 壤 重 量 3. 试 验 结 果 表 1 淡 紫 拟 青 霉 FJAT-9041 在 香 蕉 不 同 处 理 根 基 土 壤 的 定 殖 不 同 35 天 42 天 60 天 90 天 处 理 (cfu/g) (cfu/g) (cfu/g) (cfu/g) 1 1.0 10 7 5.0 10 6 2.0 10 6 6.5 10 6 2 1.0 10 6 1.0 10 6 4.0 10 5 5.0 10 6 3 2.0 10 6 7.5 10 5 1.0 10 5 1.2 10 6 6 1.0 10 6 5.0 10 5 9.0 10 5 3.0 10 6 图 1 淡 紫 拟 青 霉 FJAT-9041 在 香 蕉 不 同 处 理 根 基 土 壤 的 定 殖

21 定 殖 量 (cfu/g) 12000000 10000000 8000000 6000000 4000000 2000000 0 35 天 42 天 60 天 90 天 处 理 1 处 理 2 处 理 3 处 理 6 时 间 ( 天 ) 图 1 淡 紫 拟 青 霉 FJAT-9041 在 香 蕉 不 同 处 理 根 基 土 壤 的 定 殖 各 处 理 中 分 离 到 淡 紫 拟 青 霉, 分 离 到 的 淡 紫 拟 青 霉 FJAT-9041 菌 落 初 期 呈 白 色 隆 起, 菌 丝 致 密, 后 菌 落 变 粉 红 色, 经 形 态 鉴 定 为 淡 紫 拟 青 霉 FJAT-9041 处 理 1 处 理 2 处 理 3 处 理 6 移 栽 后 35 天 淡 紫 拟 青 霉 FJAT-9041 在 各 个 处 理 香 蕉 根 基 土 壤 的 定 殖 量 为 1.0 10 7 cfu/g 1.0 10 6 cfu/g 2.0 10 6 cfu/g 1.0 10 6 cfu/g;90 天 淡 紫 拟 青 霉 FJAT-9041 在 各 个 处 理 香 蕉 根 基 土 壤 的 定 殖 量 为 6.5 10 6 cfu/g 5.0 10 6 cfu/g 1.2 10 6 cfu/g 3.0 10 6 cfu/g, 期 间 在 42 天 和 60 天 有 些 处 理 淡 紫 拟 青 霉 FJAT-9041 定 殖 量 有 些 下 降,90 天 的 定 殖 量 略 有 上 升 以 下 是 淡 紫 拟 青 霉 在 不 同 处 理 香 蕉 盆 栽 苗 不 同 时 间 的 照 片 处 理 1 35 天 1 10 7 cfu/g 处 理 2 35 天 1 10 6 cfu/g 处 理 3 35 天 2.0 10 6 cfu/g

22 处 理 6 35 天 1.0 10 6 cfu/g 处 理 1 42 天 5 10 6 cfu/g 处 理 2 42 天 1 10 6 cfu/g 处 理 3 42 天 7.5 10 5 cfu/g 处 理 6 42 天 5.0 10 5 cfu/g 处 理 1 60 天 2 10 6 cfu/g 处 理 2 60 天 4.0 10 5 cfu/g 处 理 3 60 天 1.0 10 5 cfu/g 处 理 6 60 天 9.0 10 5 cfu/g 处 理 1 90 天 6.5 10 6 cfu/g 处 理 2 90 天 5.0 10 6 cfu/g 处 理 3 90 天 1.2 10 6 cfu/g 处 理 6 90 天 3.0 10 6 cfu/g

23 图 2 淡 紫 拟 青 霉 FJAT-9041 在 香 蕉 不 同 处 理 根 基 土 壤 的 定 殖 4. 试 验 讨 论 各 处 理 中 分 离 到 淡 紫 拟 青 霉, 分 离 到 的 淡 紫 拟 青 霉 FJAT-9041 菌 落 初 期 呈 白 色 隆 起, 菌 丝 致 密, 后 菌 落 变 粉 红 色, 经 形 态 鉴 定 为 淡 紫 拟 青 霉 FJAT-9041 处 理 1 处 理 2 处 理 3 处 理 6 移 栽 后 35 天 淡 紫 拟 青 霉 FJAT-9041 在 各 个 处 理 香 蕉 根 基 土 壤 的 定 殖 量 为 1.0 10 7 cfu/g 1.0 10 6 cfu/g 2.0 10 6 cfu/g 1.0 10 6 cfu/g;90 天 淡 紫 拟 青 霉 FJAT-9041 在 各 个 处 理 香 蕉 根 基 土 壤 的 定 殖 量 为 6.5 10 6 cfu/g 5.0 10 6 cfu/g 1.2 10 6 cfu/g 3.0 10 6 cfu/g, 期 间 在 42 天 和 60 天 有 些 处 理 淡 紫 拟 青 霉 FJAT-9041 定 殖 量 有 些 下 降,90 天 的 定 殖 量 略 有 上 升 以 淡 紫 拟 青 霉 FJAT-9041 菌 液 和 生 物 肥 药 的 的 形 式 施 入 土 壤 中, 在 香 蕉 根 基 土 壤 的 定 殖 能 力 总 趋 势 随 时 间 的 延 长 而 降 低, 以 淡 紫 拟 青 霉 FJAT-9041 生 物 肥 药 施 入 再 分 离 所 测 定 的 生 物 量 较 孢 子 液 浇 灌 大,90d 后 菌 株 以 生 物 肥 药 拌 土 和 菌 液 浇 灌 在 香 蕉 根 围 土 壤 的 存 活 量 分 别 在 10 6 级 的 数 量 级, 淡 紫 拟 青 霉 FJAT-9041 生 物 肥 药 拌 土 的 形 式 较 利 于 菌 株 在 土 壤 中 的 长 期 存 活 淡 紫 拟 青 霉 FJAT-9041 菌 液 和 生 物 肥 药 的 的 形 式 施 入 土 壤 中, 淡 紫 拟 青 霉 FJAT-9041 生 物 肥 药 较 孢 子 液 浇 灌 的 施 入 方 式 能 使 菌 株 在 围 香 蕉 土 壤 中 有 相 对 高 的 存 活 量, 而 液 体 流 状 物 的 形 式 容 易 在 土 壤 中 淋 溶 散 失, 不 利 于 长 期 存 活 可 能 由 于 淡 紫 拟 青 霉 FJAT-9041 生 物 肥 药 的 形 式 提 供 给 菌 株 以 介 质 的 固 着, 相 对 稳 定 的 留 存 在 土 壤 基 质 中, 这 样 有 利 于 淡 紫 拟 青 霉 FJAT-9041 对 土 传 病 害 的 长 效 控 制 5. 参 考 文 献 [1] 卓 国 豪, 黄 有 宝, 吴 运 新 等. 香 蕉 枯 萎 病 的 综 合 防 治 技 术 [ J]. 植 物 检 疫, 2003, 17( 5) : 279-280. [2] 王 文 华, 王 葵 娣, 曾 会 才. 香 蕉 枯 萎 病 的 危 害 及 其 防 治 策 略 [J]. 广 西 热 带 农 业, 2007, 3: 19-21. [3] 李 晓 杰, 徐 树 兰, 汤 历. 香 蕉 枯 萎 病 拮 抗 菌 的 筛 选 及 盆 栽 防 效 的 测 定 [J]. 广 东 农 业 科 学,2005 年 第 5 期 [4] 祝 明 亮, 夏 振 远, 张 克 勤, 李 天 飞, 刘 杏 忠. 淡 紫 拟 青 霉 在 烤 烟 根 际 定 殖 能 力 分 析 [J]. [5] 炳 欣, 张 平, 陈 晓 斌. 影 响 引 入 微 生 物 根 部 定 殖 的 因 素 J]. 应 用 生 态 学 报,2000, 11(6):951 一 953. [6] 成 儒 萍, 肖 炎 农. 淡 紫 拟 青 霉 在 作 物 根 围 及 土 壤 中 的 定 殖 研 究, 植 物 病 理 学. [7] 刘 杏 忠, 文 敏, 张 东 升. 定 殖 于 大 豆 胞 囊 线 虫 的 淡 紫 拟 青 霉 生 物 学 特 性 研 究 [J] 中 国 生 物 防 治, 1995,11(2):70 一 74. [8] 孙 漫 红, 刘 杏 忠. 淡 紫 拟 青 霉 在 大 豆 根 际 的 定 殖 对 根 际 微 生 物 的 影 响 [l]. 微 生 物 学 通 报,1995, 25(3):133 一 136 [9] 罗 明, 单 娜 娜, 文 起 凯 等. 几 种 固 沙 植 物 根 际 土 壤 微 生 物 特 性 研 究 [l]. 应 用 与 环 境 生 物 学 报, 2002,8(6):618 一 622

24 [10] 苏 涛, 司 美 茹, 马 宗 琪. 不 同 土 地 利 用 方 式 对 根 际 土 壤 微 生 物 数 量 的 影 响. 农 业 环 境 科 学 学 报, 2006,25( 增 刊 ):136 一 139 [11] 徐 瑞 富, 陆 宁 海, 张 定 法 等. 土 壤 不 同 微 生 物 量 对 木 霉 菌 定 殖 的 影 响 和 木 霉 菌 生 态 学 习 性 研 究 [J]. 中 国 生 态 农 业 学 报,2007,15(1):207 一 2008 试 验 负 责 史 怀 试 验 人 员 肖 马 云

25 2011-09-09 承 担 单 位 : 福 建 省 农 科 院 农 业 生 物 资 源 研 究 所 试 验 设 计 : 刘 国 红 试 验 项 目 : 获 菌 量 为 60 毫 克 时 脂 肪 酸 检 测 及 结 果 分 析 试 验 人 员 : 王 子 旋 试 验 负 责 : 林 营 志 报 告 日 期 :2011-09-9 计 数 月 份 :2011 年 08 月 研 究 资 格 系 数 (0.5. 1.0) 实 验 设 计 系 数 (0.9. 1.0) 报 告 得 分 总 分 实 验 设 计 实 验 记 载 实 验 分 析 实 验 简 报 实 验 文 章 1. 20% 21. 40% 41. 60% 61. 80% 81. 100% 1%. 5% 设 计 不 足, 实 施 错 误 6%. 10% 设 计 不 全, 实 验 无 果 11%. 15% 设 计 可 以, 实 施 不 全 16%. 20% 设 计 完 整, 分 布 实 施 21%. 25% 实 验 不 全, 记 载 无 果 26%. 30% 实 验 不 足, 记 载 不 全 31%. 35% 独 立 实 验, 记 载 不 全 36%. 40% 分 布 实 验, 记 载 完 整 41%. 45% 目 的 明 确, 实 验 完 成 46%. 50% 实 验 完 整, 记 载 清 晰 51%. 55% 实 验 系 统, 结 果 可 信 56%. 60% 实 验 创 新, 分 析 清 晰 61%. 65% 实 验 创 新, 结 论 清 晰 66%. 70% 实 验 完 整, 统 计 清 晰 71%. 75% 实 验 系 统, 数 据 可 靠 76%. 80% 报 告 完 整, 文 章 雏 形 81%. 85% 结 构 合 理, 分 析 有 据 86%. 90% 逻 辑 清 晰, 统 计 合 理 91%. 95% 图 表 完 整, 写 作 流 畅 96%. 100% 文 献 完 整, 发 表 水 平 福 建 省 农 业 科 学 院 农 业 生 物 资 源 研 究 所 农 业 微 生 物 研 究 中 心 电 话 : 0591. 87882571, 传 真 : 0591. 87882571 fjat.yzxz.com

26 1 试 验 目 的 脂 肪 酸 是 微 生 物 细 胞 组 分 中 一 种 稳 定 而 富 有 的 重 要 成 分, 它 和 细 菌 的 遗 传 变 异 毒 力 耐 药 性 等 有 极 为 密 切 的 关 系, 它 的 种 类 和 含 量 是 细 胞 化 分 类 法 的 重 要 依 据 之 一 [1] 气 相 色 谱 分 析 技 术 能 快 速 [2 3] 灵 敏 精 确 地 检 测 出 细 菌 细 胞 内 的 脂 肪 酸, 是 一 种 重 要 的 化 学 分 类 途 径 脂 肪 酸 的 提 取 方 法 是 由 MIDI 公 司 提 供 主 要 步 骤 分 为 获 菌, 皂 化, 甲 基 化, 萃 取, 洗 涤 五 个 部 分, 据 相 关 文 献 简 绍 获 菌 量 是 影 响 脂 肪 酸 种 类 和 含 量 的 主 要 因 素, 因 此, 本 实 验 对 影 响 取 脂 肪 酸 鉴 定 的 获 菌 量 进 行 了 研 究 2 试 验 方 法 2.1 检 测 仪 器 全 自 动 微 生 物 检 测 系 统 (sherlock MIDI) 2.2 材 料 标 准 菌 株 编 号 :8754,8755,8756,8757,8758,8759,8760,8761,8762,8763,8764,8765,8766,8767, 8768,8769,8770,8771,8772,8773. 实 验 设 计 : 对 这 21 株 标 准 菌 株 的 获 菌 量 以 MIDI 系 统 提 供 的 40 毫 克 为 基 础, 左 右 各 取 两 个 值 进 行 设 置, 分 别 为 20,30,40,50,60 五 个 梯 度 本 实 验 先 以 获 菌 量 为 40 毫 克 进 行 研 究 2.3 脂 肪 酸 提 取 前 处 理 试 剂 试 剂 一 :NaOH 45g+ 甲 醇 150 ml + 去 离 子 水 150 ml, 水 和 甲 醇 混 合 后 再 加 入 NaOH, 同 时 搅 拌 至 完 全 溶 解 试 剂 二 :6.00N 盐 酸 325 ml + 甲 醇 275 ml, 把 盐 酸 加 入 到 甲 醇 中, 并 不 断 搅 拌 试 剂 三 : 正 己 烷 200ML+MTBE()200ML, 把 MTBE 加 入 到 正 己 烷 中, 并 不 断 搅 拌 试 剂 四 :NaOH 10.8g+ 去 离 子 蒸 馏 水 900ML. 2.4 提 取 步 骤 2.4.1 菌 株 的 培 养 将 NA 平 板 上 的 菌 株 接 种 到 TSBA 上, 置 于 30 培 养 箱 中 培 养 24h. 2.4.2 提 取 步 骤 : 2.4.3 获 菌 用 接 种 环 挑 取 20 毫 克 芽 孢 杆 菌 置 于 耐 酸 耐 碱 管 底 部 2.4.4 皂 化 ( 强 烈 的 甲 醇 随 着 加 热 杀 菌 及 溶 解 细 菌 ) 在 装 有 菌 体 的 耐 酸 耐 碱 管 中 加 入 1.0ML 试 剂 1, 锁 紧 盖 子, 震 荡 试 管 5. 10s,95. 100 水 浴 5min, 从 沸 水 浴 中 移 出 耐 酸 耐 碱 管 并 轻 微 冷 却, 震 荡 5. 10s, 在 水 浴 25min, 取 出 室 温 冷 却 2.4.5 甲 基 化 ( 甲 基 化 转 换 脂 肪 酸 成 甲 基 酯 脂 肪 酸 以 增 加 脂 肪 酸 的 挥 发 性 以 供 GC 分 析 ) 加 入 试 剂 2 2ML, 拧 紧 盖 子, 震 荡 5. 10s,80 水 浴 10min, 移 开 且 快 速 用 流 动 的 自 来 水 冷 却 至 室 温 2.4.6 萃 取 ( 甲 基 酯 脂 肪 酸 从 酸 性 水 相 移 出 转 移 到 一 个 有 机 相 的 萃 取 过 程 ) 加 入 1.25ML 的 试 剂 3 萃 取 溶 剂, 拧 紧 盖 子, 温 和 旋 转 10min, 打 开 盖 子, 用 干 净 的 移 液 管 取 出 下 层

27 似 水 部 分, 弃 去 2.4.7 基 本 洗 涤 ( 从 有 机 相 中 移 去 自 由 的 脂 肪 ) 加 入 3.0ML 试 剂 4, 拧 紧 盖 子, 温 和 旋 转 5min, 打 开 盖 子, 利 用 干 净 的 移 液 管 移 取 2/3 体 积 的 上 层 有 机 相 到 干 净 的 GC 检 测 小 瓶 ( 此 过 程 要 小 心, 宁 可 少 取 有 机 相, 绝 不 可 吸 入 水 相, 否 则 会 损 坏 色 谱 仪 的 色 谱 柱 ) 2.5 上 样 测 定 脂 肪 酸 2.6 数 据 库 比 对 3 试 验 结 果 1) 实 验 结 果 见 错 误! 未 找 到 引 用 源 2) 测 试 所 的 结 果 如 表 1 表 1 菌 株 编 号 SI 值 MIDI 检 测 结 果 8754 0.709 Bacillus-subtilis 8755d 0.861 Bacillus-atrophaeus 8757d 0.458 Bacillus-badius 8760d 0.88 Bacillus-cereus-GC subgroup A 8761d 0.542 Virgibacillus-pantothenticus (Bacillus) 8771d 0.858 Bacillus-licheniformis (Bacillus subtilis group) 8756d 0.694 Brevibacillus-parabrevis-GC subgroup B 8758d 0.547 Bacillus-subtilis 8774d 0.59 Virgibacillus-pantothenticus (Bacillus) 8754d 0.709 Bacillus-subtilis 8762d 0.174 Geobacillus-stearothermophilus-GC subgroup A (55C, Bacillus) 8764d 0.701 Bacillus-subtilis 8766d 0.544 Bacillus-sphaericus-GC subgroup D 8768d 0.74 Staphylococcus-cohnii-cohnii 8769d 0.682 Brevibacillus-parabrevis-GC subgroup B 8770d 0.671 Bacillus-cereus-GC subgroup A 8772d 0.661 Arthrobacter-globiformis-GC subgroup A (some 48h) 8773d 0.278 Bacillus-alcalophilus (some 48h) 菌 株 编 号 SI 值 MIDI 检 测 结 果 8754e 0.689 Bacillus-subtilis 8755e 0.739 Bacillus-atrophaeus 8757e 0.489 Bacillus-badius 8760e 0.822 Bacillus-cereus-GC subgroup A 8761e 0.554 Virgibacillus-pantothenticus (Bacillus)

28 8771e 0.854 Bacillus-licheniformis (Bacillus subtilis group) 8756e 0.699 Brevibacillus-parabrevis-GC subgroup B 8758e 0.516 Bacillus-subtilis 8774e 0.568 Virgibacillus-pantothenticus (Bacillus) 8754e 0.689 Bacillus-subtilis 8762e 0.109 Geobacillus-stearothermophilus-GC subgroup B (55C, Bacillus) 8764e 0.753 Bacillus-subtilis 8766e 0.575 Bacillus-sphaericus-GC subgroup D 8768e 0.781 Staphylococcus-cohnii-cohnii 8770e 0.771 Bacillus-cereus-GC subgroup A 8772e 0.666 Arthrobacter-globiformis-GC subgroup A (some 48h) 4 试 验 讨 论 从 下 图 可 以 看 出 SI 值 小 于 0.5 的 菌 株 有 2 株, 根 据 MIDI 中 提 到 的 当 SI 值 在 0.5~0.3 之 间, 则 表 明 第 一 选 择 与 第 二 选 择 分 开, 鉴 定 可 能 成 功, 但 是 第 一 选 择 所 列 的 菌 种 为 非 典 型 的 菌 株 当 SI 值 小 于 0.300 时, 则 认 为 该 菌 株 不 存 在 于 数 据 库 中, 所 以 菌 株 8762 可 能 数 据 库 中 没 有 该 菌 株, 通 过 检 查 数 据 库 发 现 数 据 库 中 确 实 没 有 标 准 菌 株, 通 过 本 实 验 可 以 说 明 MIDI 鉴 定 系 统 的 准 确 率 较 好 图 1 不 同 菌 量 与 SI 值 比 较 5 参 考 文 献 [1] 张 国 赏, 吴 文 鹃, 潘 仁 瑞. 气 相 色 谱 一 质 谱 法 检 测 细 胞 脂 肪 酸 及 其 在 细 菌 鉴 定 上 的 应 用 [J]. 合 肥 联 合 大 学 学 报.2000,10(4):92. 96. [2] ROSE D P, CONNOLLY J M. Omega 一 3 fatty acids as cancer chemo. preventive agents [J].

29 Pharmacol Therap.1999,83:217 223. [3] 黄 伟 坤. 食 品 检 验 与 分 析 [M]. 北 京 : 中 国 轻 工 业 出 版 社.2000:23. 试 验 负 责 : 林 营 志 试 验 人 员 : 王 子 旋

30 2011-09-09 承 担 单 位 : 福 建 省 农 科 院 农 业 生 物 资 源 研 究 所 试 验 设 计 : 刘 国 红 试 验 项 目 : 获 菌 量 为 50 毫 克 时 脂 肪 酸 检 测 及 结 果 分 析 试 验 人 员 : 王 子 旋 试 验 负 责 : 林 营 志 报 告 日 期 :2011-09-9 计 数 月 份 :2011 年 08 月 研 究 资 格 系 数 (0.5. 1.0) 实 验 设 计 系 数 (0.9. 1.0) 报 告 得 分 总 分 实 验 设 计 实 验 记 载 实 验 分 析 实 验 简 报 实 验 文 章 1. 20% 21. 40% 41. 60% 61. 80% 81. 100% 1%. 5% 设 计 不 足, 实 施 错 误 6%. 10% 设 计 不 全, 实 验 无 果 11%. 15% 设 计 可 以, 实 施 不 全 16%. 20% 设 计 完 整, 分 布 实 施 21%. 25% 实 验 不 全, 记 载 无 果 26%. 30% 实 验 不 足, 记 载 不 全 31%. 35% 独 立 实 验, 记 载 不 全 36%. 40% 分 布 实 验, 记 载 完 整 41%. 45% 目 的 明 确, 实 验 完 成 46%. 50% 实 验 完 整, 记 载 清 晰 51%. 55% 实 验 系 统, 结 果 可 信 56%. 60% 实 验 创 新, 分 析 清 晰 61%. 65% 实 验 创 新, 结 论 清 晰 66%. 70% 实 验 完 整, 统 计 清 晰 71%. 75% 实 验 系 统, 数 据 可 靠 76%. 80% 报 告 完 整, 文 章 雏 形 81%. 85% 结 构 合 理, 分 析 有 据 86%. 90% 逻 辑 清 晰, 统 计 合 理 91%. 95% 图 表 完 整, 写 作 流 畅 96%. 100% 文 献 完 整, 发 表 水 平 福 建 省 农 业 科 学 院 农 业 生 物 资 源 研 究 所 农 业 微 生 物 研 究 中 心 电 话 : 0591. 87882571, 传 真 : 0591. 87882571 fjat.yzxz.com

31 1 试 验 目 的 脂 肪 酸 是 微 生 物 细 胞 组 分 中 一 种 稳 定 而 富 有 的 重 要 成 分, 它 和 细 菌 的 遗 传 变 异 毒 力 耐 药 性 等 有 极 为 密 切 的 关 系, 它 的 种 类 和 含 量 是 细 胞 化 分 类 法 的 重 要 依 据 之 一 [1] 气 相 色 谱 分 析 技 术 能 快 速 [2 3] 灵 敏 精 确 地 检 测 出 细 菌 细 胞 内 的 脂 肪 酸, 是 一 种 重 要 的 化 学 分 类 途 径 脂 肪 酸 的 提 取 方 法 是 由 MIDI 公 司 提 供 主 要 步 骤 分 为 获 菌, 皂 化, 甲 基 化, 萃 取, 洗 涤 五 个 部 分, 据 相 关 文 献 简 绍 获 菌 量 是 影 响 脂 肪 酸 种 类 和 含 量 的 主 要 因 素, 因 此, 本 实 验 对 影 响 取 脂 肪 酸 鉴 定 的 获 菌 量 进 行 了 研 究 2 试 验 方 法 2.1 检 测 仪 器 全 自 动 微 生 物 检 测 系 统 (sherlock MIDI) 2.2 材 料 标 准 菌 株 编 号 :8754,8755,8756,8757,8758,8759,8760,8761,8762,8763,8764,8765,8766,8767, 8768,8769,8770,8771,8772,8773. 实 验 设 计 : 对 这 21 株 标 准 菌 株 的 获 菌 量 以 MIDI 系 统 提 供 的 40 毫 克 为 基 础, 左 右 各 取 两 个 值 进 行 设 置, 分 别 为 20,30,40,50,60 五 个 梯 度 本 实 验 先 以 获 菌 量 为 40 毫 克 进 行 研 究 2.3 脂 肪 酸 提 取 前 处 理 试 剂 试 剂 一 :NaOH 45g+ 甲 醇 150 ml + 去 离 子 水 150 ml, 水 和 甲 醇 混 合 后 再 加 入 NaOH, 同 时 搅 拌 至 完 全 溶 解 试 剂 二 :6.00N 盐 酸 325 ml + 甲 醇 275 ml, 把 盐 酸 加 入 到 甲 醇 中, 并 不 断 搅 拌 试 剂 三 : 正 己 烷 200ML+MTBE()200ML, 把 MTBE 加 入 到 正 己 烷 中, 并 不 断 搅 拌 试 剂 四 :NaOH 10.8g+ 去 离 子 蒸 馏 水 900ML. 2.4 提 取 步 骤 2.4.1 菌 株 的 培 养 将 NA 平 板 上 的 菌 株 接 种 到 TSBA 上, 置 于 30 培 养 箱 中 培 养 24h. 2.4.2 提 取 步 骤 : (1) 获 菌 用 接 种 环 挑 取 20 毫 克 芽 孢 杆 菌 置 于 耐 酸 耐 碱 管 底 部 (2) 皂 化 ( 强 烈 的 甲 醇 随 着 加 热 杀 菌 及 溶 解 细 菌 ) 在 装 有 菌 体 的 耐 酸 耐 碱 管 中 加 入 1.0ML 试 剂 1, 锁 紧 盖 子, 震 荡 试 管 5. 10s,95. 100 水 浴 5min, 从 沸 水 浴 中 移 出 耐 酸 耐 碱 管 并 轻 微 冷 却, 震 荡 5. 10s, 在 水 浴 25min, 取 出 室 温 冷 却 (3) 甲 基 化 ( 甲 基 化 转 换 脂 肪 酸 成 甲 基 酯 脂 肪 酸 以 增 加 脂 肪 酸 的 挥 发 性 以 供 GC 分 析 ) 加 入 试 剂 2 2ML, 拧 紧 盖 子, 震 荡 5. 10s,80 水 浴 10min, 移 开 且 快 速 用 流 动 的 自 来 水 冷 却 至 室 温 (4) 萃 取 ( 甲 基 酯 脂 肪 酸 从 酸 性 水 相 移 出 转 移 到 一 个 有 机 相 的 萃 取 过 程 ) 加 入 1.25ML 的 试 剂 3 萃 取 溶 剂, 拧 紧 盖 子, 温 和 旋 转 10min, 打 开 盖 子, 用 干 净 的 移 液 管 取 出 下 层

32 似 水 部 分, 弃 去 (5) 基 本 洗 涤 ( 从 有 机 相 中 移 去 自 由 的 脂 肪 ) 加 入 3.0ML 试 剂 4, 拧 紧 盖 子, 温 和 旋 转 5min, 打 开 盖 子, 利 用 干 净 的 移 液 管 移 取 2/3 体 积 的 上 层 有 机 相 到 干 净 的 GC 检 测 小 瓶 ( 此 过 程 要 小 心, 宁 可 少 取 有 机 相, 绝 不 可 吸 入 水 相, 否 则 会 损 坏 色 谱 仪 的 色 谱 柱 ) 2.5 上 样 测 定 脂 肪 酸 2.6 数 据 库 比 对 3 试 验 结 果 3) 实 验 结 果 见 错 误! 未 找 到 引 用 源 4) 测 试 所 的 结 果 如 表 1 表 2 菌 株 编 号 SI 值 MIDI 检 测 结 果 8754 0.709 Bacillus-subtilis 8755d 0.861 Bacillus-atrophaeus 8757d 0.458 Bacillus-badius 8760d 0.88 Bacillus-cereus-GC subgroup A 8761d 0.542 Virgibacillus-pantothenticus (Bacillus) 8771d 0.858 Bacillus-licheniformis (Bacillus subtilis group) 8756d 0.694 Brevibacillus-parabrevis-GC subgroup B 8758d 0.547 Bacillus-subtilis 8774d 0.59 Virgibacillus-pantothenticus (Bacillus) 8754d 0.709 Bacillus-subtilis 8762d 0.174 Geobacillus-stearothermophilus-GC subgroup A (55C, Bacillus) 8764d 0.701 Bacillus-subtilis 8766d 0.544 Bacillus-sphaericus-GC subgroup D 8768d 0.74 Staphylococcus-cohnii-cohnii 8769d 0.682 Brevibacillus-parabrevis-GC subgroup B 8770d 0.671 Bacillus-cereus-GC subgroup A 8772d 0.661 Arthrobacter-globiformis-GC subgroup A (some 48h) 8773d 0.278 Bacillus-alcalophilus (some 48h) 4 试 验 讨 论 从 下 图 可 以 看 出 SI 值 小 于 0.5 的 菌 株 有 3 株, 根 据 MIDI 中 提 到 的 当 SI 值 在 0.5~0.3 之 间, 则 表 明 第 一 选 择 与 第 二 选 择 分 开, 鉴 定 可 能 成 功, 但 是 第 一 选 择 所 列 的 菌 种 为 非 典 型 的 菌 株 当 SI 值 小 于 0.300 时, 则 认 为 该 菌 株 不 存 在 于 数 据 库 中, 所 以 菌 株 8762,8773 可 能 数 据 库 中 没 有 该 菌 株, 通 过 检 查 数 据 库 发 现 数 据 库 中 确 实 没 有 标 准 菌 株 8773(Bacillus massilienis), 通 过 本 实 验 可 以 说 明 MIDI

33 鉴 定 系 统 的 准 确 率 较 好 图 2 不 同 菌 量 与 SI 值 比 较 5 参 考 文 献 张 国 赏, 吴 文 鹃, 潘 仁 瑞 气 相 色 谱 一 质 谱 法 检 测 细 胞 脂 肪 酸 及 其 在 细 菌 鉴 定 上 的 应 用 [J] 合 肥 联 合 大 学 学 报 2000,10(4):92. 96 ROSE D P,CONNOLLY J M.Omega 一 3 fatty acids as cancer chemo. preventive agents [J].Pharmacol Therap.1999,83:217 223. 黄 伟 坤 食 品 检 验 与 分 析 [M] 北 京 : 中 国 轻 工 业 出 版 社.2000:23 试 验 负 责 : 林 营 志 试 验 人 员 : 王 子 旋

34 2011-08-09 承 担 单 位 : 福 建 省 农 科 院 农 业 生 物 资 源 研 究 所 试 验 设 计 : 刘 国 红 试 验 项 目 : 获 菌 量 为 40 毫 克 时 脂 肪 酸 检 测 试 验 人 员 : 王 子 旋 试 验 负 责 : 林 营 志 报 告 日 期 :2011-08-9 计 数 月 份 :2011 年 07 月 研 究 资 格 系 数 (0.5. 1.0) 实 验 设 计 系 数 (0.9. 1.0) 报 告 得 分 总 分 实 验 设 计 实 验 记 载 实 验 分 析 实 验 简 报 实 验 文 章 1. 20% 21. 40% 41. 60% 61. 80% 81. 100% 1%. 5% 设 计 不 足, 实 施 错 误 6%. 10% 设 计 不 全, 实 验 无 果 11%. 15% 设 计 可 以, 实 施 不 全 16%. 20% 设 计 完 整, 分 布 实 施 21%. 25% 实 验 不 全, 记 载 无 果 26%. 30% 实 验 不 足, 记 载 不 全 31%. 35% 独 立 实 验, 记 载 不 全 36%. 40% 分 布 实 验, 记 载 完 整 41%. 45% 目 的 明 确, 实 验 完 成 46%. 50% 实 验 完 整, 记 载 清 晰 51%. 55% 实 验 系 统, 结 果 可 信 56%. 60% 实 验 创 新, 分 析 清 晰 61%. 65% 实 验 创 新, 结 论 清 晰 66%. 70% 实 验 完 整, 统 计 清 晰 71%. 75% 实 验 系 统, 数 据 可 靠 76%. 80% 报 告 完 整, 文 章 雏 形 81%. 85% 结 构 合 理, 分 析 有 据 86%. 90% 逻 辑 清 晰, 统 计 合 理 91%. 95% 图 表 完 整, 写 作 流 畅 96%. 100% 文 献 完 整, 发 表 水 平 福 建 省 农 业 科 学 院 农 业 生 物 资 源 研 究 所 农 业 微 生 物 研 究 中 心 电 话 : 0591. 87882571, 传 真 : 0591. 87882571 fjat.yzxz.com

35 1 试 验 目 的 脂 肪 酸 是 微 生 物 细 胞 组 分 中 一 种 稳 定 而 富 有 的 重 要 成 分, 它 和 细 菌 的 遗 传 变 异 毒 力 耐 药 性 等 有 极 为 密 切 的 关 系, 它 的 种 类 和 含 量 是 细 胞 化 分 类 法 的 重 要 依 据 之 一 [1] 气 相 色 谱 分 析 技 术 能 快 速 [2 3] 灵 敏 精 确 地 检 测 出 细 菌 细 胞 内 的 脂 肪 酸, 是 一 种 重 要 的 化 学 分 类 途 径 脂 肪 酸 的 提 取 方 法 是 由 MIDI 公 司 提 供 主 要 步 骤 分 为 获 菌, 皂 化, 甲 基 化, 萃 取, 洗 涤 五 个 部 分, 据 相 关 文 献 简 绍 获 菌 量 是 影 响 脂 肪 酸 种 类 和 含 量 的 主 要 因 素, 因 此, 本 实 验 对 影 响 取 脂 肪 酸 鉴 定 的 获 菌 量 进 行 了 研 究 2 试 验 方 法 2.1 检 测 仪 器 全 自 动 微 生 物 检 测 系 统 (sherlock MIDI) 2.2 材 料 标 准 菌 株 编 号 :8754,8755,8756,8757,8758,8759,8760,8761,8762,8763,8764,8765,8766,8767, 8768,8769,8770,8771,8772,8773. 实 验 设 计 : 对 这 21 株 标 准 菌 株 的 获 菌 量 以 MIDI 系 统 提 供 的 40 毫 克 为 基 础, 左 右 各 取 两 个 值 进 行 设 置, 分 别 为 20,30,40,50,60 五 个 梯 度 本 实 验 先 以 获 菌 量 为 40 毫 克 进 行 研 究 2.3 脂 肪 酸 提 取 前 处 理 试 剂 试 剂 一 :NaOH 45g+ 甲 醇 150 ml + 去 离 子 水 150 ml, 水 和 甲 醇 混 合 后 再 加 入 NaOH, 同 时 搅 拌 至 完 全 溶 解 试 剂 二 :6.00N 盐 酸 325 ml + 甲 醇 275 ml, 把 盐 酸 加 入 到 甲 醇 中, 并 不 断 搅 拌 试 剂 三 : 正 己 烷 200ML+MTBE()200ML, 把 MTBE 加 入 到 正 己 烷 中, 并 不 断 搅 拌 试 剂 四 :NaOH 10.8g+ 去 离 子 蒸 馏 水 900ML. 2.4 提 取 步 骤 2.4.1 菌 株 的 培 养 将 NA 平 板 上 的 菌 株 接 种 到 TSBA 上, 置 于 30 培 养 箱 中 培 养 24h. 2.4.2 提 取 步 骤 : 2.4.3 获 菌 用 接 种 环 挑 取 20 毫 克 芽 孢 杆 菌 置 于 耐 酸 耐 碱 管 底 部 2.4.4 皂 化 ( 强 烈 的 甲 醇 随 着 加 热 杀 菌 及 溶 解 细 菌 ) 在 装 有 菌 体 的 耐 酸 耐 碱 管 中 加 入 1.0ML 试 剂 1, 锁 紧 盖 子, 震 荡 试 管 5. 10s,95. 100 水 浴 5min, 从 沸 水 浴 中 移 出 耐 酸 耐 碱 管 并 轻 微 冷 却, 震 荡 5. 10s, 在 水 浴 25min, 取 出 室 温 冷 却 2.4.5 甲 基 化 ( 甲 基 化 转 换 脂 肪 酸 成 甲 基 酯 脂 肪 酸 以 增 加 脂 肪 酸 的 挥 发 性 以 供 GC 分 析 ) 加 入 试 剂 2 2ML, 拧 紧 盖 子, 震 荡 5. 10s,80 水 浴 10min, 移 开 且 快 速 用 流 动 的 自 来 水 冷 却 至 室 温 2.4.6 萃 取 ( 甲 基 酯 脂 肪 酸 从 酸 性 水 相 移 出 转 移 到 一 个 有 机 相 的 萃 取 过 程 ) 加 入 1.25ML 的 试 剂 3 萃 取 溶 剂, 拧 紧 盖 子, 温 和 旋 转 10min, 打 开 盖 子, 用 干 净 的 移 液 管 取 出 下 层

36 似 水 部 分, 弃 去 2.4.7 基 本 洗 涤 ( 从 有 机 相 中 移 去 自 由 的 脂 肪 ) 加 入 3.0ML 试 剂 4, 拧 紧 盖 子, 温 和 旋 转 5min, 打 开 盖 子, 利 用 干 净 的 移 液 管 移 取 2/3 体 积 的 上 层 有 机 相 到 干 净 的 GC 检 测 小 瓶 ( 此 过 程 要 小 心, 宁 可 少 取 有 机 相, 绝 不 可 吸 入 水 相, 否 则 会 损 坏 色 谱 仪 的 色 谱 柱 ) 2.5 上 样 测 定 脂 肪 酸 2.6 数 据 库 比 对 3 试 验 结 果 5) 实 验 结 果 见 错 误! 未 找 到 引 用 源 6) 测 试 所 的 结 果 如 表 1 表 3 菌 株 编 号 SI 值 MIDI 检 测 结 果 8755c 0.835 Bacillus. atrophaeus 8757c 0.447 Bacillus. badius 8760c 0.798 Bacillus. cereus. GC subgroup A 8761c 0.581 Virgibacillus. pantothenticus (Bacillus) 8771c 0.846 Bacillus. licheniformis (Bacillus subtilis group) 8756c 0.53 Brevibacillus. parabrevis. GC subgroup B 8758c 0.67 Bacillus. subtilis 8774c 0.547 Virgibacillus. pantothenticus (Bacillus) 8754c 0.729 Bacillus. subtilis 8762c 0.504 Hyphomonas. hirschiana 8764c 0.733 Bacillus. subtilis 8768c 0.795 Staphylococcus. cohnii. cohnii 8769c 0.672 Brevibacillus. parabrevis. GC subgroup B 8770c 0.781 Bacillus. cereus. GC subgroup A 8772c 0.712 Arthrobacter. globiformis. GC subgroup A (some 48h) 8773c 0.278 Bacillus. sphaericus. GC subgroup D 4 试 验 讨 论 从 下 图 可 以 看 出 SI 值 小 于 0.5 的 菌 株 有 2 株, 根 据 MIDI 中 提 到 的 当 SI 值 在 0.5~0.3 之 间, 则 表 明 第 一 选 择 与 第 二 选 择 分 开, 鉴 定 可 能 成 功, 但 是 第 一 选 择 所 列 的 菌 种 为 非 典 型 的 菌 株 当 SI 值 小 于 0.300 时, 则 认 为 该 菌 株 不 存 在 于 数 据 库 中, 所 以 菌 株 8773 可 能 数 据 库 中 没 有 该 菌 株, 通 过 检 查 数 据 库 发 现 数 据 库 中 确 实 没 有 标 准 菌 株 8773(Bacillus massilienis), 通 过 本 实 验 可 以 说 明 MIDI 鉴 定 系 统 的 准 确 率 较 好

37 图 3 不 同 菌 量 与 SI 值 比 较 5 参 考 文 献 张 国 赏, 吴 文 鹃, 潘 仁 瑞 气 相 色 谱 一 质 谱 法 检 测 细 胞 脂 肪 酸 及 其 在 细 菌 鉴 定 上 的 应 用 [J] 合 肥 联 合 大 学 学 报 2000,10(4):92. 96 ROSE D P,CONNOLLY J M.Omega 一 3 fatty acids as cancer chemo. preventive agents [J].Pharmacol Therap.1999,83:217 223. 黄 伟 坤 食 品 检 验 与 分 析 [M] 北 京 : 中 国 轻 工 业 出 版 社.2000:23 试 验 负 责 : 林 营 志 试 验 人 员 : 王 子 旋

38 承 担 单 位 : 福 建 省 农 科 院 农 业 生 物 资 源 研 究 所 试 验 设 计 : 刘 国 红 试 验 项 目 : 河 南 土 壤 标 本 中 芽 孢 杆 菌 的 分 离 与 保 存 (13824-13849) 试 验 人 员 : 王 子 旋 试 验 负 责 : 林 营 志 报 告 日 期 :2011-09-04 计 数 月 份 :2010 年 08 月 研 究 资 格 系 数 (0.5-1.0) 实 验 设 计 系 数 (0.9-1.0 0.9-1.0) 报 告 得 分 总 分 实 验 设 计 实 验 记 载 实 验 分 析 实 验 简 报 实 验 文 章 1-20% 21-40% 41-60% 61-80% 81-100% 1%-5% 设 计 不 足, 实 施 错 误 6%-10% 设 计 不 全, 实 验 无 果 11%-15% 设 计 可 以, 实 施 不 全 16%-20% 设 计 完 整, 分 布 实 施 21%-25% 实 验 不 全, 记 载 无 果 26%-30% 实 验 不 足, 记 载 不 全 31%-35% 独 立 实 验, 记 载 不 全 36%-40% 分 布 实 验, 记 载 完 整 41%-45% 目 的 明 确, 实 验 完 成 46%-50% 实 验 完 整, 记 载 清 晰 51%-55% 实 验 系 统, 结 果 可 信 56%-60% 实 验 创 新, 分 析 清 晰 61%-65% 实 验 创 新, 结 论 清 晰 66%-70% 实 验 完 整, 统 计 清 晰 71%-75% 实 验 系 统, 数 据 可 靠 76%-80% 报 告 完 整, 文 章 雏 形 81%-85% 结 构 合 理, 分 析 有 据 86%-90% 逻 辑 清 晰, 统 计 合 理 91%-95% 图 表 完 整, 写 作 流 畅 96%-100% 文 献 完 整, 发 表 水 平 福 建 省 农 业 科 学 院 农 业 生 物 资 源 研 究 所 农 业 微 生 物 研 究 中 心 电 话 : 0591-87882571, 传 真 : 0591-87882571 fjat.yzxz.com

39 1 试 验 目 的 土 壤 是 微 生 物 的 丰 富 来 源, 是 寻 找 和 发 现 有 重 要 应 用 潜 力 的 微 生 物 的 主 要 菌 源 不 同 土 壤 中 含 的 微 生 物 的 种 类 和 数 量 不 同 [1], 本 实 验 对 个 新 疆 土 样 进 行 了 分 离, 为 了 分 离 芽 孢 杆 菌 本 实 验 选 用 牛 肉 膏 蛋 白 胨 培 养 基 本 实 验 采 用 稀 释 平 板 法 从 土 壤 中 分 离 细 菌 并 进 行 分 离 纯 化, 采 用 平 板 计 数 法 统 计 不 同 土 壤 中 各 种 微 生 物 的 含 量 2 试 验 内 容 2.1 材 料 河 南 土 壤 2.2 培 养 基 牛 肉 膏 蛋 白 胨 培 养 基 ( 简 称 NA): 牛 肉 浸 膏 3g 蛋 白 胨 5g NaCl 10.0 g 琼 脂 15-20g 水 1000ml ph 7.2-7.6 2.3 仪 器 试 管 锥 形 瓶 150 ml, 移 液 枪, 涂 布 棒, 记 号 笔, 培 养 皿, 振 荡 器, 培 养 箱 2.4 试 验 方 法 2.4.1 土 样 处 理 称 取 10 g 土 壤 至 装 有 90 ml 无 菌 水 的 三 角 瓶, 摇 床 振 荡 15 min 使 之 充 分 溶 解, 在 放 置 到 80 的 水 浴 锅 中 煮 10min, 杀 死 其 他 细 菌 2.4.2 土 壤 原 液 的 配 置 吸 取 1 ml 原 液 至 装 有 9 ml 无 菌 水 的 试 管, 即 配 成 10-2 浓 度, 依 次 稀 释 配 置 成 10-1 10-2 10-3 ; 2.4.3 平 板 涂 布 超 净 台 上 无 菌 操 作, 溶 液 在 振 荡 器 上 振 荡 10~20 s 后, 吸 取 100 μl 至 平 板 上, 用 涂 布 棒 涂 匀 涂 好 的 平 板 正 放 静 置 一 会, 使 溶 液 渗 入 平 板 每 个 梯 度 重 复 3 次 ; 细 菌 涂 布 梯 度 :10-1 10-2 10-3 ; 2.4.4 培 养 将 涂 好 的 平 板 用 塑 料 袋 装 好 倒 置 于 恒 温 箱 中 30 培 养 1~2 d; 2.4.5 计 数 统 计 培 养 平 板 上 菌 落 数, 算 出 同 一 稀 释 度 的 菌 落 平 均 数, 按 公 式 : 每 克 土 样 中 微 生 物 的 数 量 = 同 一 稀 释 度 的 菌 落 平 均 数 稀 释 倍 数 / 含 菌 样 品 克 数 2.4.6 纯 化 菌 株 采 取 平 板 划 线 分 离 法, 用 接 种 环 在 无 菌 操 作 条 件 下 挑 取 NA 平 板 上 的 单 菌 落 在 新 的 平 板 培 养 基 上 划 线, 划 线 完 毕 后, 盖 上 培 养 皿 盖, 倒 置 于 温 室 培 养 培 养 一 定 时 间 后, 重 复 一 次, 一 直 到 分 离 的 微 生 物 认 为 纯 化 为 止 2.4.7 菌 种 保 藏 对 纯 化 菌 种 编 号 后 拍 照, 提 交 保 种

40 3 试 验 结 果 从 河 南 土 壤 中 共 分 离 的 到 26 种 芽 孢 杆 菌, 形 态 描 述 及 数 量 见 错 误! 未 找 到 引 用 源, 分 离 照 片 见 图 1, 纯 化 后 的 照 片 见 图 4 错 误! 未 找 到 引 用 源 细 菌 的 形 态 特 征 土 样 编 号 4 7 菌 株 编 菌 落 描 述 细 菌 含 号 大 小 表 面 颜 色 干 湿 形 状 透 明 度 光 泽 高 低 量 13824 中 褶 皱 中 白 中 干 圆 形 不 透 明 无 凸 起 2 10 4 13825 中 光 滑 灰 白 湿 圆 形 不 透 明 有 隆 起 1.8 10 5 13826 中 光 滑 灰 白 湿 圆 形 不 透 明 有 隆 起 1.8 10 5 13827 中 光 滑 白 湿 圆 形 不 透 明 无 隆 起 13 10 4 13828 中 褶 皱 灰 白 干 不 规 则 不 透 明 无 凸 起 5 10 4 13829 中 光 滑 灰 白 湿 圆 形 不 透 明 有 凸 起 5 10 4 13830 中 光 滑 灰 黄 湿 圆 形 不 透 明 有 隆 起 11 10 4 13831 大 光 滑 白 干 不 规 则 不 透 明 无 扁 平 3 10 4 13832 大 光 滑 灰 白 干 不 规 则 不 透 明 无 扁 平 2 10 4 13833 大 光 滑 白 干 圆 形 不 透 明 无 扁 平 2 10 4 13834 大 光 滑 白 干 圆 形 不 透 明 无 扁 平 2 10 4 13835 中 绒 毛 灰 湿 不 规 则 不 透 明 无 扁 平 1 10 4 13836 大 光 滑 灰 湿 不 规 则 不 透 明 有 扁 平 2 10 4 13837 中 光 滑 灰 湿 圆 形 不 透 明 无 隆 起 3 10 4 13838 中 光 滑 灰 黄 湿 圆 形 不 透 明 有 隆 起 6 10 4 13839 中 光 滑 灰 黄 湿 圆 形 不 透 明 有 扁 平 1 10 4 13840 小 光 滑 灰 湿 圆 形 半 透 明 有 扁 平 2 10 4 13841 大 不 光 滑 灰 白 湿 圆 形 不 透 明 无 扁 平 48 10 4 13842 中 光 滑 灰 色 湿 圆 形 不 透 明 无 扁 平 1 10 4 13843 中 光 滑 灰 色 湿 圆 形 不 透 明 无 扁 平 2 10 4 13844 大 光 滑 灰 色 湿 圆 形 不 透 明 有 扁 平 1 10 4 13845 大 绒 毛 灰 色 湿 圆 形 不 透 明 无 扁 平 4 10 4 13846 小 光 滑 灰 色 湿 圆 形 透 明 有 隆 起 1 10 4 13847 小 光 滑 灰 色 湿 圆 形 透 明 有 扁 平 2 10 4 13848 小 光 滑 灰 色 湿 圆 形 不 透 明 有 中 凹 3 10 4 13849 中 光 滑 灰 黄 湿 近 圆 形 不 透 明 有 扁 平 1 10 4

41 FJAT-4-1-( 反 面 ) FJAT-4-1-( 正 面 ) FJAT-7-4-( 反 面 ) FJAT-7-4-( 正 面 ) FJAT-7-4-( 反 面 ) FJAT-7-4-( 正 面 ) FJAT-7-4-( 反 面 ) FJAT-7-4-( 正 面 ) FJAT-7-3-( 反 面 ) FJAT-7-3-( 正 面 ) FJAT-4-1-( 反 面 ) FJAT-4-1-( 正 面 ) FJAT-4-2-( 反 面 ) FJAT-4-2-( 正 面 ) FJAT-4-3-( 反 面 )

42 FJAT-4-3-( 正 面 ) FJAT-7-3-( 反 面 ) FJAT-7-3-( 正 面 ) 图 4 土 壤 中 芽 孢 杆 菌 分 离 照 片 FJAT-13835-( 反 面 ) FJAT-13835-( 正 面 ) FJAT-13836-( 反 面 ) FJAT-13836-( 正 面 ) FJAT-13837-( 反 面 ) FJAT-13837-( 正 面 ) FJAT-13838-( 反 面 ) FJAT-13838-( 正 面 ) FJAT-13839-( 反 面 )

43 FJAT-13839-( 正 面 ) FJAT-13840-( 反 面 ) FJAT-13840-( 正 面 ) FJAT-13841-( 反 面 ) FJAT-13841-( 正 面 ) FJAT-13842-( 反 面 ) FJAT-13842-( 正 面 ) FJAT-13843-( 反 面 ) FJAT-13843-( 正 面 ) FJAT-13844-( 反 面 ) FJAT-13844-( 正 面 ) FJAT-13845-( 反 面 )

44 FJAT-13845-( 正 面 ) FJAT-13847-( 反 面 ) FJAT-13847-( 正 面 ) FJAT-13848-( 反 面 ) FJAT-13848-( 正 面 ) FJAT-13849-( 反 面 ) FJAT-13849-( 正 面 ) FJAT-13824-( 反 面 ) FJAT-13824-( 正 面 ) FJAT-13825-( 反 面 ) FJAT-13825-( 正 面 ) FJAT-13826-( 反 面 )

45 FJAT-13826-( 正 面 ) FJAT-13827-( 反 面 ) FJAT-13827-( 正 面 ) FJAT-13828-( 反 面 ) FJAT-13828-( 正 面 ) FJAT-13829-( 反 面 ) FJAT-13829-( 正 面 ) FJAT-13830-( 反 面 ) FJAT-13830-( 正 面 ) FJAT-13831-( 反 面 ) FJAT-13831-( 正 面 ) FJAT-13832-( 反 面 )

46 FJAT-13832-( 正 面 ) FJAT-13833-( 反 面 ) FJAT-13833-( 正 面 ) FJAT-13834-( 反 面 ) FJAT-13834-( 正 面 ) 图 2 纯 化 照 片 4 试 验 讨 论 1) 两 个 河 南 土 壤 标 本 分 离 的 到 的 芽 孢 杆 菌 均 较 多, 从 形 态 上 观 察 都 是 一 些 常 见 的 菌 株 2) 从 分 离 纯 化 的 菌 落 照 片 的 形 态 特 征 可 以 看 出 每 种 土 壤 标 本 中 都 含 有 几 种 相 同 的 样 芽 孢 杆 菌, 具 体 是 不 是 一 种 芽 孢 杆 菌 还 需 要 通 过 测 定 脂 肪 酸 来 确 定 5 参 考 文 献 沈 萍, 范 秀 容, 李 广 武. 微 生 物 学 实 验. 高 等 教 育 出 版 社. 1999 年. 试 验 负 责 : 林 营 志 试 验 人 员 : 王 子 旋

47 承 担 单 位 : 福 建 省 农 科 院 农 业 生 物 资 源 研 究 所 试 验 设 计 : 菌 种 冻 干 保 存 的 实 验 试 验 项 目 : 模 式 芽 胞 杆 菌 真 空 冷 冻 干 燥 保 存 (14201~14205) 试 验 人 员 : 王 子 旋 刘 国 红 试 验 负 责 : 林 营 志 报 告 日 期 :2011-09-20 计 数 月 份 :2011 年 08 月 研 究 资 格 系 数 (0.5-1.0) 实 验 设 计 系 数 (0.9-1.0 0.9-1.0) 报 告 得 分 总 分 实 验 设 计 实 验 记 载 实 验 分 析 实 验 简 报 实 验 文 章 1-20% 21-40% 41-60% 61-80% 81-100% 1%-5% 设 计 不 足, 实 施 错 误 6%-10% 设 计 不 全, 实 验 无 果 11%-15% 设 计 可 以, 实 施 不 全 16%-20% 设 计 完 整, 分 布 实 施 21%-25% 实 验 不 全, 记 载 无 果 26%-30% 实 验 不 足, 记 载 不 全 31%-35% 独 立 实 验, 记 载 不 全 36%-40% 分 布 实 验, 记 载 完 整 41%-45% 目 的 明 确, 实 验 完 成 46%-50% 实 验 完 整, 记 载 清 晰 51%-55% 实 验 系 统, 结 果 可 信 56%-60% 实 验 创 新, 分 析 清 晰 61%-65% 实 验 创 新, 结 论 清 晰 66%-70% 实 验 完 整, 统 计 清 晰 71%-75% 实 验 系 统, 数 据 可 靠 76%-80% 报 告 完 整, 文 章 雏 形 81%-85% 结 构 合 理, 分 析 有 据 86%-90% 逻 辑 清 晰, 统 计 合 理 91%-95% 图 表 完 整, 写 作 流 畅 96%-100% 文 献 完 整, 发 表 水 平 福 建 省 农 业 科 学 院 农 业 生 物 资 源 研 究 所 微 生 物 农 药 研 究 中 心 电 话 : 0591-87835334, 传 真 : 0591-87809378 www.fjat.com

48 1 试 验 目 的 本 研 究 的 目 为 收 集 保 藏 现 今 发 现 的 所 有 芽 胞 杆 菌 模 式 菌 株 并 建 立 芽 胞 杆 菌 菌 种 资 源 库, 对 其 进 行 真 空 冷 冻 干 燥 保 存, 供 后 续 研 究 2 试 验 方 法 2.1 材 料 进 品 脱 脂 菌 种 培 养 专 业 奶 粉, 海 藻 糖, 安 瓿 管, 毛 细 滴 管 模 式 菌 株 : 菌 种 名 FJAT 编 号 DMZS 编 号 Bacillus odysseyi 14201 18869 Bacillus niacini 14202 2923 Paenibacillus lautus 14203 3035 Paenibacillus macerans 14204 24 Aneurinibacillus migulanus 14205 2895 Ba illus odysseyi 14201 18869 2.2 实 验 前 的 准 备 2.2.1 斜 面 培 养 基 准 备 : 准 备 10 ml 试 管, 带 透 气 孔 橡 胶 塞, 洗 净 烘 干 ; 培 养 基 配 置 完 毕 后, 加 热 让 琼 脂 溶 解 混 匀 后 分 装 到 每 个 试 管 中, 每 管 约 3 ml, 灭 菌 后 试 管 一 端 垫 起 移 液 管 一 支, 保 持 倾 斜 即 可 待 试 管 中 的 培 养 基 凝 固 后 用 报 纸 包 好 后 置 常 温 中 备 用 每 次 应 尽 可 能 多 配 置 2.2.2 斜 面 划 线 培 养 : 挑 取 平 板 上 培 养 的 单 菌 落 在 斜 面 培 养 基 上 划 线 后, 放 28 恒 温 培 养 箱 中 培 养 48 小 时 2.2.3 牛 奶 保 护 液 : 重 新 配 置 冻 干 用 牛 奶,25 ml 水 + 3.0 g 奶 粉 (Difco 进 口 脱 脂 菌 种 培 养 专 业 奶 粉 ) + 1.25 g D- 海 藻 糖 (Sigma t5221),115 8 min 灭 菌 后 置 37 培 养 3 days, 检 查 是 否 灭 菌 彻 底 ( 如 染 菌 生 长, 牛 奶 会 变 干 结 块 ), 检 验 无 菌 后 置 4 冰 箱 备 用 灭 菌 后 通 常 为 白 色 略 带 黄 色, 奶 粉 和 海 藻 糖 应 4 低 温 保 存 使 用 的 三 角 瓶 和 纱 布 应 先 行 灭 菌, 应 按 批 次 分 装 小 瓶 2.2.4 安 瓿 管 : 安 瓿 管 内 径 6 mm, 壁 厚 1 mm, 外 径 8mm, 半 球 形 底 部, 不 含 半 球 形 长 度 10.5 mm 使 用 前 用 2% 盐 酸 浸 泡 2 hrs, 一 级 蒸 馏 水 冲 洗 浸 泡 至 中 性,60 鼓 风 烘 箱 烘 干 塞 入 内 标 签, 内 标 签 使 用 普 通 打 印 纸 激 光 打 印, 小 六 号 字, 标 记 菌 种 保 存 号 和 制 作 日 期, 切 成 0.8cm 1cm 的 长 方 形 ; 安 瓿 管 口 塞 上 棉 花 5 支 或 10 支 一 组 ( 每 组 对 应 一 个 菌 种 ) 包 扎 湿 热 灭 菌 (121,20 分 钟 );60 鼓 风 烘 干 2.2.5 毛 细 滴 管 : 毛 细 滴 管 粗 端 关 口 塞 上 棉 花, 放 入 大 试 管 中 灭 菌 处 理, 大 试 管 底 部 塞 好 棉 花 ( 避 免 折 断 ), 包 扎 湿

49 热 灭 菌 (121,20 分 钟 );60 鼓 风 烘 干 2.3 方 法 2.3.1 斜 面 培 养 菌 落 分 装 步 骤 : 1. 将 所 有 器 具 置 超 净 台 中 灭 菌 30 min 2. 取 斜 面 试 管 一 支, 取 掉 塞 子 3. 吸 取 0.2 ml 保 护 剂, 加 入 斜 面 培 养 试 管 中 4. 用 毛 细 滴 管 轻 轻 刮 取 表 面 菌 苔, 反 复 吹 吸 10 次 混 匀, 制 备 成 均 匀 的 细 胞 悬 液 6. 分 装 : 一 人 轻 轻 吸 取 0.2 ml 菌 液 至 安 瓿 管 中, 另 一 人 用 镊 子 夹 取 棉 花 塞 住 安 瓿 管 的 管 口 7. 将 安 瓿 管 放 置 到 组 培 瓶 中, 组 培 瓶 底 部 预 先 点 上 揉 成 团 的 报 纸, 每 瓶 5 个 菌 株,25 支 安 瓿 管 8. 做 完 实 验 立 刻 将 安 瓿 管 放 入 超 低 温 冰 箱 预 冻 2.4 预 冻 将 插 好 安 瓿 管 的 组 培 瓶 放 入 放 入 -70 冰 箱 预 冻 预 冻 速 度 控 制 在 每 分 钟 下 降 1, 使 样 品 冻 结 到 -35 ~-40, 预 冻 4-5 h 2.5 真 空 干 燥 1. 检 查 冻 干 机 密 封 油 脂 涂 抹 情 况 2. 组 装 冻 干 机, 检 查 所 有 出 气 阀 门, 关 闭 出 排 水 阀 3. 开 启 冻 干 机 4. 开 启 低 温, 降 至 -80, 等 待 5 分 钟 5. 从 超 低 温 冰 箱 将 预 冻 后 的 样 品 迅 速 置 于 已 充 分 预 冷 地 冷 冻 干 燥 机 样 品 舱 内 6. 放 上 顶 盖, 开 启 真 空 泵, 开 始 冷 冻 干 燥, 持 续 8-24 小 时 7. 确 认 冷 冻 干 燥 完 毕 后, 缓 慢 打 开 放 气 阀, 待 压 力 平 衡 后 关 闭 真 空 泵 8. 取 出 样 品 安 瓿 管 置 于 干 燥 器 内, 备 用 9. 关 闭 冷 凝 器 2.6 判 断 冷 冻 干 燥 已 完 成 的 指 标 : 抽 干 的 样 品 体 积 会 缩 小 至 原 来 的 1/3, 呈 现 白 色, 未 干 的 样 品 仍 然 偏 黄 色 冻 干 样 品 的 汗 水 率 应 低 于 10% 安 瓿 管 内 冻 干 物 呈 酥 松 块 状 或 松 散 片 状 可 取 一 支 用 牙 签 捅, 呈 现 干 粉 状 真 空 度 接 近 空 载 时 的 最 高 值 冷 冻 干 燥 机 显 示 的 样 品 温 度 与 舱 内 温 度 接 近 蒸 馏 水 对 照 管 中 的 水 分 已 完 全 挥 发 掉 或 1%~2% 氯 化 钴 的 对 照 管 已 呈 深 蓝 色 2.7 封 口 在 火 焰 上 封 口 2.8 存 放 安 瓿 管 贴 外 标 签, 装 入 菌 种 保 藏 管 ( 保 存 管 底 部 塞 上 棉 花, 安 瓿 管 封 口 处 朝 内 放 置 ), 放 入 保 存 盒, 低 温 避 光 保 藏 同 一 种 菌 的 保 存 管 扎 在 一 起

50 3 试 验 结 果 本 次 试 验 做 的 5 株 标 准 菌 株 是 从 DSMZ 购 买 的 标 准 菌 株, 经 涂 板 培 养 后, 确 认 无 污 染 之 后 做 的 真 空 冷 冻 干 燥 保 藏 下 图 为 标 准 菌 株 涂 板 照 片 FJAT-14201-( 反 面 ) FJAT-14201-( 正 面 ) FJAT-14202-( 反 面 ) FJAT-14202-( 正 面 )

51 FJAT-14203-( 反 面 ) FJAT-14203-( 正 面 ) FJAT-14204-( 反 面 ) FJAT-14204-( 正 面 )

52 FJAT-14205-( 反 面 ) FJAT-14205-( 正 面 ) 4 试 验 结 论 实 验 负 责 人 林 营 志 实 验 人 员 王 子 旋 刘 国 红

53 2011-08 承 担 单 位 : 福 建 省 农 科 院 农 业 生 物 资 源 研 究 所 试 验 设 计 : 试 验 项 目 : 大 肠 杆 菌 荧 光 定 量 PCR 标 准 曲 线 的 制 备 试 验 人 员 : 刘 云 浩 试 验 负 责 : 蓝 江 林 报 告 日 期 :2011 年 08 月 计 数 月 份 :2011 年 08 月 研 究 资 格 系 数 (0.5-1.0) 实 验 设 计 系 数 (0.9-1.0 0.9-1.0) 报 告 得 分 总 分 实 验 设 计 实 验 记 载 实 验 分 析 实 验 简 报 实 验 文 章 1-20% 21-40% 41-60% 61-80% 81-100% 1%-5% 设 计 不 足, 实 施 错 误 6%-10% 设 计 不 全, 实 验 无 果 11%-15% 设 计 可 以, 实 施 不 全 16%-20% 设 计 完 整, 分 布 实 施 21%-25% 实 验 不 全, 记 载 无 果 26%-30% 实 验 不 足, 记 载 不 全 31%-35% 独 立 实 验, 记 载 不 全 36%-40% 分 布 实 验, 记 载 完 整 41%-45% 目 的 明 确, 实 验 完 成 46%-50% 实 验 完 整, 记 载 清 晰 51%-55% 实 验 系 统, 结 果 可 信 56%-60% 实 验 创 新, 分 析 清 晰 61%-65% 实 验 创 新, 结 论 清 晰 66%-70% 实 验 完 整, 统 计 清 晰 71%-75% 实 验 系 统, 数 据 可 靠 76%-80% 报 告 完 整, 文 章 雏 形 81%-85% 结 构 合 理, 分 析 有 据 86%-90% 逻 辑 清 晰, 统 计 合 理 91%-95% 图 表 完 整, 写 作 流 畅 96%-100% 文 献 完 整, 发 表 水 平 福 建 省 农 业 科 学 院 农 业 生 物 资 源 研 究 所 农 业 微 生 物 研 究 中 心 电 话 : 0591-87882571, 传 真 : 0591-87882571 fjat.yzxz.com

54 1. 试 验 目 的 鉴 于 之 前 提 取 的 芽 孢 杆 菌 和 大 肠 杆 菌 的 质 粒 都 有 RNA 的 污 染, 本 试 验 采 用 天 根 生 物 的 质 粒 提 取 试 剂 盒 来 提 取 重 组 质 粒, 以 求 获 得 纯 度 很 高 的 质 粒, 为 下 一 步 质 粒 标 准 品 的 获 取 奠 定 基 础 2. 试 验 方 法 2.1 材 料 和 试 剂 2.1.1 材 料 插 入 了 大 肠 杆 菌 特 异 性 片 段 的 pmd-18t 质 粒 标 准 品 2.1.2 试 剂 和 仪 器 Premix Ex Taq TM (Perfect Real Time), 大 肠 杆 菌 TaqMan 荧 光 探 针 ( 5 -(FAM)CACTTATGAGGTCCGCTTGCTCTCGC(TAMARA)-3 ), 上 游 引 物 (5 -AATGGCGCATACAAAGAGAAGC-3 ), 下 游 引 物 (5 -GTTGCAGACTCCAATCCGGA-3 ), ABI7500 Real-Time PCR System 2.2 方 法 将 大 肠 杆 菌 质 粒 标 准 品 稀 释 到 250.9ng/µl, 经 计 算 拷 贝 数 是 6.2 10 10 /µl 将 此 样 品 10 倍 倍 比 稀 释, 取 浓 度 6.2 10 8, 6.2 10 7,6.2 10 6, 6.2 10 5, 6.2 10 4 四 个 梯 度 的 质 粒 标 准 品 进 行 反 应, 绘 制 标 准 曲 线, 每 个 浓 度 设 置 三 个 重 复 反 应 体 系 : 试 剂 使 用 量 (µl) 使 用 量 (µl) 终 浓 度 Premix Ex Taq(2x) 10.0 25.0 1 x PCR Forward Premier(10 µm) 0.4 1.0 0.2 µm*1 PCR Reverse Premier(10µM) 0.4 1.0 0.2 µm*1 荧 光 探 针 溶 液 0.8 2.0 *2 ROX Reference Dye Ⅱ(50x)*4 0.4 1.0 1 x DNA 模 板 2.0 4.0 *3 dh2o( 灭 菌 蒸 馏 水 ) 6.0 16.0 Total 20.0 50.0 *5 反 应 程 序 : 两 步 法 PCR 扩 增 标 准 程 序 :Stage 1: 预 变 性 Reps:1, 95 30s;Stage 2:PCR 反 应 Reps: 40, 95 5s,60 34s

55 图 1 反 应 程 序 3. 试 验 结 果 蓝 白 斑 筛 选 结 果 如 下 : 图 2 大 肠 杆 菌 荧 光 定 量 PCR 标 准 曲 线

56 图 3 大 肠 杆 菌 荧 光 定 量 PCR 扩 增 曲 线 所 得 到 的 标 准 曲 线 的 方 程 是 y = -3.39x +45.72 R 2 = 0.9926 E= 0.98 4. 试 验 结 论 一 般 认 为 相 关 系 数 (R 2 ) 大 于 0.98, 越 接 近 1, 结 果 可 信 度 越 高, 扩 增 效 率 (E) 在 0.8-1.2 之 间, 越 接 近 1, 结 果 越 理 想 从 试 验 结 果 中 看 出, 所 得 到 的 标 准 曲 线 方 程 R 2 达 到 了 0.99, 说 明 结 果 具 有 很 高 的 可 信 度, 而 扩 增 效 率 达 到 了 0.98, 也 比 较 理 想 因 此 可 以 进 行 下 一 步 样 品 中 大 肠 杆 菌 拷 贝 数 的 测 定 试 验 负 责 蓝 江 林 试 验 人 员 刘 云 浩

57 2011-08 承 担 单 位 : 福 建 省 农 科 院 农 业 生 物 资 源 研 究 所 试 验 设 计 : 试 验 项 目 : 荧 光 定 量 PCR 测 定 枯 草 芽 孢 杆 菌 大 肠 杆 菌 葡 萄 球 菌 的 数 量 变 化 试 验 人 员 : 刘 云 浩 试 验 负 责 : 蓝 江 林 报 告 日 期 :2011 年 08 月 计 数 月 份 :2011 年 08 月 研 究 资 格 系 数 (0.5-1.0) 实 验 设 计 系 数 (0.9-1.0 0.9-1.0) 报 告 得 分 总 分 实 验 设 计 实 验 记 载 实 验 分 析 实 验 简 报 实 验 文 章 1-20% 21-40% 41-60% 61-80% 81-100% 1%-5% 设 计 不 足, 实 施 错 误 6%-10% 设 计 不 全, 实 验 无 果 11%-15% 设 计 可 以, 实 施 不 全 16%-20% 设 计 完 整, 分 布 实 施 21%-25% 实 验 不 全, 记 载 无 果 26%-30% 实 验 不 足, 记 载 不 全 31%-35% 独 立 实 验, 记 载 不 全 36%-40% 分 布 实 验, 记 载 完 整 41%-45% 目 的 明 确, 实 验 完 成 46%-50% 实 验 完 整, 记 载 清 晰 51%-55% 实 验 系 统, 结 果 可 信 56%-60% 实 验 创 新, 分 析 清 晰 61%-65% 实 验 创 新, 结 论 清 晰 66%-70% 实 验 完 整, 统 计 清 晰 71%-75% 实 验 系 统, 数 据 可 靠 76%-80% 报 告 完 整, 文 章 雏 形 81%-85% 结 构 合 理, 分 析 有 据 86%-90% 逻 辑 清 晰, 统 计 合 理 91%-95% 图 表 完 整, 写 作 流 畅 96%-100% 文 献 完 整, 发 表 水 平 福 建 省 农 业 科 学 院 农 业 生 物 资 源 研 究 所 农 业 微 生 物 研 究 中 心 电 话 : 0591-87882571, 传 真 : 0591-87882571 fjat.yzxz.com

58 1. 试 验 目 的 利 用 荧 光 定 量 PCR 的 方 法 对 垫 料 中 的 枯 草 芽 孢 杆 菌 大 肠 杆 菌 和 葡 萄 球 菌 进 行 定 量 分 析, 本 实 验 基 于 之 前 提 取 的 五 批 新 店 部 队 猪 场 的 垫 料 总 DNA, 测 定 这 些 垫 料 之 中 上 述 菌 的 数 量, 以 期 获 得 它 们 的 数 量 变 化 规 律, 以 此 说 明 益 生 菌 和 致 病 菌 在 垫 料 之 中 的 定 殖 情 况 2. 试 验 方 法 2.1 材 料 和 试 剂 2.1.1 材 料 见 下 表 表 1 垫 料 样 品 信 息 样 品 采 集 时 间 ( 年. 月. 日 ) 采 集 栏 位 总 DNA 浓 度 (ng/g) 10.8.1 第 一 栏 10395 10.8.1 第 二 栏 25210 10.8.1 第 五 栏 19810 10.8.1 第 八 栏 14435 10.8.1 第 十 二 栏 37280 10.8.1 第 十 四 栏 8335 10.8.1 第 十 五 栏 3245 10.8.1 第 十 六 栏 8465 10.8.15 第 一 栏 29605 10.8.15 第 二 栏 9945 10.8.15 第 五 栏 29860 10.8.15 第 八 栏 13045 10.8.15 第 十 二 栏 9880 10.8.15 第 十 四 栏 12845 10.8.15 第 十 五 栏 8600 10.8.15 第 十 六 栏 5325 10.9.1 第 一 栏 35165 10.9.1 第 二 栏 58345 10.9.1 第 五 栏 22360 10.9.1 第 八 栏 58455 10.9.1 第 十 二 栏 25230 10.9.1 第 十 四 栏 58630 10.9.1 第 十 五 栏 79600 10.9.1 第 十 六 栏 51680 10.9.15 第 一 栏 10850 10.9.15 第 二 栏 9945 10.9.15 第 五 栏 43760 10.9.15 第 八 栏 22515 10.9.15 第 十 二 栏 7780 10.9.15 第 十 四 栏 100010 10.9.15 第 十 五 栏 5015 10.9.15 第 十 六 栏 7775

59 10.10.1 第 一 栏 31225 10.10.1 第 二 栏 19955 10.10.1 第 五 栏 17610 10.10.1 第 八 栏 10750 10.10.1 第 十 二 栏 10645 10.10.1 第 十 四 栏 22880 10.10.1 第 十 五 栏 12645 10.10.1 第 十 六 栏 7795 2.1.2 试 剂 和 仪 器 Premix Ex Taq TM (Perfect Real Time), ABI7500 Real-Time PCR System 2.2 方 法 反 应 体 系 见 下 表 : 表 2 反 应 体 系 试 剂 使 用 量 (µl) 使 用 量 (µl) 终 浓 度 Premix Ex Taq(2x) 10.0 25.0 1 x PCR Forward Premier(10 µm) 0.4 1.0 0.2 µm*1 PCR Reverse Premier(10µM) 0.4 1.0 0.2 µm*1 荧 光 探 针 溶 液 0.8 2.0 *2 ROX Reference Dye Ⅱ(50x)*4 0.4 1.0 1 x DNA 模 板 2.0 4.0 *3 dh2o( 灭 菌 蒸 馏 水 ) 6.0 16.0 Total 20.0 50.0 *5 反 应 程 序 : 两 步 法 PCR 扩 增 标 准 程 序 :Stage 1: 预 变 性 Reps:1, 95 30s;Stage 2:PCR 反 应 Reps: 40, 95 5s,60 34s 图 1 反 应 程 序

60 3 试 验 结 果 见 下 表 所 示 表 2 所 测 样 本 中 枯 草 芽 孢 杆 菌 葡 萄 球 菌 和 大 肠 杆 菌 拷 贝 数 的 对 数 值 样 品 采 集 时 间 ( 年. 月. 日 ) 采 集 栏 位 枯 草 芽 孢 杆 菌 拷 贝 数 葡 萄 球 菌 拷 贝 数 大 肠 杆 菌 拷 贝 数 的 对 数 值 的 对 数 值 的 对 数 值 10.8.1 第 一 栏 5.09 3.73 4.41 10.8.1 第 二 栏 5.57 4.05 4.47 10.8.1 第 五 栏 6.58 5.16 4.60 10.8.1 第 八 栏 5.83 4.47 5.36 10.8.1 第 十 二 栏 4.72 3.70 4.11 10.8.1 第 十 四 栏 5.74 4.57 5.01 10.8.1 第 十 五 栏 5.61 4.19 4.93 10.8.1 第 十 六 栏 6.94 5.02 5.32 10.8.15 第 一 栏 6.14 5.55 4.54 10.8.15 第 二 栏 6.06 4.45 4.06 10.8.15 第 五 栏 5.55 4.08 5.06 10.8.15 第 八 栏 5.46 4.52 4.25 10.8.15 第 十 二 栏 6.06 4.98 4.76 10.8.15 第 十 四 栏 5.82 4.40 4.35 10.8.15 第 十 五 栏 6.26 4.87 4.78 10.8.15 第 十 六 栏 6.04 2.68 4.78 10.9.1 第 一 栏 6.9 5.28 5.99 10.9.1 第 二 栏 6.31 4.43 4.59 10.9.1 第 五 栏 5.82 5.55 4.46 10.9.1 第 八 栏 6.64 4.97 5.90 10.9.1 第 十 二 栏 6.56 4.43 5.75 10.9.1 第 十 四 栏 6.66 6.04 5.95 10.9.1 第 十 五 栏 6.63 5.43 5.22 10.9.1 第 十 六 栏 6.51 5.9 5.35 10.9.15 第 一 栏 6.39 5.99 4.85 10.9.15 第 二 栏 5.74 4.66 4.52 10.9.15 第 五 栏 5.61 5.3 4.16 10.9.15 第 八 栏 6.72 4.77 4.84 10.9.15 第 十 二 栏 6.17 5.3 5.57 10.9.15 第 十 四 栏 5.98 5.47 4.14 10.9.15 第 十 五 栏 6.09 5.17 4.04 10.9.15 第 十 六 栏 6.74 4.85 5.84 10.10.1 第 一 栏 4.9 2.83 4.26 10.10.1 第 二 栏 5.55 4.17 4.27 10.10.1 第 五 栏 5.57 4.98 3.83 10.10.1 第 八 栏 5.54 4.75 4.13

61 10.10.1 第 十 二 栏 6.13 4.56 4.92 10.10.1 第 十 四 栏 4.97 4.07 4.01 10.10.1 第 十 五 栏 5.74 4.06 4.07 10.10.1 第 十 六 栏 6.09 4.77 4.98 4. 试 验 结 论 从 试 验 结 果 中 看 出, 通 过 蓝 白 斑 筛 选, 所 有 插 入 的 片 段 都 获 得 很 好 的 筛 选 结 果, 准 备 下 一 步 提 取 质 粒 DNA, 来 验 证 是 否 插 入 进 去 了 特 异 性 片 段 试 验 负 责 蓝 江 林 试 验 人 员 刘 云 浩

62 2011-08 承 担 单 位 : 福 建 省 农 科 院 农 业 生 物 资 源 研 究 所 试 验 设 计 : 试 验 项 目 : 枯 草 芽 孢 杆 菌 荧 光 定 量 PCR 标 准 曲 线 的 制 备 试 验 人 员 : 刘 云 浩 试 验 负 责 : 蓝 江 林 报 告 日 期 :2011 年 08 月 计 数 月 份 :2011 年 08 月 研 究 资 格 系 数 (0.5-1.0) 实 验 设 计 系 数 (0.9-1.0 0.9-1.0) 报 告 得 分 总 分 实 验 设 计 实 验 记 载 实 验 分 析 实 验 简 报 实 验 文 章 1-20% 21-40% 41-60% 61-80% 81-100% 1%-5% 设 计 不 足, 实 施 错 误 6%-10% 设 计 不 全, 实 验 无 果 11%-15% 设 计 可 以, 实 施 不 全 16%-20% 设 计 完 整, 分 布 实 施 21%-25% 实 验 不 全, 记 载 无 果 26%-30% 实 验 不 足, 记 载 不 全 31%-35% 独 立 实 验, 记 载 不 全 36%-40% 分 布 实 验, 记 载 完 整 41%-45% 目 的 明 确, 实 验 完 成 46%-50% 实 验 完 整, 记 载 清 晰 51%-55% 实 验 系 统, 结 果 可 信 56%-60% 实 验 创 新, 分 析 清 晰 61%-65% 实 验 创 新, 结 论 清 晰 66%-70% 实 验 完 整, 统 计 清 晰 71%-75% 实 验 系 统, 数 据 可 靠 76%-80% 报 告 完 整, 文 章 雏 形 81%-85% 结 构 合 理, 分 析 有 据 86%-90% 逻 辑 清 晰, 统 计 合 理 91%-95% 图 表 完 整, 写 作 流 畅 96%-100% 文 献 完 整, 发 表 水 平 福 建 省 农 业 科 学 院 农 业 生 物 资 源 研 究 所 农 业 微 生 物 研 究 中 心 电 话 : 0591-87882571, 传 真 : 0591-87882571 fjat.yzxz.com

63 1. 试 验 目 的 鉴 于 之 前 提 取 的 芽 孢 杆 菌 和 大 肠 杆 菌 的 质 粒 都 有 RNA 的 污 染, 本 试 验 采 用 天 根 生 物 的 质 粒 提 取 试 剂 盒 来 提 取 重 组 质 粒, 以 求 获 得 纯 度 很 高 的 质 粒, 为 下 一 步 质 粒 标 准 品 的 获 取 奠 定 基 础 2. 试 验 方 法 2.1 材 料 和 试 剂 2.1.1 材 料 插 入 了 枯 草 芽 孢 杆 菌 特 异 性 片 段 的 pmd-18t 质 粒 标 准 品 2.1.2 试 剂 和 仪 器 Premix Ex Taq TM (Perfect Real Time), 枯 草 芽 孢 杆 菌 TaqMan 荧 光 探 针 ( 5 -(HEX)CGGTTTGTCACCGGCAGTCACCT(BHQ1)-3 ), 上 游 引 物 (5 -ACGTCATCCCCACCTTCCT-3 ), 下 游 引 物 (5 -ACGTCATCCCCACCTTCCT-3 ), ABI7500 Real-Time PCR System 2.2 方 法 将 枯 草 芽 孢 杆 菌 质 粒 标 准 品 稀 释 到 246.8ng/µl, 经 计 算 拷 贝 数 是 7.2 10 10 /µl 将 此 样 品 10 倍 倍 比 稀 释, 取 浓 度 7.2 10 8, 7.2 10 7,7.2 10 6, 7.2 10 5, 7.2 10 4 四 个 梯 度 的 质 粒 标 准 品 进 行 反 应, 绘 制 标 准 曲 线, 每 个 浓 度 设 置 四 个 重 复 反 应 体 系 : 试 剂 使 用 量 (µl) 使 用 量 (µl) 终 浓 度 Premix Ex Taq(2x) 10.0 25.0 1 x PCR Forward Premier(10 µm) 0.4 1.0 0.2 µm*1 PCR Reverse Premier(10µM) 0.4 1.0 0.2 µm*1 荧 光 探 针 溶 液 0.8 2.0 *2 ROX Reference Dye Ⅱ(50x)*4 0.4 1.0 1 x DNA 模 板 2.0 4.0 *3 dh2o( 灭 菌 蒸 馏 水 ) 6.0 16.0 Total 20.0 50.0 *5 反 应 程 序 : 两 步 法 PCR 扩 增 标 准 程 序 :Stage 1: 预 变 性 Reps:1, 95 30s;Stage 2:PCR 反 应 Reps: 40, 95 5s,60 34s

64 图 1 反 应 程 序 3 试 验 结 果 蓝 白 斑 筛 选 结 果 如 下 : 图 2 枯 草 芽 孢 杆 菌 荧 光 定 量 PCR 标 准 曲 线

65 图 3 枯 草 芽 孢 杆 菌 荧 光 定 量 PCR 扩 增 曲 线 所 得 到 的 标 准 曲 线 的 方 程 是 y = -3.33x + 47.02 R 2 = 0.9926 E= 0.99 4 试 验 结 论 一 般 认 为 相 关 系 数 (R 2 ) 大 于 0.98, 越 接 近 1, 结 果 可 信 度 越 高, 扩 增 效 率 (E) 在 0.8-1.2 之 间, 越 接 近 1, 结 果 越 理 想 从 试 验 结 果 中 看 出, 所 得 到 的 标 准 曲 线 方 程 R 2 达 到 了 0.99, 说 明 结 果 具 有 很 高 的 可 信 度, 而 扩 增 效 率 达 到 了 0.99, 也 十 分 理 想 因 此 可 以 进 行 下 一 步 样 品 中 枯 草 芽 孢 杆 菌 拷 贝 数 的 测 定 试 验 负 责 蓝 江 林 试 验 人 员 刘 云 浩

66 2011-08 承 担 单 位 : 福 建 省 农 科 院 农 业 生 物 资 源 研 究 所 试 验 设 计 : 试 验 项 目 : 垫 料 中 所 分 离 的 益 生 菌 对 致 病 菌 的 抑 制 效 果 试 验 2 试 验 人 员 : 刘 云 浩 试 验 负 责 : 蓝 江 林 报 告 日 期 :2011 年 08 月 计 数 月 份 :2011 年 08 月 研 究 资 格 系 数 (0.5-1.0) 实 验 设 计 系 数 (0.9-1.0 0.9-1.0) 报 告 得 分 总 分 实 验 设 计 实 验 记 载 实 验 分 析 实 验 简 报 实 验 文 章 1-20% 21-40% 41-60% 61-80% 81-100% 1%-5% 设 计 不 足, 实 施 错 误 6%-10% 设 计 不 全, 实 验 无 果 11%-15% 设 计 可 以, 实 施 不 全 16%-20% 设 计 完 整, 分 布 实 施 21%-25% 实 验 不 全, 记 载 无 果 26%-30% 实 验 不 足, 记 载 不 全 31%-35% 独 立 实 验, 记 载 不 全 36%-40% 分 布 实 验, 记 载 完 整 41%-45% 目 的 明 确, 实 验 完 成 46%-50% 实 验 完 整, 记 载 清 晰 51%-55% 实 验 系 统, 结 果 可 信 56%-60% 实 验 创 新, 分 析 清 晰 61%-65% 实 验 创 新, 结 论 清 晰 66%-70% 实 验 完 整, 统 计 清 晰 71%-75% 实 验 系 统, 数 据 可 靠 76%-80% 报 告 完 整, 文 章 雏 形 81%-85% 结 构 合 理, 分 析 有 据 86%-90% 逻 辑 清 晰, 统 计 合 理 91%-95% 图 表 完 整, 写 作 流 畅 96%-100% 文 献 完 整, 发 表 水 平 福 建 省 农 业 科 学 院 农 业 生 物 资 源 研 究 所 农 业 微 生 物 研 究 中 心 电 话 : 0591-87882571, 传 真 : 0591-87882571 fjat.yzxz.com

67 1. 试 验 目 的 芽 孢 杆 菌 如 枯 草 芽 孢 杆 菌, 地 衣 芽 孢 杆 菌, 短 短 芽 孢 杆 菌, 蜡 样 芽 胞 杆 菌 和 多 粘 芽 孢 杆 菌 等 在 生 长 过 程 中 能 产 生 枯 草 菌 素 多 粘 菌 素 制 霉 菌 素 短 杆 菌 素 等 活 性 物 质, 这 些 活 性 物 质 对 致 病 菌 或 内 源 性 感 染 的 条 件 致 病 菌 有 明 显 的 抑 制 作 用, 这 些 益 生 菌 在 动 物 体 内 能 迅 速 消 耗 环 境 中 的 游 离 氧, 造 成 肠 道 低 氧, 促 进 有 益 厌 氧 菌 的 生 长, 并 产 生 乳 酸 等 有 机 酸 类, 降 低 肠 道 PH 值, 间 接 抑 制 其 他 致 病 菌 的 生 长 本 实 验 基 于 这 些 理 论, 来 探 讨 从 垫 料 分 离 得 到 的 枯 草 芽 孢 杆 菌 短 短 芽 孢 杆 菌 地 衣 芽 孢 杆 菌 和 多 粘 芽 孢 杆 菌, 对 垫 料 中 分 离 的 致 病 菌 的 抑 制 效 果. 鉴 于 之 前 采 用 的 采 用 的 是 单 层 培 养 基 打 孔 法, 本 次 试 验 采 用 滤 纸 片 法 来 检 测 四 种 芽 孢 杆 菌 对 致 病 菌 的 抑 菌 效 果 2. 试 验 方 法 2.1 材 料 和 试 剂 2.1.1 材 料 供 试 菌 株 : 见 表 1 培 养 基 :NA 培 养 基 表 1 试 验 菌 株 菌 株 编 号 Species 中 文 种 名 来 源 采 集 地 点 FJAT-8505 Klebsiella pneumoniae 肺 炎 克 雷 伯 斯 氏 菌 垫 料 新 店 73121 部 队 主 场 FJAT-8506 Acinetobacter towneri 不 动 杆 菌 垫 料 新 店 73121 部 队 主 场 FJAT-8588 Acinetobacter junii 琼 氏 不 动 杆 菌 垫 料 新 店 73121 部 队 主 场 FJAT-8589 Comamonas testosteroni 睾 丸 酮 丛 毛 单 胞 菌 垫 料 新 店 73121 部 队 主 场 FJAT-8440 Acinetobacter calcoaceticus 乙 酸 钙 不 动 杆 菌 垫 料 新 店 73121 部 队 主 场 FJAT-10504 Burkholderiales bacterium 伯 克 霍 尔 德 氏 菌 垫 料 新 店 73121 部 队 主 场 FJAT-11369 Acinetobacter sp. 不 动 杆 菌 垫 料 新 店 73121 部 队 主 场 FJAT-11371 Staphylococcus epidermidis 表 皮 葡 萄 球 菌 垫 料 新 店 73121 部 队 主 场 FJAT-10506 Staphylococcus gallinarum 鸡 葡 萄 球 菌 垫 料 新 店 73121 部 队 主 场 FJAT-10505 Bacillus amyloliquefaciens 解 淀 粉 芽 孢 杆 菌 垫 料 新 店 73121 部 队 主 场 FJAT-10502 Bacillus subtilis 枯 草 芽 孢 杆 菌 垫 料 新 店 73121 部 队 主 场 FJAT-8349 Brevibacillus brevis 短 短 芽 孢 杆 菌 垫 料 新 店 73121 部 队 主 场 FJAT-8464 Salmonella 沙 门 氏 菌 垫 料 新 店 73121 部 队 主 场 FJAT-17381 Escherichia coli 大 肠 杆 菌 垫 料 新 店 73121 部 队 主 场 2.2 方 法 2.2.1 四 种 益 生 芽 孢 杆 菌 发 酵 液 的 制 备 将 枯 草 芽 孢 杆 菌 短 短 芽 孢 杆 菌 地 衣 芽 孢 杆 菌 和 多 年 芽 孢 杆 菌 进 行 平 板 划 线 进 行 活 化, 之 后 挑 取 单 菌 落 于 50ml 液 体 NA 培 养 基 中,30,170rpm 培 养 16 小 时 将 发 酵 液 用 20mm 的 无 菌 滤 膜 进 行 过 滤, 从 而 制 备 这 四 种 菌 的 无 菌 发 酵 液 2.2.2 致 病 菌 的 NA 平 板 制 备 挑 取 睾 丸 酮 丛 毛 单 胞 菌 肺 炎 克 雷 伯 斯 氏 菌 乙 酸 钙 不 动 杆 菌 表 皮 葡 萄 球 菌 鸡 葡 萄 球 菌

68 嗜 麦 芽 寡 养 单 胞 菌 中 间 型 苍 白 杆 菌 沙 门 氏 菌 大 肠 杆 菌 的 单 菌 落 于 NA 液 体 培 养 基 中 摇 床 培 养 16 小 时, 将 预 先 制 备 好 的 1.7% 琼 脂 的 NA 固 体 培 养 基 加 热 熔 化, 待 其 冷 却 至 50 左 右 时, 分 别 加 入 上 述 菌 的 培 养 液 ( 每 2ml 加 入 到 100mlNA 培 养 基 中 ), 充 分 摇 匀 后 平 均 倒 入 4 块 培 养 皿 中, 制 备 成 培 养 基 平 板 2.2.3 抑 制 菌 滤 纸 片 的 制 备 将 制 备 好 的 滤 纸 片 放 置 在 枯 草 芽 孢 杆 菌 短 短 芽 孢 杆 菌 地 衣 芽 孢 杆 菌 和 解 淀 粉 芽 孢 杆 菌 的 摇 床 培 养 液 中, 浸 泡 5 分 钟, 用 镊 子 挑 取 单 个 滤 纸 片, 轻 轻 贴 放 到 被 抑 菌 平 板 上 3 试 验 结 果 图 1 对 8505 的 抑 制 效 果 ( 白 色 ) 图 2 对 8505 的 抑 制 效 果 ( 白 色 ) 图 3 对 8506 的 抑 制 效 果 ( 白 色 ) 图 4 对 8506 的 抑 制 效 果 ( 黑 色 )

69 图 5 对 8588 的 抑 制 效 果 ( 白 色 ) 图 6 对 8588 的 抑 制 效 果 ( 反 面 ) 图 7 对 8589 的 抑 制 效 果 ( 白 的 ) 图 8 对 8589 的 抑 制 效 果 ( 黑 色 ) 图 9 对 8595 的 抑 制 效 果 ( 白 色 ) 图 10 对 8595 的 抑 制 效 果 ( 黑 色 )

70 图 11 对 8440 的 抑 制 效 果 ( 白 色 ) 图 12 对 8440 的 抑 制 效 果 ( 黑 色 ) 图 13 对 8842 的 抑 制 效 果 ( 白 色 ) 图 14 对 8842 的 抑 制 效 果 ( 黑 色 ) 图 15 对 10504 的 抑 制 效 果 ( 白 色 ) 图 16 对 10504 的 抑 制 效 果 ( 黑 色 )

71 图 17 对 11369 的 抑 制 效 果 ( 白 色 ) 图 18 对 11369 的 抑 制 效 果 ( 黑 色 ) 图 19 对 11371 的 抑 制 效 果 ( 白 色 ) 图 20 对 11371 的 抑 制 效 果 ( 黑 色 ) 图 21 对 8464 的 抑 制 效 果 ( 白 色 ) 图 22 对 8464 的 抑 制 效 果 ( 黑 色 )

72 图 23 对 17381 的 抑 制 效 果 表 2 益 生 菌 对 致 病 菌 的 抑 制 效 果 致 病 菌 及 条 件 致 病 菌 对 对 其 抑 制 作 用 的 益 生 菌 肺 炎 克 雷 伯 斯 氏 菌 枯 草 芽 孢 杆 菌 琼 氏 不 动 杆 菌 枯 草 芽 孢 杆 菌 短 短 芽 孢 杆 菌 乙 酸 钙 不 动 杆 菌 解 淀 粉 芽 孢 杆 菌 枯 草 芽 孢 杆 菌 短 短 芽 孢 杆 菌 地 衣 芽 孢 杆 菌 红 球 菌 解 淀 粉 芽 孢 杆 菌 枯 草 芽 孢 杆 菌 短 短 芽 孢 杆 菌 表 皮 葡 萄 球 菌 枯 草 芽 孢 杆 菌 短 短 芽 孢 杆 菌 Acinetobacter towneri Acinetobacter sp. 解 淀 粉 芽 孢 杆 菌 枯 草 芽 孢 杆 菌 短 短 芽 孢 杆 菌 枯 草 芽 孢 杆 菌 短 短 芽 孢 杆 菌 大 肠 杆 菌 解 淀 粉 芽 孢 杆 菌 枯 草 芽 孢 杆 菌 短 短 芽 孢 杆 菌 沙 门 氏 菌 解 淀 粉 芽 孢 杆 菌 枯 草 芽 孢 杆 菌 短 短 芽 孢 杆 菌 伯 克 霍 尔 徳 氏 菌 解 淀 粉 芽 孢 杆 菌 枯 草 芽 孢 杆 菌 短 短 芽 孢 杆 菌 地 衣 芽 孢 杆 菌 粘 质 沙 雷 氏 菌 解 淀 粉 芽 孢 杆 菌 枯 草 芽 孢 杆 菌 短 短 芽 孢 杆 菌 睾 丸 酮 从 毛 单 胞 菌 解 淀 粉 芽 孢 杆 菌 枯 草 芽 孢 杆 菌 短 短 芽 孢 杆 菌

73 4 试 验 结 论 从 结 果 发 现, 除 蜡 样 芽 孢 杆 菌 之 外 的 四 种 芽 孢 杆 菌 对 12 种 病 原 菌 都 有 抑 制 效 果 其 中 枯 草 芽 孢 杆 菌 能 够 抑 制 所 有 的 病 原 菌, 短 短 芽 孢 杆 菌 和 解 淀 粉 芽 孢 杆 菌 能 够 抑 制 除 肺 炎 克 雷 伯 斯 氏 菌 之 外 的 所 有 病 原 菌, 地 衣 芽 孢 杆 菌 只 对 乙 酸 钙 不 动 杆 菌 和 伯 克 霍 尔 徳 氏 菌 有 抑 制 效 果 试 验 负 责 蓝 江 林 试 验 人 员 刘 云 浩

74 2011-08 承 担 单 位 : 福 建 省 农 科 院 农 业 生 物 资 源 研 究 所 试 验 设 计 : 试 验 项 目 : 葡 萄 球 菌 质 粒 标 准 品 的 制 作 和 荧 光 定 量 PCR 标 准 曲 线 的 制 备 试 验 人 员 : 刘 云 浩 试 验 负 责 : 蓝 江 林 报 告 日 期 :2011 年 08 月 计 数 月 份 :2011 年 08 月 研 究 资 格 系 数 (0.5-1.0) 实 验 设 计 系 数 (0.9-1.0 0.9-1.0) 报 告 得 分 总 分 实 验 设 计 实 验 记 载 实 验 分 析 实 验 简 报 实 验 文 章 1-20% 21-40% 41-60% 61-80% 81-100% 1%-5% 设 计 不 足, 实 施 错 误 6%-10% 设 计 不 全, 实 验 无 果 11%-15% 设 计 可 以, 实 施 不 全 16%-20% 设 计 完 整, 分 布 实 施 21%-25% 实 验 不 全, 记 载 无 果 26%-30% 实 验 不 足, 记 载 不 全 31%-35% 独 立 实 验, 记 载 不 全 36%-40% 分 布 实 验, 记 载 完 整 41%-45% 目 的 明 确, 实 验 完 成 46%-50% 实 验 完 整, 记 载 清 晰 51%-55% 实 验 系 统, 结 果 可 信 56%-60% 实 验 创 新, 分 析 清 晰 61%-65% 实 验 创 新, 结 论 清 晰 66%-70% 实 验 完 整, 统 计 清 晰 71%-75% 实 验 系 统, 数 据 可 靠 76%-80% 报 告 完 整, 文 章 雏 形 81%-85% 结 构 合 理, 分 析 有 据 86%-90% 逻 辑 清 晰, 统 计 合 理 91%-95% 图 表 完 整, 写 作 流 畅 96%-100% 文 献 完 整, 发 表 水 平 福 建 省 农 业 科 学 院 农 业 生 物 资 源 研 究 所 农 业 微 生 物 研 究 中 心 电 话 : 0591-87882571, 传 真 : 0591-87882571 fjat.yzxz.com

75 1. 试 验 目 的 鉴 于 之 前 提 取 的 芽 孢 杆 菌 和 大 肠 杆 菌 的 质 粒 都 有 RNA 的 污 染, 本 试 验 采 用 天 根 生 物 的 质 粒 提 取 试 剂 盒 来 提 取 重 组 质 粒, 以 求 获 得 纯 度 很 高 的 质 粒, 为 下 一 步 质 粒 标 准 品 的 获 取 奠 定 基 础 2. 试 验 方 法 2.1 材 料 和 试 剂 2.1.1 材 料 大 肠 杆 菌 DH5α,pMD 18-T Vector 试 剂 盒 插 入 了 大 肠 杆 菌 特 异 性 片 段 的 pmd-18t 质 粒 标 准 品 2.1.2 试 剂 和 仪 器 CaCl2(0.1M),75% 甘 油,AMP 母 液 (100mg/ml),IPTG(200mg/ml),X-gal(20mg/ml, 用 二 甲 基 甲 酰 胺 溶 解 ),LB 液 体 培 养 基 (50ml),50ml 离 心 管,5ml 枪 头 氨 苄 抗 性 平 板 (50ug/ml AMP,40ul X-gal,7ul IPTG) 葡 萄 球 菌 插 入 片 段 扩 增 所 需 引 物 : premier1-5 -GGAGGCAGCAGTAGGGAATC ; premier2-5 -CAGTTTCCAATGACCCTCCA Premix Ex Taq TM (Perfect Real Time), 葡 萄 球 菌 TaqMan 荧 光 探 针 ( 5 -(FAM) AAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGC(TAMARA)-3 ), 上 游 引 物 (5 - GCACATCTTGACGGTACCTAATCA-3 ), 下 游 引 物 (5 - AACGCTTGCCACCTACGTATTAC -3 ), ABI7500 Real-Time PCR System 2.2 方 法 2.2.1 葡 萄 球 菌 特 异 性 片 段 的 获 得 体 系 :10 buffer 2.5µl,dNTPs 0.5µl,Taq 酶 0.3µl,ddH 2O 18.7µl, 引 物 (10µM)1µl, 模 板 1µl 程 序 :95 3min,95 30s,57 30s,72 1min,35 个 循 环,72 5min,12 停 止 2.2.2 质 粒 提 取 步 骤 1. 柱 平 衡 步 骤 : 向 吸 附 柱 CP3 中 ( 吸 附 柱 放 入 收 集 管 中 ) 加 入 500µl 的 平 衡 液 BL,12,000 rpm (~13,400 g ) 离 心 1 分 钟, 倒 掉 收 集 管 中 的 废 液, 将 吸 附 柱 重 新 放 回 收 集 管 中 ( 请 使 用 当 天 处 理 过 的 柱 子 ) 2. 取 1-5 ml 过 夜 培 养 的 菌 液, 加 入 离 心 管 中, 使 用 常 规 台 式 离 心 机,12,000 rpm (~13,400 g ) 离 心 1 分 钟, 尽 量 吸 除 上 清 ( 菌 液 较 多 时 可 以 通 过 多 次 离 心 将 菌 体 沉 淀 收 集 到 一 个 离 心 管 中 ) 3. 向 留 有 菌 体 沉 淀 的 离 心 管 中 加 入 250 µl 溶 液 P1( 请 先 检 查 是 否 已 加 入 RNaseA), 使 用 移 液 器 或 涡 旋 振 荡 器 彻 底 悬 浮 细 菌 沉 淀 注 意 : 如 果 有 未 彻 底 混 匀 的 菌 块, 会 影 响 裂 解, 导 致 提 取 量 和 纯 度 偏 低 4. 向 离 心 管 中 加 入 250 µl 溶 液 P2, 温 和 地 上 下 翻 转 6-8 次 使 菌 体 充 分 裂 解 注 意 : 温 和 地 混 合, 不 要 剧 烈 震 荡, 以 免 打 断 基 因 组 DNA, 造 成 提 取 的 质 粒 中 混 有 基 因 组 DNA 片 断 此 时 菌 液 应 变 得 清 亮 粘 稠, 所 用 时 间 不 应 超 过 5 分 钟, 以 免 质 粒 受 到 破 坏 如 果 未 变 得 清 亮, 可 能 由 于 菌 体 过 多, 裂 解 不 彻 底, 应 减 少 菌 体 量 5. 向 离 心 管 中 加 入 350 µl 溶 液 P3, 立 即 温 和 地 上 下 翻 转 6-8 次, 充 分 混 匀, 此 时 将 出 现 白 色 絮 状 沉 淀 12,000 rpm (~13,400 g ) 离 心 10 分 钟, 此 时 在 离 心 管 底 部 形 成 沉 淀 注 意 :P3 加 入 后 应 立 即 混 合, 避 免 产 生 局 部 沉 淀 如 果 上 清 中 还 有 微 小 白 色 沉 淀, 可 再 次 离 心 后 取 上 清 6. 将 上 一 步 收 集 的 上 清 液 用 移 液 器 转 移 到 吸 附 柱 CP3 中 ( 吸 附 柱 放 入 收 集 管 中 ), 注 意 尽 量 不 要

76 吸 出 沉 淀 12,000 rpm (~13,400 g) 离 心 30-60 秒, 倒 掉 收 集 管 中 的 废 液, 将 吸 附 柱 CP3 放 入 收 集 管 中 7. 可 选 步 骤 : 向 吸 附 柱 CP3 中 加 入 500 µl 去 蛋 白 液 PD,12,000 rpm (~13,400 g ) 离 心 30-60 秒, 倒 掉 收 集 管 中 的 废 液, 将 吸 附 柱 CP3 重 新 放 回 收 集 管 中 如 果 宿 主 菌 是 end A + 宿 主 菌 (TG1,BL21, HB101,JM 系 列, ET12567 等 ), 这 些 宿 主 菌 含 有 大 量 的 核 酸 酶, 易 降 解 质 粒 DNA, 推 荐 采 用 此 步 如 果 宿 主 菌 是 enda - 宿 主 菌 (DH5α,TOP10 等 ), 这 步 可 省 略 8. 向 吸 附 柱 CP3 中 加 入 600 ul 漂 洗 液 PW( 请 先 检 查 是 否 已 加 入 无 水 乙 醇 ),12,000 rpm 离 心 30~60 秒, 倒 掉 收 集 管 中 的 废 液, 将 吸 附 柱 CP3 放 入 收 集 管 中 9. 重 复 操 作 步 骤 8 10. 将 吸 附 柱 CP3 放 入 收 集 管 中,12,000 rpm 离 心 2 分 钟, 目 的 是 将 吸 附 柱 中 残 余 的 漂 洗 液 去 除 11. 将 吸 附 柱 CP3 置 于 一 个 干 净 的 离 心 管 中, 向 吸 附 膜 的 中 间 部 位 滴 加 50-100 ul 洗 脱 缓 冲 液 EB, 室 温 放 置 2 分 钟,12,000 rpm 离 心 2 分 钟 将 质 粒 溶 液 收 集 到 离 心 管 中 2.2.3 荧 光 定 量 标 准 曲 线 绘 制 方 法 将 葡 萄 球 菌 质 粒 标 准 品 稀 释 到 207.8ng/µl, 经 计 算 拷 贝 数 是 6.0 10 10 /µl 将 此 样 品 10 倍 倍 比 稀 释, 取 浓 度 6.0 10 8, 6.0 10 7,6.0 10 6, 6.0 10 5, 6.0 10 4 四 个 梯 度 的 质 粒 标 准 品 进 行 反 应, 绘 制 标 准 曲 线, 每 个 浓 度 设 置 四 个 重 复 反 应 体 系 : 试 剂 使 用 量 (µl) 使 用 量 (µl) 终 浓 度 Premix Ex Taq(2x) 10.0 25.0 1 x PCR Forward Premier(10 µm) 0.4 1.0 0.2 µm*1 PCR Reverse Premier(10µM) 0.4 1.0 0.2 µm*1 荧 光 探 针 溶 液 0.8 2.0 *2 ROX Reference Dye Ⅱ(50x)*4 0.4 1.0 1 x DNA 模 板 2.0 4.0 *3 dh2o( 灭 菌 蒸 馏 水 ) 6.0 16.0 Total 20.0 50.0 *5 反 应 程 序 : 两 步 法 PCR 扩 增 标 准 程 序 :Stage 1: 预 变 性 Reps:1, 95 30s;Stage 2:PCR 反 应 Reps: 40, 95 5s,60 34s

77 图 1 反 应 程 序 3 试 验 结 果 插 入 了 葡 萄 球 菌 特 异 序 列 的 pmd-18t 重 组 质 粒 的 测 序 结 果 ( 红 色 部 分 表 示 插 入 序 列 ): TGATGAAGATTCGAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGATTGGAGGCAGCAGTA GGGAATCTTCCGCAATGGGCGAAAGCCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTCT TCGGATCGTAAAACTCTGTTATTAGGGAAGAACATATGTGTAAGTAACTGTGCACATCTTGAC GGTACCTAATCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGC AAGCGTTATCCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGCGCGTAGGCGGTTTTTTAAGTCTGATGTGAA AGCCCACGGCTCAACCGTGGAGGGTCATTGGAAACTGAATCGTCGACCTGCAGGCATGCAA GCTTGGCACTGGCCGTCGTTTTACAACGTCGTGACTGGGAAAACCCTGGCGTTACCCAACTT AATCGCCTTGCAGCACATCCCCCTTTCGCCAGCTGGCGTAATAGCGAAGAGGCCCGCACCGA TCGCCCTTCCCAACAGTTGCGCAGCCTGAATGGCGAATGGCGCCTGATGCGGTATTTTCTCCT TACGCATCTGTGCGGTATTTCACACCGCATATGGTGCACTCTCAGTACAATCTGCTCTGATGCC GCATAGTTAAGCCAGCCCCGACACCCGCCAACACCCGCTGACGCGCCCTGACGGGCTTGTCT GCTCCCGGCATCCGCTTACAGACAAGCTGTGACCGTCTCCGGGAGCTGCATGTGTCAGAGGT TTTCACCGTCATCACCGAAACGCGCGAGACGAAAGGGCCTCGTGATACGCCTATTTTTATAGG TTAATGTCATGATAATAATGGTTTCTTAGACGTCAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCG GAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACATAACCCT GATAAATGCTTCAATAATATTGAGAAAAGGAAGAGTATGAGGATTCCACATTTCCGTGTCCGC CCTTATTTCCTCTTTTTTTCGCGCATTGCCTCCCCGGTTGTTGGTCCCCCCCCCATA 表 1 所 测 得 序 列 的 比 对 结 果 Accession Description Total score Query coverage Max ident FR690783.1 Uncultured Staphylococcus sp. partial 16S rrna gene, clone 9.31 540 87% 100% FR690689.1 Uncultured Staphylococcus sp. 540 87% 100%

78 FR690574.1 FR821779.1 partial 16S rrna gene, clone 7.2 Uncultured Staphylococcus sp. partial 16S rrna gene, clone 3.9 Staphylococcus aureus subsp. aureus LGA251 complete genome sequence 540 87% 100% 540 87% 100% 荧 光 定 量 标 准 曲 线 如 下 : 图 2 葡 萄 球 菌 荧 光 定 量 PCR 标 准 曲 线

79 图 3 葡 萄 球 菌 荧 光 定 量 PCR 扩 增 曲 线 所 得 到 的 标 准 曲 线 的 方 程 是 y = -3.17x +45.4 R 2 = 0.9917 E= 1.06 4 试 验 结 论 从 测 序 的 比 对 结 果 中 可 以 看 出, 所 插 入 片 段 为 葡 萄 球 菌 属 的 特 异 性 片 段, 说 明 质 粒 标 准 品 构 建 成 功 一 般 认 为 相 关 系 数 (R 2 ) 大 于 0.98, 越 接 近 1, 结 果 可 信 度 越 高, 扩 增 效 率 (E) 在 0.8-1.2 之 间, 越 接 近 1, 结 果 越 理 想 从 试 验 结 果 中 看 出, 所 得 到 的 标 准 曲 线 方 程 R 2 达 到 了 0.99, 说 明 结 果 具 有 很 高 的 可 信 度, 而 扩 增 效 率 达 到 了 0.98, 也 比 较 理 想 因 此 可 以 进 行 下 一 步 样 品 中 大 肠 杆 菌 拷 贝 数 的 测 定 试 验 负 责 蓝 江 林 试 验 人 员 刘 云 浩

80 2011-08 承 担 单 位 : 福 建 省 农 科 院 农 业 生 物 资 源 研 究 所 试 验 设 计 : 试 验 项 目 : 荧 光 定 量 PCR 测 定 枯 草 芽 孢 杆 菌 大 肠 杆 菌 葡 萄 球 菌 的 数 量 变 化 试 验 人 员 : 刘 云 浩 试 验 负 责 : 蓝 江 林 报 告 日 期 :2011 年 08 月 计 数 月 份 :2011 年 08 月 研 究 资 格 系 数 (0.5-1.0) 实 验 设 计 系 数 (0.9-1.0 0.9-1.0) 报 告 得 分 总 分 实 验 设 计 实 验 记 载 实 验 分 析 实 验 简 报 实 验 文 章 1-20% 21-40% 41-60% 61-80% 81-100% 1%-5% 设 计 不 足, 实 施 错 误 6%-10% 设 计 不 全, 实 验 无 果 11%-15% 设 计 可 以, 实 施 不 全 16%-20% 设 计 完 整, 分 布 实 施 21%-25% 实 验 不 全, 记 载 无 果 26%-30% 实 验 不 足, 记 载 不 全 31%-35% 独 立 实 验, 记 载 不 全 36%-40% 分 布 实 验, 记 载 完 整 41%-45% 目 的 明 确, 实 验 完 成 46%-50% 实 验 完 整, 记 载 清 晰 51%-55% 实 验 系 统, 结 果 可 信 56%-60% 实 验 创 新, 分 析 清 晰 61%-65% 实 验 创 新, 结 论 清 晰 66%-70% 实 验 完 整, 统 计 清 晰 71%-75% 实 验 系 统, 数 据 可 靠 76%-80% 报 告 完 整, 文 章 雏 形 81%-85% 结 构 合 理, 分 析 有 据 86%-90% 逻 辑 清 晰, 统 计 合 理 91%-95% 图 表 完 整, 写 作 流 畅 96%-100% 文 献 完 整, 发 表 水 平 福 建 省 农 业 科 学 院 农 业 生 物 资 源 研 究 所 农 业 微 生 物 研 究 中 心 电 话 : 0591-87882571, 传 真 : 0591-87882571 fjat.yzxz.com

81 1. 试 验 目 的 利 用 荧 光 定 量 PCR 的 方 法 对 垫 料 中 的 枯 草 芽 孢 杆 菌 大 肠 杆 菌 和 葡 萄 球 菌 进 行 定 量 分 析, 本 实 验 基 于 之 前 提 取 的 五 批 新 店 部 队 猪 场 的 垫 料 总 DNA, 测 定 这 些 垫 料 之 中 上 述 菌 的 数 量, 以 期 获 得 它 们 的 数 量 变 化 规 律, 以 此 说 明 益 生 菌 和 致 病 菌 在 垫 料 之 中 的 定 殖 情 况 2. 试 验 方 法 2.1 材 料 和 试 剂 2.1.1 材 料 见 下 表 表 1 垫 料 样 品 信 息 样 品 采 集 时 间 ( 年. 月. 日 ) 采 集 栏 位 总 DNA 浓 度 (ng/g) 10.8.1 第 一 栏 10395 10.8.1 第 二 栏 25210 10.8.1 第 五 栏 19810 10.8.1 第 八 栏 14435 10.8.1 第 十 二 栏 37280 10.8.1 第 十 四 栏 8335 10.8.1 第 十 五 栏 3245 10.8.1 第 十 六 栏 8465 10.8.15 第 一 栏 29605 10.8.15 第 二 栏 9945 10.8.15 第 五 栏 29860 10.8.15 第 八 栏 13045 10.8.15 第 十 二 栏 9880 10.8.15 第 十 四 栏 12845 10.8.15 第 十 五 栏 8600 10.8.15 第 十 六 栏 5325 10.9.1 第 一 栏 35165 10.9.1 第 二 栏 58345 10.9.1 第 五 栏 22360 10.9.1 第 八 栏 58455 10.9.1 第 十 二 栏 25230 10.9.1 第 十 四 栏 58630 10.9.1 第 十 五 栏 79600 10.9.1 第 十 六 栏 51680 10.9.15 第 一 栏 10850 10.9.15 第 二 栏 9945 10.9.15 第 五 栏 43760 10.9.15 第 八 栏 22515 10.9.15 第 十 二 栏 7780 10.9.15 第 十 四 栏 100010 10.9.15 第 十 五 栏 5015

82 10.9.15 第 十 六 栏 7775 10.10.1 第 一 栏 31225 10.10.1 第 二 栏 19955 10.10.1 第 五 栏 17610 10.10.1 第 八 栏 10750 10.10.1 第 十 二 栏 10645 10.10.1 第 十 四 栏 22880 10.10.1 第 十 五 栏 12645 10.10.1 第 十 六 栏 7795 2.1.2 试 剂 和 仪 器 Premix Ex Taq TM (Perfect Real Time), ABI7500 Real-Time PCR System 2.2 方 法 反 应 体 系 见 下 表 : 表 2 反 应 体 系 试 剂 使 用 量 (µl) 使 用 量 (µl) 终 浓 度 Premix Ex Taq(2x) 10.0 25.0 1 x PCR Forward Premier(10 µm) 0.4 1.0 0.2 µm*1 PCR Reverse Premier(10µM) 0.4 1.0 0.2 µm*1 荧 光 探 针 溶 液 0.8 2.0 *2 ROX Reference Dye Ⅱ(50x)*4 0.4 1.0 1 x DNA 模 板 2.0 4.0 *3 dh 2O( 灭 菌 蒸 馏 水 ) 6.0 16.0 Total 20.0 50.0 *5 反 应 程 序 : 两 步 法 PCR 扩 增 标 准 程 序 :Stage 1: 预 变 性 Reps:1, 95 30s;Stage 2:PCR 反 应 Reps: 40, 95 5s,60 34s 图 1 反 应 程 序

83 3 试 验 结 果 见 下 表 所 示 表 3 所 测 样 本 中 枯 草 芽 孢 杆 菌 葡 萄 球 菌 和 大 肠 杆 菌 拷 贝 数 的 对 数 值 样 品 采 集 时 间 ( 年. 月. 日 ) 采 集 栏 位 枯 草 芽 孢 杆 菌 拷 贝 数 葡 萄 球 菌 拷 贝 数 大 肠 杆 菌 拷 贝 数 的 对 数 值 的 对 数 值 的 对 数 值 10.8.1 第 一 栏 5.09 3.73 4.41 10.8.1 第 二 栏 5.57 4.05 4.47 10.8.1 第 五 栏 6.58 5.16 4.60 10.8.1 第 八 栏 5.83 4.47 5.36 10.8.1 第 十 二 栏 4.72 3.70 4.11 10.8.1 第 十 四 栏 5.74 4.57 5.01 10.8.1 第 十 五 栏 5.61 4.19 4.93 10.8.1 第 十 六 栏 6.94 5.02 5.32 10.8.15 第 一 栏 6.14 5.55 4.54 10.8.15 第 二 栏 6.06 4.45 4.06 10.8.15 第 五 栏 5.55 4.08 5.06 10.8.15 第 八 栏 5.46 4.52 4.25 10.8.15 第 十 二 栏 6.06 4.98 4.76 10.8.15 第 十 四 栏 5.82 4.40 4.35 10.8.15 第 十 五 栏 6.26 4.87 4.78 10.8.15 第 十 六 栏 6.04 2.68 4.78 10.9.1 第 一 栏 6.9 5.28 5.99 10.9.1 第 二 栏 6.31 4.43 4.59 10.9.1 第 五 栏 5.82 5.55 4.46 10.9.1 第 八 栏 6.64 4.97 5.90 10.9.1 第 十 二 栏 6.56 4.43 5.75 10.9.1 第 十 四 栏 6.66 6.04 5.95 10.9.1 第 十 五 栏 6.63 5.43 5.22 10.9.1 第 十 六 栏 6.51 5.9 5.35 10.9.15 第 一 栏 6.39 5.99 4.85 10.9.15 第 二 栏 5.74 4.66 4.52 10.9.15 第 五 栏 5.61 5.3 4.16 10.9.15 第 八 栏 6.72 4.77 4.84 10.9.15 第 十 二 栏 6.17 5.3 5.57 10.9.15 第 十 四 栏 5.98 5.47 4.14 10.9.15 第 十 五 栏 6.09 5.17 4.04 10.9.15 第 十 六 栏 6.74 4.85 5.84 10.10.1 第 一 栏 4.9 2.83 4.26 10.10.1 第 二 栏 5.55 4.17 4.27 10.10.1 第 五 栏 5.57 4.98 3.83 10.10.1 第 八 栏 5.54 4.75 4.13 10.10.1 第 十 二 栏 6.13 4.56 4.92 10.10.1 第 十 四 栏 4.97 4.07 4.01

84 10.10.1 第 十 五 栏 5.74 4.06 4.07 10.10.1 第 十 六 栏 6.09 4.77 4.98 图 1 第 1 栏 中 三 种 菌 不 同 时 期 的 动 态 变 化 图 图 2 第 2 栏 中 三 种 菌 不 同 时 期 的 动 态 变 化 图

85 图 3 第 5 栏 中 三 种 菌 不 同 时 期 的 动 态 变 化 图 图 4 第 8 栏 中 三 种 菌 不 同 时 期 的 动 态 变 化 图

86 图 5 第 12 栏 中 三 种 菌 不 同 时 期 的 动 态 变 化 图 图 6 第 14 栏 中 三 种 菌 不 同 时 期 的 动 态 变 化 图

87 图 7 第 15 栏 中 三 种 菌 不 同 时 期 的 动 态 变 化 图 图 8 第 16 栏 中 三 种 菌 不 同 时 期 的 动 态 变 化 图 4 试 验 结 论 从 试 验 结 果 中 看 出, 枯 草 芽 孢 杆 菌 的 数 量 要 比 葡 萄 球 菌 和 大 肠 杆 菌 高 出 1~2 个 数 量 级, 通 过 两 个 月 的 数 据 变 化 可 以 看 出, 枯 草 芽 孢 杆 菌 的 数 量 基 本 上 没 有 很 大 变 化, 维 持 在 10 5 到 10 7 的 数 量 级 ; 葡 萄 球 菌 和 大 肠 杆 菌 有 比 较 小 的 变 化 幅 度, 但 基 本 上 维 持 在 10 3 到 10 5 的 数 量 级 说 明 在 取 样 的 这 个 阶 段, 这 三 种 菌 基 本 形 成 了 比 较 稳 定 的 群 落 结 构 而 枯 草 芽 孢 杆 菌 作 为 益 生 菌 能 够 在 垫 料 中 稳 定 的 存 在, 不 仅 如 此, 而 且 可 能 很 好 的 抑 制 了 大 肠 杆 菌 和 葡 萄 球 菌 的 繁 殖 试 验 负 责 蓝 江 林 试 验 人 员 刘 云 浩

88 2011-8-20 承 担 单 位 : 福 建 省 农 科 院 农 业 生 物 资 源 研 究 所 试 验 设 计 : 试 验 项 目 :Co 60 照 射 后 无 致 病 力 的 尖 孢 镰 刀 菌 菌 落 形 态 观 察 及 保 存 试 验 人 员 : 詹 洪 试 验 负 责 : 肖 荣 凤 报 告 日 期 :2011-8-20 计 数 月 份 :2011 年 8 月 研 究 资 格 系 数 (0.5-1.0) 实 验 设 计 系 数 (0.9-1.0 0.9-1.0) 报 告 得 分 总 分 实 验 设 计 实 验 记 载 实 验 分 析 实 验 简 报 实 验 文 章 1-20% 21-40% 41-60% 61-80% 81-100% 1%-5% 设 计 不 足, 实 施 错 误 6%-10% 设 计 不 全, 实 验 无 果 11%-15% 设 计 可 以, 实 施 不 全 16%-20% 设 计 完 整, 分 布 实 施 21%-25% 实 验 不 全, 记 载 无 果 26%-30% 实 验 不 足, 记 载 不 全 31%-35% 独 立 实 验, 记 载 不 全 36%-40% 分 布 实 验, 记 载 完 整 41%-45% 目 的 明 确, 实 验 完 成 46%-50% 实 验 完 整, 记 载 清 晰 51%-55% 实 验 系 统, 结 果 可 信 56%-60% 实 验 创 新, 分 析 清 晰 61%-65% 实 验 创 新, 结 论 清 晰 66%-70% 实 验 完 整, 统 计 清 晰 71%-75% 实 验 系 统, 数 据 可 靠 76%-80% 报 告 完 整, 文 章 雏 形 81%-85% 结 构 合 理, 分 析 有 据 86%-90% 逻 辑 清 晰, 统 计 合 理 91%-95% 图 表 完 整, 写 作 流 畅 96%-100% 文 献 完 整, 发 表 水 平 福 建 省 农 业 科 学 院 农 业 生 物 资 源 研 究 所 农 业 微 生 物 研 究 中 心 电 话 : 0591-87882571, 传 真 : 0591-87882571 fjat.yzxz.com

89 1. 试 验 目 的 Co 60 γ 射 线 是 一 种 高 能 电 磁 波, 其 诱 发 的 突 变 率 和 射 线 剂 量 直 接 有 关 它 能 产 生 电 离 作 用, 直 接 或 间 接 地 改 变 DNA 结 构 直 接 的 效 应 是 导 致 碱 基 的 化 学 键 脱 氧 核 糖 的 化 学 键 糖 - 磷 酸 相 连 接 的 化 学 键 的 断 裂 ; 间 接 的 效 应 是 电 离 辐 射 使 水 和 有 机 分 子 产 生 自 由 基, 自 由 基 作 用 于 DNA 分 子, 特 别 是 对 嘧 啶 的 作 用 较 强, 可 引 起 缺 失 和 损 伤, 造 成 基 因 突 变, 还 可 引 起 染 色 体 断 裂, 引 起 倒 位 缺 失 [1] 和 易 位 等 畸 变, 从 而 改 变 微 生 物 遗 传 性 状 尖 孢 镰 刀 菌 可 以 引 起 农 作 物 枯 萎 病, 是 世 界 范 围 内 毁 灭 性 的 土 传 病 害, 造 成 损 失 平 均 高 达 20%~80%, 镰 刀 菌 所 有 的 菌 株 都 能 在 土 壤 有 机 质 以 及 多 种 植 物 组 织 中 生 长 并 存 活 多 年, 极 难 彻 底 根 除 经 过 对 镰 刀 菌 多 种 微 生 物 防 治 作 用 的 比 较 研 究 发 现, 镰 刀 菌 无 致 病 力 菌 株 是 防 效 最 好 最 稳 定 [2] 的 生 防 因 子 之 一 非 致 病 力 镰 刀 菌 应 用 了 弱 株 系 交 互 保 护 作 用, 特 别 是 与 病 原 菌 同 型 的 非 致 病 力 菌 株, 在 根 际 与 致 病 菌 进 行 营 养 和 侵 染 位 点 的 竞 争, 诱 导 植 株 产 生 抗 性, 阻 止 或 延 迟 致 病 菌 的 进 入 和 [3] 繁 殖, 从 而 达 到 防 病 的 效 果 利 用 Co 60 γ 射 线 诱 变 处 理 无 致 病 力 的 尖 孢 镰 刀 菌 ( FJAT-9290), 筛 选 菌 落 形 态 差 异 大 的 菌 株 保 存, 为 进 一 步 的 诱 变 实 验 做 准 备 2. 试 验 方 法 2.1 实 验 材 料 2.1.1 供 试 菌 株 FJAT-9290 即 无 致 病 力 的 尖 孢 镰 刀 菌, 来 自 实 验 室 保 存 的 菌 种 2.1.2 实 验 仪 器 (1) 试 剂 : PDA 液 体 培 养 基 : 每 升 含 马 铃 薯 200g, 半 葡 萄 糖 20g PDA 培 养 基 : 每 升 含 马 铃 薯 200g, 半 葡 萄 糖 20g, 琼 脂 18g, 每 200 毫 升 培 养 基 中 加 入 1mL 40mg/mL 的 硫 酸 链 霉 素 9mL 的 无 菌 水 (2) 仪 器 : 超 净 工 作 台 恒 温 培 养 箱 2.2 试 验 方 法 2.2.1 菌 悬 液 的 制 备 用 接 种 环 刮 取 纯 化 的 菌 丝 放 入 100 ml 的 PDA 液 体 培 养 基 中,150rpm,28 培 养 2d 2.2.2 Co 60 照 射 诱 变 方 法 将 菌 悬 液 分 装 在 18 180mm 的 已 灭 菌 的 试 管 中, 用 橡 胶 赛 封 住 依 次 照 射, 剂 量 分 别 为 400Gy 600Gy 800Gy 1100Gy 1400Gy, 一 管 作 为 对 照, 不 接 受 辐 射 2.2.3 平 板 涂 布 (1) 经 过 Co 60 γ 射 线 处 理 后 的 菌 悬 液 分 别 依 次 稀 释 成 10-2 10-3 10-4 对 照 稀 释 成 10-5 10-6 (2) 分 别 取 100μL 涂 布 于 固 体 基 本 培 养 基 上, 每 个 梯 度 重 复 三 次, 于 28 培 养 箱 中 倒 置 培 养 4d 2.2.4 菌 落 计 数 统 计 培 养 平 板 上 菌 落 数, 算 出 同 一 稀 释 度 的 菌 落 平 均 数, 按 公 式 : 每 毫 升 菌 液 中 孢 子 的 数 量 =

90 同 一 稀 释 度 的 菌 落 平 均 数 稀 释 倍 数 2.2.5 菌 株 纯 化 用 灭 菌 的 牙 签 刮 取 菌 落 形 态 变 化 较 大 的 接 于 PDA 平 板 上, 在 28 的 恒 温 培 养 箱 中 培 养 4d 2.2.6 菌 种 保 存 对 纯 化 的 菌 种 编 号 拍 照, 提 交 保 存 3. 试 验 结 果 3.1 菌 落 计 数 对 稀 释 涂 布 的 平 板 进 行 计 数, 计 算 其 死 亡 率, 结 果 见 表 1 稀 释 涂 布 平 板 的 部 分 照 片 见 图 1-4(A: 反 面,B: 正 面 ) 表 1 Co 60 γ 射 线 处 理 后 菌 株 的 致 死 率 Co 60 辐 射 剂 量 (Gy) 菌 落 计 数 死 亡 率 0 6 10 7 0 400 6.55 10 6 89.08% 600 5.5 10 6 90.83% 800 2.45 10 6 95.92% 1100 6.33 10 5 98.95% 1400 8.67 10 5 98.55% 图 1 Co 60 照 射 剂 量 为 1100Gy( 重 复 一 )

91 图 2 Co 60 照 射 剂 量 为 1100Gy( 重 复 二 ) 3.2 菌 落 形 态 观 察 挑 出 部 分 纯 化 后 菌 落 形 态 变 化 较 大 的 菌 落 和 对 照 进 行 形 态 描 述 记 录, 结 果 见 表 2 表 3, 菌 落 照 片 见 图 3-11(A: 反 面,B: 正 面 ) 表 2 菌 落 反 面 形 态 菌 株 编 号 菌 落 反 面 形 态 FJAT-9290 整 体 紫 色, 圆 环 比 较 密 集, 圆 环 的 宽 度 窄, 颜 色 逐 渐 变 浅 FJAT-9907 整 体 深 紫, 圆 环 比 较 稀 疏, 宽 度 较 大, 圆 环 紫 黑 FJAT-9946 整 体 紫 黑, 圆 环 稀 疏, 宽 度 较 大, 颜 色 逐 渐 加 深, 边 缘 颜 色 较 浅 FJAT-9976 整 体 紫 色, 圆 环 稀 疏, 宽 度 逐 渐 赠 大, 颜 色 深 紫 FJAT-9997 整 体 浅 紫, 圆 环 稀 疏, 宽 度 逐 渐 赠 大, 颜 色 逐 渐 加 深 FJAT-30006 整 体 紫 色, 圆 环 稀 疏, 宽 度 逐 渐 赠 大, 颜 色 深 紫 FJAT-30022 整 体 紫 色, 圆 环 稀 疏, 宽 度 逐 渐 赠 大, 颜 色 逐 渐 加 深 FJAT-30031 整 体 紫 黑, 圆 环 稀 疏, 宽 度 逐 渐 赠 大, 颜 色 逐 渐 加 深 FJAT-30068 整 体 紫 色, 圆 环 稀 疏, 宽 度 逐 渐 增 大, 颜 色 逐 渐 加 深 表 3 菌 落 正 面 形 态 菌 株 编 号 菌 落 正 面 形 态 FJAT-9290 中 心 浅 紫, 四 周 浅 紫 ( 很 小 面 积 ), 菌 丝 稀 疏, 网 状 : 边 缘 很 稀 疏, 菌 丝 呈 絮 状 FJAT-9907 中 心 深 紫, 四 周 浅 紫 ( 大 面 积 ), 菌 丝 浓 密, 网 状 ; 白 色 菌 丝 稀 疏 絮 状, FJAT-9946 中 心 紫 黑, 四 周 紫 红, 菌 丝 很 浓 密, 网 状 ; 白 色 菌 丝 稍 稀 疏, 絮 状 FJAT-9976 中 心 紫 黑, 四 周 紫 色, 菌 丝 浓 密, 网 状 ; 白 色 菌 丝 稀 疏, 絮 状 FJAT-9997 中 心 紫 色, 四 周 淡 紫, 菌 丝 较 浓 密, 网 状 ; 白 色 面 积 大, 边 缘 稀 疏, 由 网 状 变 为 絮 状 FJAT-30006 中 心 紫 黑, 四 周 紫 色, 菌 丝 浓 密, 网 状 ; 白 色 菌 丝 稀 疏, 絮 状 FJAT-30022 中 心 紫 黑, 四 周 紫 色 ( 小 面 积 ), 网 状 ; 白 色 菌 丝 很 稀 疏, 絮 状 FJAT-30031 中 心 紫 黑, 四 周 浅 紫 ( 小 面 积 ), 菌 丝 浓 密, 网 状 ; 白 色 菌 丝 很 稀 疏, 稀 疏 FJAT-30068 中 心 紫 黑, 四 周 紫 色, 菌 丝 浓 密, 网 状 ; 白 色 菌 丝 由 网 状 到 絮 状

92 图 3 FJAT-9290 菌 落 图 片 图 4 FJAT-9907 菌 落 图 片

93 图 5 FJAT-9946 菌 落 图 片 图 6 FJAT-9997 菌 落 图 片

94 图 7 FJAT-30006 菌 落 图 片 图 8 FJAT-30022 菌 落 图 片

95 图 9 FJAT-30031 菌 落 图 片 图 10 FJAT-9976 菌 落 图 片 图 11 FJAT-30068 菌 落 图 片 4. 试 验 讨 论 1, 由 表 1 可 知, 菌 悬 液 经 不 同 剂 量 的 Co 60 γ 射 线 诱 变 处 理 后, 死 亡 率 随 着 诱 变 剂 量 的 增 加 逐 渐 增 大, 在 1100Gy 时 死 亡 率 达 到 最 高, 为 98.95% 2, 不 同 剂 量 的 诱 变 处 理, 观 察 纯 化 后 的 菌 落 形 态,400 600 800Gy 对 比 未 诱 变 的 菌 株, 菌 落 形 态 几 乎 没 有 差 异, 故 挑 选 诱 变 剂 量 1100Gy 和 1400Gy 的 纯 化 菌 株 保 存 观 察 菌 落 的 形 态, 与 对 照 比 较, 整 体 上 诱 变 后 的 菌 落 颜 色 变 深, 菌 丝 变 得 浓 密 3, 单 因 素 的 诱 变 处 理 获 得 诱 变 菌 株 的 可 能 性 很 小, 因 此 通 过 Co 60 γ 射 线 处 理 后 挑 选 出 的 菌 株 需 要 进 一 步 采 用 多 种 理 化 因 素 循 环 处 理, 例 如 高 温, 紫 外 等 诱 变 方 式

96 5.. 参 考 文 献 [1] 曹 友 声, 刘 仲 敏. 现 代 工 业 微 生 物 学 [M]. 长 沙 : 湖 南 科 学 技 术 出 版 社,1998. [2]Fuchs L.G.,Moenne Loccoz Y.,Delagu G. Nonpathogenic Fusarium oxysporum strain Fo47 induces resistance to Fusarium wilt in tomoto[j].plant Disease,1997,81:492-496. [3] 蓝 江 林, 朱 育 菁, 肖 荣 凤 等. 培 养 基 对 尖 孢 镰 刀 菌 非 致 病 力 菌 株 281 产 孢 量 的 影 响 [J]. 中 国 农 学 通 报,2007,23(9). 试 验 负 责 肖 荣 凤 试 验 人 员 詹 洪

97 2011-8-13 承 担 单 位 : 福 建 省 农 科 院 农 业 生 物 资 源 研 究 所 试 验 设 计 : 试 验 项 目 : 从 三 种 不 同 植 株 上 分 离 到 的 真 菌 的 分 子 鉴 定 试 验 人 员 : 詹 洪 试 验 负 责 : 肖 荣 凤 报 告 日 期 :2011-8-13 计 数 月 份 :2011 年 8 月 研 究 资 格 系 数 (0.5-1.0) 实 验 设 计 系 数 (0.9-1.0 0.9-1.0) 报 告 得 分 总 分 实 验 设 计 实 验 记 载 实 验 分 析 实 验 简 报 实 验 文 章 1-20% 21-40% 41-60% 61-80% 81-100% 1%-5% 设 计 不 足, 实 施 错 误 6%-10% 设 计 不 全, 实 验 无 果 11%-15% 设 计 可 以, 实 施 不 全 16%-20% 设 计 完 整, 分 布 实 施 21%-25% 实 验 不 全, 记 载 无 果 26%-30% 实 验 不 足, 记 载 不 全 31%-35% 独 立 实 验, 记 载 不 全 36%-40% 分 布 实 验, 记 载 完 整 41%-45% 目 的 明 确, 实 验 完 成 46%-50% 实 验 完 整, 记 载 清 晰 51%-55% 实 验 系 统, 结 果 可 信 56%-60% 实 验 创 新, 分 析 清 晰 61%-65% 实 验 创 新, 结 论 清 晰 66%-70% 实 验 完 整, 统 计 清 晰 71%-75% 实 验 系 统, 数 据 可 靠 76%-80% 报 告 完 整, 文 章 雏 形 81%-85% 结 构 合 理, 分 析 有 据 86%-90% 逻 辑 清 晰, 统 计 合 理 91%-95% 图 表 完 整, 写 作 流 畅 96%-100% 文 献 完 整, 发 表 水 平 福 建 省 农 业 科 学 院 农 业 生 物 资 源 研 究 所 农 业 微 生 物 研 究 中 心 电 话 : 0591-87882571, 传 真 : 0591-87882571 fjat.yzxz.com

98 1. 试 验 目 的 鉴 定 真 菌 的 方 法 很 多, 传 统 的 真 菌 分 类 方 法 是 以 真 菌 菌 株 的 形 态 学 特 征 生 长 特 征 以 及 生 理 生 化 指 标 为 基 础 对 某 一 未 知 真 菌 的 鉴 定, 以 上 指 标 所 耗 费 的 长, 工 作 繁 琐 而 且 某 些 真 菌 属 种 之 间 的 形 态 学 生 理 生 化 特 征 差 异 不 显 著, 形 态 学 和 生 长 特 征 经 常 受 到 环 境 因 素 的 影 响, 要 采 用 传 统 的 方 法 对 这 些 真 菌 进 行 鉴 定 分 类 有 一 定 的 难 度 随 着 分 子 生 物 学 和 生 物 信 息 学 等 相 关 学 科 的 迅 速 发 展, 一 系 列 分 子 生 物 学 方 法 逐 渐 被 应 用 到 真 菌 的 分 类 鉴 定 中 大 分 子 rrna 及 其 基 因 rdna 已 被 作 为 一 个 分 子 指 标, 广 泛 的 应 用 到 真 菌 的 分 类 的 鉴 定 中 利 用 ITS 进 行 菌 种 鉴 定 是 目 前 较 多 采 用 的 方 法 ITS 是 内 源 转 录 间 隔 区 (Internal Transcribed Spacer) 的 英 文 缩 写, 位 于 rrna 编 码 基 因 18S,5.8S 和 28S 之 间 的 小 基 因 片 段 其 优 点 有 : 具 有 高 拷 贝 数, 整 个 序 列 的 长 度 在 600~800bp, 利 用 rdna 通 用 引 物 能 够 很 容 易 被 扩 增 出 来 ; 同 时 包 含 保 守 与 变 异 序 列, 能 根 据 保 守 序 列 中 的 变 异 位 点 设 计 特 殊 引 物 进 行 特 异 性 扩 增 比 较,rRNA 基 因 (rdna) 在 微 [1] 生 物 的 鉴 定 应 用 中, 具 有 检 测 微 生 物 种 水 平 的 多 态 性 特 征 本 实 验 用 ITS4 和 ITS5 作 为 引 物, 对 从 三 种 不 同 植 株 中 获 取 的 7 株 真 菌 进 行 鉴 定 2. 试 验 方 法 2.1 实 验 材 料 2.1.1 供 试 菌 株 ( 菌 株 来 源 见 表 1) 表 1 供 试 菌 株 的 来 源 序 号 菌 株 编 号 来 源 采 样 地 1 FJAT-9851 发 病 空 心 菜 福 建 漳 州 2 FJAT-9852 发 病 空 心 菜 福 建 漳 州 3 FJAT-9853 发 病 空 心 菜 福 建 漳 州 4 FJAT-9862 发 病 莲 雾 叶 福 建 漳 州 5 FJAT-9863 发 病 莲 雾 叶 福 建 漳 州 6 FJAT-9865 发 病 莲 雾 叶 福 建 漳 州 7 FJAT-9866 健 康 番 茄 福 建 福 州 2.1.2 实 验 仪 器 (1) 试 剂 :PDA 培 养 基 : 每 升 含 马 铃 薯 200g, 半 葡 萄 糖 20g, 琼 脂 18g, 每 200 毫 升 培 养 基 中 加 入 1mL 40mg/mL 的 硫 酸 链 霉 素 无 菌 水 dntp 购 自 福 州 博 海 生 物 技 术 有 限 公 司 ;Buffer,Taq 酶 购 自 北 京 天 根 生 化 科 技 有 限 公 司 ; 引 物 1500 bpmaker 购 自 上 海 英 竣 生 物 技 术 公 司 (2) 仪 器 : 超 净 工 作 台 离 心 机 Biometra 梯 度 PCR 仪 BIO-RAD 电 泳 仪 UVP 凝 胶 成 像 仪 2.2 实 验 方 法 2.2.1 2.1 菌 株 的 活 化 于 -80 冰 箱 中 取 出 保 存 的 菌 株, 在 PDA 平 板 上 划 线 培 养 3d 后, 用 灭 菌 的 牙 签 挑 取 菌 丝 插 入 PDA 平 板 上 培 养 3d

99 2.2.2 DNA 的 提 取 ( 采 用 尿 素 提 取 法 ) (1) 称 取 150mg 研 磨 的 菌 丝 样 品 与 1.5mL 灭 菌 的 离 心 管 中, 加 入 800μL 尿 素 提 缓 冲 液 (7 mol/l Urea,50mmol/L Tris-HCl PH8.0,62.5mmol/L NaCl),160μL 20%SDS, 用 力 震 荡 摇 匀 后,12000r/min 离 心 5min (2) 将 上 清 液 移 入 到 另 一 个 新 的 离 心 管 中, 12000r/min 再 次 离 心 5min, 再 次 吸 取 上 清 液 到 新 的 离 心 管 中, 加 入 等 提 及 的 苯 酚 / 氯 仿 / 异 戊 醇 溶 液 ( 体 积 比 为 25:24:1, 吸 下 层 ), 用 力 震 荡 上 下 颠 倒 混 匀,12000r/min 离 心 5min (3) 取 上 清 液 到 新 的 离 心 管 中 加 入 等 体 积 的 异 丙 醇 和 1/10 体 积 的 3mol/L 的 NaAC 溶 液 (PH5.2), -20 放 置 20min (4)12000r/min 离 心 5min, 弃 上 清 夜, 放 置 使 管 壁 液 体 流 尽 (5) 加 70% 无 水 乙 醇 漂 洗 两 次 使 DNA 沉 淀,12000r/min 离 心 1min, 弃 上 清 液 室 温 风 干 挥 发 乙 醇, 加 入 50μL 灭 菌 水 溶 解, 放 置 4 冰 箱 过 夜 溶 解 (6)-20 保 存 2.2.3.3 PCR 扩 增 (1) 扩 增 体 系 ddw:37.5μl ; Buffer:5μL; dntp:1μl ITS4:2μL; ITS5:2μL L; Taq:0.5μL DNA:2μL (2) 扩 增 程 序 94, 预 变 性 5min; 94 变 性 1min, 55 退 火 30 s, 72 延 伸 1min, 进 行 30 个 循 环 ; 最 后 72 5min 3. 试 验 结 果 3.1 ITS 区 扩 增 结 果 供 试 菌 株 的 核 糖 体 DNA ITS 区 扩 增 结 果 如 图 1 所 示, 泳 道 编 号 1~7 为 所 扩 增 的 结 果 1 号 和 4 号 菌 株 无 条 带, 2 3 5 6 和 7 号 菌 株 均 扩 增 出 单 一 条 带, 大 小 在 500~600bp 之 间

100 图 1 供 试 菌 株 的 PCR 扩 增 图 谱 泳 道 编 号 1~7 为 表 1 中 所 列 菌 株 ;M:1500bp DNA ladder; +: 阳 性 对 照 ;-: 阴 性 对 照 3.2 ITS 区 序 列 测 定 结 果 测 序 结 果 显 示, 序 列 长 度 580~603bp 不 等, 菌 株 碱 基 编 码 序 列 如 下 所 示 2 号 :FJAT-98 2 1 ttcctcccgg cttttgatat gcttaagttc agcgggtatt cctacctgat ccgaggtcaa 61 cattcagaag ttgggggttt aacggcttgg ccgcgccgcg ttccagttgc gagggtttta 121 ctactacgca atggaggctg cagcgagacc gccactagat ttcggggccg gcttgccgca 181 agggctcgcc gatccccaac accaaacccg agggcttgag ggttgaaatg acgctcgaac 241 aggcatgccc gccagaatac tggcgggcgc aatgtgcgtt caaagattcg atgattcact 301 gaattctgca attcacatta cttatcgcat tttgctgcgt tcttcatcga tgccagaacc 361 aagagatccg ttgttgaaag ttttgattta tttatggttt tactcagaag ttacatatag 421 aaacagagtt taggggtcct ctggcgggcc gtcccgtttt accgggagcg ggctgatccg 481 ccgaggcaac aagtggtatg ttcacagggg tttgggagtt gtaaactcgg taatgatccc 541 tccgctggtt caccaacgga gaccttgtta cgatttttta ct 3 号 :FJAT-9853 1 ttcctccgct tattgatatg cttaagttca gcgggtattc ctacctgatc cgaggtcaac 61 cttagtaaaa ttgggggttt tacggctaga gtccctccga atcccaatgc gagacgaaat 121 gttactacgc aaaggaggct ccgagagggt ccgccactac ctttaagggc ctacgtcaac 181 cgtagagccc caacaccaag cagagcttga gggttgaaat gacgctcgaa caggcatgcc 241 cgccagaatg ctggcgggcg caatgtgcgt tcaaagattc gatgattcac tgaattctgc 301 aattcacatt acttatcgca tttcgctgcg ttcttcatcg atgccagaac caagagatcc 361 gttgttaaaa gttttgatta tttgcttgtg tcactcagaa gaaacgtcgt taaatcagag 421 tttggttatc ctccggcggg cgccccaccc gcggacggga gagggccggg agacgtcctt 481 tttaggggac gcctacccgc cgaagcaaca gttaaggtat gttcacaaag ggttgatgag 541 cggtaactca gtaatgatcc ctccgctggt tcaccaacgg agaccttgtt acgacttttt 601 act

101 5 号 :FJAT-9863 1 atatgcttaa gttcagcggg tattcctacc tgatccgagg tcaacctttg gaaaattggg 61 gggttttacg gcaagagtcc ctccggatcc cagtgcgaga cgtaaagtta ctacgcaaag 121 gaggctccgg gagggtccgc cactaccttt gagggcctac atcagctgta gggccccaac 181 accaagcaga gcttgagggt tgaaatgacg ctcgaacagg catgcccgcc agaatgctgg 241 cgggcgcaat gtgcgttcaa agattcgatg attcactgaa ttctgcaatt cacattactt 301 atcgcatttc gctgcgttct tcatcgatgc cagaaccaag agatccgttg ttaaaagttt 361 tgattatttg cttgtaccac tcagaagaaa cgtcgttaaa tcagagtttg gttatcctcc 421 ggcgggcgcc gacccgcccg gaggcgggag gccgggaggg tcgcggagac cctacccgcc 481 gaagcaacag ttataggtat gttcacaaag ggttatagag cgtaaactca gtaatgatcc 541 ctccgctggt tcaccaacgg agaccttgtt acgatttttt act 6 号 :FJAT-9865 1 ttcctccggc ttttgatatg cttaagttca gcgggtattc ctacctgatc cgaggtcaac 61 ctttggaaaa ttggggggtt ttacggcaag agtccctccg gatcccagtg cgagacgtaa 121 agttactacg caaaggaggc tccgggaggg tccgccacta cctttgaggg cctacatcag 181 ctgtagggcc ccaacaccaa gcagagcttg agggttgaaa tgacgctcga acaggcatgc 241 ccgccagaat gctggcgggc gcaatgtgcg ttcaaagatt cgatgattca ctgaattctg 301 caattcacat tacttatcgc atttcgctgc gttcttcatc gatgccagaa ccaagagatc 361 cgttgttaaa agttttgatt atttgcttgt accactcaga agaaacgtcg ttaaatcaga 421 gtttggttat cctccggcgg gcgccgaccc gcccggaggc gggaggccgg gagggtcgcg 481 gagaccctac ccgccgaagc aacagttata ggtatgttca caaagggtta tagagcgtaa 541 actcagtaat gatccctccg ctggttcacc aacggagacc ttgttacgat ttttact 7 号 :FJAT-9866 1 ttcctccggc ttttgatatg cttaagttca gcgggtattc ctacctgatc cgaggtcaac 61 attcagaagt tgggggttta acggcttggc cgcgccgcgt tccagttgcg agggttttac 121 tactacgcaa tggaggctgc agcgagaccg ccactagatt tcggggccgg cttgccgcaa 181 gggctcgccg atccccaaca ccaaacccga gggcttgagg gttgaaatga cgctcgaaca 241 ggcatgcccg ccagaatact ggcgggcgca atgtgcgttc aaagattcga tgattcactg 301 aattctgcaa ttcacattac ttatcgcatt ttgctgcgtt cttcatcgat gccagaacca 361 agagatccgt tgttgaaagt tttgatttat ttatggtttt actcagaagt tacatataga 421 aacagagttt aggggtcctc tggcgggccg tcccgtttta ccgggagcgg gctgatccgc 481 cgaggcaaca agtggtatgt tcacaggggt ttgggagttg taaactcggt aatgatccct 541 ccgctggttc accaacggag accttgttac gatttttact 3.3 测 序 结 果 与 GenBank 核 酸 序 列 数 据 库 进 行 同 源 性 比 较 将 所 得 序 列 在 GenBank 核 酸 序 列 数 据 库 中 进 行 同 源 序 列 搜 索 根 据 真 菌 的 分 子 分 类 原 则, 认 为 通 过 ITS 区 域 比 对, 序 列 相 似 性 99%, 即 鉴 别 为 相 同 种 ; 序 列 相 似 性 大 于 95% 且 小 于 99%, 鉴 别 为 相 同 属 ; 序 列 相 似 性 95%, 鉴 别 为 相 同 科 比 较 结 果 见 表 2

102 表 2 与 GenBank 核 酸 序 列 数 据 库 进 行 同 源 性 比 对 的 结 果 序 号 菌 株 编 号 结 果 2 FJAT-9852 Gibberella moniliformis( 串 珠 赤 霉 菌 ) 3 FJAT-9853 Colletotrichum truncatum( 大 豆 炭 疽 病 菌 ) 5 FJAT-9863 Glomerella cingulata( 炭 疽 病 菌 ) 6 FJAT-9865 Glomerella cingulata( 炭 疽 病 菌 ) 7 FJAT-9866 Gibberella moniliformis( 串 珠 赤 霉 菌 ) 4. 试 验 讨 论 (1) 图 1 可 知,1 号 和 4 号 菌 株 在 泳 道 中 无 条 带 显 示, 这 可 能 是 扩 增 的 产 物 浓 度 过 低 造 成 的, 具 体 的 原 因 有 待 检 测 (2)3 号 菌 株 即 FJAT-9853 分 离 自 空 心 菜,5 号 和 6 号 菌 株 即 FJAT-9863 和 FJAT-9865 均 分 离 自 莲 雾 病 叶 这 三 株 菌 均 为 炭 疽 病 菌 炭 疽 菌 属 真 菌 是 一 类 全 球 性 分 布 的 植 物 病 原 菌, 特 别 是 在 热 带 亚 热 带 引 起 谷 类 水 果 蔬 菜 等 多 种 作 物 在 采 收 前 后 发 生 炭 疽 病, 导 致 很 大 的 经 济 损 失 故 此 推 测 炭 疽 病 菌 可 能 是 导 致 空 心 菜 和 莲 雾 发 病 的 原 因 之 一 (3)2 号 和 7 号 菌 株 即 FJAT-9852 和 FJAT-9866 分 别 分 离 自 发 病 的 空 心 菜 和 健 康 的 番 茄, 两 株 菌 均 为 串 珠 赤 霉 菌 串 珠 赤 霉 菌 是 串 珠 镰 刀 菌 的 有 性 态, 串 珠 镰 刀 菌 易 造 成 植 株 的 根 腐 和 茎 基 腐, 还 能 引 起 顶 腐 穗 腐 等 症 状 5.. 参 考 文 献 [1] 朱 研 研, 王 耀 耀, 付 美 红 等. 真 菌 分 类 鉴 定 研 究 进 展 [J]. 河 北 化 工,2010,33(4). 试 验 负 责 肖 荣 凤 试 验 人 员 詹 洪

103 2011-8-27 承 担 单 位 : 福 建 省 农 科 院 农 业 生 物 资 源 研 究 所 试 验 设 计 : 试 验 项 目 : 漳 州 香 蕉 枯 萎 病 植 株 根 际 土 壤 中 芽 孢 杆 菌 的 分 离 与 保 存 试 验 人 员 : 詹 洪 试 验 负 责 : 肖 荣 凤 报 告 日 期 :2011-8-27 计 数 月 份 :2011 年 8 月 研 究 资 格 系 数 (0.5-1.0) 实 验 设 计 系 数 (0.9-1.0 0.9-1.0) 报 告 得 分 总 分 实 验 设 计 实 验 记 载 实 验 分 析 实 验 简 报 实 验 文 章 1-20% 21-40% 41-60% 61-80% 81-100% 1%-5% 设 计 不 足, 实 施 错 误 6%-10% 设 计 不 全, 实 验 无 果 11%-15% 设 计 可 以, 实 施 不 全 16%-20% 设 计 完 整, 分 布 实 施 21%-25% 实 验 不 全, 记 载 无 果 26%-30% 实 验 不 足, 记 载 不 全 31%-35% 独 立 实 验, 记 载 不 全 36%-40% 分 布 实 验, 记 载 完 整 41%-45% 目 的 明 确, 实 验 完 成 46%-50% 实 验 完 整, 记 载 清 晰 51%-55% 实 验 系 统, 结 果 可 信 56%-60% 实 验 创 新, 分 析 清 晰 61%-65% 实 验 创 新, 结 论 清 晰 66%-70% 实 验 完 整, 统 计 清 晰 71%-75% 实 验 系 统, 数 据 可 靠 76%-80% 报 告 完 整, 文 章 雏 形 81%-85% 结 构 合 理, 分 析 有 据 86%-90% 逻 辑 清 晰, 统 计 合 理 91%-95% 图 表 完 整, 写 作 流 畅 96%-100% 文 献 完 整, 发 表 水 平 福 建 省 农 业 科 学 院 农 业 生 物 资 源 研 究 所 农 业 微 生 物 研 究 中 心 电 话 : 0591-87882571, 传 真 : 0591-87882571 fjat.yzxz.com

104 1. 试 验 目 的 土 壤 是 一 种 极 其 复 杂, 具 有 自 身 来 源 和 自 身 发 展 历 史 的 有 机 自 然 物, 是 微 生 物 的 天 然 培 养 基 土 壤 中 不 仅 有 微 生 物 的 存 在, 而 且 形 形 色 色, 种 类 繁 多 主 要 包 括 细 菌 真 菌 放 线 菌 藻 类 和 原 [1] 生 动 物 其 中, 细 菌 占 最 大 量, 其 次 是 真 菌, 它 们 的 作 用 也 最 盛 芽 孢 杆 菌 具 有 代 谢 快 繁 殖 快, 生 命 力 强 体 积 大 等 特 征 芽 孢 杆 菌 4 小 时 增 殖 10 万 倍, 而 标 准 菌 4 小 时 仅 可 繁 殖 6 倍 ; 无 湿 状 态 可 耐 低 温 -60 耐 高 温 +280, 耐 强 酸 耐 强 碱 抗 菌 消 毒 耐 高 氧 耐 低 氧 ; 体 积 比 一 般 病 源 菌 分 子 大 4 倍 数, 占 据 空 间 优 势, 抑 制 有 害 菌 的 生 长 繁 殖 本 实 验 中 的 土 壤 样 本 是 分 别 从 健 康 和 患 香 蕉 枯 病 的 植 株 根 际 采 集 的, 且 植 株 的 发 病 程 度 逐 渐 加 深 香 蕉 枯 萎 病 (Banana vasicular wilt) 也 称 巴 拿 马 病, 是 一 种 国 内 检 疫 性 毁 灭 性 病 害,1904 年 [2] 在 美 国 夏 威 夷 首 次 发 现, 现 分 布 于 亚 洲 非 洲 澳 大 利 亚 南 太 平 洋 及 热 带 美 洲 的 香 蕉 产 区, 我 国 广 东 广 西 台 湾 福 建 有 分 布, 福 建 省 漳 州 南 靖 泉 州 莆 田 等 地 发 生 严 重, 引 起 粉 蕉 整 株 枯 萎, [3] 林 时 迟 (2000) 鉴 定 该 病 病 原 为 古 巴 尖 镰 孢 分 离 香 蕉 枯 萎 病 植 株 根 际 土 壤 中 的 芽 孢 杆 菌, 保 存 菌 种, 以 供 深 入 研 究 其 和 香 蕉 枯 萎 病 之 间 的 关 系 2. 试 验 方 法 2.1 实 验 材 料 2.1.1 供 试 土 样 本 实 验 的 6 种 土 样 均 于 2011 年 9 月 采 自 福 建 漳 州 南 靖, 分 别 从 健 康 植 株 和 发 病 植 株 根 际 采 集, 根 据 褐 变 程 度,5 株 患 病 植 株 的 发 病 等 级 依 次 为 1 2 3 4 5 级, 具 体 见 表 1 表 1 土 样 来 源 土 样 编 号 来 源 采 样 地 点 时 间 1 健 康 香 蕉 根 际 漳 州 南 靖 2011 年 9 月 2 1 级 发 病 植 株 根 际 漳 州 南 靖 2011 年 9 月 3 2 级 发 病 植 株 根 际 漳 州 南 靖 2011 年 9 月 4 3 级 发 病 植 株 根 际 漳 州 南 靖 2011 年 9 月 5 4 级 发 病 植 株 根 际 漳 州 南 靖 2011 年 9 月 6 5 级 发 病 植 株 根 际 漳 州 南 靖 2011 年 9 月 2.1.2 实 验 仪 器 (1) 试 剂 :NA 培 养 基 : 每 升 含 牛 肉 浸 膏 3g, 酵 母 浸 膏 1g, 蛋 白 胨 5g, 葡 萄 糖 10g, 琼 脂 18g,pH 7.2-7.6 9mL 无 菌 水 (2) 仪 器 : 超 净 工 作 台, 恒 温 培 养 箱 2.2 实 验 方 法 2.2.1 样 品 处 理 分 别 称 取 1g 的 土 样 加 入 9mL 的 无 菌 水 中, 剧 烈 震 荡 混 匀 用 移 液 枪 吸 1mL 原 液 加 入 9mL 的 无 菌 水 中 稀 释 成 10-2 将 稀 释 成 10-2 的 土 壤 样 品 放 置 到 80 的 水 浴 中 加 热 10min, 杀 死 其 他 细 菌 2.2.2 稀 释 涂 布 用 移 液 枪 吸 100 μl 水 浴 后 的 土 壤 样 品 在 NA 平 板 上 涂 布, 每 个 样 本 两 个 重 复 2.2.3 恒 温 培 养

105 将 涂 布 好 的 平 板 放 在 30 的 恒 温 培 养 箱 中 培 养 1~2d 2.2.4 菌 落 计 数 统 计 培 养 平 板 上 菌 落 数, 算 出 同 一 稀 释 度 的 菌 落 平 均 数, 按 公 式 : 每 克 土 样 中 微 生 物 的 数 量 = 同 一 稀 释 度 的 菌 落 平 均 数 稀 释 倍 数 / 含 菌 样 品 克 数 2.2.5 菌 株 纯 化 用 划 线 法 挑 取 平 板 上 的 单 菌 落 在 NA 培 养 基 上 划 线, 倒 置 于 30 的 恒 温 培 养 箱 中 培 养 1~2d 2.2.6 菌 种 保 存 对 菌 种 进 行 编 号 拍 照, 然 后 提 交 保 存 3. 试 验 结 果 3.1 菌 落 形 态 特 征 从 6 个 根 际 土 壤 样 本 中 共 分 离 到 9 种 芽 孢 杆 菌, 菌 株 编 号 及 菌 落 形 态 特 征 见 表 2, 菌 落 照 片 见 图 1-9(A: 反 面,B: 正 面 ) 表 2 菌 落 形 态 特 征 序 号 菌 株 编 号 菌 落 特 征 1 FJAT-14460 中, 淡 粉 色, 圆 形, 湿 润, 表 面 光 滑 稍 凸 2 FJAT-14461 中, 淡 黄 色, 圆 形, 较 湿 润, 表 面 光 滑 稍 凸 3 FJAT-14462 小, 乳 白 色, 圆 形, 较 湿 润, 表 面 平 滑 4 FJAT-14465 中, 乳 白 色, 不 规 则, 四 周 湿 润, 表 面 凸 出 褶 皱 干 燥, 5 FJAT-14466 淡 白 色, 圆 形 或 椭 圆 形, 湿 润, 表 面 凸 出 光 滑, 边 缘 模 糊 6 FJAT-14470 大, 白 色, 性 状 不 规 则, 极 干 燥, 表 面 平 滑 7 FJAT-14472 乳 黄 色, 圆 形, 极 湿 润, 表 面 凸 出 光 滑, 具 流 动 性 8 FJAT-14474 黄 色, 不 规 则, 较 干 燥, 表 面 凸 出 褶 皱 9 FJAT-14475 大, 乳 白 色, 树 枝 状, 较 湿 润, 表 面 平 滑 图 1 FJAT-14460 菌 落 图 片

106 图 2 FJAT-14461 菌 落 图 片 图 3 FJAT-14462 菌 落 图 片

107 图 4 FJAT-14465 菌 落 图 片 图 5 FJAT-14466 菌 落 图 片

108 图 6 FJAT-14470 菌 落 图 片 图 7 FJAT-14472 菌 落 图 片

109 图 8 FJAT-14474 菌 落 图 片 图 9 FJAT-14475 菌 落 图 片 3.2 数 量 统 计 3.2.1 每 种 土 样 在 平 板 上 的 菌 落 总 数 从 6 种 根 际 土 壤 中 共 分 离 到 的 9 种 芽 孢 杆 菌 :FJAT-14460 FJAT-14461 FJAT-14462 FJAT-14465 FJAT-14466 FJAT-14470 FJAT-14472 FJAT-14474 FJAT-14475 它 们 的 序 号 依 次 为 :1 2 3 4 5 6 7 8 9 每 种 土 样 平 板 上 的 菌 落 总 数 ( 见 图 10) 25 20 16.8 20.8 18.9 17.1 22.3 菌 落 总 数 万 个 15 10 13.8 5 0 1 2 3 4 5 6 菌 株 序 号 图 10 每 种 土 样 在 平 板 上 菌 落 总 数

110 3.2.2 每 种 土 样 中 含 各 种 菌 的 具 体 数 目 ( 见 图 11-16) 菌 落 总 数 万 个 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 9.2 5.6 0 0.5 0.4 0 0 0.5 0.6 1 2 3 4 5 6 7 8 9 菌 株 序 号 图 11 1 号 土 样 中 每 种 菌 在 平 板 上 的 总 数 8 7.6 7.6 菌 落 总 数 万 个 7 6 5 4 3 2 1 0 2.5 1.1 1.2 0.8 0 0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 菌 株 序 号 图 12 2 号 土 样 中 每 种 菌 在 平 板 上 的 总 数

111 12 10 10.4 菌 落 总 数 8 6 5.2 万 个 4 2 0 2.8 0 0.2 0 0 0.3 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 菌 株 序 号 图 13 3 号 土 样 中 每 种 菌 在 平 板 上 的 总 数 菌 落 总 数 万 个 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 9.2 4 2.8 0 0.4 0.5 0 0.2 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 菌 株 序 号 图 14 4 号 土 样 中 每 种 菌 在 平 板 上 的 总 数 6 5 5.3 4.4 菌 落 总 数 万 个 4 3 2 1 0 1.7 1.2 0.8 0.4 0 0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 菌 株 序 号

112 图 15 5 号 土 样 中 每 种 菌 在 平 板 上 的 总 数 菌 落 总 数 万 个 14 12 10 8 6 4 2 0 12.4 5 2.2 2.3 0 0 0.4 0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 菌 株 序 号 图 16 3.2.3 每 种 菌 在 平 板 上 的 总 数 9 种 菌 每 种 的 数 量 总 和 见 图 17 6 号 土 样 中 每 种 菌 在 平 板 上 的 总 数 菌 落 总 数 万 个 50 45 40 35 30 25 20 15 10 5 0 43.1 42.8 1.1 1.9 12.1 4.3 1.6 2.2 0.6 1 2 3 4 5 6 7 8 9 菌 株 序 号 图 17 每 种 菌 在 平 板 上 的 总 数 4. 试 验 讨 论 (1) 土 壤 中 含 有 丰 富 的 微 生 物, 从 图 10 可 以 看 出 健 康 植 株 根 际 土 壤 含 有 的 芽 孢 杆 菌 数 量 少, 发 病 最 严 重 的 植 株 根 际 土 壤 中 含 有 的 芽 孢 杆 菌 数 量 最 多, 这 可 能 与 芽 孢 杆 菌 的 抑 菌 作 用 有 关 (2) 结 合 图 11- 图 16 可 知, 在 香 蕉 枯 萎 病 植 株 根 际 土 壤 中, 均 含 有 2 号 和 3 号 菌 株 即 FJAT-14461 和 FJAT-14462, 且 含 量 最 多, 这 两 种 菌 在 土 壤 中 的 作 用 需 要 用 分 子 鉴 定 后, 以 确 定 其 分 类 地 位, 再 做 深 入 的 研 究 ; 在 健 康 的 植 株 根 际 土 壤 中 存 在 9 号 菌 株 即 FJAT-14475, 而 其 他 发 病 植 株 中 没 有 这 种 菌, 这 种 菌 可 能 对 抑 制 植 株 发 病 起 一 定 作 用 ; 发 病 植 株 根 际 土 壤 中 都 存 在 7 号 菌 株 即 FJAT-14472, 这 或 许 是 致 病 菌, 是 造 成 植 株 患 病 的 原 因 之 一

113 (3) 由 图 17 知,2 号 和 3 号 菌 株 即 FJAT-14461 和 FJAT-14462 在 土 壤 中 的 含 量 最 多, 其 次 是 只 在 发 病 植 株 根 际 土 壤 中 存 在 的 7 号 菌 株 即 FJAT-14472, 含 量 最 少 的 是 只 在 健 康 植 株 根 际 土 壤 中 存 在 的 9 号 菌 株 即 FJAT-14475 (4) 因 为 芽 孢 杆 菌 耐 高 温, 用 80 的 水 浴 中 加 热 10min 杀 死 其 他 细 菌, 稀 释 涂 布, 理 论 上 分 离 到 的 应 该 都 是 芽 孢 杆 菌, 但 是 仍 需 要 用 16S 引 物 鉴 定 5.. 参 考 文 献 [1] 王 祖 农. 土 壤 和 土 攘 微 生 物 [J]. 山 东 大 学 生 物 系. [2] 高 乔 婉. 香 蕉 枯 萎 病 [A]. 中 国 农 业 百 科 全 书. 植 物 病 理 学 卷 [C]. 北 京 : 中 国 农 业 出 版 社,1996. 482,483. [3] 林 时 迟, 张 绍 升, 周 乐 峰. 福 建 省 香 蕉 枯 萎 病 鉴 定 [J]. 福 建 农 业 大 学 学 报,2000,29(4):465~469. 试 验 负 责 肖 荣 凤 试 验 人 员 詹 洪

114 2011-08-20 承 担 单 位 : 福 建 省 农 科 院 农 业 生 物 资 源 研 究 所 试 验 设 计 : 蓝 江 林 试 验 项 目 : 福 建 省 不 同 地 区 发 酵 床 垫 料 的 含 水 量 比 较 试 验 人 员 : 宋 泽 琼 试 验 负 责 : 蓝 江 林 报 告 日 期 :2011-08-20 计 数 月 份 :2011 年 8 月 研 究 资 格 系 数 (0.5-1.0) 实 验 设 计 系 数 (0.9-1.0 0.9-1.0) 报 告 得 分 总 分 实 验 设 计 实 验 记 载 实 验 分 析 实 验 简 报 实 验 文 章 1-20% 21-40% 41-60% 61-80% 81-100% 1%-5% 设 计 不 足, 实 施 错 误 6%-10% 设 计 不 全, 实 验 无 果 11%-15% 设 计 可 以, 实 施 不 全 16%-20% 设 计 完 整, 分 布 实 施 21%-25% 实 验 不 全, 记 载 无 果 26%-30% 实 验 不 足, 记 载 不 全 31%-35% 独 立 实 验, 记 载 不 全 36%-40% 分 布 实 验, 记 载 完 整 41%-45% 目 的 明 确, 实 验 完 成 46%-50% 实 验 完 整, 记 载 清 晰 51%-55% 实 验 系 统, 结 果 可 信 56%-60% 实 验 创 新, 分 析 清 晰 61%-65% 实 验 创 新, 结 论 清 晰 66%-70% 实 验 完 整, 统 计 清 晰 71%-75% 实 验 系 统, 数 据 可 靠 76%-80% 报 告 完 整, 文 章 雏 形 81%-85% 结 构 合 理, 分 析 有 据 86%-90% 逻 辑 清 晰, 统 计 合 理 91%-95% 图 表 完 整, 写 作 流 畅 96%-100% 文 献 完 整, 发 表 水 平 福 建 省 农 业 科 学 院 农 业 生 物 资 源 研 究 所 农 业 微 生 物 研 究 中 心 电 话 : 0591-87882571, 传 真 : 0591-87882571 fjat.yzxz.com

115 1. 试 验 目 的 零 污 染 养 猪 技 术 就 是 从 样 品 中 分 离 筛 选 出 一 种 功 能 微 生 物 菌 种, 然 后 通 过 特 定 的 营 养 剂 的 培 养 形 成 的 土 著 微 生 物 原 种, 将 原 种 按 一 定 比 例 掺 拌 锯 末 谷 壳 泥 土, 然 后 控 制 一 定 的 条 件 让 其 发 酵 成 优 势 群 落, 最 后 制 成 猪 舍 的 垫 料 把 垫 料 在 猪 舍 铺 设 成 一 定 厚 度 的 垫 料 层 利 用 生 猪 拱 翻 的 生 活 习 性, 使 垫 料 和 猪 粪 尿 充 分 混 合, 通 过 样 品 微 生 物 菌 落 的 分 解 发 酵, 使 猪 粪 尿 中 的 有 机 物 质 得 到 充 分 的 分 解 和 转 化 [1] 并 且 同 时 对 猪 配 合 以 专 一 性 的 益 生 菌, 最 终 达 到 降 解 消 化 猪 粪 便, 除 去 异 味 和 无 害 化 的 目 的, 是 一 种 无 污 染 零 排 放 的 新 型 环 保 养 猪 技 术 垫 料 的 主 要 作 用 是 保 温 隔 热 吸 收 粪 尿 和 水 分, 从 而 维 持 动 物 的 舒 适 性 和 栏 内 的 清 洁 度, 使 动 物 生 活 在 舒 适 的 环 境 中, 它 直 接 与 动 物 体 接 触, 也 影 响 着 猪 舍 内 的 微 环 境, 对 实 验 动 物 的 健 康 和 实 验 结 果 有 极 大 的 影 响 [2] 垫 料 的 含 水 量 测 定 参 照 土 壤 含 水 量 的 测 定 方 法, 土 壤 含 水 量 (water content of soil) 是 土 壤 中 所 含 水 分 的 数 量 一 般 是 指 土 壤 绝 对 含 水 量, 即 100g 烘 干 土 中 含 有 若 干 克 水 分, 也 称 土 壤 含 水 率 本 文 通 过 采 集 不 同 地 区 不 同 使 用 时 间 的 发 酵 床 垫 料, 测 定 垫 料 的 含 水 量, 并 研 究 它 们 与 垫 料 腐 熟 程 度 的 相 关 性, 以 期 建 立 养 猪 微 生 物 发 酵 床 垫 料 腐 熟 程 度 的 判 别 指 标, 从 而 进 一 步 研 究 旧 垫 料 的 资 源 化 利 用, 利 用 旧 垫 料 生 产 有 机 肥 料 和 生 物 肥 药 等 2. 试 验 方 法 2.1 供 试 养 猪 发 酵 床 垫 料 发 酵 床 垫 料 于 2011 年 3 月 和 2011 年 7 月 期 间 在 福 建 省 内 采 集 的, 具 体 垫 料 来 源 见 表 1 表 1 发 酵 床 垫 料 样 品 信 息 表 样 品 数 量 使 用 时 间 采 集 时 间 福 安 03 溪 柄 垫 料 10 1 年 2011.3.4 宁 德 扶 摇 垫 料 9 4 个 月 2011.3.22 福 安 07 溪 柄 垫 料 6 1 年 半 2011.7.8 福 州 新 店 垫 料 11 1 年 半 2011.7.19 2.2 垫 料 含 水 量 测 定 方 法 2.2.1 测 定 原 理 垫 料 样 品 在 105±2 烘 至 恒 重 时 的 失 重, 即 为 样 品 所 含 水 分 的 质 量 2.2.2 仪 器 设 备 2.2.3 测 定 步 骤 1) 铝 制 称 样 皿 : 直 径 约 40mm, 高 约 20mm; 2) 分 析 天 平 : 感 量 为 0.01g; 3) 小 型 电 热 恒 温 烘 箱 ; 4) 干 燥 器 : 内 盛 变 色 硅 胶 或 无 水 氯 化 钙 用 洁 净 的 铝 制 称 样 皿 于 105 ±2 的 恒 温 干 燥 箱 中 烘 烤 1 h, 取 出 后 置 于 干 燥 器 中 30min, 准 确 称 重, 再 烘 烤 30min, 冷 却 称 重, 至 两 次 称 重 之 差 小 于 0.0005g 为 恒 重 ; 将 已 恒 重 的 称 样 皿 在 分 析 天 平 上 回 零 后, 准 确 的 称 取 垫 料 样 品 ( 平 行 样 )l0g 于 已 恒 重 的 铝 制 称 样 皿 中 ; 称 样 皿 的 盖 打 开, 放 入 105 ±2 的 恒 温 烘 箱 中, 烘 烤 3 h; 取 出 称 样 皿 后, 将 称 样 皿 置 于 干 燥 器 中 30min, 准 确 称 重 ; 再 用 相 同 的 方 法 烘 烤 1 h, 冷 却 称 重, 至 两 次 称 重 之 差 小 于 0.002g 为 恒 重 2.2.4 测 定 结 果 的 计 算

116 (1) 计 算 公 式 水 分 ( 分 析 基 ),%= (m1-m2)/(m1-m0) 100 (1) 水 分 ( 干 基 ),%= (m1-m2)/(m2-m0) 100 (2) 式 中 :m0 烘 干 空 铝 制 称 样 皿 质 量,g; m1 烘 干 前 铝 制 称 样 皿 及 土 样 质 量,g; m2 烘 干 后 铝 制 称 样 皿 及 土 样 质 量,g (2) 平 行 测 定 的 结 果 用 算 术 平 均 值 表 示, 保 留 小 数 后 一 位 3. 试 验 结 果 3.1 福 安 溪 柄 3 月 份 养 猪 场 垫 料 含 水 量 测 定 福 安 溪 柄 3 月 份 养 猪 场 垫 料 共 采 集 10 栏, 各 栏 垫 料 的 含 水 量 的 试 验 结 果 见 表 2,10 份 垫 料 的 分 析 基 水 分 含 量 在 37.7%-56.1%, 平 均 为 48.98%, 水 分 ( 干 基 ) 含 量 在 6.05%-12.78%, 平 均 为 9.79% 表 2 福 安 溪 柄 3 月 份 养 猪 场 垫 料 的 含 水 量 样 品 名 称 m0(g) m1(g) m2(g) 含 水 量 ( 分 析 基 )/% 含 水 量 ( 干 基 )/% 山 上 1 栏 16.51 26.51 21.26 52.50 11.05 山 上 2 栏 16.51 26.51 21.27 52.40 11.01 山 上 3 栏 16.34 26.34 21.24 51.00 10.41 山 上 4 栏 16.26 26.26 20.65 56.10 12.78 山 上 5 栏 16.1 26.1 21.3 48.00 9.23 山 下 左 1 栏 16.35 26.35 21.22 51.30 10.53 山 下 左 2 栏 16.3 26.3 21.36 49.40 9.76 山 下 左 3 栏 17.26 27.26 23.49 37.70 6.05 山 下 右 1 栏 16.57 26.57 21.57 50.00 10.00 山 下 右 2 栏 16.72 26.72 22.58 41.40 7.06 3.2 宁 德 扶 摇 零 排 放 养 猪 场 垫 料 含 水 量 测 定 宁 德 扶 摇 零 排 放 养 猪 场 垫 料 共 采 集 9 栏, 各 栏 垫 料 的 含 水 量 的 试 验 结 果 见 表 3,9 份 垫 料 的 分 析 基 水 分 含 量 在 43.3%-66.9%, 平 均 为 54.68%, 水 分 ( 干 基 ) 含 量 在 7.64%-20.21%, 平 均 为 12.84% 表 3 宁 德 扶 摇 零 排 放 养 猪 场 垫 料 的 含 水 量 样 品 名 称 m0(g) m1(g) m2(g) 含 水 量 ( 分 析 基 )/% 含 水 量 ( 干 基 )/% 1 栏 16.92 26.92 22.24 46.80 8.80 2 栏 16.45 26.45 20.37 60.80 15.51 3 栏 16.94 26.94 22.1 48.40 9.38 4 栏 16.86 26.86 20.17 66.90 20.21 5 栏 16.24 26.24 21.91 43.30 7.64 6 栏 17.16 27.16 20.55 66.10 19.50 7 栏 16.38 26.38 21.37 50.10 10.04 8 栏 16.56 26.56 21.35 52.10 10.88 9 栏 16.01 26.01 20.25 57.60 13.58

117 3.3 福 安 溪 柄 7 月 份 养 猪 场 垫 料 含 水 量 测 定 福 安 溪 柄 7 月 份 养 猪 场 垫 料 共 采 集 6 栏, 各 栏 垫 料 的 含 水 量 的 试 验 结 果 见 表 4,6 份 垫 料 的 分 析 基 水 分 含 量 在 43.2%-49.6%, 平 均 为 46.83%, 水 分 ( 干 基 ) 含 量 在 7.61%-9.84%, 平 均 为 8.84% 表 4 福 安 溪 柄 7 月 份 养 猪 场 垫 料 的 含 水 量 样 品 名 称 m0(g) m1(g) m2(g) 含 水 量 ( 分 析 基 )/% 含 水 量 ( 干 基 )/% 山 下 左 1 栏 17.23 27.23 22.91 43.20 7.61 山 下 左 2 栏 16.98 26.98 22.13 48.50 9.42 山 下 左 3 栏 16.24 26.24 21.53 47.10 8.90 山 下 右 1 栏 16.15 26.15 21.45 47.00 8.87 山 下 右 2 栏 16.36 26.36 21.4 49.60 9.84 山 下 右 3 栏 16.65 26.65 22.09 45.60 8.38 3.4 福 州 新 店 零 排 放 养 猪 场 垫 料 含 水 量 测 定 福 州 新 店 零 排 放 养 猪 场 垫 料 共 采 集 11 栏, 各 栏 垫 料 的 含 水 量 的 试 验 结 果 见 表 5,11 份 垫 料 的 分 析 基 水 分 含 量 在 29.97%-66.8%, 平 均 为 51.14%, 水 分 ( 干 基 ) 含 量 在 4.28%-20.12%, 平 均 为 11.36% 表 5 福 州 新 店 零 排 放 养 猪 场 垫 料 的 含 水 量 样 品 名 称 m0(g) m1(g) m2(g) 含 水 量 ( 分 析 基 )/% 含 水 量 ( 干 基 )/% 1 栏 17.1 27.1 21.42 56.80 13.15 2 栏 16.77 26.77 20.92 58.53 14.12 4 栏 17.28 27.28 21.77 55.07 12.26 8 栏 16.51 26.51 20.43 60.82 15.52 9 栏 17.17 27.17 21.43 57.43 13.49 10 栏 16.06 26.06 19.38 66.80 20.12 12 栏 17.02 27.02 24.02 29.97 4.28 13 栏 16.11 26.11 21.81 42.97 7.53 14 栏 16.79 26.79 22.20 45.90 8.48 15 栏 16.44 26.44 21.55 48.82 9.54 16 栏 16.07 26.07 22.13 39.43 6.51 4. 试 验 讨 论 福 建 省 三 个 地 区 零 排 放 养 猪 场 垫 料 的 分 析 基 水 分 含 量 在 29.97%-66.8% 之 间, 水 分 ( 干 基 ) 含 量 在 4.28%-20.21% 其 中 宁 德 扶 摇 零 排 放 养 猪 场 垫 料 的 平 均 水 分 含 量 最 高, 对 照 福 安 3 月 份 7 月 份 采 集 的 垫 料 和 新 店 垫 料 的 含 水 量 较 低, 这 主 要 是 垫 料 使 用 时 间 和 垫 料 原 料 配 方 不 同 的 影 响 其 中 宁 德 扶 摇 零 排 放 养 猪 场 垫 料 相 对 使 用 时 间 最 短

118 5.. 参 考 文 献 [1]. 刘 波, 朱 昌 雄. 微 生 物 发 酵 床 零 污 染 养 猪 技 术 研 究 与 应 用 [M]. 北 京 : 中 国 农 业 科 学 技 术 出 版 社,2009, 5. [2]. 刘 恩 岐. 实 验 动 物 垫 料 质 量 的 评 估 [J]. 中 国 比 较 医 学 杂 志,2004,14(3):179-184. 试 验 负 责 蓝 江 林 试 验 人 员 宋 泽 琼

119 2011-08-20 承 担 单 位 : 福 建 省 农 科 院 农 业 生 物 资 源 研 究 所 试 验 设 计 : 蓝 江 林 试 验 项 目 : 高 温 条 件 下 发 酵 床 的 微 生 物 生 物 量 的 测 定 ( 四 ) 试 验 人 员 : 宋 泽 琼 试 验 负 责 : 蓝 江 林 报 告 日 期 :2011-08-01 计 数 月 份 :2011 年 08 月 研 究 资 格 系 数 (0.5-1.0) 实 验 设 计 系 数 (0.9-1.0 0.9-1.0) 报 告 得 分 总 分 实 验 设 计 实 验 记 载 实 验 分 析 实 验 简 报 实 验 文 章 1-20% 21-40% 41-60% 61-80% 81-100% 1%-5% 设 计 不 足, 实 施 错 误 6%-10% 设 计 不 全, 实 验 无 果 11%-15% 设 计 可 以, 实 施 不 全 16%-20% 设 计 完 整, 分 布 实 施 21%-25% 实 验 不 全, 记 载 无 果 26%-30% 实 验 不 足, 记 载 不 全 31%-35% 独 立 实 验, 记 载 不 全 36%-40% 分 布 实 验, 记 载 完 整 41%-45% 目 的 明 确, 实 验 完 成 46%-50% 实 验 完 整, 记 载 清 晰 51%-55% 实 验 系 统, 结 果 可 信 56%-60% 实 验 创 新, 分 析 清 晰 61%-65% 实 验 创 新, 结 论 清 晰 66%-70% 实 验 完 整, 统 计 清 晰 71%-75% 实 验 系 统, 数 据 可 靠 76%-80% 报 告 完 整, 文 章 雏 形 81%-85% 结 构 合 理, 分 析 有 据 86%-90% 逻 辑 清 晰, 统 计 合 理 91%-95% 图 表 完 整, 写 作 流 畅 96%-100% 文 献 完 整, 发 表 水 平 福 建 省 农 业 科 学 院 农 业 生 物 资 源 研 究 所 农 业 微 生 物 研 究 中 心 电 话 : 0591-87882571, 传 真 : 0591-87882571 fjat.yzxz.com

120 1. 试 验 目 的 零 污 染 养 猪 技 术 就 是 从 样 品 中 分 离 筛 选 出 一 种 功 能 微 生 物 菌 种, 然 后 通 过 特 定 的 营 养 剂 的 培 养 形 成 白 的 土 著 微 生 物 原 种, 将 原 种 按 一 定 比 例 掺 拌 锯 末 谷 壳 泥 土, 然 后 控 制 一 定 的 条 件 让 其 发 酵 成 优 势 群 落, 最 后 制 成 猪 舍 的 垫 料 把 垫 料 在 猪 舍 铺 设 成 一 定 厚 度 的 垫 料 层 利 用 生 猪 拱 翻 的 生 活 习 性, 使 垫 料 和 猪 粪 尿 充 分 混 合, 通 过 样 品 微 生 物 菌 落 的 分 解 发 酵, 使 猪 粪 尿 中 的 有 机 物 质 得 到 [1] 充 分 的 分 解 和 转 化 并 且 同 时 对 猪 配 合 以 专 一 性 的 益 生 菌, 最 终 达 到 降 解 消 化 猪 粪 便, 除 去 异 味 和 无 害 化 的 目 的, 是 一 种 无 污 染 零 排 放 的 新 型 环 保 养 猪 技 术 土 壤 微 生 物 生 物 量 对 土 壤 肥 力 的 影 响 已 被 认 识 多 年, 土 壤 微 生 物 生 物 量 虽 然 只 占 土 壤 总 有 机 碳 的 1%-3%, 但 这 一 部 分 的 有 机 碳 却 影 响 着 所 有 进 入 土 壤 的 有 机 质 的 转 化, 成 为 土 壤 组 成 中 的 精 华 部 分, 是 整 个 森 林 生 态 系 统 中 养 分 和 能 源 循 环 的 动 力 [2] 同 理, 猪 舍 的 垫 料 成 分 中 也 含 有 一 定 量 的 土 壤, 也 可 以 用 类 似 土 壤 微 生 物 生 物 量 的 测 定 来 测 定 猪 垫 料 的 微 生 物 生 物 量 测 定 微 生 物 生 物 量 的 方 法 当 首 推 氯 仿 熏 蒸 一 培 养 法 该 法 是 根 据 被 杀 死 的 微 生 物 细 胞 因 矿 化 作 用 而 释 放 的 CO2 量 的 激 增 来 估 计 微 生 物 生 物 量 的 2. 试 验 方 法 2.1 供 试 材 料 2011 年 7 月 19 日 从 中 国 福 建 省 福 州 市 驻 新 店 73121 部 队 生 猪 养 殖 场 采 集 的 新 鲜 猪 垫 料 样 品 采 集 方 法 : 根 据 实 际 情 况 间 隔 猪 栏 采 集, 共 11 栏 11 个 样 本, 在 采 集 的 每 栏 猪 舍 中 纵 向 中 轴 线 上 平 均 分 三 个 部 位, 每 个 部 位 各 采 集 500g, 三 个 部 位 的 样 品 混 合 均 匀, 采 集 2kg 发 酵 床 垫 料 2.2 实 验 器 材 振 荡 器 11cm 的 滤 纸 0.45μm 的 滤 膜 针 筒 量 筒 紫 外 分 光 光 度 计 擦 镜 纸 比 色 皿 密 闭 箱 组 培 瓶 等 2.3 实 验 方 法 每 个 样 本 在 密 闭 箱 中 用 氯 仿 熏 蒸 24 h 后 取 出, 在 通 气 良 好 的 地 方 放 置 2~3 h, 使 残 留 垫 料 中 的 氯 仿 尽 可 能 挥 发 未 熏 蒸 的 样 品 置 于 冰 箱 中 4 保 存 至 分 析 称 取 新 鲜 垫 料 20 g, 转 入 组 培 瓶 中, 加 50 ml 0.5 mol/l K2 SO4, 振 荡 30 min 后 用 两 层 直 径 为 11cm 的 滤 纸 过 滤, 再 用 0.45μm 的 滤 膜 过 滤 一 遍, 然 后 立 即 在 280 nm 紫 外 光 下 测 定 吸 光 度 熏 蒸 和 未 熏 蒸 作 相 同 处 理 微 生 物 生 物 量 (SMB) 用 单 位 样 品 中 的 吸 光 度 增 量 α( 10-3 /g) 表 示,α=(abs 熏 /G 熏 ) 一 (abs 未 熏 /G 未 熏 ), 其 中 abs 代 表 UV280 的 吸 光 度,G 代 表 新 鲜 垫 料 的 质 量

121 3. 试 验 结 果 11 个 样 品 在 280 nm 紫 外 光 下 测 定 的 熏 蒸 和 未 熏 蒸 的 吸 光 度 及 微 生 物 生 物 量 见 表 1 表 1 各 样 品 的 吸 光 度 及 微 生 物 生 物 量 样 品 abs 熏 abs 未 熏 一 二 平 均 值 一 二 平 均 值 α( 10-3 /g) 1 栏 0.574 0.591 0.583 0.278 0.284 0.281 0.015 2 栏 0.602 0.682 0.642 0.29 0.287 0.289 0.018 4 栏 0.854 0.845 0.850 0.387 0.365 0.376 0.024 8 栏 0.969 0.967 0.968 0.518 0.524 0.521 0.022 9 栏 0.813 0.833 0.823 0.507 0.514 0.511 0.016 10 栏 0.395 0.403 0.399 0.378 0.376 0.377 0.001 12 栏 0.945 1.117 1.031 0.569 0.568 0.569 0.023 13 栏 0.473 0.581 0.527 0.306 0.312 0.309 0.011 14 栏 0.675 0.734 0.705 0.303 0.31 0.307 0.020 15 栏 0.570 0.574 0.572 0.418 0.421 0.420 0.008 16 栏 0.420 0.467 0.444 0.412 0.402 0.407 0.002 注 :SMB 用 单 位 样 品 中 的 吸 光 度 增 量 α( 10-3 /g) 表 示,α=(abs 熏 /G 熏 ) 一 (abs 未 熏 /G 未 熏 ), 其 中 abs 代 表 UV280 的 吸 光 度,G 代 表 新 鲜 垫 料 的 质 量 α( 10-3 /g) 0.030 0.025 0.020 0.015 0.010 0.005 0.000-0.005 1 2 4 8 9 10 12 13 14 15 16 栏 号 图 1 新 鲜 猪 垫 料 的 微 生 物 生 物 量 (SMB) 的 柱 状 图 从 图 1 可 以 看 出 如 下 结 果 : 单 位 样 品 中 的 吸 光 度 增 量 α( 10-3 /g) 若 为 负 值, 说 明 在 薰 蒸 后 垫 料 中 被 杀 死 的 微 生 物 分 解 所 产 生 的 CO2 量 要 小 于 非 薰 蒸 垫 料 中 死 亡 的 微 生 物 分 解 所 产 生 的 CO2, 即 这 些 样 品 中 的 微 生 物 生 物 量 小 单 位 样 品 中 的 吸 光 度 增 量 α( 10-3 /g) 若 为 正 值, 说 明 在 薰 蒸 后 垫 料 中 被 杀 死 的 微 生 物 分 解 所 产 生 的 CO2 量 要 大 于 非 薰 蒸 垫 料 中 死 亡 的 微 生 物 分 解 所 产 生 的 CO2 即 这 些 样 品 中 的 微 生 物 生 物 量 大 见 图 1 中 所 有 的 样 品 都 是 单 位 样 品 中 的 吸 光 度 增 量 α( 10-3 /g) 都 为 正 值, 其 中 4 栏 垫 料 样 品 的 吸 光 度 增 量 最 大,10 栏 垫 料 样 品 的 吸 光 度 增 量 最 小,

122 4. 试 验 结 论 (1) 综 上 可 知,11 个 样 品 的 微 生 物 生 物 量 的 含 量 都 较 高, 最 高 的 是 10 栏 的 垫 料 样 品, 最 低 的 是 4 栏 垫 料 样 品 (2) 氯 仿 薰 蒸 后 导 致 垫 料 中 一 些 有 机 体 更 易 分 解 ; 用 氯 仿 熏 蒸 后 单 位 样 品 中 的 吸 光 度 增 量 α( 10-3 /g) 值 有 的 为 正 值, 有 的 为 负 值, 有 的 不 变, 说 明 氯 仿 薰 蒸 对 杀 除 垫 料 中 的 微 生 物 具 有 选 择 性 ; (3) 氯 仿 熏 蒸 杀 菌 作 用 受 多 种 因 素, 尤 其 是 水 分 的 影 响 所 以 用 此 法 所 测 得 的 微 生 物 生 物 量 之 所 以 随 季 节 而 异, 实 际 上 是 由 于 在 不 同 季 节 里 物 质 含 水 量 不 同 所 致, 即 微 生 物 生 物 量 与 含 水 量 呈 负 相 关 这 是 因 为 潮 湿 环 境 下 微 生 物 不 容 易 被 熏 蒸 剂 所 杀 死, 即 使 已 被 杀 死 的, 其 矿 化 作 用 也 因 含 水 量 过 大 而 受 阻 碍, 测 得 的 微 生 物 生 物 量 将 必 然 偏 低 5. 参 考 文 献 [1] 刘 波, 朱 昌 雄. 微 生 物 发 酵 床 零 污 染 养 猪 技 术 研 究 与 应 用 [M]. 北 京 : 中 国 农 业 科 学 技 术 出 版 社, 2009, 5. [2] Laurie A T,Mary A A,Ruth D Y,Forest floor microbical biomass across a northern hardwood successional sequence. Soil Biol Biochem,1998,31:431-439. 试 验 设 计 : 蓝 江 林 试 验 负 责 : 蓝 江 林 试 验 人 员 : 宋 泽 琼

123 2010-08-20 承 担 单 位 : 福 建 省 农 科 院 农 业 生 物 资 源 研 究 所 试 验 设 计 : 蓝 江 林 试 验 项 目 : 不 同 产 量 和 施 肥 方 式 下 葡 萄 的 CAT 酶 活 性 比 较 试 验 人 员 : 宋 泽 琼 试 验 负 责 : 蓝 江 林 报 告 日 期 :2011-08-30 计 数 月 份 :2011 年 08 月 研 究 资 格 系 数 (0.5-1.0) 实 验 设 计 系 数 (0.9-1.0 0.9-1.0) 报 告 得 分 总 分 实 验 设 计 实 验 记 载 实 验 分 析 实 验 简 报 实 验 文 章 1-20% 21-40% 41-60% 61-80% 81-100% 1%-5% 设 计 不 足, 实 施 错 误 6%-10% 设 计 不 全, 实 验 无 果 11%-15% 设 计 可 以, 实 施 不 全 16%-20% 设 计 完 整, 分 布 实 施 21%-25% 实 验 不 全, 记 载 无 果 26%-30% 实 验 不 足, 记 载 不 全 31%-35% 独 立 实 验, 记 载 不 全 36%-40% 分 布 实 验, 记 载 完 整 41%-45% 目 的 明 确, 实 验 完 成 46%-50% 实 验 完 整, 记 载 清 晰 51%-55% 实 验 系 统, 结 果 可 信 56%-60% 实 验 创 新, 分 析 清 晰 61%-65% 实 验 创 新, 结 论 清 晰 66%-70% 实 验 完 整, 统 计 清 晰 71%-75% 实 验 系 统, 数 据 可 靠 76%-80% 报 告 完 整, 文 章 雏 形 81%-85% 结 构 合 理, 分 析 有 据 86%-90% 逻 辑 清 晰, 统 计 合 理 91%-95% 图 表 完 整, 写 作 流 畅 96%-100% 文 献 完 整, 发 表 水 平 福 建 省 农 业 科 学 院 农 业 生 物 资 源 研 究 所 农 业 微 生 物 研 究 中 心 电 话 : 0591-87882571, 传 真 : 0591-87882571 fjat.yzxz.com

124 1. 试 验 目 的 过 氧 化 氢 酶 (CAT) 是 一 种 酶 类 清 除 剂, 又 称 为 触 酶, 是 以 铁 卟 啉 为 辅 基 的 结 合 酶 它 可 促 使 H 2 O 2 分 解 为 分 子 氧 和 水, 清 除 体 内 的 过 氧 化 氢, 从 而 使 细 胞 免 于 遭 受 H 2 O 2 的 毒 害, 是 生 物 防 御 体 系 的 关 键 酶 之 一 H 2 O 2 在 240nm 波 长 下 有 强 烈 吸 收, 过 氧 化 氢 酶 能 分 解 过 氧 化 氢, 使 反 应 溶 液 吸 光 度 (A 240 ) 随 反 应 时 间 而 降 低 根 据 测 量 吸 光 率 的 变 化 速 度 即 可 测 出 过 氧 化 氢 酶 的 活 性 CAT 作 用 于 过 氧 化 氢 的 机 理 实 质 上 是 H 2 O 2 的 歧 化, 必 须 有 两 个 H 2 O 2 先 后 与 CAT 相 遇 且 碰 撞 在 活 性 中 心 上, 才 能 发 生 反 应 H 2 O 2 浓 度 越 高, 分 解 速 度 越 快 CAT 是 红 血 素 酶, 不 同 的 来 源 有 不 同 的 结 构 在 不 同 的 组 织 中 其 活 性 水 平 高 低 不 同 过 氧 化 氢 在 肝 脏 中 分 解 速 度 比 在 脑 或 心 脏 等 器 官 快, 就 是 因 为 肝 中 的 CAT 含 量 水 平 高 本 文 对 不 同 产 量 不 同 施 肥 方 式 下 葡 萄 的 叶 片 葡 萄 果 皮 和 果 肉 的 CAT 酶 活 性 进 行 分 析 比 较, 探 讨 葡 萄 产 量 和 播 种 方 式 与 葡 萄 过 氧 化 物 酶 活 性 的 关 系 2. 试 验 方 法 2.1 供 试 材 料 2011 年 7 月 底, 采 集 自 福 安 的 葡 萄 叶 片 和 葡 萄 果 实, 具 体 信 息 见 表 1 葡 萄 叶 片 从 编 号 1 号 到 编 号 16 号, 葡 萄 果 皮 编 号 从 果 皮 1 号 到 果 皮 8 号, 对 应 的 果 肉 编 号 从 果 肉 1 号 到 果 肉 8 号 表 1 葡 萄 叶 片 和 葡 萄 果 肉 果 皮 的 信 息 编 号 产 量 (kg/ 株 ) 施 肥 方 式 叶 片 形 态 1 号 5 沟 施 老 叶 2 号 5 撒 施 老 叶 3 号 5 沟 施 嫩 叶 4 号 5 撒 施 嫩 叶 5 号 3 沟 施 嫩 叶 6 号 对 照 CK 嫩 叶 7 号 3 沟 施 老 叶 8 号 对 照 CK 老 叶 9 号 丰 产 树 老 叶 10 号 4 撒 施 嫩 叶 11 号 4 撒 施 老 叶 12 号 3 撒 施 嫩 叶 13 号 丰 产 树 嫩 叶 14 号 3 撒 施 老 叶 15 号 4 沟 施 嫩 叶 16 号 4 沟 施 老 叶 果 皮 1 号 5 撒 施 果 皮 2 号 丰 产 树 果 皮 3 号 4 沟 施 果 皮 4 号 3 撒 施 果 皮 5 号 5 沟 施 果 皮 6 号 4 撒 施

125 果 皮 7 号 3 沟 施 果 皮 8 号 对 照 CK 果 肉 1 号 5 撒 施 果 肉 2 号 丰 产 树 果 肉 3 号 4 沟 施 果 肉 4 号 3 撒 施 果 肉 5 号 5 沟 施 果 肉 6 号 4 撒 施 果 肉 7 号 3 沟 施 果 肉 8 号 对 照 CK 2.2. 仪 器 和 试 剂 研 钵 25ml 容 量 瓶 试 管 离 心 机 岛 津 Shimadzu 紫 外 分 光 光 度 计 UV-2550 50ml 离 心 管 冰 块 天 平 恒 温 水 浴 0.2mol/L ph7.8 磷 酸 缓 冲 液 ( 内 含 1% 聚 乙 烯 吡 咯 烷 酮 ),0.1mol/L H 2 O 2 ( 用 0.1mol/L 高 锰 酸 钾 标 定 ) 2.3 葡 萄 粗 酶 液 提 取 称 取 新 鲜 小 麦 叶 片 或 其 它 植 物 组 织 5g 置 研 钵 中, 加 入 2~3ml 4 下 预 冷 的 ph7.0 磷 酸 缓 冲 液 和 少 量 石 英 砂 研 磨 成 匀 浆 后, 转 入 25ml 容 量 瓶 中, 并 用 缓 冲 液 冲 洗 研 钵 数 次, 合 并 冲 洗 液, 并 定 容 到 刻 度 混 合 均 匀 将 量 瓶 置 5 冰 箱 中 静 置 10min, 取 上 部 澄 清 液 在 4000rpm 下 离 心 15min, 上 清 液 即 为 过 氧 化 氢 酶 粗 提 液 5 下 保 存 备 用 2.4 过 氧 化 氢 酶 (CAT CAT) 的 酶 活 测 定 取 10ml 试 管 3 支, 其 中 1 支 为 对 照 管, 编 号 S0,2 支 为 样 品 测 定 管, 编 号 为 S1 S2, 按 表 2 顺 序 加 入 试 剂 25 预 热 后, 逐 管 加 入 0.5ml 0.1mol/L 的 H 2 O 2, 每 加 完 一 管 立 即 记 时, 并 迅 速 倒 入 石 英 比 色 杯 中,240nm 下 测 定 吸 光 度, 每 隔 1min 读 数 1 次, 共 测 4min, 待 3 支 管 全 部 测 定 完 后, 根 据 公 式 计 算 酶 活 性 表 2 紫 外 吸 收 法 测 定 H 2O 2 样 品 液 配 置 表 管 号 粗 酶 液 (ml) ph7.8 磷 酸 (ml) 蒸 馏 水 (ml) S0 0.02 1.5 1.0 S1 0.02 1.5 1.0 S2 0.02 1.5 1.0 2.5 过 氧 化 氢 酶 (CAT CAT) 的 酶 活 计 算 以 1min 内 A240 减 少 0.1 的 酶 量 为 1 个 酶 活 单 位 (u) A 240Vt 过 氧 化 氢 酶 活 性 ( U/min gfw) = 0.1 V FW t 式 中 A240 = AS0-(AS1+ AS2)/2;AS0 加 入 煮 死 酶 液 的 对 照 管 吸 光 值 ;AS1, AS2 样 品 管 吸 光 值 ;Vt 粗 酶 提 取 液 总 体 积 (ml);v1 测 定 用 粗 酶 液 体 积 (ml);fw 样 品 鲜 重 (g);0.1 1

126 A240 每 下 降 0.1 为 1 个 酶 活 单 位 (u);t 加 过 氧 化 氢 到 最 后 一 次 读 数 时 间 (min) 3. 试 验 结 果 3.1 葡 萄 叶 片 的 过 氧 化 氢 酶 (CAT CAT) 的 酶 活 测 定 不 同 产 量 施 肥 方 式 下 的 葡 萄 叶 片 的 CAT 酶 活 见 表 3 和 图 1 16 株 葡 萄 叶 片 的 酶 活 通 过 LSD 单 因 素 试 验 分 析 可 知 p=0.0002, 即 p<0.01, 说 明 这 16 株 葡 萄 叶 片 的 CAT 酶 活 之 间 差 异 极 显 著 酶 活 最 高 的 是 11 号 叶 片, 即 产 量 为 4kg/ 株, 施 肥 为 撒 施 的 老 叶, 达 198.750 U/min gfw, 最 低 的 是 5 号 叶 片, 即 产 量 为 3kg/ 株, 施 肥 为 沟 施 的 嫩 叶, 达 8.438U/min gfw 此 外 从 表 2 和 图 1 中 可 知, 相 同 产 量 和 相 同 施 肥 方 式 下, 老 叶 和 嫩 叶 的 CAT 酶 活 也 不 同, 大 部 分 是 嫩 叶 高 于 老 叶, 如 编 号 1 与 3, 2 与 4,9 与 13,12 与 14,16 与 15, 也 有 一 些 是 老 叶 高 于 嫩 叶, 如 编 号 5 与 7,6 与 8, 相 同 产 量 和 相 同 叶 片 形 态 下, 不 同 施 肥 方 式 的 葡 萄 叶 片 CAT 酶 活 也 不 同, 有 的 是 撒 施 的 施 肥 方 式 下 的 酶 活 高 于 沟 施, 如 编 号 1 与 2,5 与 12,11 与 16, 也 有 相 反 的, 即 沟 施 的 酶 活 高 于 撒 施, 如 编 号 3 与 4, 7 与 14,10 与 15 不 同 产 量 的 葡 萄 叶 片 的 酶 活 之 间 没 有 关 系, 即 施 肥 方 式 和 叶 片 形 态 相 同 下, 产 量 为 5 4 3kg/ 株 的 葡 萄 叶 片 的 酶 活 都 有 最 高 的 出 现 表 3 葡 萄 叶 片 的 CAT 酶 活 (AS1+ AS2) 编 号 AS0 AS1 AS2 /2 ΔA 240 CAT 酶 活 (U/min gfw) 1 号 0.745 0.716 0.714 0.715 0.030 18.750 2 号 0.541 0.503 0.506 0.505 0.037 22.813 3 号 1.452 1.252 1.089 1.171 0.282 175.938 4 号 0.958 0.785 0.918 0.852 0.107 66.563 5 号 1.147 1.133 1.134 1.134 0.014 8.438 6 号 0.945 0.860 0.923 0.892 0.054 33.438 7 号 1.062 0.845 0.993 0.919 0.143 89.375 8 号 0.758 0.667 0.724 0.696 0.063 39.063 9 号 0.460 0.403 0.446 0.425 0.036 22.188 10 号 1.425 1.168 1.098 1.133 0.292 182.500 11 号 1.389 1.038 1.104 1.071 0.318 198.750 12 号 1.487 1.373 1.329 1.351 0.136 85.000 13 号 0.871 0.823 0.786 0.805 0.067 41.563 14 号 0.583 0.509 0.467 0.488 0.095 59.375 15 号 1.057 0.929 0.952 0.941 0.117 72.813 16 号 0.585 0.562 0.548 0.555 0.030 18.750

127 葡 萄 叶 片 CAT 活 性 250.000 200.000 150.000 100.000 50.000 0.000 1 号 2 号 3 号 4 号 5 号 6 号 7 号 8 号 9 号 10 号 11 号 12 号 13 号 14 号 15 号 16 号 样 品 编 号 图 1 葡 萄 叶 片 CAT 酶 活 3.2 葡 萄 果 皮 的 过 氧 化 氢 酶 (CAT CAT) 的 酶 活 测 定 不 同 产 量 施 肥 方 式 下 的 葡 萄 果 皮 的 CAT 酶 活 见 表 4 和 图 2,8 株 果 皮 的 酶 活 通 过 LSD 单 因 素 试 验 分 析 可 知 p=0.0001, 即 p<0.01, 说 明 这 8 株 果 皮 的 CAT 酶 活 之 间 差 异 极 显 著,8 株 果 皮 的 酶 活 最 高 的 是 果 皮 4 号, 即 产 量 为 3kg/ 株, 施 肥 为 撒 施 的 葡 萄 果 皮, 为 32.1875U/min gfw, 最 低 的 是 果 皮 1 号, 为 5.9375 U/min gfw 表 4 葡 萄 果 皮 的 CAT 酶 活 (AS1+ AS2) 编 号 AS0 AS1 AS2 /2 ΔA240 CAT 酶 活 (U/min gfw) 果 皮 1 号 0.371 0.361 0.362 0.362 0.010 5.9375 果 皮 2 号 0.328 0.293 0.289 0.291 0.037 23.125 果 皮 3 号 0.378 0.357 0.354 0.356 0.023 14.0625 果 皮 4 号 0.418 0.360 0.373 0.367 0.052 32.1875 果 皮 5 号 0.635 0.602 0.605 0.604 0.032 19.6875 果 皮 6 号 0.627 0.610 0.615 0.613 0.015 9.0625 果 皮 7 号 0.563 0.516 0.513 0.515 0.049 30.3125 果 皮 8 号 0.617 0.591 0.596 0.594 0.024 14.6875 葡 萄 果 皮 CAT 酶 活 40 35 30 25 20 15 10 5 0 果 皮 1 号 果 皮 2 号 果 皮 3 号 果 皮 4 号 果 皮 5 号 果 皮 6 号 果 皮 7 号 果 皮 8 号 果 皮 编 号 图 2 葡 萄 果 皮 CAT 酶 活

128 3.3 葡 萄 果 肉 的 过 氧 化 氢 酶 (CAT CAT) 的 酶 活 测 定 不 同 产 量 施 肥 方 式 下 的 葡 萄 果 肉 的 CAT 酶 活 见 表 5 和 图 3,8 株 果 肉 的 酶 活 通 过 LSD 单 因 素 试 验 分 析 可 知 p=0.0001, 即 p<0.01, 说 明 这 8 株 果 肉 的 CAT 酶 活 之 间 差 异 极 显 著, 酶 活 最 高 的 是 果 肉 6 号, 即 产 量 为 4kg/ 株, 施 肥 为 撒 施 的 葡 萄 果 肉, 为 33.125 U/min gfw 表 5 葡 萄 果 肉 的 CAT 酶 活 (A S1+ A S2) 编 号 A S0 A S1 A S2 /2 ΔA240 CAT 酶 活 (U/min gfw) 果 肉 1 号 0.289 0.268 0.263 0.266 0.024 14.6875 果 肉 2 号 0.297 0.266 0.263 0.265 0.033 20.3125 果 肉 3 号 0.297 0.287 0.293 0.290 0.007 4.375 果 肉 4 号 0.323 0.297 0.299 0.298 0.025 15.625 果 肉 5 号 0.391 0.318 0.320 0.319 0.072 45 果 肉 6 号 0.397 0.341 0.347 0.344 0.053 33.125 果 肉 7 号 0.326 0.296 0.302 0.299 0.027 16.875 果 肉 8 号 0.321 0.305 0.310 0.308 0.014 8.4375 60 葡 萄 果 肉 CAT 酶 活 50 40 30 20 10 0 果 肉 1 号 果 肉 2 号 果 肉 3 号 果 肉 4 号 果 肉 5 号 果 肉 6 号 果 肉 7 号 果 肉 8 号 果 肉 编 号 图 3 葡 萄 果 肉 CAT 酶 活 3.4 葡 萄 果 肉 的 糖 度 测 定 对 8 株 葡 萄 果 肉 的 糖 度 测 定, 结 果 见 表 6,8 株 果 肉 的 糖 度 通 过 LSD 单 因 素 试 验 分 析 ( 表 7) 可 知 p=0.0001, 即 p<0.01, 说 明 这 8 株 果 肉 的 糖 度 之 间 差 异 极 显 著 表 6 葡 萄 果 肉 的 糖 度 编 号 重 复 一 重 复 二 重 复 三 平 均 值 果 肉 1 号 18.2 18 17.5 17.9 果 肉 2 号 17.3 17.3 18.4 17.7 果 肉 3 号 16.9 17.8 16.2 17.0 果 肉 4 号 15.2 15.9 17.1 16.1

129 果 肉 5 号 18.8 19.2 18.4 18.8 果 肉 6 号 15.6 17 15 15.9 果 肉 7 号 15 14.4 16 15.1 果 肉 8 号 15.2 14.3 14.6 14.7 表 7 葡 萄 果 肉 的 糖 度 的 LSD 单 因 素 方 差 分 析 变 异 来 源 平 方 和 自 由 度 均 方 F 值 p 值 处 理 间 43.1229 7 6.1604 11.8 0.0001 处 理 内 8.3533 16 0.5221 总 变 异 51.4762 23 8 株 葡 萄 果 肉 的 糖 度 间 差 异 见 表 8, 在 5%( 或 1%) 显 著 水 平 下, 有 相 同 字 母 出 现 的 表 示 无 显 著 性 ( 极 显 著 性 ) 差 异 表 4 葡 萄 果 肉 的 糖 度 的 LSD 法 多 重 比 较 处 理 5% 显 著 水 平 1% 显 著 水 平 果 肉 5 号 a A 果 肉 1 号 ab B 果 肉 2 号 ab B 果 肉 3 号 bc C 果 肉 4 号 cd CD 果 肉 6 号 cde CD 果 肉 7 号 de CD 果 肉 8 号 e CD 4. 试 验 结 论 几 乎 所 有 的 生 物 机 体 都 存 在 过 氧 化 氢 酶 其 普 遍 存 在 于 能 呼 吸 的 生 物 体 内, 主 要 存 在 于 植 物 的 叶 绿 体 线 粒 体 内 质 网 动 物 的 肝 和 红 细 胞 中, 其 酶 促 活 性 为 机 体 提 供 了 抗 氧 化 防 御 机 理 本 实 验 研 究 发 现 16 株 不 同 产 量 施 肥 方 式 下 的 葡 萄 叶 片 葡 萄 果 皮 果 肉 的 的 CAT 酶 活 差 异 性 极 显 著, 其 中 在 相 同 产 量 和 施 肥 方 式 下, 大 部 分 是 嫩 叶 的 POD 酶 活 高 于 老 叶, 不 同 产 量 的 葡 萄 叶 片 的 酶 活 之 间 没 有 关 系, 即 施 肥 方 式 和 叶 片 形 态 相 同 下, 产 量 为 5 4 3kg/ 株 的 葡 萄 叶 片 的 酶 活 都 有 最 高 的 出 现 测 定 8 株 果 肉 的 糖 度 发 现 他 们 之 间 差 异 极 显 著 5 参 考 文 献 试 验 设 计 : 蓝 江 林 试 验 负 责 : 蓝 江 林 试 验 人 员 : 宋 泽 琼

130 2011-08-20 承 担 单 位 : 福 建 省 农 科 院 农 业 生 物 资 源 研 究 所 试 验 设 计 : 蓝 江 林 试 验 项 目 : 宁 德 市 九 都 镇 示 范 点 水 质 中 的 细 菌 脂 肪 酸 鉴 定 ( 六 ) ( 编 号 12927-12932 13032) 试 验 人 员 : 宋 泽 琼 试 验 负 责 : 蓝 江 林 报 告 日 期 :2011-08-10 计 数 月 份 :2011 年 8 月 研 究 资 格 系 数 (0.5-1.0) 实 验 设 计 系 数 (0.9-1.0 0.9-1.0) 报 告 得 分 总 分 实 验 设 计 实 验 记 载 实 验 分 析 实 验 简 报 实 验 文 章 1-20% 21-40% 41-60% 61-80% 81-100% 1%-5% 设 计 不 足, 实 施 错 误 6%-10% 设 计 不 全, 实 验 无 果 11%-15% 设 计 可 以, 实 施 不 全 16%-20% 设 计 完 整, 分 布 实 施 21%-25% 实 验 不 全, 记 载 无 果 26%-30% 实 验 不 足, 记 载 不 全 31%-35% 独 立 实 验, 记 载 不 全 36%-40% 分 布 实 验, 记 载 完 整 41%-45% 目 的 明 确, 实 验 完 成 46%-50% 实 验 完 整, 记 载 清 晰 51%-55% 实 验 系 统, 结 果 可 信 56%-60% 实 验 创 新, 分 析 清 晰 61%-65% 实 验 创 新, 结 论 清 晰 66%-70% 实 验 完 整, 统 计 清 晰 71%-75% 实 验 系 统, 数 据 可 靠 76%-80% 报 告 完 整, 文 章 雏 形 81%-85% 结 构 合 理, 分 析 有 据 86%-90% 逻 辑 清 晰, 统 计 合 理 91%-95% 图 表 完 整, 写 作 流 畅 96%-100% 文 献 完 整, 发 表 水 平 福 建 省 农 业 科 学 院 农 业 生 物 资 源 研 究 所 农 业 微 生 物 研 究 中 心 电 话 : 0591-87882571, 传 真 : 0591-87882571 fjat.yzxz.com

131 1. 试 验 目 的 脂 肪 酸 是 微 生 物 细 胞 组 分 中 一 种 稳 定 而 富 有 的 重 要 成 分, 它 和 细 菌 的 遗 传 变 异 毒 力 耐 药 性 [1] 等 有 极 为 密 切 的 关 系, 它 的 种 类 和 含 量 是 微 生 物 鉴 定 和 分 类 法 的 重 要 依 据 之 一 气 相 色 谱 分 析 技 术 能 快 速 灵 敏 精 确 地 检 测 出 细 菌 细 胞 内 的 脂 肪 酸, 从 而 确 定 它 是 哪 种 微 生 物 所 以 本 实 验 采 用 气 相 色 谱 分 析 技 术 对 宁 德 市 九 都 镇 示 范 点 水 质 中 的 细 菌 进 行 鉴 定, 从 而 确 定 其 具 体 的 菌 株 2. 试 验 方 法 2.1 供 试 材 料 2010 年 12 月 1 日 于 宁 德 市 九 都 镇 水 质 示 范 点 采 集 的 水 样, 分 别 为 水 龙 头 设 备 进 水 口 ( 简 称 进 水 口 ) 设 备 出 水 口 ( 简 称 出 水 口 ) 的 水 样 2.2 检 测 仪 器 和 实 验 器 材 试 剂 一 :NaOH 45g+ 甲 醇 (HPLC grade)150 ml + 去 离 子 水 150 ml, 水 和 甲 醇 混 合 后 再 加 入 NaOH, 同 时 搅 拌 至 完 全 溶 解 试 剂 二 :6.00N 盐 酸 325 ml + 甲 醇 (HPLC grade)275 ml, 把 盐 酸 加 入 到 甲 醇 中, 并 不 断 搅 拌 试 剂 三 : 正 己 烷 200 ml +MTBE(HPLC grade)200 ml, 把 MTBE 加 入 到 正 己 烷 中, 并 不 断 搅 拌 试 剂 四 :NaOH 10.8g+ 去 离 子 蒸 馏 水 900 ml. 试 剂 五 : 饱 和 氯 化 钠 溶 液 ( 用 来 最 后 消 气 泡 ) 2.3 提 取 步 骤 2.3.1 菌 株 的 培 养 将 NA 平 板 上 的 菌 株 采 用 四 区 划 线 法 在 TSBA 平 板 上 划 线, 置 于 30 培 养 箱 中 培 养 24h. ( 可 通 过 四 区 不 同 密 度 的 菌 株 去 确 认 是 否 纯 化, 最 佳 获 菌 区 为 第 三 区, 此 区 必 须 有 菌 落 并 且 量 要 足 够 多 ) 2.3.2 宁 德 市 九 都 镇 示 范 点 水 质 中 的 细 菌 脂 肪 酸 的 提 取 : 2.3.2.1 获 菌 用 接 种 环 挑 取 3-5 环 湿 重 的 菌 落 置 于 清 洁 干 燥 的 耐 酸 耐 碱 管 底 部 2.3.2.2 皂 化 ( 强 烈 的 甲 醇 随 着 加 热 杀 菌 及 溶 解 细 菌 ) 在 装 有 菌 体 的 耐 酸 耐 碱 管 中 加 入 1.0±0.1ml 试 剂 1, 锁 紧 盖 子, 震 荡 试 管 5-10s,95-100 水 浴 5min, 从 沸 水 浴 中 移 出 耐 酸 耐 碱 管 并 轻 微 冷 却, 震 荡 5-10s, 再 水 浴 25min, 取 出 室 温 冷 却 2.3.2.3 甲 基 化 ( 甲 基 化 转 换 脂 肪 酸 成 甲 基 酯 脂 肪 酸 以 增 加 脂 肪 酸 的 挥 发 性 以 供 GC 分 析 ) 加 入 试 剂 2 2.0±0.1ml, 拧 紧 盖 子, 震 荡 5-10s,80 水 浴 10min, 移 开 且 快 速 用 流 动 的 自 来 水 冷 却 至 室 温 2.3.2.4 萃 取 ( 甲 基 酯 脂 肪 酸 从 酸 性 水 相 移 出 转 移 到 一 个 有 机 相 的 萃 取 过 程 ) 加 入 1.25±0.1ml 的 试 剂 3 萃 取 溶 剂, 拧 紧 盖 子, 温 和 混 合 旋 转 10min, 打 开 盖 子, 用 干 净 的 移 液 管 取 出 下 层 似 水 部 分, 弃 去 2.3.2.5 基 本 洗 涤 ( 从 有 机 相 中 移 去 自 由 的 脂 肪 ) 加 入 3.0±0.1ml 试 剂 4, 拧 紧 盖 子, 温 和 混 合 旋 转 5min, 打 开 盖 子, 利 用 干 净 的 移 液 管 移 取 2/3 体 积 的 上 层 有 机 相 到 干 净 的 GC 检 测 小 瓶 ( 此 过 程 要 小 心, 宁 可 少 取 有 机 相, 绝 不 可 吸 入 水 相, 否 则 会 损 坏 色 谱 仪 的 色 谱 柱 )

132 2.4 上 样 和 脂 肪 酸 的 检 测 PLFAs 的 检 测 采 用 美 国 MIDI 公 司 生 产 的 微 生 物 自 动 鉴 定 系 统 (Sherlock Microbial Identification System), 包 括 Agilent6890N 型 气 相 色 谱 仪, 全 自 动 进 样 装 置 石 英 毛 细 管 柱 及 氢 火 焰 离 子 化 检 测 器 ; 在 下 述 色 谱 条 件 下 平 行 分 析 脂 肪 酸 甲 酯 混 合 物 标 样 和 待 检 样 本 : 二 阶 程 序 升 高 柱 温,l70 起 始,5 /min 升 至 260, 而 后 40 /min 升 温 至 310, 维 持 90s; 汽 化 室 温 度 250 检 测 器 温 度 300 ; 载 气 为 H2(2ml/min) 尾 吹 气 为 N2(30ml/min); 柱 前 压 l0.00 psi(1psi=6.895kpa); 进 样 量 lμl, 进 样 分 流 比 100:1 2.5 数 据 库 比 对 MIDI 操 作 手 册 指 明, 当 鉴 定 结 果 第 一 选 择 的 相 似 指 数 (Similarity Index, SI) 在 0.500 以 上, 且 第 一 选 择 和 第 二 选 择 的 SI 差 值 大 于 0.100, 则 可 以 认 为 鉴 定 成 功, 鉴 定 结 果 为 第 一 选 择 所 列 的 菌 种 名 若 SI 值 在 0.300 到 0.500 之 间, 且 第 一 选 择 和 第 二 选 择 的 SI 差 值 大 于 0.100, 则 表 明 第 一 选 择 与 第 二 选 择 分 开, 鉴 定 可 能 成 功, 但 是 第 一 选 择 所 列 的 菌 种 为 非 典 型 的 菌 株 当 SI 值 小 于 0.300 时, 则 认 为 该 菌 株 不 存 在 于 数 据 库 中, 但 软 件 会 给 出 一 个 最 相 关 的 菌 株 3. 试 验 结 果 3.1 进 水 口 的 细 菌 脂 肪 酸 鉴 定 结 果 采 用 稀 释 涂 板 法 对 水 质 净 化 设 备 中 进 设 备 前 的 水 ( 即 进 水 口 ) 中 的 细 菌 进 行 了 分 离 纯 化, 共 得 到 3 株 细 菌, 其 菌 株 形 态 特 征 和 脂 肪 酸 鉴 定 结 果 见 表 1 表 1 进 水 口 的 细 菌 特 征 及 脂 肪 酸 鉴 定 结 果 细 菌 编 号 菌 落 特 征 Sim Index 菌 种 名 ( 拉 丁 文 ) FJAT-12930 FJAT-12931 FJAT-13032 大, 乳 黄 色, 圆 形, 湿 润, 扁 平, 半 透 明, 有 光 泽 小, 乳 白 色, 圆 形, 湿 润, 微 隆, 不 透 明, 有 光 泽 小, 乳 白 色, 圆 形, 偏 湿, 扁 平, 透 明, 有 光 泽 0.707 Acinetobacter-calcoaceticus 0.016 0.108 Stenotrophomonas-maltophilia (Xanthomonas, Pseudomonas) Moraxella-catarrhalis (Branhamella catarrhalis) 菌 种 名 ( 中 文 ) 醋 酸 钙 不 动 杆 菌 嗜 麦 寡 养 食 单 胞 菌 粘 膜 炎 莫 拉 菌 从 表 1 可 知, 两 株 细 菌 的 匹 配 度 均 大 于 0.5, 所 以 FJAT-11893 FJAT-11904 两 株 可 以 基 本 上 确 定 为 数 据 库 中 的 醋 酸 钙 不 动 杆 菌 嗜 麦 寡 养 食 单 胞 菌 和 粘 膜 炎 莫 拉 菌 表 1 中 各 菌 株 匹 配 的 菌 种 的 形 态 学 特 征 分 别 如 下 : 1) 醋 酸 钙 不 动 杆 菌 : 不 动 杆 菌 广 泛 分 布 于 外 界 环 境 中, 主 要 在 水 体 和 土 壤 中, 易 在 潮 湿 环 境 中 生 存, 如 浴 盆 肥 皂 盒 等 处 该 菌 粘 附 力 极 强, 易 在 各 类 医 用 材 料 上 粘 附, 而 可 能 成 为 贮 菌 源 此 外, 本 菌 还 存 在 于 健 康 人 皮 肤 ( 25%) 咽 部 (7%), 也 存 在 于 结 膜 唾 液 胃 肠 道 及 阴 道 分 泌 物 中 感 染 源 可 以 是 病 人 自 身 ( 内 源 性 感 染 ), 亦 可 以 是 不 动 杆 菌 感 染 者 或 带 菌 者, 尤 其 是 双 手 带 菌 的 医 务 人 员 传 播 途 径 有 接 触 传 播 和 空 气 传 播 在 医 院 里, 污 染 的 医 疗 器 械 及 工 作 人 员 的 手 是 重 要 的 传 播 媒 介 易 感 者 为 老 年 患 者 早 产 儿 和 新 生 儿, 手 术 创 伤

133 严 重 烧 伤 气 管 切 开 或 插 管 使 用 人 工 呼 吸 机 行 静 脉 导 管 和 腹 膜 透 析 者, 广 谱 抗 菌 药 物 或 免 疫 抑 制 剂 应 用 者 等 在 使 用 呼 吸 机 者 中, 肺 炎 发 生 率 约 为 3%~5% 2) 嗜 - 麦 芽 ( 黄 单 胞 菌 假 单 胞 菌 ): 又 名 嗜 - 麦 芽 窄 食 单 孢 菌 嗜 麦 芽 寡 养 单 胞 菌, 该 病 近 年 已 成 为 呼 吸 疾 病 的 较 常 见 菌 种, 仅 次 于 大 肠 埃 希 菌 铜 绿 假 单 胞 菌 克 雷 伯 菌 肺 炎 链 球 菌 金 黄 色 葡 萄 球 菌 流 感 嗜 血 杆 菌 等 在 医 院 环 境 如 制 冰 器 械 透 析 装 置 医 务 工 作 者 的 双 手 氧 气 湿 化 罐 淋 浴 蓬 头 藏 垢 水 洼 水 龙 头 血 压 计 中 心 动 / 静 脉 压 监 测 仪 消 毒 溶 液 雾 化 吸 入 及 人 工 呼 吸 装 置 通 气 管 道 等, 可 分 离 到 该 菌 该 菌 在 潮 湿 环 境 易 于 生 长 繁 殖, 而 在 干 燥 物 品 上 则 不 易 生 长 嗜 麦 芽 窄 食 单 胞 菌 是 院 内 具 有 易 感 因 素 患 者 严 重 感 染 的 重 要 致 病 菌 之 一, 因 其 外 膜 渗 透 屏 障 外 排 系 统 各 种 酶 类 及 迅 速 突 变 的 靶 位 等 原 因 对 多 种 广 谱 抗 菌 药 物 包 括 泰 能 等 碳 青 霉 烯 类 先 天 耐 药 目 前 嗜 麦 芽 窄 食 单 胞 菌 的 临 床 分 离 率 有 逐 年 上 升 趋 势, 耐 药 性 日 益 严 重, 抗 菌 药 物 选 择 有 一 定 困 难, 因 而 引 起 临 床 医 师 的 高 度 关 注 3) 粘 膜 炎 莫 拉 菌 : 为 革 兰 阴 性 双 球 菌, 发 现 于 1896 年, 当 时 称 卡 他 微 球 菌, 因 形 态 学 类 似 奈 瑟 球 菌 属, 后 改 称 卡 他 奈 瑟 球 菌. 但 因 该 菌 与 奈 瑟 球 菌 的 DNA 碱 基 组 成 含 量 及 脂 肪 酸 组 成 的 差 异,Catlin 提 出 将 此 菌 归 属 于 布 兰 汉 菌 属, 称 为 卡 他 布 兰 汉 菌, 后 将 布 兰 汉 菌 属 改 成 莫 拉 菌 属 的 亚 属, 而 改 现 名. 近 年 来 的 研 究 表 明 MC 可 引 起 临 床 多 种 感 染, 儿 童 及 免 疫 缺 陷 者 更 具 感 染 性 3.2 出 水 口 的 细 菌 脂 肪 酸 鉴 定 结 果 采 用 稀 释 涂 板 法 对 水 质 净 化 设 备 中 出 设 备 后 的 水 ( 即 出 水 口 ) 中 的 细 菌 进 行 了 分 离 纯 化, 共 鉴 定 2 株 细 菌, 其 菌 株 形 态 特 征 和 脂 肪 酸 鉴 定 结 果 见 表 2 表 2 出 水 口 的 细 菌 特 征 及 脂 肪 酸 鉴 定 结 果 细 菌 编 号 菌 落 特 征 Sim Index 菌 种 名 ( 拉 丁 文 ) FJAT-12928 FJAT-12932 中, 乳 白 色, 圆 形, 光 滑, 扁 平, 湿 润, 有 光 泽 中, 金 黄 色, 圆 形, 光 滑, 平 整, 湿 润, 有 光 泽, 不 透 明 0.955 Stenotrophomonas-maltophilia (Xanthomonas, Pseudomonas) 0.847 Kocuria-kristinae 菌 种 名 ( 中 文 ) 嗜 麦 寡 养 食 单 胞 菌 克 氏 库 克 菌 从 表 2 可 知, 两 株 细 菌 的 匹 配 度 均 大 于 0.5, 所 以 FJAT-12928 FJAT-12932 两 株 可 以 基 本 上 确 定 为 数 据 库 中 的 嗜 麦 寡 养 食 单 胞 菌 和 克 氏 库 克 菌 表 2 中 不 同 于 进 水 口 的 菌 株 的 形 态 学 特 征 分 别 如 下 : 1) 克 氏 库 克 菌 : 原 名 克 氏 微 球 菌. 考 克 菌 属 是 革 兰 阳 性 球 菌, 广 泛 存 在 于 土 壤 水 及 人 类 皮 肤 或 呼 吸 道, 一 般 不 致 病, 但 当 机 体 抵 抗 力 下 降 时 可 以 引 起 人 类 感 染 甚 至 出 现 败 血 症 3.3 水 龙 头 的 细 菌 脂 肪 酸 鉴 定 结 果 采 用 稀 释 涂 板 法 对 自 来 水 即 水 龙 头 的 细 菌 进 行 了 分 离 纯 化, 共 得 到 4 株 细 菌, 其 菌 株 形 态 特 征 和 脂 肪 酸 鉴 定 结 果 见 表 3

134 表 3 水 龙 头 的 细 菌 特 征 及 脂 肪 酸 鉴 定 结 果 细 菌 编 号 菌 落 特 征 Sim Index 菌 种 名 ( 拉 丁 文 ) FJAT-12927 FJAT-12928 FJAT-12929 FJAT-12931 大, 乳 黄 色, 圆 形, 平 整, 光 滑, 湿 润, 透 明, 有 光 泽 偏 小, 圆 形, 不 规 则, 乳 白 色, 透 明, 湿 润, 有 光 泽 小, 粉 红 色, 圆 形, 光 滑, 扁 平, 湿 润, 有 光 泽, 中, 乳 白 色, 圆 形, 光 滑, 湿 润, 透 明, 有 光 泽 0.276 Acinetobacter-haemolyticus 0.955 Stenotrophomonas-maltophilia (Xanthomonas, Pseudomonas) 0.026 Corynebacterium-diphtheriae-intermedius 0.016 Stenotrophomonas-maltophilia (Xanthomonas, Pseudomonas) 菌 种 名 ( 中 文 ) 溶 血 不 动 杆 菌 嗜 麦 寡 养 食 单 胞 菌 中 间 型 白 喉 棒 状 杆 菌 嗜 麦 寡 养 食 单 胞 菌 从 表 3 可 知, 仅 细 菌 FJAT-12928 的 匹 配 度 均 大 于 0.5, 所 以 FJAT-12928 可 以 基 本 上 确 定 为 数 据 库 中 的 嗜 麦 寡 养 食 单 胞 菌 表 3 中 不 同 于 进 水 口 的 菌 株 的 形 态 学 特 征 分 别 如 下 : 1) 溶 血 不 动 杆 菌 :G-, 也 有 G+ 细 胞, 较 粗 的 短 杆, 也 有 球 状,0.5~0.8 0.5~1.2; 氧 化 酶 阴 性, 触 酶 明 胶 水 解 溶 血 性 皆 为 阳 性 ; 葡 萄 糖 产 酸 微 弱 ; 可 利 用 中 长 链 烃 乙 醇 苹 果 酸 等, 不 利 用 甲 酸 盐 乳 酸 盐 和 丙 酸 盐 等 可 产 大 量 乳 化 剂, 用 于 采 油 和 含 油 污 水 治 理 2) 中 间 型 白 喉 棒 状 杆 菌 : 棒 状 杆 菌 属 ( diphtheriae), 本 属 细 菌 菌 体 一 端 或 两 端 膨 大 呈 棒 状, 革 兰 染 色 阳 性, 有 异 染 颗 粒, 排 列 不 规 则, 常 呈 栅 栏 状 本 属 细 菌 种 类 多, 主 要 有 白 喉 棒 状 杆 菌 和 类 白 喉 棒 状 杆 菌 引 起 人 类 疾 病 的 主 要 是 白 喉 棒 状 杆 菌, 俗 称 白 喉 杆 菌, 为 白 喉 的 病 原 菌, 白 喉 是 一 种 急 性 呼 吸 道 传 染 病, 其 特 征 是 咽 喉 等 处 形 成 灰 白 色 假 膜 本 菌 不 侵 入 血 流, 其 外 毒 素 进 入 血 液 后 可 引 起 全 身 中 毒 症 状 菌 体 细 长 微 弯, 一 端 或 两 端 膨 大 成 棒 状, 排 列 不 规 则, 常 呈 L V Y 形 或 呈 栅 栏 状 革 兰 染 色 阳 性, 用 美 蓝 或 Neisser 染 色 可 见 异 染 颗 粒 ( 见 彩 图 ), 是 本 菌 的 形 态 特 征 之 一 需 氧 或 兼 性 厌 氧, 在 普 通 培 养 基 上 虽 可 生 长, 但 形 态 不 典 型, 在 凝 固 血 清 培 养 基 上 生 长 迅 速, 形 成 灰 白 色, 圆 形 的 菌 落, 异 染 颗 粒 明 显, 形 态 典 型 在 含 有 0.03%~0.04% 亚 碲 酸 钾 血 清 琼 脂 平 板 上 生 长 时, 菌 体 能 吸 收 碲 盐, 将 其 还 原 为 金 属 碲, 使 菌 落 呈 灰 黑 色 或 黑 色

135 4. 试 验 结 论 1) 从 宁 德 九 都 水 质 示 范 点 的 设 备 进 水 口 设 备 出 水 口 水 龙 头 处 共 分 离 到 的 细 菌 种 类 有 6 种, 分 别 为 : 醋 酸 钙 不 动 杆 菌 嗜 - 麦 芽 ( 黄 单 胞 菌 假 单 胞 菌 ) 粘 膜 炎 莫 拉 菌 克 氏 库 氏 菌 中 间 型 白 喉 棒 状 杆 菌 溶 血 不 动 杆 菌 2) 从 宁 德 九 都 水 质 示 范 点 的 设 备 进 水 口 分 离 到 3 株 细 菌, 分 别 为 : 醋 酸 钙 不 动 杆 菌 嗜 - 麦 芽 ( 黄 单 胞 菌 假 单 胞 菌 ) 粘 膜 炎 莫 拉 菌. 3) 从 宁 德 九 都 水 质 示 范 点 的 设 备 出 水 口 分 离 到 2 株 细 菌, 分 别 为 : 嗜 - 麦 芽 ( 黄 单 胞 菌, 假 单 胞 菌 ) 克 氏 库 氏 菌 4) 从 宁 德 九 都 水 质 示 范 点 的 水 龙 头 分 离 到 4 株 细 菌, 分 别 为 : 中 间 型 白 喉 棒 状 杆 菌 溶 血 不 动 杆 菌 嗜 - 麦 芽 ( 黄 单 胞 菌 假 单 胞 菌 ) 中 间 型 白 喉 棒 状 杆 菌 5) 从 宁 德 九 都 水 质 示 范 点 的 设 备 进 水 口 设 备 出 水 口 水 龙 头 处 分 离 到 的 细 菌 脂 肪 酸 结 果 见 附 件 1. 5 参 考 文 献 [1] 张 国 赏, 吴 文 鹃, 潘 仁 瑞. 气 相 色 谱 一 质 谱 法 检 测 细 胞 脂 肪 酸 及 其 在 细 菌 鉴 定 上 的 应 用 [J]. 合 肥 联 合 大 学 学 报.2000,10(4):92-96. 试 验 设 计 : 蓝 江 林 试 验 负 责 : 蓝 江 林 试 验 人 员 : 宋 泽 琼

136 2011-08-20 承 担 单 位 : 福 建 省 农 科 院 农 业 生 物 资 源 研 究 所 试 验 设 计 : 试 验 项 目 : 发 酵 床 养 猪 垫 料 的 酸 碱 度 与 电 导 率 的 测 定 试 验 人 员 : 宋 泽 琼 试 验 负 责 : 蓝 江 林 报 告 日 期 :2011-08-10 计 数 月 份 :2011 年 8 月 研 究 资 格 系 数 (0.5-1.0) 实 验 设 计 系 数 (0.9-1.0 0.9-1.0) 报 告 得 分 总 分 实 验 设 计 实 验 记 载 实 验 分 析 实 验 简 报 实 验 文 章 1-20% 21-40% 41-60% 61-80% 81-100% 1%-5% 设 计 不 足, 实 施 错 误 6%-10% 设 计 不 全, 实 验 无 果 11%-15% 设 计 可 以, 实 施 不 全 16%-20% 设 计 完 整, 分 布 实 施 21%-25% 实 验 不 全, 记 载 无 果 26%-30% 实 验 不 足, 记 载 不 全 31%-35% 独 立 实 验, 记 载 不 全 36%-40% 分 布 实 验, 记 载 完 整 41%-45% 目 的 明 确, 实 验 完 成 46%-50% 实 验 完 整, 记 载 清 晰 51%-55% 实 验 系 统, 结 果 可 信 56%-60% 实 验 创 新, 分 析 清 晰 61%-65% 实 验 创 新, 结 论 清 晰 66%-70% 实 验 完 整, 统 计 清 晰 71%-75% 实 验 系 统, 数 据 可 靠 76%-80% 报 告 完 整, 文 章 雏 形 81%-85% 结 构 合 理, 分 析 有 据 86%-90% 逻 辑 清 晰, 统 计 合 理 91%-95% 图 表 完 整, 写 作 流 畅 96%-100% 文 献 完 整, 发 表 水 平 福 建 省 农 业 科 学 院 农 业 生 物 资 源 研 究 所 农 业 微 生 物 研 究 中 心 电 话 : 0591-87882571, 传 真 : 0591-87882571 fjat.yzxz.com

137 1. 试 验 目 的 微 生 物 发 酵 床 养 猪 是 从 样 品 中 分 离 筛 选 出 一 种 功 能 微 生 物 菌 种, 然 后 通 过 特 定 的 营 养 剂 的 培 养 形 成 的 土 著 微 生 物 原 种, 将 原 种 按 一 定 比 例 掺 拌 锯 末 谷 壳 泥 土, 然 后 控 制 一 定 的 条 件 让 其 发 酵 成 优 势 群 落, 最 后 制 成 猪 舍 的 垫 料 把 垫 料 在 猪 舍 铺 设 成 一 定 厚 度 的 垫 料 层 利 用 生 猪 拱 翻 的 生 活 习 性, 使 垫 料 和 猪 粪 尿 充 分 混 合, 通 过 样 品 微 生 物 菌 落 的 分 解 发 酵, 使 猪 粪 尿 中 的 有 机 物 质 得 到 充 分 的 分 解 和 转 化 [1] 并 且 同 时 对 猪 配 合 以 专 一 性 的 益 生 菌, 最 终 达 到 降 解 消 化 猪 粪 便, 除 去 异 味 和 无 害 化 的 目 的, 是 在 有 益 微 生 物 菌 种 作 用 下 的 一 种 无 污 染 零 排 放 良 性 循 环 的 新 型 环 保 养 猪 技 术 [2-7] 目 前, 许 多 大 规 模 正 规 的 养 猪 基 地 均 采 用 微 生 物 发 酵 床 技 术 该 技 术 与 传 统 养 猪 模 式 相 比, 有 诸 多 的 优 点 [8-13], 如 解 决 了 粪 污 处 理 问 题, 改 善 了 猪 的 生 长 环 境, 提 高 饲 料 的 利 用 率, 增 强 了 机 体 的 免 疫 力 和 抗 病 力, 节 约 资 源, 提 高 了 养 殖 效 益 等 垫 料 的 主 要 作 用 是 保 温 隔 热 吸 收 粪 尿 和 水 分, 从 而 维 持 动 物 的 舒 适 性 和 栏 内 的 清 洁 度, 使 动 物 生 活 在 舒 适 的 环 境 中, 它 直 接 与 动 物 体 接 触, 也 影 响 着 猪 舍 内 的 微 环 境, 对 实 验 动 物 的 健 康 和 实 验 结 果 有 极 大 的 影 响 [14] ph 值 是 影 响 微 生 物 生 长 的 重 要 条 件 之 一, 有 机 物 料 堆 积 发 酵 过 程 中, 堆 内 酸 碱 度 是 变 化 的, 微 生 物 的 降 解 活 动, 需 要 一 个 微 酸 性 或 中 性 的 环 境 条 件,pH 值 过 高 或 过 低 都 不 利 于 微 生 物 的 繁 殖 和 有 机 物 的 降 解 土 壤 营 养 液 和 灌 溉 水 的 盐 度 对 于 园 艺 作 物 和 植 物 生 长 很 重 要, 溶 液 的 电 导 率 受 温 度 影 响, 它 反 映 了 浸 提 液 中 的 离 子 总 浓 度, 即 可 溶 性 盐 的 含 量 ; 土 壤 的 盐 度 则 依 赖 于 土 壤 结 构 和 正 确 的 含 水 量, 且 溶 液 的 电 导 率 和 盐 度 之 间 有 着 密 切 的 相 关 性 本 实 验 中 养 猪 微 生 物 发 酵 床 垫 料 的 盐 度 ph 值 电 导 率 的 测 定 参 照 土 壤 的 测 定 方 法, 以 期 了 解 不 同 发 酵 时 间 垫 料 的 物 理 性 状, 为 今 后 快 速 测 定 垫 料 的 理 化 性 质 提 供 可 靠 方 法 和 理 论 依 据, 2. 试 验 方 法 2.1 供 试 材 料 样 品 垫 料 采 集 自 宁 德 扶 摇 村 零 排 放 示 范 点 宁 德 福 安 市 溪 柄 养 猪 场 中 国 人 民 解 放 军 73121 部 队 驻 福 州 新 店 养 猪 场, 具 体 信 息 见 表 1 表 1 垫 料 的 具 体 信 息 样 品 样 品 数 量 使 用 时 间 采 集 时 间 宁 德 扶 摇 村 零 排 放 示 范 点 垫 料 宁 德 福 安 市 溪 柄 养 猪 场 垫 料 中 国 人 民 解 放 军 73121 部 队 驻 福 州 新 店 养 猪 场 垫 料 9 4 个 月 2011.3.22 12 2 年 2011.6.2 11 1 年 半 2011.7.8 设 备 及 试 剂 :HI 993310 便 捷 式 水 质 电 导 率 土 壤 盐 度 测 定 仪 Starter 3C ph 计 振 荡 器 2mm 筛 300 目 过 滤 筛 去 离 子 水 去 CO2 蒸 馏 水 100ml 三 角 瓶 25ml 量 筒 10ml 离 心 管 2.2 试 验 方 法 2.2.1 养 猪 微 生 物 发 酵 床 垫 料 的 盐 度 测 定 用 HI 993310 便 捷 式 水 质 电 导 率 土 壤 盐 度 测 定 仪 的 HI76305( 不 锈 钢 探 头 ) 测 定 盐 度, 将 探 头 尖 完 全 和 垫 料 接 触, 如 果 干 燥, 则 加 入 去 离 子 水, 等 到 显 示 的 数 值 稳 定 后 再 读 数 2.2.2 养 猪 微 生 物 发 酵 床 垫 料 的 电 导 率 测 定

138 称 取 过 2mm 筛 的 风 干 垫 料 10g, 放 在 100ml 三 角 瓶 中, 采 用 土 水 比 1..2, 加 无 CO2 蒸 馏 水 20ml, 盖 好 瓶 塞, 在 振 荡 器 上 振 荡 30min, 放 置 30min, 通 过 300 目 过 滤 筛 过 滤 垫 料 溶 液, 滤 液 倒 入 10ml 离 心 管, 测 量 电 导 率 值 2.2.3 养 猪 微 生 物 发 酵 床 垫 料 的 酸 碱 度 测 定 采 用 电 位 法 测 定 养 猪 微 生 物 发 酵 床 垫 料 的 酸 碱 度 : 称 取 过 2mm 筛 的 风 干 垫 料 10g, 放 在 100ml 三 角 瓶 中, 采 用 土 水 比 1..10, 加 无 CO2 蒸 馏 水 50ml, 盖 好 瓶 塞, 在 振 荡 器 上 振 荡 30min, 放 置 30min, 通 过 300 目 过 滤 筛 过 滤 垫 料 溶 液, 滤 液 倒 入 10ml 离 心 管, 用 酸 度 计 测 定 2.2.4 数 据 处 理 利 用 Excel DPS 数 据 统 计 分 析 软 件 进 行 数 据 处 理 3. 试 验 结 果 3.1 养 猪 微 生 物 发 酵 床 垫 料 的 盐 度 养 猪 微 生 物 发 酵 床 垫 料 的 盐 度 见 表 2 和 图 1, 宁 德 扶 摇 村 零 排 放 示 范 点 垫 料 的 盐 度 介 于 0.26-0.91g/l 之 间, 平 均 为 0.59g/l; 宁 德 福 安 市 溪 柄 养 猪 场 垫 料 的 盐 度 介 于 0.35-0.89g/l 之 间, 平 均 为 0.56g/l; 中 国 人 民 解 放 军 73121 部 队 驻 福 州 新 店 养 猪 场 的 垫 料 的 盐 度 介 于 0. 42 0.93 g/l 之 间, 平 均 为 0.71 g/l 表 2 养 猪 微 生 物 发 酵 床 垫 料 的 盐 度 和 电 导 率 样 品 盐 度 (g/l) 电 导 率 (ms/cm) ph 值 扶 摇 1 栏 0.44 3.56 6.73 扶 摇 2 栏 0.76 5 6.14 扶 摇 3 栏 0.91 6.06 5.13 扶 摇 4 栏 0.55 3.66 7.5 扶 摇 5 栏 0.54 4.94 5.39 扶 摇 6 栏 0.4 3.37 8.02 扶 摇 7 栏 0.65 5.82 5.4 扶 摇 8 栏 0.77 4.48 7.26 扶 摇 9 栏 0.26 2.62 7.15 福 安 山 上 1 栏 0.37 9.25 6.27 福 安 山 上 2 栏 0.72 10.63 7.08 福 安 山 上 3 栏 0.77 10.37 7.57 福 安 山 上 4 栏 0.67 10.32 7.74 福 安 山 上 5 栏 0.49 10.52 7.88 福 安 山 上 6 栏 0.52 10.41 7.62 福 安 山 下 左 1 栏 0.35 9.47 5.76 福 安 山 下 左 2 栏 0.57 8.39 7.22 福 安 山 下 左 3 栏 0.56 9.52 6.22 福 安 山 下 右 1 栏 0.89 8.25 5.46 福 安 山 下 右 2 栏 0.36 6.05 7.96 福 安 山 下 右 3 栏 0.48 6.74 7.9 新 店 1 栏 0.88 5.55 8.79 新 店 2 栏 0.71 4.84 8.88 新 店 4 栏 0.63 5.59 8.77 新 店 8 栏 0.73 4.49 8.06

139 新 店 9 栏 0.78 5.06 8.54 新 店 10 栏 0.93 5.06 8.78 新 店 12 栏 0.60 6.62 8.25 新 店 13 栏 0.83 6.54 8.50 新 店 14 栏 0.61 5.70 8.19 新 店 15 栏 0.42 5.45 7.65 新 店 16 栏 0.68 7.19 7.53 盐 度 (g/l) 1.2 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0 扶 摇 1 栏 扶 摇 2 栏 扶 摇 3 栏 扶 摇 4 栏 扶 摇 5 栏 扶 摇 6 栏 扶 摇 7 栏 扶 摇 8 栏 扶 摇 9 栏 样 品 编 号 图 1 宁 德 扶 摇 村 零 排 放 示 范 点 垫 料 的 盐 度 盐 度 (g/l) 1.2 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0 山 上 1 栏 山 上 2 栏 山 上 3 栏 山 上 4 栏 山 上 5 栏 山 上 6 栏 山 下 左 1 栏 样 品 编 号 山 下 左 2 栏 山 下 左 3 栏 山 下 右 1 栏 山 下 右 2 栏 山 下 右 3 栏 图 2 宁 德 福 安 市 溪 柄 养 猪 场 垫 料 的 盐 度 盐 度 (g/l) 1.20 1.00 0.80 0.60 0.40 0.20 0.00 新 店 1 栏 新 店 2 栏 新 店 4 栏 新 店 8 栏 新 店 9 栏 新 店 10 栏 新 店 12 栏 新 店 13 栏 新 店 14 栏 新 店 15 栏 新 店 16 栏 样 品 编 号 图 3 中 国 人 民 解 放 军 73121 部 队 驻 福 州 新 店 养 猪 场 垫 料 的 盐 度

140 3.2 养 猪 微 生 物 发 酵 床 垫 料 的 电 导 率 养 猪 微 生 物 发 酵 床 垫 料 的 电 导 率 见 表 1 和 图 4- 图 6, 宁 德 扶 摇 村 零 排 放 示 范 点 垫 料 的 电 导 率 介 于 2.62-6.06 ms/cm 之 间, 平 均 为 4.39 ms/cm; 宁 德 福 安 市 溪 柄 养 猪 场 垫 料 的 电 导 率 介 于 6.05-10.63 ms/cm 之 间, 平 均 为 9.16 ms/cm; 中 国 人 民 解 放 军 73121 部 队 驻 福 州 新 店 养 猪 场 的 垫 料 的 电 导 率 介 于 4.49 7.19 ms/cm 之 间, 平 均 为 5.64 ms/cm [15] 聂 永 丰 认 为, 当 堆 肥 电 导 率 (EC) 值 小 于 9.0 ms/cm, 对 种 子 发 芽 没 有 抑 制 作 用, 说 明 宁 德 扶 摇 村 零 排 放 示 范 点 垫 料 和 中 国 人 民 解 放 军 73121 部 队 驻 福 州 新 店 养 猪 场 的 垫 料 样 品 自 然 发 酵 后 若 作 为 堆 肥, 对 种 子 发 芽 没 有 抑 制 作 用 电 导 率 (ms/cm) 8 7 6 5 4 3 2 1 0 扶 摇 1 栏 扶 摇 2 栏 扶 摇 3 栏 扶 摇 4 栏 扶 摇 5 栏 扶 摇 6 栏 扶 摇 7 栏 扶 摇 8 栏 扶 摇 9 栏 样 品 编 号 图 4 宁 德 扶 摇 村 零 排 放 示 范 点 垫 料 的 电 导 率 电 导 率 (ms/cm) 14 12 10 8 6 4 2 0 山 上 1 栏 山 上 2 栏 山 上 3 栏 山 上 4 栏 山 上 5 栏 山 上 6 栏 山 下 左 1 栏 样 品 编 号 山 下 左 2 栏 山 下 左 3 栏 山 下 右 1 栏 山 下 右 2 栏 山 下 右 3 栏 图 5 宁 德 福 安 市 溪 柄 养 猪 场 垫 料 的 电 导 率 电 导 率 (ms/cm) 9.00 8.00 7.00 6.00 5.00 4.00 3.00 2.00 1.00 0.00 新 店 1 栏 新 店 2 栏 新 店 4 栏 新 店 8 栏 新 店 9 栏 新 店 10 栏 新 店 12 栏 样 品 编 号 新 店 13 栏 新 店 14 栏 新 店 15 栏 新 店 16 栏 图 4 中 国 人 民 解 放 军 73121 部 队 驻 福 州 新 店 养 猪 场 垫 料 的 电 导 率

141 3.3 养 猪 微 生 物 垫 料 的 酸 碱 度 养 猪 微 生 物 发 酵 床 垫 料 的 酸 碱 度 见 表 1 和 图 7- 图 9, 宁 德 扶 摇 村 零 排 放 示 范 点 垫 料 的 ph 值 介 于 5.13 8.02 之 间, 平 均 为 6.52; 宁 德 福 安 市 溪 柄 养 猪 场 垫 料 的 电 导 率 介 于 5.46 7.96 之 间, 平 均 为 7.06; 中 国 人 民 解 放 军 73121 部 队 驻 福 州 新 店 养 猪 场 的 垫 料 的 电 导 率 介 于 7.53 8.88 之 间, 平 均 为 8.36 10 8 6 ph 值 4 2 0 扶 摇 1 栏 扶 摇 2 栏 扶 摇 3 栏 扶 摇 4 栏 扶 摇 5 栏 扶 摇 6 栏 扶 摇 7 栏 扶 摇 8 栏 扶 摇 9 栏 样 品 编 号 图 7 宁 德 扶 摇 村 零 排 放 示 范 点 垫 料 的 ph 值 10 8 6 ph 值 4 2 0 山 上 1 栏 山 上 2 栏 山 上 3 栏 山 上 4 栏 山 上 5 栏 山 上 6 栏 山 下 左 1 栏 样 品 编 号 山 下 左 2 栏 山 下 左 3 栏 山 下 右 1 栏 山 下 右 2 栏 山 下 右 3 栏 图 8 宁 德 福 安 市 溪 柄 养 猪 场 垫 料 的 ph 值 10.00 8.00 6.00 ph 值 4.00 2.00 0.00 新 店 1 栏 新 店 2 栏 新 店 4 栏 新 店 8 栏 新 店 9 栏 新 店 10 栏 新 店 12 栏 样 品 编 号 新 店 13 栏 新 店 14 栏 新 店 15 栏 新 店 16 栏 图 9 中 国 人 民 解 放 军 73121 部 队 驻 福 州 新 店 养 猪 场 垫 料 的 ph 值

142 3.4 不 同 使 用 时 间 垫 料 的 酸 碱 度 与 盐 度 电 导 率 的 关 系 比 较 宁 德 扶 摇 村 福 安 溪 柄 猪 场 福 州 新 店 猪 场 垫 料 的 酸 碱 度 与 盐 度 电 导 率 的 平 均 值, 见 图 10, 不 同 使 用 时 间 垫 料 的 盐 度 p=0.1209, 即 p>0.05, 说 明 这 三 个 地 方 垫 料 的 盐 度 间 无 显 著 性 差 异 ; 三 个 地 方 垫 料 的 电 导 率 p=0.0001, 即 p<0.01, 说 明 这 三 个 地 方 垫 料 的 电 导 率 间 有 显 著 性 差 异 ; 三 个 地 方 垫 料 的 ph 值 显 著 性 差 异 比 较 可 知, 新 店 猪 场 垫 料 的 ph 值 与 扶 摇 和 福 安 的 有 显 著 性 差 异 使 用 时 间 越 长, 电 导 率 也 越 大, 即 福 安 市 > 新 店 镇 > 扶 摇 村 的 12.00 10.00 盐 度 电 导 率 ph 值 8.00 6.00 4.00 2.00 0.00 扶 摇 村 (4 个 月 ) 福 安 市 (2 年 ) 新 店 镇 (1.5 年 ) 图 10 不 同 使 用 时 间 垫 料 的 酸 碱 度 与 盐 度 电 导 率 的 关 系 4. 试 验 讨 论 盐 度 即 植 物 吸 收 溶 解 在 灌 溉 水 中 的 营 养 元 素, 土 壤 中 离 子 浓 度 的 大 小 与 土 壤 的 类 型 有 关, 根 据 土 壤 的 化 学 组 成 和 其 持 水 量, 土 壤 可 能 富 含 营 养 成 分 或 贫 瘠 宁 德 扶 摇 村 零 排 放 示 范 点 垫 料 的 盐 度 平 均 为 0.59g/l; 宁 德 福 安 市 溪 柄 养 猪 场 垫 料 的 盐 度 平 均 为 0.56g/l; 中 国 人 民 解 放 军 73121 部 队 驻 福 州 新 店 养 猪 场 的 垫 料 的 盐 度 平 均 为 0.71 g/l 与 适 宜 种 植 的 土 壤 盐 度 值 范 围 比 较, 这 些 样 品 的 盐 度 较 小, 可 以 作 为 植 物 和 果 树 的 肥 料 电 导 率 是 灌 溉 水 和 营 养 液 最 重 要 的 参 数, 灌 溉 需 要 定 期 检 查, 特 别 是 无 土 栽 培, 如 果 电 导 率 值 很 高, 对 植 物 的 影 响 会 非 常 严 重 ; 营 养 液 的 持 效 性 对 植 物 的 生 长 和 产 量 非 常 重 要, 根 据 不 同 的 植 物 状 态, 施 用 正 确 的 营 养 液, 可 以 得 到 较 好 的 效 果, 因 此 需 要 定 期 检 测 电 导 率 值, 确 保 和 植 物 状 态 相 适 合, 且 植 物 有 季 节 性, 如 在 夏 季 需 要 较 低 电 导 率 的 溶 液 宁 德 扶 摇 村 零 排 放 示 范 点 垫 料 的 电 导 率 平 均 为 4.39 ms/cm; 宁 德 福 安 市 溪 柄 养 猪 场 垫 料 的 电 导 率 平 均 为 9.16 ms/cm; 中 国 人 民 解 放 军 73121 部 队 驻 福 州 新 店 养 猪 场 的 垫 料 的 电 导 率 平 均 为 5.64 ms/cm 宁 德 扶 摇 村 零 排 放 示 范 点 垫 料 的 ph 值 平 均 为 6.52; 宁 德 福 安 市 溪 柄 养 猪 场 垫 料 的 电 导 率 平 均 为 7.06; 中 国 人 民 解 放 军 73121 部 队 驻 福 州 新 店 养 猪 场 的 垫 料 的 电 导 率 平 均 为 8.36 这 三 个 地 方 垫 料 的 盐 度 间 无 显 著 性 差 异, 电 导 率 间 有 显 著 性 差 异 ; 三 个 地 方 垫 料 的 ph 值 显 著 性 差 异 比 较 可 知, 新 店 猪 场 垫 料 的 ph 值 与 扶 摇 和 福 安 的 有 显 著 性 差 异 使 用 时 间 越 长, 电 导 率 也 越 大, 即 福 安 市 > 新 店 镇 > 扶 摇 村 的 5. 参 考 文 献 [3]. 刘 波, 朱 昌 雄. 微 生 物 发 酵 床 零 污 染 养 猪 技 术 研 究 与 应 用 [M]. 北 京 : 中 国 农 业 科 学 技 术 出 版

143 社,2009, 5. [4]. 张 庆 宁, 胡 明, 朱 荣 生. 生 态 养 猪 模 式 中 发 酵 床 优 势 细 菌 的 微 生 物 学 性 质 及 其 应 用 研 究 [J]. 山 东 农 业 科 学,2009,4:99-105. [5]. 刘 波, 朱 昌 雄. 微 生 物 发 酵 床 零 污 染 养 猪 技 术 研 究 与 应 用 [M]. 北 京 : 中 国 农 业 科 学 技 术 出 版 社,2009, 5. [6]. S.M.Tiquia,N.F.Y.Tam,I.J.Hodgkiss.Effects of turning frequency on composting of spent pig-manure sawdust litter[j]. Bioresource Technology, 1997 (62):37-42. [7]. Tam,N. F. Y.&Vrijmoed,L.L.P. Effects of Commercial Bacterial Product on Microbial Decomposition of Pig Manure Under Pig-on-litter System[J]. Research Report of the City Polytechnic of Hong Kong, 1993,BCH-93-01. [8]. Tiquia,S.M. Further Composting of Pig-manure Disposed from the Pig-on-litter (POL) System in Hong Kong[J]. Ph.D. thesis. The University of Hong Kong. Pokfulam Road, Hong Kong.1996. [9]. 李 兆 华, 张 志 彬, 王 巍 等. 解 析 发 酵 床 养 猪 技 术 [J]. 吉 林 畜 牧 兽 医,2010,31(1):5-7. [10]. TapkI,Sahin A. Comparison of the thermoregulatory behaviours of low and high producing day cows in a hot environment[j].applied Animal Behaviour Scienc-e,2006,99(8):l-11. [11]. Hemsworth,P.H,Barnett,J.L.The importance of animal comfort for animal prod-uction in intensive grassland systems.in:proceedings of the 19th International Grassland Congress[J].Sao Paulo, Brazil,pp. 2001:425 433. [12]. Rebecca S.Morrison,Lee J.The behaviour, welfare, growth performance and meat quality of pigs housed in a deep-litter, large group housing system compar-ed to a conventional confinement system[j].2007:12-24. [13]. 樊 志 刚, 李 胜 刚 等. 生 物 发 酵 舍 养 猪 技 术 原 理 及 优 点 [J]. 畜 禽 饲 养,2008, 11:18-19. [14]. 白 福 翥, 发 酵 床 养 猪 关 键 技 术 [J]. 现 代 农 业 科 技,2010(12):292-293. [15]. 陈 绿 素, 彭 乃 木, 郑 秀 兰. 生 物 发 酵 舍 零 排 放 环 保 养 殖 技 术 的 基 本 原 理 及 关 键 技 术 [J]. 畜 禽 业 生 产 指 导,2010,7(255):32-33. [16]. 刘 恩 岐. 实 验 动 物 垫 料 质 量 的 评 估 [J]. 中 国 比 较 医 学 杂 志,2004,14(3):179-184. [17] 聂 永 丰. 三 废 处 理 工 程 技 术 手 册. 北 京 : 化 学 工 业 出 版 社.2000. 试 验 设 计 : 蓝 江 林 试 验 负 责 : 蓝 江 林 试 验 人 员 : 宋 泽 琼

144 编 号 : 农 业 微 生 物 研 究 中 心, 共 6 页 承 担 单 位 : 福 建 省 农 科 院 农 业 生 物 资 源 研 究 所 试 验 设 计 : 试 验 项 目 : 灰 黄 霉 素 缩 甘 氨 酸 的 合 成 ( 二 ) 试 验 人 员 : 于 晓 杰 李 智 聪 朱 育 菁 试 验 负 责 : 朱 育 菁 李 智 聪 于 晓 杰 报 告 日 期 :2011-09-21 计 数 月 份 :2011 年 08 月 研 究 资 格 系 数 (0.5-1.0) 实 验 设 计 系 数 (0.9-1.0 0.9-1.0) 报 告 得 分 总 分 实 验 设 计 实 验 记 载 实 验 分 析 实 验 简 报 实 验 文 章 1-20% 21-40% 41-60% 61-80% 81-100% 1%-5% 设 计 不 足, 实 施 错 误 6%-10% 设 计 不 全, 实 验 无 果 11%-15% 设 计 可 以, 实 施 不 全 16%-20% 设 计 完 整, 分 布 实 施 21%-25% 实 验 不 全, 记 载 无 果 26%-30% 实 验 不 足, 记 载 不 全 31%-35% 独 立 实 验, 记 载 不 全 36%-40% 分 布 实 验, 记 载 完 整 41%-45% 目 的 明 确, 实 验 完 成 46%-50% 实 验 完 整, 记 载 清 晰 51%-55% 实 验 系 统, 结 果 可 信 56%-60% 实 验 创 新, 分 析 清 晰 61%-65% 实 验 创 新, 结 论 清 晰 66%-70% 实 验 完 整, 统 计 清 晰 71%-75% 实 验 系 统, 数 据 可 靠 76%-80% 报 告 完 整, 文 章 雏 形 81%-85% 结 构 合 理, 分 析 有 据 86%-90% 逻 辑 清 晰, 统 计 合 理 91%-95% 图 表 完 整, 写 作 流 畅 96%-100% 文 献 完 整, 发 表 水 平 福 建 省 农 业 科 学 院 农 业 生 物 资 源 研 究 所 农 业 微 生 物 研 究 中 心 电 话 : 0591-87882571, 传 真 : 0591-87882571 fjat.yzxz.com

145 1. 试 验 目 的 该 系 列 试 验, 就 是 根 据 灰 黄 霉 素 的 结 构 特 点, 对 其 进 行 位 点 改 造 或 者 基 团 添 加, 试 图 通 过 增 加 其 极 性 从 而 增 加 水 溶 性 另 外, 该 系 列 试 验 还 研 究 了 合 成 的 灰 黄 霉 素 衍 生 物 对 几 种 常 见 农 业 病 害 真 菌 的 抑 制 作 用 并 与 灰 黄 霉 素 进 行 了 对 比, 从 而 归 纳 总 结 出 灰 黄 霉 素 的 结 构 和 抗 真 菌 活 力 之 间 的 关 系 目 前 对 席 夫 碱 的 研 究 发 现, 很 多 席 夫 碱 都 有 很 好 的 抗 菌 活 性, 而 灰 黄 霉 素 的 4 位 置 有 一 个 C=O, 可 以 对 其 进 行 改 造, 生 成 C=N 席 夫 碱 本 次 实 验 是 利 用 甘 氨 酸 与 灰 黄 霉 素 进 行 反 应, 生 成 灰 黄 霉 素 缩 甘 氨 酸 甘 氨 酸 本 身 就 是 极 性 很 大 的 物 质, 水 溶 性 也 非 常 好 通 过 缩 合, 产 物 的 极 性 也 得 到 提 升, 因 此 水 溶 性 有 可 能 得 到 改 变 在 上 次 实 验 中, 我 们 已 经 通 过 对 反 应 后 物 质 进 行 质 谱 检 测 发 现 有 目 标 产 物 的 存 在 只 不 过 是 副 反 应 的 产 物 过 多, 而 且 与 目 标 产 物 极 性 相 近 且 都 很 大, 给 分 离 纯 化 带 来 很 大 的 困 难 另 外, 反 应 中 用 到 了 DMSO, 它 虽 然 溶 解 性 很 好, 但 是 沸 点 很 高 且 挥 发 性 极 差, 这 样 也 给 后 期 溶 剂 的 处 理 带 来 了 极 大 的 困 难 因 此, 本 次 试 验 在 总 结 上 次 试 验 的 基 础 上, 更 新 了 反 应 方 法, 试 图 能 使 反 应 向 有 利 于 目 标 产 物 生 成 的 方 向 进 行, 同 时 还 不 会 给 产 物 的 分 离 纯 化 造 成 过 多 的 困 难 灰 黄 霉 素 (6 - 甲 基 -2,4,6- 三 甲 氧 基 -7- 氯 螺 [ 苯 并 呋 喃 -2(3H),1 -[2] 环 己 烯 ]-3,4 - 二 酮 ) 是 由 Oxford 等 从 灰 黄 青 霉 ( Penicillium griseofulvin ) 培 养 液 中 得 到 的 一 种 含 氯 代 谢 产 物, 分 子 式 为 C17 H17 ClO6, 分 子 质 量 为 352. 77, 分 子 结 构 见 图 1, 为 白 色 或 类 白 色 结 晶 性 粉 末, 无 臭, 味 微 苦, 可 溶 于 丙 酮 无 水 乙 醇 和 二 甲 基 甲 酰 胺, 但 在 水 中 极 微 溶 解, 熔 点 为 218~ 224 1 它 是 一 种 非 多 烯 类 的 抗 真 菌 抗 生 素, 在 临 床 上 用 于 治 疗 皮 肤 癣 菌 属 引 起 的 感 染 其 作 用 机 理 是 由 于 灰 黄 霉 素 的 结 构 与 鸟 嘌 呤 相 似, 能 竞 争 性 抑 制 鸟 嘌 呤 进 入 DNA 分 子 中, 干 扰 真 菌 DNA 合 成 而 抑 制 真 菌 的 生 长 ; 并 且 它 与 微 管 蛋 白 结 合, 阻 止 真 菌 细 胞 分 裂 1958 年 开 始 用 于 医 学 临 床, 至 今 灰 黄 霉 素 已 广 泛 用 于 治 疗 皮 肤 及 角 质 层 的 真 菌 感 染, 对 红 色 发 癣 菌 断 发 癣 菌 和 琉 毛 发 癣 菌 等 具 有 强 烈 的 抑 制 作 用 2 灰 黄 霉 素 不 仅 是 一 种 普 遍 应 用 于 临 床 治 疗 皮 肤 和 角 质 层 真 菌 感 染 的 抗 生 素, 而 且 在 农 业 植 物 保 护 方 面 有 着 良 好 的 应 用 前 景 在 我 国, 灰 黄 霉 素 的 应 用 范 围 已 逐 渐 扩 大 到 畜 牧 业 水 产 及 植 物 真 菌 性 病 害 的 防 治 等, 包 括 以 内 服 的 方 式 治 疗 犊 牛 毛 癣, 马 属 动 物 毛 癣 和 犬 的 毛 癣 等 ; 制 成 药 饵 喂 食, 进 行 鱼 类 水 霉 病 的 预 防 与 防 治 ; 加 入 热 猪 油 中 涂 抹 于 蛋 壳 表 面 进 行 鲜 蛋 的 保 鲜 ; 用 5%~10% 灰 黄 霉 素 膏 剂 涂 茎 部 病 处 防 治 瓜 类 枯 萎 病 等 3, 4 但 是 我 国 未 能 实 现 灰 黄 霉 素 的 大 规 模 农 用 化, 其 中 重 要 的 原 因 就 是 在 于 灰 黄 霉 素 的 水 溶 性 极 小, 限 制 了 制 剂 的 研 制, 目 前 开 发 的 剂 型 仅 包 括 片 剂 软 膏 微 粉 片 剂 和 胶 囊 剂 等, 生 产 成 本 高, 农 民 难 于 承 受 在 我 国, 灰 黄 霉 素 的 应 用 范 围 已 逐 渐 扩 大 到 畜 牧 业 水 产 及 植 物 真 菌 性 病 害 的 防 治 等, 包 括 以 内 服 的 方 式 治 疗 犊 牛 毛 癣, 马 属 动 物 毛 癣 和 犬 的 毛 癣 等 ; 制 成 药 饵 喂 食, 进 行 鱼 类 水 霉 病 的 预 防 与 防 治 ; 加 入 热 猪 油 中 涂 抹 于 蛋 壳 表 面 进 行 鲜 蛋 的 保 鲜 ; 用 5%~10% 灰 黄 霉 素 膏 剂 涂 茎 部 病 处 防 治 瓜 类 枯 萎 病 等 但 是 我 国 未 能 实 现 灰 黄 霉 素 的 大 规 模 农 用 化, 其 中 重 要 的 原 因 就 是 在 于 灰 黄 霉 素 的 水 溶 性 极 小, 限 制 了 制 剂 的 研 制, 目 前 开 发 的 剂 型 仅 包 括 片 剂 软 膏 微 粉 片 剂 和 胶 囊 剂 等, 生 产 成 本 高, 农 民 难 于 承 受 农 用 抗 生 素 是 随 着 医 用 抗 生 素 的 发 展 而 发 展 起 来 的, 由 于 成 本 和 性 能 问 题, 竞 争 不 过 化 学 农 药, 以 致 一 直 发 展 缓 慢, 直 到 1963 年 日 本 生 产 的 杀 稻 瘟 菌 素 S, 才 闯 过 了 成 本 和 药 害 两 关, 在 近 千 亩 水 稻 田 大 规 模 防 治 稻 瘟 病 取 得 显 著 效 果 俄 罗 斯 美 国 日 本 德 国 意 大 利 印 度 丹 麦 等 国 已 把 农 用 抗 生 素 的 研 究 列 入 国 家 重 点 计 划 国 外 农 用 抗 生 素 的 研 究 主 要 从 以 下 3 个 方 面 着 手 : 1) 大 量 筛 选 新 的 化 合 物,2) 重 点 改 造 一 些 医 用 抗 生 素 的 结 构, 以 增 加 用 途 或 提 高 药 效,3) 加 强 老 品 种 的 再 开

146 发, 以 拓 宽 其 用 途 5, 6 但 是, 我 国 目 前 在 农 业 上 应 用 于 防 治 作 物 真 菌 性 病 害 的 农 用 抗 生 素 还 十 分 缺 乏, 除 井 冈 霉 素 放 线 菌 酮 与 庆 丰 霉 素 等 少 数 几 个 抗 生 素 品 种 外, 农 用 抗 真 菌 抗 生 素 品 种 稀 缺, 远 远 不 能 满 足 农 业 生 产 的 需 要, 急 需 开 发 推 广 抗 真 菌 生 物 农 药, 因 此, 研 究 和 应 用 具 有 独 立 知 识 产 权 无 公 害 的 生 物 农 药 已 成 为 当 务 之 急, 而 将 列 入 药 典 并 已 在 国 外 广 泛 应 用 的 灰 黄 霉 素 进 行 农 用 化 具 有 非 常 广 阔 的 应 用 前 景 图 1 灰 黄 霉 素 结 构 式 2. 试 验 方 法 2.1 试 验 材 料 2.1.1 试 剂 灰 黄 霉 素, 甲 醇, 水, 甘 氨 酸, 氢 氧 化 钠, 二 氯 甲 烷, 乙 酸 乙 酯,300-400 目 硅 胶, 薄 层 层 析 板 2.1.2 实 验 器 具 及 仪 器 烧 杯, 试 管, 镊 子, 胶 头 滴 管, 铁 架 台, 通 风 橱, 玻 璃 刀, 硅 胶 柱, 药 匙, 硅 胶 板, 锥 形 瓶, 圆 底 反 应 瓶, 天 平, 磁 力 搅 拌 器, 量 筒, 旋 转 蒸 发 仪, 调 温 电 热 套, 蒸 馏 仪, 分 液 漏 斗, 真 空 泵, 电 烤 炉, BRUKER 核 磁 共 振 仪,Finnigan LCQ 质 谱 仪 2.2 灰 黄 霉 素 缩 甘 氨 酸 的 合 成 MeO MeO Cl O OMe O O Gly,MeOH,H 2 O NaOH,reflux MeO MeO Cl O OMe O N COOH 图 2 灰 黄 霉 素 缩 甘 氨 酸 的 合 成 过 程 简 式 2.2.1 称 取 3.53 g(10 mmol) 灰 黄 霉 素, 加 入 50 ml 甲 醇 和 20 ml H 2O 中 2.2.2 称 取 0.9 g (12 mmol) 甘 氨 酸 和 1.2 g NaOH, 加 入 上 述 溶 液 2.2.3 加 热 到 60-70, 回 流 反 应 72h 2.2.4 停 止 反 应, 向 其 中 加 入 冰 水 2.2.5 二 氯 甲 烷 水 进 行 萃 取, 产 物 溶 于 水 层 2.2.6 浓 缩 得 到 的 粗 产 品 用 硅 胶 柱 分 离 纯 化, 其 淋 洗 剂 为 乙 酸 乙 酯 - 甲 醇 (1:2,v:v) 硅 胶 柱 分 离 时, 试 管 收 集 点 板, 薄 层 层 析 示 意 图 如 图 3-7

147 G R 7 8 9 10 图 3 图 4 11 29 30 34 41 END 图 5 图 6 图 7 图 3 中, G 为 灰 黄 霉 素 原 料 点,R 为 反 应 结 束 后 反 应 液 的 点 从 从 中 可 以 看 出, 产 物 中 至 少 有 三 个 点, 并 且 淋 洗 液 是 甲 醇 和 乙 酸 乙 酯, 极 性 很 大, 要 将 反 应 液 中 的 各 个 点 分 离 出 来, 难 度 可 想 而 知 图 4-7 为 硅 胶 柱 层 析 时, 收 集 的 试 管 薄 层 检 测 图 中 的 7-10,11,29,30,34,41,END 均 为 收 集 的 试 管 编 号 7-10 管 收 集 到 极 性 最 小 的 第 一 点,11-29 管 同 时 洗 脱 下 第 一 和 第 二 个 点,30-34 管 三 个 点 同 时 出 现, 而 41 管 以 后 则 只 剩 下 极 性 最 大 的 原 点 处 点 将 7-10 管 合 并, 减 压 蒸 干, 然 后 水 洗, 过 滤 ; 甲 醇 洗, 过 滤 收 集 滤 液 合 并, 蒸 干 ( 标 记 为 A) 41- 最 后 管 合 并, 减 压 蒸 干, 甲 醇 洗, 过 滤, 收 集 滤 液 蒸 干 ( 标 记 为 B) 11-29 管 合 并, 蒸 干, 水 洗 过 滤, 收 集 滤 渣 ( 标 记 为 C) 将 A B C 进 行 质 谱 初 步 检 测 3. 试 验 结 果

148 图 8 组 分 A 的 ESI-MS 谱 图 图 9 组 分 B 的 ESI-MS 谱 图 图 10 组 分 C 的 ESI-MS 谱 图 灰 黄 霉 素 缩 甘 氨 酸 的 分 子 量 为 409.1, 或 者 以 钠 盐 的 形 式 存 在, 分 子 量 为 431 可 是 A B C 三 个 组 分 的 质 谱 图 均 没 有 出 现 目 标 峰, 而 是 很 奇 怪 的 都 出 现 了 几 乎 相 同 的 质 谱 图 它 们 的 主 峰 均 是 543.2, 另 一 个 峰 是 557.2, 与 目 标 峰 相 差 甚 远 可 是 具 体 什 么 原 因 还 不 清 楚 后 来 查 阅 资 料 发 现, 席 夫 碱 遇 水 不 稳 定, 极 其 容 易 分 解 这 可 能 的 一 个 解 释 是, 反 应 原 液 中 加 入 水, 本 来 的 最 初 目 的 是 想 让 水 溶 解 甘 氨 酸, 然 后 与 甲 醇 互 溶, 可 是 水 却 起 到 了 遏 制 反 应 进 行 的 反 作 用, 或 者 是 即 便 有 产 物 生 成, 可 是 遇 水 分 解 了 这 样 便 导 致 了 一 系 列 的 副 反 应 的 进 行, 以 至 543.2 副 产 物 峰 的 出 现 4. 试 验 结 论 本 次 实 验 中, 综 合 薄 层 层 析 结 果 以 及 质 谱 图, 并 没 有 发 现 目 的 产 物 的 出 现 还 需 要 优 化 试 验 反 应 以 及 纯 化 的

149 条 件, 才 能 得 到 较 为 纯 的 产 物 不 过 本 次 实 验 也 有 很 大 的 收 获, 首 先 是 了 解 到 席 夫 碱 遇 水 溶 解 分 解 ; 其 次 是 反 应 溶 剂 的 选 择, 要 根 据 原 料 以 及 产 物 的 性 质 慎 重 选 择 5 参 考 文 献 1) Fausther M, Villeneuve L, Cadrin M. Heat shock protein 70 expression, keratin phosphorylation and Mallory body formation in hepatocytes from griseofulvin intoxicatedmice[j]. Comparative Hepatology, 2004, 3: 5. 2) Finkelstein E, Amichai B, Grunwald M H. Griseofulvin and its uses[j]. Int J Antimicr ob Ag, 1996, 6: 189-194. 3) 李 国 勤, 孙 仁 寅. 抗 动 物 皮 癣 菌 与 螨 虫 病 联 合 缓 释 剂 研 制 与 应 用 [J]. 浙 江 农 业 学 报,2002,14(1):24-27. 4) 苏 明 星, 朱 育 菁, 刘 波 等. 生 物 杀 菌 剂 松 刚 霉 素 对 枯 萎 病 病 原 菌 抑 制 作 用 的 研 究 [J]. 武 夷 科 学,2004,20: 8. 5) 杨 丽 荣, 全 鑫, 刘 玉 霞 等. 农 用 微 生 物 杀 菌 剂 研 究 进 展 [J]. 河 南 农 业 科 学,2009(9):131-134. 6) 朱 昌 雄, 宋 渊. 我 国 农 用 抗 生 素 的 现 状 与 发 展 趋 势 探 讨 [J]. 中 国 农 业 科 技 导 报,2006,8(6):17-19. 7) 石 德 清, 陈 琦, 李 中 华. 含 氨 基 酸 席 夫 碱 的 5- 氟 尿 嘧 啶 衍 生 物 的 合 成 及 其 抗 肿 瘤 活 性 [J]. 有 机 化 学,2005, 25(5):549-553. 试 验 设 计 : 于 晓 杰, 李 智 聪 试 验 负 责 : 朱 育 菁, 李 智 聪, 于 晓 杰 试 验 人 员 : 于 晓 杰, 李 智 聪

150 2011-09-27 承 担 单 位 : 福 建 省 农 科 院 农 业 生 物 资 源 研 究 所 试 验 设 计 : 试 验 项 目 : 阿 维 菌 素 的 PEG 化 试 验 人 员 : 于 晓 杰 潘 志 针 朱 育 菁 试 验 负 责 : 朱 育 菁 潘 志 针 于 晓 杰 报 告 日 期 :2011-9-27 计 数 月 份 :2011 年 08 月 研 究 资 格 系 数 (0.5-1.0) 实 验 设 计 系 数 (0.9-1.0 0.9-1.0) 报 告 得 分 总 分 实 验 设 计 实 验 记 载 实 验 分 析 实 验 简 报 实 验 文 章 1-20% 21-40% 41-60% 61-80% 81-100% 1%-5% 设 计 不 足, 实 施 错 误 6%-10% 设 计 不 全, 实 验 无 果 11%-15% 设 计 可 以, 实 施 不 全 16%-20% 设 计 完 整, 分 布 实 施 21%-25% 实 验 不 全, 记 载 无 果 26%-30% 实 验 不 足, 记 载 不 全 31%-35% 独 立 实 验, 记 载 不 全 36%-40% 分 布 实 验, 记 载 完 整 41%-45% 目 的 明 确, 实 验 完 成 46%-50% 实 验 完 整, 记 载 清 晰 51%-55% 实 验 系 统, 结 果 可 信 56%-60% 实 验 创 新, 分 析 清 晰 61%-65% 实 验 创 新, 结 论 清 晰 66%-70% 实 验 完 整, 统 计 清 晰 71%-75% 实 验 系 统, 数 据 可 靠 76%-80% 报 告 完 整, 文 章 雏 形 81%-85% 结 构 合 理, 分 析 有 据 86%-90% 逻 辑 清 晰, 统 计 合 理 91%-95% 图 表 完 整, 写 作 流 畅 96%-100% 文 献 完 整, 发 表 水 平 福 建 省 农 业 科 学 院 农 业 生 物 资 源 研 究 所 农 业 微 生 物 研 究 中 心 电 话 : 0591-87882571, 传 真 : 0591-87882571 fjat.yzxz.com

151 1 试 验 背 景 聚 乙 二 醇 (polyethylene glycol, PEG) 是 一 种 ph 中 性, 无 毒, 水 溶 性 较 高 的 亲 水 聚 合 物, 其 重 复 单 元 为 氧 乙 烯 基, 端 基 为 两 个 羟 基, 呈 线 性 或 支 化 链 状 结 构 PEG 聚 合 物 是 迄 今 为 止 已 知 聚 合 物 中 蛋 白 和 细 胞 吸 收 水 平 最 低 的 聚 合 物, 由 于 PEG 无 毒 及 良 好 的 生 物 相 容 性,PEG 已 被 FDA 批 准 可 作 为 体 内 注 射 药 用 聚 合 物 药 物 的 PEG 修 饰 是 将 活 化 的 PEG 通 过 化 学 方 法 偶 联 到 药 物 上 的 过 程, 即 PEG 化 (PEGylation) PEG 具 有 高 度 的 亲 水 性, 在 水 溶 液 中 有 较 大 的 水 动 力 学 体 积, 并 且 没 有 免 疫 原 性 当 偶 联 到 药 物 分 子 或 药 物 表 面 时, 可 以 将 其 优 良 性 质 赋 予 修 饰 后 的 药 物 分 子, 改 变 它 们 在 水 溶 液 中 的 生 物 分 配 行 为 和 溶 解 性, 在 其 修 饰 的 药 物 周 围 产 生 空 间 屏 障, 减 少 药 物 的 酶 解, 避 免 在 肾 脏 的 代 谢 中 很 快 消 除, 并 使 药 物 能 被 免 疫 系 统 的 细 胞 识 别 1 PEG 最 早 用 于 药 物 修 饰 要 追 溯 到 1977 年,Abuchowsk 2 等 用 PEG 来 修 饰 牛 血 清 蛋 白, 发 现 可 以 有 效 地 改 变 其 免 疫 性 质 在 此 后 的 二 三 十 年 中,, 聚 乙 二 醇 修 饰 技 术 得 到 了 迅 速 的 发 展, 成 功 地 开 发 出 多 种 PEG 化 的 药 品 在 本 实 验 中 PEG 的 引 入, 既 可 以 增 加 阿 维 菌 素 的 水 溶 性 又 可 以 当 作 中 间 介 质 将 阿 维 与 蛋 白 连 接 起 来, 要 是 可 以 做 成 功, 其 实 是 一 举 两 得 PEG 对 蛋 白 的 修 饰 : 因 为 本 实 验 还 要 涉 及 到 以 后 对 Bt 晶 体 的 PEG 化, 因 此 在 这 里 也 介 绍 下 PEG 对 蛋 白 的 修 饰 采 用 PEG 修 饰 技 术 可 以 改 变 蛋 白 质 的 生 物 化 学 特 性, 增 加 蛋 白 水 溶 性 和 稳 定 性, PEG 化 的 蛋 白 在 保 留 天 然 蛋 白 质 的 内 在 生 物 学 活 性 的 同 时, 能 有 效 克 服 蛋 白 质 类 药 物 在 临 床 应 用 中 的 一 些 缺 点, 如 可 以 提 高 血 浆 半 衰 期, 增 强 生 物 利 用 度 等. 为 了 使 PEG 在 较 温 和 的 反 应 条 件 下 与 蛋 白 质 偶 联, 需 将 PEG 活 化, 活 化 后 的 PEG 再 与 蛋 白 质 分 子 上 的 氨 基 巯 基 或 羧 基 进 行 偶 联 氨 基 的 修 饰 : 蛋 白 质 分 子 表 面 的 氨 基 有 较 高 的 亲 核 反 应 活 性, 因 而 是 蛋 白 质 化 学 修 饰 中 最 常 被 修 饰 的 基 团. 用 于 氨 基 修 饰 的 PEG 的 种 类 较 多, 其 中 氰 脲 酰 氯 法 为 最 经 典 的 PEG 活 化 方 法, 烷 基 化 (alkylating) PEGs 和 酰 基 化 (acylation) PEGs 也 是 两 种 常 用 的 PEG 活 化 方 法 姚 文 兵 等 3 用 三 光 气 和 羟 基 琥 珀 酰 亚 胺 对 mpeg-5000 进 行 活 化, 再 对 人 干 扰 素 α-2b 进 行 了 修 饰. 结 果 表 明, 修 饰 后 其 热 稳 定 性 和 耐 酸 碱 稳 定 性 有 极 大 提 高, 体 内 半 衰 期 明 显 延 长 季 波 等 4 采 用 氰 脲 酰 氯 法 先 对 聚 乙 二 醇 单 甲 醚 6000 (mpeg-6000) 进 行 活 化, 再 以 活 化 后 的 PEG 对 牛 血 Cu, Zn-SOD 冻 干 粉 进 行 化 学 修 饰, 制 得 PEG-SOD 与 天 然 的 SOD 相 比, PEG-SOD 衍 生 物 在 耐 热 耐 酸 碱 以 及 抗 酶 解 方 面 都 有 显 著 提 高, 而 抗 胰 蛋 白 酶 的 能 力 强 于 抗 胃 蛋 白 酶 另 外, 这 个 实 验 中 的 氰 脲 酰 氯 也 为 我 们 提 供 了 一 个 思 路 : 或 者 可 以 将 氰 脲 酰 氯 的 三 个 氯 分 别 以 阿 维 菌 素 Bt 蛋 白 以 及 PEG 所 置 换, 合 成 一 种 新 的 物 质 不 过 难 题 是 三 个 氯 处 于 同 等 的 位 置, 要 被 三 种 不 同 物 质 分 别 替 代, 其 操 作 难 度 会 比 较 大 巯 基 的 修 饰 : 巯 基 在 蛋 白 质 组 成 中 通 常 含 量 不 高, 但 是 位 置 确 定, 因 而 可 针 对 那 些 对 活 性 影 响 不 大 呈 游 离 状 态 的 巯 基 进 行 定 量 定 点 修 饰 目 前 可 用 于 巯 基 修 饰 的 活 化 PEG 有 以 下 几 种 : (1)PEG- 邻 - 吡 啶 - 二 硫 醚 (PEG-orthopyridyl-disulphide);(2)PEG- 马 来 酰 亚 胺 (PEG-maleimide);(3)PEG- 乙 烯 基 砜 (PEG-vinylsulfone); (4)PEG- 碘 乙 酰 胺 (PEG-iodoacetamide) Goodson 等 5 通 过 重 组 技 术 把 Cys 残 基 引 入 白 介 素 (ril-2) 的 非 活 性 单 糖 基 化 位 点, 采 用 马 来 酰 亚 胺 活 化 的 PEG (PEG-maleimide) 对 其 进 行 修 饰, 结 果 表 明, PEG-Cys-rIL-2 与 ril-2 具 有 几 乎 相 同 的 生 物 活 性, 而 前 者 在 体 循 环 中 的 滞 留 时 间 是 后 者 的 4 倍 羧 基 的 修 饰 : 羧 基 也 是 蛋 白 质 分 子 侧 链 上 常 见 的 化 学 反 应 基 团, 一 般 在 二 环 己 基 碳 二 亚 胺 (DCC) 或 1- 乙 基 -3- 二 甲 氨 基 丙 基 - 碳 二 亚 胺 盐 酸 盐 (EDC) 存 在 下, 羧 基 可 与 氨 基 PEG 结 合 PEG 对 小 分 子 的 修 饰 : 聚 乙 二 醇 对 小 分 子 药 物 的 修 饰, 可 以 把 它 的 许 多 优 良 性 质 也 随 之 转

152 移 到 结 合 物 中, 使 该 聚 合 物 具 有 优 异 的 生 物 相 容 性, 在 体 内 能 溶 于 组 织 液 中, 能 被 机 体 迅 速 排 出 体 外 而 不 产 生 任 何 毒 副 作 用, 因 此 它 在 医 学 上 的 应 用 受 到 了 广 泛 的 重 视, 目 前 以 抗 肿 瘤 药 物 为 多. 近 年 来, 采 用 PEG 修 饰 技 术 的 小 分 子 药 物 主 要 有 : 紫 杉 醇, 喜 树 碱, 阿 糖 胞 苷, 灯 盏 乙 素 等 PEG 修 饰 小 分 子 药 物, 仍 然 主 要 与 药 物 的 OH, NH2, COOH 等 基 团 反 应 Greenwald 等 6, 7, 8 报 道 了 PEG 对 喜 树 碱 的 修 饰 路 线, PEG-40000 对 喜 树 碱 2 -OH 进 行 修 饰 后 在 水 中 的 溶 解 度 约 为 2 mg/ml, 是 原 药 喜 树 碱 溶 解 度 (0.0025 mg/ml) 的 800 倍 PEG 对 2 - 羟 基 的 修 饰 不 仅 增 加 了 药 物 的 水 溶 性, 还 提 高 了 内 酯 的 稳 定 性, 同 时 赋 予 了 药 物 抗 肿 瘤 的 靶 向 性, 动 物 实 验 发 现 前 药 在 肿 瘤 部 位 的 药 物 浓 度 是 喜 树 碱 的 30 倍, 大 大 提 高 了 其 疗 效, 现 该 药 物 已 进 入 临 床 阶 段 本 实 验 中 是 利 用 4 羟 基 进 行 羧 基 化 改 造 后 的 阿 维 菌 素, 与 PEG 衍 生 物 NH2-PEG-COOH 进 行 反 应 阿 维 菌 素 衍 生 物 的 自 由 羧 基 先 用 N- 羟 基 琥 珀 酰 亚 胺 进 行 活 化 生 成 琥 珀 酰 亚 胺 酯, 然 后 再 与 PEG 的 N 端 氨 基 进 行 酰 胺 化 反 应 2. 试 验 方 法 2.1 试 验 材 料 2.1.1 试 剂 5- TBDMS-4 - 羧 基 - 阿 维 菌 素,NH2-PEG-COOH,EDC, 四 氢 呋 喃,N- 羟 基 琥 珀 酰 亚 胺 (NHS), 三 乙 胺 薄 层 层 析 硅 胶 板 2.1.2 实 验 器 具 及 仪 器 烧 杯, 试 管, 镊 子, 胶 头 滴 管, 铁 架 台, 通 风 橱, 玻 璃 刀, 硅 胶 板, 锥 形 瓶, 圆 底 反 应 瓶, 天 平, 磁 力 搅 拌 器, 量 筒, 旋 转 蒸 发 仪, 调 温 电 热 套, 蒸 馏 仪, 分 液 漏 斗, 真 空 泵 2.2 阿 维 菌 素 的 PEG 化 反 应 1: 称 取 0.025 mmol(0.0272 g)5- TBDMS-4 - 羧 基 - 阿 维 菌 素 0.025 mmol(0.0048 g)edc 和 0.00 mmol(0.0029 g)nhs 溶 于 2 ml DMF 搅 拌 反 应 40 min, 向 其 中 加 入 0.12 g 常 规 PEG(4000), 搅 拌 反 应 过 夜 反 应 2: 称 取 0.025 mmol(0.0272 g)5- TBDMS-4 - 羧 基 - 阿 维 菌 素 0.025 mmol(0.0048 g)edc 和 0.0025 mmol(0.0029 g)nhs 溶 于 1 ml DMF 搅 拌 1 小 时, 向 其 中 加 入 0.1 g NH2-PEG-COOH 3.5 微 升 三 乙 胺 和 0.5 ml DMF, 搅 拌 反 映 4 h 反 应 3: 称 取 0.0544g 5- TBDMS-4 - 羧 基 - 阿 维 菌 素 0.0096 g EDC 和 0.0058 g NHS 溶 于 1.5 ml THF 搅 拌 1 小 时, 向 其 中 加 入 0.2 g NH2-PEG-COOH 7 微 升 三 乙 胺, 搅 拌 反 映 4 h 3 试 验 结 果 A N R A N 1 R A N 1 R

153 图 1 图 2 图 3 反 应 1 用 的 PEG 为 常 规 的 PEG, 即 两 端 为 羟 基 的 PEG 本 次 试 验 为 预 试 验, 主 要 是 摸 索 PEG 与 阿 维 菌 素 藕 合 的 条 件 图 1 为 反 应 1 结 束 后 薄 层 层 析 示 意 图, A N R 分 别 代 表 5- TBDMS-4 - 羧 基 - 阿 维 菌 素 NHS 和 反 应 液 从 图 中 可 以 看 出 反 应 液 中 多 出 一 个 新 点, 说 明 阿 维 菌 素 有 可 能 与 PEG 发 生 藕 合 反 应 反 应 2 则 是 在 反 应 1 的 基 础 上, 采 用 修 饰 后 的 NH2-PEG-COOH 进 行 反 应, 而 N 端 的 氨 基 是 以 盐 酸 盐 的 形 式 存 在, 因 此 加 入 三 乙 胺 释 放 出 活 性 的 氨 基 以 便 进 行 反 应 图 2 为 反 应 2 薄 层 层 析 示 意 图, A N 1 R 分 别 代 表 5- TBDMS-4 - 羧 基 - 阿 维 菌 素 NHS 未 加 NH2-PEG-COOH 前 的 反 应 液 以 及 最 终 反 应 液 从 图 中 可 以 看 出, 1 处 有 一 个 新 点, 应 该 是 阿 维 菌 素 与 NHS 反 应 生 成 琥 珀 酰 亚 胺 酯 的 点, R 处 又 多 个 一 个 点, 红 色 标 示, 该 点 理 论 上 应 该 为 PEG 化 后 阿 维 菌 素 的 点 由 于 反 应 2 中 采 用 的 DMF 沸 点 高, 挥 发 性 差, 溶 剂 难 以 除 去, 因 此 反 应 3 采 用 THF 做 溶 剂 进 行 反 应 图 3 为 反 应 3 薄 层 层 析 示 意 图, A N 1 R 分 别 代 表 5- TBDMS-4 - 羧 基 - 阿 维 菌 素 NHS 未 加 NH2-PEG-COOH 前 的 反 应 液 以 及 最 终 反 应 液 从 图 中 可 以 看 出, 虽 然 1 多 了 一 个 淡 淡 的 新 点, 可 是 反 应 液 R 貌 似 冰 没 有 出 现 产 物 点 4. 试 验 结 论 一 系 列 的 文 献 资 料 显 示, 无 论 通 过 酰 胺 化 还 是 酯 化 进 行 的 阿 维 菌 素 PEG 化 反 应, 理 论 上 是 可 行 的, 该 试 验 证 明 实 际 上 也 是 可 操 作 的 本 次 实 验 中, 反 应 1 是 利 用 羧 基 与 羟 基 的 酯 化 反 应 进 行 的 PEG 藕 合 修 饰 ; 反 应 2 则 是 利 用 羧 基 与 氨 基 的 酰 胺 化 反 应 进 行 的 PEG 化 修 饰 反 应 2 中 有 新 的 物 质 点 出 现 那 么, 在 接 下 来 的 试 验 中, 则 要 继 续 摸 索 优 化 实 验 条 件 和 分 离 纯 化 条 件, 然 后 进 行 产 物 的 质 谱 核 磁 检 测 5 参 考 文 献 1) Kozlowski A,Harris JM. Improvements in protein PEGylation: pegylated interferons for treatment of hepatits C[J].J Control Release,2001,72 :217. 2) Abuchowski A, Van Es T, Palczuk NC, et al. Alteration of immunological properities of bovine serum albumin by covalent attachment of polyethylene glycol[j]. J Biol Chem, 1977,252: 3578. 3) 姚 文 兵, 林 碧 蓉, 沈 子 龙 等. 聚 乙 二 醇 修 饰 干 扰 素 α-2b 的 分 离 纯 化 和 制 备. 中 国 生 化 药 物 杂 志,2001, 22, 289. 4) 季 波, 徐 滢 波, 赵 树 进. 聚 乙 二 醇 修 饰 超 氧 化 物 歧 化 酶 及 其 稳 定 性 研 究. 广 州 医 学 院 学 报, 2002, 30, 16. 5) Goodson, R. J., Katre, N. V. Site-direct PEGylation of interleukin-2 at its glycosylation site. Bio/technology. 1990, 8, 343. 6) Greenwald, R. B., Pendri, A., Conover, C. Drug delivery system. 2.Camptothecin 20-O-poly (ethylene glycol) ester transport forms. J. Med. Chem.1996, 39, 1938. 7) Pendri, A., Conover, C. D., Greenwald, R. B. Antitumor activity of paclitaxel-20-glycinate conjugated to poly (ethylene glycol): a water-soluble prodrug. Anti-Cancer Drug Des. 1998, 13, 387. 8) Conover, C. D.; Greenwald, R. B. Camptothecin delivery system: enhanced efficacy and tumor accumulation

154 of camptothecin following its conjugation to polyethylene glycol via a glycine linker. Cancer Chemother. Pharmacol. 1998, 42, 407. 试 验 设 计 : 于 晓 杰, 潘 志 针 试 验 负 责 : 朱 育 菁, 潘 志 针, 于 晓 杰, 试 验 人 员 : 于 晓 杰, 潘 志 针

155 编 号 : 农 业 微 生 物 研 究 中 心, 共 6 页 承 担 单 位 : 福 建 省 农 科 院 农 业 生 物 资 源 研 究 所 试 验 设 计 : 试 验 项 目 : 灰 黄 霉 素 缩 甘 氨 酸 的 合 成 ( 三 ) 试 验 人 员 : 于 晓 杰 李 智 聪 朱 育 菁 试 验 负 责 : 朱 育 菁 李 智 聪 于 晓 杰 报 告 日 期 :2011-09-25 计 数 月 份 :2011 年 08 月 研 究 资 格 系 数 (0.5-1.0) 实 验 设 计 系 数 (0.9-1.0 0.9-1.0) 报 告 得 分 总 分 实 验 设 计 实 验 记 载 实 验 分 析 实 验 简 报 实 验 文 章 1-20% 21-40% 41-60% 61-80% 81-100% 1%-5% 设 计 不 足, 实 施 错 误 6%-10% 设 计 不 全, 实 验 无 果 11%-15% 设 计 可 以, 实 施 不 全 16%-20% 设 计 完 整, 分 布 实 施 21%-25% 实 验 不 全, 记 载 无 果 26%-30% 实 验 不 足, 记 载 不 全 31%-35% 独 立 实 验, 记 载 不 全 36%-40% 分 布 实 验, 记 载 完 整 41%-45% 目 的 明 确, 实 验 完 成 46%-50% 实 验 完 整, 记 载 清 晰 51%-55% 实 验 系 统, 结 果 可 信 56%-60% 实 验 创 新, 分 析 清 晰 61%-65% 实 验 创 新, 结 论 清 晰 66%-70% 实 验 完 整, 统 计 清 晰 71%-75% 实 验 系 统, 数 据 可 靠 76%-80% 报 告 完 整, 文 章 雏 形 81%-85% 结 构 合 理, 分 析 有 据 86%-90% 逻 辑 清 晰, 统 计 合 理 91%-95% 图 表 完 整, 写 作 流 畅 96%-100% 文 献 完 整, 发 表 水 平 福 建 省 农 业 科 学 院 农 业 生 物 资 源 研 究 所 农 业 微 生 物 研 究 中 心 电 话 : 0591-87882571, 传 真 : 0591-87882571 fjat.yzxz.com

156 1 试 验 目 的 在 上 两 次 次 实 验 中, 我 们 已 经 通 过 对 反 应 后 物 质 进 行 质 谱 检 测 发 现 有 目 标 产 物 的 存 在, 但 是 接 下 来 的 时 候 改 变 了 下 试 验 条 件, 反 而 没 有 产 物 生 成 本 次 试 验 在 总 结 上 几 次 试 验 的 基 础 上, 继 续 改 进 反 应 方 法, 试 图 在 反 应 顺 利 的 同 时, 反 应 产 物 也 更 容 易 分 离 纯 化 该 系 列 试 验, 就 是 根 据 灰 黄 霉 素 的 结 构 特 点, 对 其 进 行 位 点 改 造 或 者 基 团 添 加, 试 图 通 过 增 加 其 极 性 从 而 增 加 水 溶 性 另 外, 该 系 列 试 验 还 研 究 了 合 成 的 灰 黄 霉 素 衍 生 物 对 几 种 常 见 农 业 病 害 真 菌 的 抑 制 作 用 并 与 灰 黄 霉 素 进 行 了 对 比, 从 而 归 纳 总 结 出 灰 黄 霉 素 的 结 构 和 抗 真 菌 活 力 之 间 的 关 系 目 前 对 席 夫 碱 的 研 究 发 现, 很 多 席 夫 碱 都 有 很 好 的 抗 菌 活 性, 而 灰 黄 霉 素 的 4 位 置 有 一 个 C=O, 可 以 对 其 进 行 改 造, 生 成 C=N 席 夫 碱 本 次 实 验 是 利 用 甘 氨 酸 与 灰 黄 霉 素 进 行 反 应, 生 成 灰 黄 霉 素 缩 甘 氨 酸 甘 氨 酸 本 身 就 是 极 性 很 大 的 物 质, 水 溶 性 也 非 常 好 通 过 缩 合, 产 物 的 极 性 也 得 到 提 升, 因 此 水 溶 性 有 可 能 得 到 改 变 灰 黄 霉 素 (6 - 甲 基 -2,4,6- 三 甲 氧 基 -7- 氯 螺 [ 苯 并 呋 喃 -2(3H),1 -[2] 环 己 烯 ]-3,4 - 二 酮 ) 是 由 Oxford 等 从 灰 黄 青 霉 ( Penicillium griseofulvin ) 培 养 液 中 得 到 的 一 种 含 氯 代 谢 产 物, 分 子 式 为 C17 H17 ClO6, 分 子 质 量 为 352. 77, 分 子 结 构 见 图 1, 为 白 色 或 类 白 色 结 晶 性 粉 末, 无 臭, 味 微 苦, 可 溶 于 丙 酮 无 水 乙 醇 和 二 甲 基 甲 酰 胺, 但 在 水 中 极 微 溶 解, 熔 点 为 218~ 224 1 它 是 一 种 非 多 烯 类 的 抗 真 菌 抗 生 素, 在 临 床 上 用 于 治 疗 皮 肤 癣 菌 属 引 起 的 感 染 其 作 用 机 理 是 由 于 灰 黄 霉 素 的 结 构 与 鸟 嘌 呤 相 似, 能 竞 争 性 抑 制 鸟 嘌 呤 进 入 DNA 分 子 中, 干 扰 真 菌 DNA 合 成 而 抑 制 真 菌 的 生 长 ; 并 且 它 与 微 管 蛋 白 结 合, 阻 止 真 菌 细 胞 分 裂 1958 年 开 始 用 于 医 学 临 床, 至 今 灰 黄 霉 素 已 广 泛 用 于 治 疗 皮 肤 及 角 质 层 的 真 菌 感 染, 对 红 色 发 癣 菌 断 发 癣 菌 和 琉 毛 发 癣 菌 等 具 有 强 烈 的 抑 制 作 用 2 灰 黄 霉 素 不 仅 是 一 种 普 遍 应 用 于 临 床 治 疗 皮 肤 和 角 质 层 真 菌 感 染 的 抗 生 素, 而 且 在 农 业 植 物 保 护 方 面 有 着 良 好 的 应 用 前 景 在 我 国, 灰 黄 霉 素 的 应 用 范 围 已 逐 渐 扩 大 到 畜 牧 业 水 产 及 植 物 真 菌 性 病 害 的 防 治 等, 包 括 以 内 服 的 方 式 治 疗 犊 牛 毛 癣, 马 属 动 物 毛 癣 和 犬 的 毛 癣 等 ; 制 成 药 饵 喂 食, 进 行 鱼 类 水 霉 病 的 预 防 与 防 治 ; 加 入 热 猪 油 中 涂 抹 于 蛋 壳 表 面 进 行 鲜 蛋 的 保 鲜 ; 用 5%~10% 灰 黄 霉 素 膏 剂 涂 茎 部 病 处 防 治 瓜 类 枯 萎 病 等 3, 4 但 是 我 国 未 能 实 现 灰 黄 霉 素 的 大 规 模 农 用 化, 其 中 重 要 的 原 因 就 是 在 于 灰 黄 霉 素 的 水 溶 性 极 小, 限 制 了 制 剂 的 研 制, 目 前 开 发 的 剂 型 仅 包 括 片 剂 软 膏 微 粉 片 剂 和 胶 囊 剂 等, 生 产 成 本 高, 农 民 难 于 承 受 在 我 国, 灰 黄 霉 素 的 应 用 范 围 已 逐 渐 扩 大 到 畜 牧 业 水 产 及 植 物 真 菌 性 病 害 的 防 治 等, 包 括 以 内 服 的 方 式 治 疗 犊 牛 毛 癣, 马 属 动 物 毛 癣 和 犬 的 毛 癣 等 ; 制 成 药 饵 喂 食, 进 行 鱼 类 水 霉 病 的 预 防 与 防 治 ; 加 入 热 猪 油 中 涂 抹 于 蛋 壳 表 面 进 行 鲜 蛋 的 保 鲜 ; 用 5%~10% 灰 黄 霉 素 膏 剂 涂 茎 部 病 处 防 治 瓜 类 枯 萎 病 等 但 是 我 国 未 能 实 现 灰 黄 霉 素 的 大 规 模 农 用 化, 其 中 重 要 的 原 因 就 是 在 于 灰 黄 霉 素 的 水 溶 性 极 小, 限 制 了 制 剂 的 研 制, 目 前 开 发 的 剂 型 仅 包 括 片 剂 软 膏 微 粉 片 剂 和 胶 囊 剂 等, 生 产 成 本 高, 农 民 难 于 承 受 农 用 抗 生 素 是 随 着 医 用 抗 生 素 的 发 展 而 发 展 起 来 的, 由 于 成 本 和 性 能 问 题, 竞 争 不 过 化 学 农 药, 以 致 一 直 发 展 缓 慢, 直 到 1963 年 日 本 生 产 的 杀 稻 瘟 菌 素 S, 才 闯 过 了 成 本 和 药 害 两 关, 在 近 千 亩 水 稻 田 大 规 模 防 治 稻 瘟 病 取 得 显 著 效 果 俄 罗 斯 美 国 日 本 德 国 意 大 利 印 度 丹 麦 等 国 已 把 农 用 抗 生 素 的 研 究 列 入 国 家 重 点 计 划 国 外 农 用 抗 生 素 的 研 究 主 要 从 以 下 3 个 方 面 着 手 :1) 大 量 筛 选 新 的 化 合 物,2) 重 点 改 造 一 些 医 用 抗 生 素 的 结 构, 以 增 加 用 途 或 提 高 药 效,3) 加 强 老 品 种 的 再 开 发, 以 拓 宽 其 用 途 5, 6 但 是, 我 国 目 前 在 农 业 上 应 用 于 防 治 作 物 真 菌 性 病 害 的 农 用 抗 生 素 还 十 分 缺 乏, 除 井 冈 霉 素 放 线 菌 酮 与 庆 丰 霉 素 等 少 数 几 个 抗 生 素 品 种 外, 农 用 抗 真 菌 抗 生

157 素 品 种 稀 缺, 远 远 不 能 满 足 农 业 生 产 的 需 要, 急 需 开 发 推 广 抗 真 菌 生 物 农 药, 因 此, 研 究 和 应 用 具 有 独 立 知 识 产 权 无 公 害 的 生 物 农 药 已 成 为 当 务 之 急, 而 将 列 入 药 典 并 已 在 国 外 广 泛 应 用 的 灰 黄 霉 素 进 行 农 用 化 具 有 非 常 广 阔 的 应 用 前 景 图 1 灰 黄 霉 素 结 构 式 2. 试 验 方 法 2.1 试 验 材 料 2.1.1 试 剂 灰 黄 霉 素, 甲 醇, 甘 氨 酸, 氢 氧 化 钾, 二 氯 甲 烷, 乙 酸 乙 酯, 石 油 醚, 石 油 醚, 薄 层 层 析 板 2.1.2 实 验 器 具 及 仪 器 烧 杯, 试 管, 镊 子, 胶 头 滴 管, 铁 架 台, 通 风 橱, 玻 璃 刀, 硅 胶 柱, 药 匙, 硅 胶 板, 锥 形 瓶, 圆 底 反 应 瓶, 天 平, 磁 力 搅 拌 器, 量 筒, 旋 转 蒸 发 仪, 调 温 电 热 套, 蒸 馏 仪, 分 液 漏 斗, 真 空 泵, 电 烤 炉,BRUKER 核 磁 共 振 仪,Finnigan LCQ 质 谱 仪 2.2 灰 黄 霉 素 缩 甘 氨 酸 的 合 成 MeO O OMe MeO O OMe MeO Cl O O Gly,MeOH KOH,reflux MeO Cl O N COOH 图 2 灰 黄 霉 素 缩 甘 氨 酸 的 合 成 过 程 简 式 2.2.1 反 应 1: 称 取 8 mmol 甘 氨 酸 8 mmol KOH 加 入 30 ml 甲 醇 中, 加 热 搅 拌 回 流 反 应 1 小 时, 过 滤 去 掉 少 量 残 渣 将 滤 液 滴 入 含 10 mmol 灰 黄 霉 素 的 甲 醇 溶 液 中 回 流 反 应 72 小 时 停 止 反 应, 待 其 冷 却 后, 放 入 冰 箱 静 置 过 夜 有 沉 淀 析 出, 过 滤 收 集 沉 淀 A 2.2.2 反 应 2: 称 取 3.53 g(10 mmol) 灰 黄 霉 素, 加 入 50 ml 甲 醇 中, 搅 拌 下 加 入 0.9 g (12 mmol) 甘 氨 酸 和 0.48g KOH 加 热 到 70-80, 回 流 反 应 72h 停 止 反 应, 将 反 应 液 冷 却 蒸 去 大 部 分 溶 剂, 将 反 应 液 浓 缩 到 较 小 体 积, 然 后 向 其 中 加 入 少 量 乙 醇 和 大 量 的 石 油 醚 这 时 有 沉 淀 析 出, 过 滤 收 集 沉 淀 B

158 G R G R 图 3 图 4 反 应 1 和 反 应 2 反 应 结 束 后, 反 应 液 点 板 结 果 相 近, 如 图 3 和 图 4 所 示 图 3 为 两 个 反 应 液 点 板 后, 用 二 氯 甲 烷 和 乙 酸 乙 酯 (2:1,v:v) 作 淋 洗 液 图 4 为 三 氯 甲 烷 和 甲 醇 (2:1,v:v) 做 淋 洗 液 图 3 中, 由 于 淋 洗 液 极 性 较 小, 产 物 点 并 没 有 跑 上 去, 而 是 聚 集 在 原 点 图 4 中, 加 大 淋 洗 液 极 性, 有 两 个 点 跑 上 去 3. 试 验 结 果 图 5 组 分 A 的 ESI-MS 谱 图

159 图 6 组 分 B 的 ESI-MS 谱 图 灰 黄 霉 素 缩 甘 氨 酸 的 分 子 量 为 409.1, 本 实 验 中 反 应 产 物 要 是 以 钾 盐 形 式 存 在 责 分 子 量 为 447.9 图 5 为 组 分 A 的 质 谱 图, 图 6 为 组 分 B 的 质 谱 图 组 分 A 主 峰 分 子 量 496.8, 与 目 标 产 物 的 分 子 量 相 差 甚 远 组 分 B 质 谱 图 中 出 现 了 408.5,433.5,446.6,471.6 这 样 几 个 峰 其 中 408.5 峰 与 灰 黄 霉 素 缩 甘 氨 酸 分 子 量 (409.1) 相 近 ;433.5 峰 则 与 灰 黄 霉 素 缩 甘 氨 酸 同 时 加 氢 加 钠 (433.1) 相 近 ;446.6 峰 则 与 灰 黄 霉 素 缩 甘 氨 酸 钾 分 子 量 (447.9) 相 近 ; 而 471.6 峰 则 与 灰 黄 霉 素 缩 甘 氨 酸 钾 质 谱 加 钠 分 子 量 (470.9) 相 近 这 一 切 很 好 的 证 明 了, 组 分 B 中 应 该 存 在 着 目 标 产 物 或 者 目 标 产 物 的 钾 盐 4. 试 验 结 论 本 次 实 验 中, 两 个 反 应 薄 层 层 析 结 果 说 明 有 新 的 产 物 生 成 可 是 结 合 质 谱 图 发 现, 组 分 A 中 没 有 目 标 产 物 生 成 而 组 分 B 中 的 各 个 不 同 的 峰 值, 则 说 明 存 在 着 目 标 产 物 或 者 其 钾 盐 在 接 下 来 的 试 验 中, 则 要 进 一 步 通 过 核 磁 高 分 辨 质 谱 等 方 法 对 目 标 产 物 的 结 构 进 行 解 析 另 外, 还 要 进 一 步 摸 索 优 化 反 应 条 件, 使 产 物 产 率 得 到 提 升

160 5 参 考 文 献 1) Fausther M, Villeneuve L, Cadrin M. Heat shock protein 70 expression, keratin phosphorylation and Mallory body formation in hepatocytes from griseofulvin intoxicatedmice[j]. Comparative Hepatology, 2004, 3: 5. 2) Finkelstein E, Amichai B, Grunwald M H. Griseofulvin and its uses[j]. Int J Antimicr ob Ag, 1996, 6: 189-194. 3) 李 国 勤, 孙 仁 寅. 抗 动 物 皮 癣 菌 与 螨 虫 病 联 合 缓 释 剂 研 制 与 应 用 [J]. 浙 江 农 业 学 报,2002,14(1):24-27. 4) 苏 明 星, 朱 育 菁, 刘 波 等. 生 物 杀 菌 剂 松 刚 霉 素 对 枯 萎 病 病 原 菌 抑 制 作 用 的 研 究 [J]. 武 夷 科 学,2004, 20:8. 5) 杨 丽 荣, 全 鑫, 刘 玉 霞 等. 农 用 微 生 物 杀 菌 剂 研 究 进 展 [J]. 河 南 农 业 科 学,2009(9):131-134. 6) 朱 昌 雄, 宋 渊. 我 国 农 用 抗 生 素 的 现 状 与 发 展 趋 势 探 讨 [J]. 中 国 农 业 科 技 导 报,2006,8(6):17-19. 7) 石 德 清, 陈 琦, 李 中 华. 含 氨 基 酸 席 夫 碱 的 5- 氟 尿 嘧 啶 衍 生 物 的 合 成 及 其 抗 肿 瘤 活 性 [J]. 有 机 化 学,2005, 25(5):549-553. 试 验 设 计 : 于 晓 杰, 李 智 聪 试 验 负 责 : 朱 育 菁, 李 智 聪, 于 晓 杰 试 验 人 员 : 于 晓 杰, 李 智 聪

161 编 号 : 农 业 微 生 物 研 究 中 心, 共 6 页 承 担 单 位 : 福 建 省 农 科 院 农 业 生 物 资 源 研 究 所 试 验 设 计 : 试 验 项 目 : 灰 黄 霉 素 的 结 构 改 造 ( 九 ):5 - 氯 灰 黄 霉 素 的 合 成 试 验 人 员 : 于 晓 杰 李 智 聪 朱 育 菁 试 验 负 责 : 朱 育 菁 李 智 聪 于 晓 杰 报 告 日 期 :2011-09-25 计 数 月 份 :2011 年 08 月 研 究 资 格 系 数 (0.5-1.0) 实 验 设 计 系 数 (0.9-1.0 0.9-1.0) 报 告 得 分 总 分 实 验 设 计 实 验 记 载 实 验 分 析 实 验 简 报 实 验 文 章 1-20% 21-40% 41-60% 61-80% 81-100% 1%-5% 设 计 不 足, 实 施 错 误 6%-10% 设 计 不 全, 实 验 无 果 11%-15% 设 计 可 以, 实 施 不 全 16%-20% 设 计 完 整, 分 布 实 施 21%-25% 实 验 不 全, 记 载 无 果 26%-30% 实 验 不 足, 记 载 不 全 31%-35% 独 立 实 验, 记 载 不 全 36%-40% 分 布 实 验, 记 载 完 整 41%-45% 目 的 明 确, 实 验 完 成 46%-50% 实 验 完 整, 记 载 清 晰 51%-55% 实 验 系 统, 结 果 可 信 56%-60% 实 验 创 新, 分 析 清 晰 61%-65% 实 验 创 新, 结 论 清 晰 66%-70% 实 验 完 整, 统 计 清 晰 71%-75% 实 验 系 统, 数 据 可 靠 76%-80% 报 告 完 整, 文 章 雏 形 81%-85% 结 构 合 理, 分 析 有 据 86%-90% 逻 辑 清 晰, 统 计 合 理 91%-95% 图 表 完 整, 写 作 流 畅 96%-100% 文 献 完 整, 发 表 水 平 福 建 省 农 业 科 学 院 农 业 生 物 资 源 研 究 所 农 业 微 生 物 研 究 中 心 电 话 : 0591-87882571, 传 真 : 0591-87882571 fjat.yzxz.com

162 1 试 验 目 的 该 系 列 试 验 的 主 要 目 的, 就 是 根 据 灰 黄 霉 素 的 结 构 特 点, 对 其 进 行 位 点 改 造 或 者 基 团 添 加, 试 图 通 过 增 加 其 极 性 从 而 增 加 水 溶 性 另 外, 该 系 列 试 验 还 研 究 了 合 成 的 灰 黄 霉 素 衍 生 物 对 几 种 常 见 农 业 病 害 真 菌 的 抑 制 作 用 并 与 灰 黄 霉 素 进 行 了 对 比, 从 而 归 纳 总 结 出 灰 黄 霉 素 的 结 构 和 抗 真 菌 活 力 之 间 的 关 系 本 次 实 验 是 对 灰 黄 霉 素 的 5 位 置 进 行 改 造, 添 加 一 个 卤 素 原 子 氯, 生 成 5 - 氯 灰 黄 霉 素 通 过 该 次 反 应 的 改 造, 试 图 让 产 物 的 极 性 得 到 提 升, 水 溶 性 有 可 能 得 到 改 变 另 外, 新 产 物 的 抑 菌 活 性 也 可 能 改 变 同 时, 还 可 以 探 讨 比 较 对 灰 黄 霉 素 5 位 置 分 别 添 加 卤 素 Br 和 Cl 产 物 性 质 的 异 同 灰 黄 霉 素 (6 - 甲 基 -2,4,6- 三 甲 氧 基 -7- 氯 螺 [ 苯 并 呋 喃 -2(3H),1 -[2] 环 己 烯 ]-3,4 - 二 酮 ) 是 由 Oxford 等 从 灰 黄 青 霉 ( Penicillium griseofulvin ) 培 养 液 中 得 到 的 一 种 含 氯 代 谢 产 物, 分 子 式 为 C17 H17 ClO6, 分 子 质 量 为 352. 77, 分 子 结 构 见 图 1, 为 白 色 或 类 白 色 结 晶 性 粉 末, 无 臭, 味 微 苦, 可 溶 于 丙 酮 无 水 乙 醇 和 二 甲 基 甲 酰 胺, 但 在 水 中 极 微 溶 解, 熔 点 为 218~ 224 1 它 是 一 种 非 多 烯 类 的 抗 真 菌 抗 生 素, 在 临 床 上 用 于 治 疗 皮 肤 癣 菌 属 引 起 的 感 染 其 作 用 机 理 是 由 于 灰 黄 霉 素 的 结 构 与 鸟 嘌 呤 相 似, 能 竞 争 性 抑 制 鸟 嘌 呤 进 入 DNA 分 子 中, 干 扰 真 菌 DNA 合 成 而 抑 制 真 菌 的 生 长 ; 并 且 它 与 微 管 蛋 白 结 合, 阻 止 真 菌 细 胞 分 裂 1958 年 开 始 用 于 医 学 临 床, 至 今 灰 黄 霉 素 已 广 泛 用 于 治 疗 皮 肤 及 角 质 层 的 真 菌 感 染, 对 红 色 发 癣 菌 断 发 癣 菌 和 琉 毛 发 癣 菌 等 具 有 强 烈 的 抑 制 作 用 2 灰 黄 霉 素 不 仅 是 一 种 普 遍 应 用 于 临 床 治 疗 皮 肤 和 角 质 层 真 菌 感 染 的 抗 生 素, 而 且 在 农 业 植 物 保 护 方 面 有 着 良 好 的 应 用 前 景 在 我 国, 灰 黄 霉 素 的 应 用 范 围 已 逐 渐 扩 大 到 畜 牧 业 水 产 及 植 物 真 菌 性 病 害 的 防 治 等, 包 括 以 内 服 的 方 式 治 疗 犊 牛 毛 癣, 马 属 动 物 毛 癣 和 犬 的 毛 癣 等 ; 制 成 药 饵 喂 食, 进 行 鱼 类 水 霉 病 的 预 防 与 防 治 ; 加 入 热 猪 油 中 涂 抹 于 蛋 壳 表 面 进 行 鲜 蛋 的 保 鲜 ; 用 5%~10% 灰 黄 霉 素 膏 剂 涂 茎 部 病 处 防 治 瓜 类 枯 萎 病 等 3, 4 但 是 我 国 未 能 实 现 灰 黄 霉 素 的 大 规 模 农 用 化, 其 中 重 要 的 原 因 就 是 在 于 灰 黄 霉 素 的 水 溶 性 极 小, 限 制 了 制 剂 的 研 制, 目 前 开 发 的 剂 型 仅 包 括 片 剂 软 膏 微 粉 片 剂 和 胶 囊 剂 等, 生 产 成 本 高, 农 民 难 于 承 受 在 我 国, 灰 黄 霉 素 的 应 用 范 围 已 逐 渐 扩 大 到 畜 牧 业 水 产 及 植 物 真 菌 性 病 害 的 防 治 等, 包 括 以 内 服 的 方 式 治 疗 犊 牛 毛 癣, 马 属 动 物 毛 癣 和 犬 的 毛 癣 等 ; 制 成 药 饵 喂 食, 进 行 鱼 类 水 霉 病 的 预 防 与 防 治 ; 加 入 热 猪 油 中 涂 抹 于 蛋 壳 表 面 进 行 鲜 蛋 的 保 鲜 ; 用 5%~10% 灰 黄 霉 素 膏 剂 涂 茎 部 病 处 防 治 瓜 类 枯 萎 病 等 但 是 我 国 未 能 实 现 灰 黄 霉 素 的 大 规 模 农 用 化, 其 中 重 要 的 原 因 就 是 在 于 灰 黄 霉 素 的 水 溶 性 极 小, 限 制 了 制 剂 的 研 制, 目 前 开 发 的 剂 型 仅 包 括 片 剂 软 膏 微 粉 片 剂 和 胶 囊 剂 等, 生 产 成 本 高, 农 民 难 于 承 受 农 用 抗 生 素 是 随 着 医 用 抗 生 素 的 发 展 而 发 展 起 来 的, 由 于 成 本 和 性 能 问 题, 竞 争 不 过 化 学 农 药, 以 致 一 直 发 展 缓 慢, 直 到 1963 年 日 本 生 产 的 杀 稻 瘟 菌 素 S, 才 闯 过 了 成 本 和 药 害 两 关, 在 近 千 亩 水 稻 田 大 规 模 防 治 稻 瘟 病 取 得 显 著 效 果 俄 罗 斯 美 国 日 本 德 国 意 大 利 印 度 丹 麦 等 国 已 把 农 用 抗 生 素 的 研 究 列 入 国 家 重 点 计 划 国 外 农 用 抗 生 素 的 研 究 主 要 从 以 下 3 个 方 面 着 手 :1) 大 量 筛 选 新 的 化 合 物,2) 重 点 改 造 一 些 医 用 抗 生 素 的 结 构, 以 增 加 用 途 或 提 高 药 效,3) 加 强 老 品 种 的 再 开 发, 以 拓 宽 其 用 途 5, 6 但 是, 我 国 目 前 在 农 业 上 应 用 于 防 治 作 物 真 菌 性 病 害 的 农 用 抗 生 素 还 十 分 缺 乏, 除 井 冈 霉 素 放 线 菌 酮 与 庆 丰 霉 素 等 少 数 几 个 抗 生 素 品 种 外, 农 用 抗 真 菌 抗 生 素 品 种 稀 缺, 远 远 不 能 满 足 农 业 生 产 的 需 要, 急 需 开 发 推 广 抗 真 菌 生 物 农 药, 因 此, 研 究 和 应 用 具 有 独 立 知 识 产 权 无 公 害 的 生 物 农 药 已 成 为 当 务 之 急, 而 将 列 入 药 典 并 已 在 国 外 广 泛 应 用 的 灰 黄 霉 素 进 行 农 用 化 具 有 非 常 广 阔 的 应 用 前 景

163 图 1 灰 黄 霉 素 结 构 式 2. 试 验 方 法 2.1 试 验 材 料 2.1.1 试 剂 5 - 醛 基 灰 黄 霉 素, 氯 仿,N- 氯 代 琥 珀 酰 亚 胺, 水, 二 氯 甲 烷, 甲 醇 钠, 甲 醇, 氢 氧 化 钠 2.1.2 实 验 器 具 及 仪 器 烧 杯, 试 管, 镊 子, 胶 头 滴 管, 铁 架 台, 通 风 橱, 玻 璃 刀, 硅 胶 柱, 药 匙, 硅 胶 板, 锥 形 瓶, 圆 底 反 应 瓶, 天 平, 磁 力 搅 拌 器, 量 筒, 旋 转 蒸 发 仪, 调 温 电 热 套, 蒸 馏 仪, 分 液 漏 斗, 真 空 泵, 电 烤 炉,BRUKER 核 磁 共 振 仪,esquire3000 plus 2.2 5 - 灰 黄 霉 素 的 合 成 MeO OOMe MeO O Cl Mol. Wt.: 380.77638 O NCS RT. MeO OOMe O MeO O Cl Cl Mol. Wt.: 387.21134 图 2 5 - 氯 灰 黄 霉 素 的 合 成 过 程 简 式 2.2.1 称 取 1.9 g 5 - 醛 基 灰 黄 霉 素 溶 于 15 ml 氯 仿 中 2.2.2 向 上 述 溶 液 中 加 入 0.7 g N- 氯 代 琥 珀 酰 亚 胺 2.2.3 室 温 搅 拌 反 应 1 h 2.2.4 停 止 反 应, 向 其 中 加 入 冰 水,2 mol/l NaOH 溶 液 和 二 氯 甲 烷 进 行 萃 取 2.2.5 收 集 有 机 相, 减 压 真 空 浓 缩 到 很 小 的 体 积 2.2.6 向 浓 缩 液 中 加 入 10 ml 甲 醇 和 1 ml 1 mol/l 的 甲 醇 钠 溶 液, 有 沉 淀 析 出 2.2.7 剧 烈 搅 拌 15 min 真 空 抽 滤 收 集 固 体, 少 量 甲 醇 洗 干 燥 后 得 1.18 g 固 体 产 物 2.2.8 质 谱 检 测

164 图 3 循 环 水 真 空 干 燥 图 4 薄 层 层 析 图 5 萃 取 图 6 硅 胶 柱 层 析 3. 试 验 结 果

165 图 7 5 - 氯 灰 黄 霉 素 的 ESI-MS 谱 图 ( 一 ) 图 8 5 - 氯 灰 黄 霉 素 的 ESI-MS 谱 图 ( 二 ) 5 - 氯 基 灰 黄 霉 素 的 分 子 量 为 387.2 图 1 中 出 现 了 两 个 相 对 较 高 的 峰 值, 分 别 为 352.4 和 374.4, 它 们 并 不 是 目 标 产 物 的 峰, 而 有 可 能 是 灰 黄 霉 素 (352.7) 图 2 中 改 变 了 质 谱 的 条 件 以 后, 从 图 中 可 以 看 到 有 两 个 386.4 和 408.4 的 峰, 其 中 386.4 与 387.2 相 近, 有 可 能 是 本 次 试 验 的 产 物, 而 408.4 则 可 能 是 产 物 加 钠 的 结 果 4. 试 验 结 论 本 次 实 验 中, 综 合 质 谱 图, 可 以 看 到 应 该 有 目 的 产 物 合 成, 还 有 一 些 不 会 对 实 验 结 果 产 生 本 质 影 响 的 较 少 的 杂 质 在 接 下 来 还 需 要 通 过 核 磁 进 行 进 一 步 的 确 认, 以 及 对 物 质 的 抑 菌 活 性 和 水 溶 性 进 行 探 究 5 参 考 文 献 1) Fausther M, Villeneuve L, Cadrin M. Heat shock protein 70 expression, keratin phosphorylation and Mallory body formation in hepatocytes from griseofulvin intoxicatedmice[j]. Comparative Hepatology, 2004, 3: 5. 2) Finkelstein E, Amichai B, Grunwald M H. Griseofulvin and its uses[j]. Int J Antimicr ob Ag, 1996, 6: 189-194. 3) 李 国 勤, 孙 仁 寅 抗 动 物 皮 癣 菌 与 螨 虫 病 联 合 缓 释 剂 研 制 与 应 用 [J] 浙 江 农 业 学 报,2002,14(1):24-27 4) 苏 明 星, 朱 育 菁, 刘 波, 等 生 物 杀 菌 剂 松 刚 霉 素 对 枯 萎 病 病 原 菌 抑 制 作 用 的 研 究 [J] 武 夷 科 学,2004, 20:8 5) 杨 丽 荣, 全 鑫, 刘 玉 霞, 等 农 用 微 生 物 杀 菌 剂 研 究 进 展 [J] 河 南 农 业 科 学,2009(9):131-134 6) 朱 昌 雄, 宋 渊 我 国 农 用 抗 生 素 的 现 状 与 发 展 趋 势 探 讨 [J] 中 国 农 业 科 技 导 报,2006,8(6):17-19 试 验 设 计 : 于 晓 杰, 李 智 聪 试 验 负 责 : 朱 育 菁, 李 智 聪, 于 晓 杰 试 验 人 员 : 于 晓 杰, 李 智 聪

166 编 号 : 农 业 微 生 物 研 究 中 心, 共 6 页 承 担 单 位 : 福 建 省 农 科 院 农 业 生 物 资 源 研 究 所 试 验 设 计 : 试 验 项 目 : 灰 黄 霉 素 的 结 构 改 造 ( 十 ):5 - 醛 基 灰 黄 霉 素 的 还 原 试 验 人 员 : 于 晓 杰 李 智 聪 朱 育 菁 试 验 负 责 : 朱 育 菁 李 智 聪 于 晓 杰 报 告 日 期 :2011-09-26 计 数 月 份 :2011 年 08 月 研 究 资 格 系 数 (0.5-1.0) 实 验 设 计 系 数 (0.9-1.0 0.9-1.0) 报 告 得 分 总 分 实 验 设 计 实 验 记 载 实 验 分 析 实 验 简 报 实 验 文 章 1-20% 21-40% 41-60% 61-80% 81-100% 1%-5% 设 计 不 足, 实 施 错 误 6%-10% 设 计 不 全, 实 验 无 果 11%-15% 设 计 可 以, 实 施 不 全 16%-20% 设 计 完 整, 分 布 实 施 21%-25% 实 验 不 全, 记 载 无 果 26%-30% 实 验 不 足, 记 载 不 全 31%-35% 独 立 实 验, 记 载 不 全 36%-40% 分 布 实 验, 记 载 完 整 41%-45% 目 的 明 确, 实 验 完 成 46%-50% 实 验 完 整, 记 载 清 晰 51%-55% 实 验 系 统, 结 果 可 信 56%-60% 实 验 创 新, 分 析 清 晰 61%-65% 实 验 创 新, 结 论 清 晰 66%-70% 实 验 完 整, 统 计 清 晰 71%-75% 实 验 系 统, 数 据 可 靠 76%-80% 报 告 完 整, 文 章 雏 形 81%-85% 结 构 合 理, 分 析 有 据 86%-90% 逻 辑 清 晰, 统 计 合 理 91%-95% 图 表 完 整, 写 作 流 畅 96%-100% 文 献 完 整, 发 表 水 平 福 建 省 农 业 科 学 院 农 业 生 物 资 源 研 究 所 农 业 微 生 物 研 究 中 心 电 话 : 0591-87882571, 传 真 : 0591-87882571 fjat.yzxz.com

167 1 试 验 目 的 该 系 列 试 验 的 主 要 目 的, 就 是 根 据 灰 黄 霉 素 的 结 构 特 点, 对 其 进 行 位 点 改 造 或 者 基 团 添 加, 试 图 通 过 增 加 其 极 性 从 而 增 加 水 溶 性 另 外, 该 系 列 试 验 还 研 究 了 合 成 的 灰 黄 霉 素 衍 生 物 对 几 种 常 见 农 业 病 害 真 菌 的 抑 制 作 用 并 与 灰 黄 霉 素 进 行 了 对 比, 从 而 归 纳 总 结 出 灰 黄 霉 素 的 结 构 和 抗 真 菌 活 力 之 间 的 关 系 本 次 实 验 是 对 灰 黄 霉 素 的 5 位 置 进 行 改 造, 将 之 前 合 成 的 5 - 醛 基 灰 黄 霉 素 的 醛 基 进 行 还 原 通 过 该 次 反 应 的 改 造, 试 图 让 产 物 的 极 性 得 到 提 升, 水 溶 性 有 可 能 得 到 改 变 另 外, 新 产 物 的 抑 菌 活 性 也 可 能 改 变 灰 黄 霉 素 (6 - 甲 基 -2,4,6- 三 甲 氧 基 -7- 氯 螺 [ 苯 并 呋 喃 -2(3H),1 -[2] 环 己 烯 ]-3,4 - 二 酮 ) 是 由 Oxford 等 从 灰 黄 青 霉 ( Penicillium griseofulvin ) 培 养 液 中 得 到 的 一 种 含 氯 代 谢 产 物, 分 子 式 为 C17 H17 ClO6, 分 子 质 量 为 352. 77, 分 子 结 构 见 图 1, 为 白 色 或 类 白 色 结 晶 性 粉 末, 无 臭, 味 微 苦, 可 溶 于 丙 酮 无 水 乙 醇 和 二 甲 基 甲 酰 胺, 但 在 水 中 极 微 溶 解, 熔 点 为 218~ 224 1 它 是 一 种 非 多 烯 类 的 抗 真 菌 抗 生 素, 在 临 床 上 用 于 治 疗 皮 肤 癣 菌 属 引 起 的 感 染 其 作 用 机 理 是 由 于 灰 黄 霉 素 的 结 构 与 鸟 嘌 呤 相 似, 能 竞 争 性 抑 制 鸟 嘌 呤 进 入 DNA 分 子 中, 干 扰 真 菌 DNA 合 成 而 抑 制 真 菌 的 生 长 ; 并 且 它 与 微 管 蛋 白 结 合, 阻 止 真 菌 细 胞 分 裂 1958 年 开 始 用 于 医 学 临 床, 至 今 灰 黄 霉 素 已 广 泛 用 于 治 疗 皮 肤 及 角 质 层 的 真 菌 感 染, 对 红 色 发 癣 菌 断 发 癣 菌 和 琉 毛 发 癣 菌 等 具 有 强 烈 的 抑 制 作 用 2 灰 黄 霉 素 不 仅 是 一 种 普 遍 应 用 于 临 床 治 疗 皮 肤 和 角 质 层 真 菌 感 染 的 抗 生 素, 而 且 在 农 业 植 物 保 护 方 面 有 着 良 好 的 应 用 前 景 在 我 国, 灰 黄 霉 素 的 应 用 范 围 已 逐 渐 扩 大 到 畜 牧 业 水 产 及 植 物 真 菌 性 病 害 的 防 治 等, 包 括 以 内 服 的 方 式 治 疗 犊 牛 毛 癣, 马 属 动 物 毛 癣 和 犬 的 毛 癣 等 ; 制 成 药 饵 喂 食, 进 行 鱼 类 水 霉 病 的 预 防 与 防 治 ; 加 入 热 猪 油 中 涂 抹 于 蛋 壳 表 面 进 行 鲜 蛋 的 保 鲜 ; 用 5%~10% 灰 黄 霉 素 膏 剂 涂 茎 部 病 处 防 治 瓜 类 枯 萎 病 等 3, 4 但 是 我 国 未 能 实 现 灰 黄 霉 素 的 大 规 模 农 用 化, 其 中 重 要 的 原 因 就 是 在 于 灰 黄 霉 素 的 水 溶 性 极 小, 限 制 了 制 剂 的 研 制, 目 前 开 发 的 剂 型 仅 包 括 片 剂 软 膏 微 粉 片 剂 和 胶 囊 剂 等, 生 产 成 本 高, 农 民 难 于 承 受 在 我 国, 灰 黄 霉 素 的 应 用 范 围 已 逐 渐 扩 大 到 畜 牧 业 水 产 及 植 物 真 菌 性 病 害 的 防 治 等, 包 括 以 内 服 的 方 式 治 疗 犊 牛 毛 癣, 马 属 动 物 毛 癣 和 犬 的 毛 癣 等 ; 制 成 药 饵 喂 食, 进 行 鱼 类 水 霉 病 的 预 防 与 防 治 ; 加 入 热 猪 油 中 涂 抹 于 蛋 壳 表 面 进 行 鲜 蛋 的 保 鲜 ; 用 5%~10% 灰 黄 霉 素 膏 剂 涂 茎 部 病 处 防 治 瓜 类 枯 萎 病 等 但 是 我 国 未 能 实 现 灰 黄 霉 素 的 大 规 模 农 用 化, 其 中 重 要 的 原 因 就 是 在 于 灰 黄 霉 素 的 水 溶 性 极 小, 限 制 了 制 剂 的 研 制, 目 前 开 发 的 剂 型 仅 包 括 片 剂 软 膏 微 粉 片 剂 和 胶 囊 剂 等, 生 产 成 本 高, 农 民 难 于 承 受 农 用 抗 生 素 是 随 着 医 用 抗 生 素 的 发 展 而 发 展 起 来 的, 由 于 成 本 和 性 能 问 题, 竞 争 不 过 化 学 农 药, 以 致 一 直 发 展 缓 慢, 直 到 1963 年 日 本 生 产 的 杀 稻 瘟 菌 素 S, 才 闯 过 了 成 本 和 药 害 两 关, 在 近 千 亩 水 稻 田 大 规 模 防 治 稻 瘟 病 取 得 显 著 效 果 俄 罗 斯 美 国 日 本 德 国 意 大 利 印 度 丹 麦 等 国 已 把 农 用 抗 生 素 的 研 究 列 入 国 家 重 点 计 划 国 外 农 用 抗 生 素 的 研 究 主 要 从 以 下 3 个 方 面 着 手 :1) 大 量 筛 选 新 的 化 合 物,2) 重 点 改 造 一 些 医 用 抗 生 素 的 结 构, 以 增 加 用 途 或 提 高 药 效,3) 加 强 老 品 种 的 再 开 发, 以 拓 宽 其 用 途 5, 6 但 是, 我 国 目 前 在 农 业 上 应 用 于 防 治 作 物 真 菌 性 病 害 的 农 用 抗 生 素 还 十 分 缺 乏, 除 井 冈 霉 素 放 线 菌 酮 与 庆 丰 霉 素 等 少 数 几 个 抗 生 素 品 种 外, 农 用 抗 真 菌 抗 生 素 品 种 稀 缺, 远 远 不 能 满 足 农 业 生 产 的 需 要, 急 需 开 发 推 广 抗 真 菌 生 物 农 药, 因 此, 研 究 和 应 用 具 有 独 立 知 识 产 权 无 公 害 的 生 物 农 药 已 成 为 当 务 之 急, 而 将 列 入 药 典 并 已 在 国 外 广 泛 应 用 的 灰 黄 霉 素 进 行 农 用 化 具 有 非 常 广 阔 的 应 用 前 景

168 图 1 灰 黄 霉 素 结 构 式 2. 试 验 方 法 2.1 试 验 材 料 2.1.1 试 剂 5 - 醛 基 灰 黄 霉 素, 四 氢 呋 喃, 水, 硼 氢 化 钠, 碳 酸 氢 钠, 二 氯 甲 烷, 乙 酸 乙 酯 2.1.2 实 验 器 具 及 仪 器 烧 杯, 试 管, 镊 子, 胶 头 滴 管, 铁 架 台, 通 风 橱, 玻 璃 刀, 硅 胶 柱, 药 匙, 硅 胶 板, 锥 形 瓶, 圆 底 反 应 瓶, 天 平, 磁 力 搅 拌 器, 量 筒, 旋 转 蒸 发 仪, 调 温 电 热 套, 蒸 馏 仪, 分 液 漏 斗, 真 空 泵, 电 烤 炉,esquire3000 plus 2.2 5 - 灰 黄 霉 素 的 合 成 MeO O OMe MeO O OMe MeO Cl O O O NaBH 4 MeO Cl O O CH 2 OH 图 2 5 - 醛 基 灰 黄 霉 素 还 原 过 程 简 式 2.2.1 称 取 1.9 g 5 - 醛 基 灰 黄 霉 素 溶 于 25 ml THF 和 1.5 ml 水 中 2.2.2 冰 浴 条 件 下, 向 上 述 溶 液 中 缓 慢 加 入 0.375 g NaBH4 2.2.3 保 持 冰 浴 搅 拌 反 应 4 h 2.2.4 加 入 3%NaHCO3 溶 液 终 止 反 应 2.2.5 向 其 中 加 入 50 ml 乙 酸 乙 酯 进 行 萃 取, 然 后 水 洗, 饱 和 NaCl 洗 2.2.6 减 压 蒸 掉 溶 剂, 二 氯 甲 烷 和 乙 酸 乙 酯 (2:1,v:v) 作 为 淋 洗 液 硅 胶 柱 分 离 纯 化 2.2.7 质 谱 检 测

169 图 3 循 环 水 真 空 干 燥 图 4 薄 层 层 析 3. 试 验 结 果 图 5 萃 取 图 6 硅 胶 柱 层 析

170 a 8 9 10 16 17 31 图 7 硅 胶 柱 纯 化 收 集 试 管 薄 层 层 析 图 图 7 为 硅 胶 柱 纯 化 时, 收 集 的 试 管 薄 层 层 析 示 意 图, 其 实 a 代 表 原 料 点, 8-31 代 表 收 集 试 管 的 管 数 从 图 中 可 以 看 出,8 9 10 管 洗 脱 下 的 为 原 料, 而 从 第 16 管 开 始 系 脱 下 产 物, 直 到 31 管 收 集 16-31 管, 蒸 干 溶 剂, 做 质 谱 检 测 图 8 产 物 ESI-MS 谱 图 本 试 验 目 标 产 物 分 子 量 382.8, 而 质 谱 图 中 主 峰 值 为 404.5, 应 该 为 产 物 在 质 谱 时 加 钠 的 缘 故 从 图 中 可 以 看 出, 主 峰 404.5 峰 值 相 对 最 高, 说 明 含 量 很 大, 而 其 它 的 杂 志 峰 都 比 较 少 4. 试 验 结 论 本 次 实 验 中, 综 合 质 谱 图, 可 以 看 到 应 该 有 目 的 产 物 合 成, 还 有 一 些 不 会 对 实 验 结 果 产 生 本 质 影 响 的 较 少 的 杂 质 在 接 下 来 还 需 要 通 过 核 磁 进 行 进 一 步 的 确 认, 以 及 对 物 质 的 抑 菌 活 性 和 水 溶 性 进 行 探 究 5 参 考 文 献 1) Fausther M, Villeneuve L, Cadrin M. Heat shock protein 70 expression, keratin phosphorylation and Mallory body formation in hepatocytes from griseofulvin intoxicatedmice[j]. Comparative Hepatology, 2004, 3: 5. 2) Finkelstein E, Amichai B, Grunwald M H. Griseofulvin and its uses[j]. Int J Antimicr ob Ag, 1996, 6: 189-194. 3) 李 国 勤, 孙 仁 寅 抗 动 物 皮 癣 菌 与 螨 虫 病 联 合 缓 释 剂 研 制 与 应 用 [J] 浙 江 农 业 学 报,2002,14(1):24-27 4) 苏 明 星, 朱 育 菁, 刘 波, 等 生 物 杀 菌 剂 松 刚 霉 素 对 枯 萎 病 病 原 菌 抑 制 作 用 的 研 究 [J] 武 夷 科 学,2004, 20:8 5) 杨 丽 荣, 全 鑫, 刘 玉 霞, 等 农 用 微 生 物 杀 菌 剂 研 究 进 展 [J] 河 南 农 业 科 学,2009(9):131-134

171 6) 朱 昌 雄, 宋 渊 我 国 农 用 抗 生 素 的 现 状 与 发 展 趋 势 探 讨 [J] 中 国 农 业 科 技 导 报,2006,8(6):17-19 试 验 设 计 : 于 晓 杰, 李 智 聪 试 验 负 责 : 朱 育 菁, 李 智 聪, 于 晓 杰 试 验 人 员 : 于 晓 杰, 李 智 聪

172 2011-09-27 承 担 单 位 : 福 建 省 农 科 院 农 业 生 物 资 源 研 究 所 试 验 设 计 : 试 验 项 目 : 灰 黄 霉 素 的 结 构 改 造 ( 十 一 ): 灰 黄 霉 素 缩 苯 基 氨 基 硫 脲 的 合 成 试 验 人 员 : 于 晓 杰 李 智 聪 朱 育 菁 试 验 负 责 : 朱 育 菁 李 智 聪 于 晓 杰 报 告 日 期 :2011-09-27 计 数 月 份 :2011 年 8 月 研 究 资 格 系 数 (0.5-1.0) 实 验 设 计 系 数 (0.9-1.0 0.9-1.0) 报 告 得 分 总 分 实 验 设 计 实 验 记 载 实 验 分 析 实 验 简 报 实 验 文 章 1-20% 21-40% 41-60% 61-80% 81-100% 1%-5% 设 计 不 足, 实 施 错 误 6%-10% 设 计 不 全, 实 验 无 果 11%-15% 设 计 可 以, 实 施 不 全 16%-20% 设 计 完 整, 分 布 实 施 21%-25% 实 验 不 全, 记 载 无 果 26%-30% 实 验 不 足, 记 载 不 全 31%-35% 独 立 实 验, 记 载 不 全 36%-40% 分 布 实 验, 记 载 完 整 41%-45% 目 的 明 确, 实 验 完 成 46%-50% 实 验 完 整, 记 载 清 晰 51%-55% 实 验 系 统, 结 果 可 信 56%-60% 实 验 创 新, 分 析 清 晰 61%-65% 实 验 创 新, 结 论 清 晰 66%-70% 实 验 完 整, 统 计 清 晰 71%-75% 实 验 系 统, 数 据 可 靠 76%-80% 报 告 完 整, 文 章 雏 形 81%-85% 结 构 合 理, 分 析 有 据 86%-90% 逻 辑 清 晰, 统 计 合 理 91%-95% 图 表 完 整, 写 作 流 畅 96%-100% 文 献 完 整, 发 表 水 平 福 建 省 农 业 科 学 院 农 业 生 物 资 源 研 究 所 农 业 微 生 物 研 究 中 心 电 话 : 0591-87882571, 传 真 : 0591-87882571 fjat.yzxz.com 编 号 : 农 业 微 生 物 研 究 中 心, 共 6 页

173 1 试 验 目 的 该 系 列 试 验, 就 是 根 据 灰 黄 霉 素 的 结 构 特 点, 对 其 进 行 位 点 改 造 或 者 基 团 添 加, 试 图 通 过 增 加 其 极 性 从 而 增 加 水 溶 性 另 外, 该 系 列 试 验 还 研 究 了 合 成 的 灰 黄 霉 素 衍 生 物 对 几 种 常 见 农 业 病 害 真 菌 的 抑 制 作 用 并 与 灰 黄 霉 素 进 行 了 对 比, 从 而 归 纳 总 结 出 灰 黄 霉 素 的 结 构 和 抗 真 菌 活 力 之 间 的 关 系 目 前 对 席 夫 碱 的 研 究 发 现, 很 多 席 夫 碱 都 有 很 好 的 抗 菌 活 性, 而 灰 黄 霉 素 的 4 位 置 有 一 个 C=O, 可 以 对 其 进 行 改 造, 生 成 C=N 席 夫 碱 本 次 实 验 与 灰 黄 霉 素 缩 氨 基 硫 脲 的 反 应 相 仿, 是 利 用 苯 基 氨 基 硫 脲 与 灰 黄 霉 素 进 行 反 应, 生 成 灰 黄 霉 素 缩 苯 基 氨 基 硫 脲 而 与 此 同 时, 产 物 的 极 性 也 得 到 提 升, 因 此 水 溶 性 有 可 能 得 到 改 变 灰 黄 霉 素 (6 - 甲 基 -2,4,6- 三 甲 氧 基 -7- 氯 螺 [ 苯 并 呋 喃 -2(3H),1 -[2] 环 己 烯 ]-3,4 - 二 酮 ) 是 由 Oxford 等 从 灰 黄 青 霉 ( Penicillium griseofulvin ) 培 养 液 中 得 到 的 一 种 含 氯 代 谢 产 物, 分 子 式 为 C17 H17 ClO6, 分 子 质 量 为 352. 77, 分 子 结 构 见 图 1, 为 白 色 或 类 白 色 结 晶 性 粉 末, 无 臭, 味 微 苦, 可 溶 于 丙 酮 无 水 乙 醇 和 二 甲 基 甲 酰 胺, 但 在 水 中 极 微 溶 解, 熔 点 为 218~ 224 1 它 是 一 种 非 多 烯 类 的 抗 真 菌 抗 生 素, 在 临 床 上 用 于 治 疗 皮 肤 癣 菌 属 引 起 的 感 染 其 作 用 机 理 是 由 于 灰 黄 霉 素 的 结 构 与 鸟 嘌 呤 相 似, 能 竞 争 性 抑 制 鸟 嘌 呤 进 入 DNA 分 子 中, 干 扰 真 菌 DNA 合 成 而 抑 制 真 菌 的 生 长 ; 并 且 它 与 微 管 蛋 白 结 合, 阻 止 真 菌 细 胞 分 裂 1958 年 开 始 用 于 医 学 临 床, 至 今 灰 黄 霉 素 已 广 泛 用 于 治 疗 皮 肤 及 角 质 层 的 真 菌 感 染, 对 红 色 发 癣 菌 断 发 癣 菌 和 琉 毛 发 癣 菌 等 具 有 强 烈 的 抑 制 作 用 2 灰 黄 霉 素 不 仅 是 一 种 普 遍 应 用 于 临 床 治 疗 皮 肤 和 角 质 层 真 菌 感 染 的 抗 生 素, 而 且 在 农 业 植 物 保 护 方 面 有 着 良 好 的 应 用 前 景 在 我 国, 灰 黄 霉 素 的 应 用 范 围 已 逐 渐 扩 大 到 畜 牧 业 水 产 及 植 物 真 菌 性 病 害 的 防 治 等, 包 括 以 内 服 的 方 式 治 疗 犊 牛 毛 癣, 马 属 动 物 毛 癣 和 犬 的 毛 癣 等 ; 制 成 药 饵 喂 食, 进 行 鱼 类 水 霉 病 的 预 防 与 防 治 ; 加 入 热 猪 油 中 涂 抹 于 蛋 壳 表 面 进 行 鲜 蛋 的 保 鲜 ; 用 5%~10% 灰 黄 霉 素 膏 剂 涂 茎 部 病 处 防 治 瓜 类 枯 萎 病 等 3, 4 但 是 我 国 未 能 实 现 灰 黄 霉 素 的 大 规 模 农 用 化, 其 中 重 要 的 原 因 就 是 在 于 灰 黄 霉 素 的 水 溶 性 极 小, 限 制 了 制 剂 的 研 制, 目 前 开 发 的 剂 型 仅 包 括 片 剂 软 膏 微 粉 片 剂 和 胶 囊 剂 等, 生 产 成 本 高, 农 民 难 于 承 受 在 我 国, 灰 黄 霉 素 的 应 用 范 围 已 逐 渐 扩 大 到 畜 牧 业 水 产 及 植 物 真 菌 性 病 害 的 防 治 等, 包 括 以 内 服 的 方 式 治 疗 犊 牛 毛 癣, 马 属 动 物 毛 癣 和 犬 的 毛 癣 等 ; 制 成 药 饵 喂 食, 进 行 鱼 类 水 霉 病 的 预 防 与 防 治 ; 加 入 热 猪 油 中 涂 抹 于 蛋 壳 表 面 进 行 鲜 蛋 的 保 鲜 ; 用 5%~10% 灰 黄 霉 素 膏 剂 涂 茎 部 病 处 防 治 瓜 类 枯 萎 病 等 但 是 我 国 未 能 实 现 灰 黄 霉 素 的 大 规 模 农 用 化, 其 中 重 要 的 原 因 就 是 在 于 灰 黄 霉 素 的 水 溶 性 极 小, 限 制 了 制 剂 的 研 制, 目 前 开 发 的 剂 型 仅 包 括 片 剂 软 膏 微 粉 片 剂 和 胶 囊 剂 等, 生 产 成 本 高, 农 民 难 于 承 受 农 用 抗 生 素 是 随 着 医 用 抗 生 素 的 发 展 而 发 展 起 来 的, 由 于 成 本 和 性 能 问 题, 竞 争 不 过 化 学 农 药, 以 致 一 直 发 展 缓 慢, 直 到 1963 年 日 本 生 产 的 杀 稻 瘟 菌 素 S, 才 闯 过 了 成 本 和 药 害 两 关, 在 近 千 亩 水 稻 田 大 规 模 防 治 稻 瘟 病 取 得 显 著 效 果 俄 罗 斯 美 国 日 本 德 国 意 大 利 印 度 丹 麦 等 国 已 把 农 用 抗 生 素 的 研 究 列 入 国 家 重 点 计 划 国 外 农 用 抗 生 素 的 研 究 主 要 从 以 下 3 个 方 面 着 手 :1) 大 量 筛 选 新 的 化 合 物,2) 重 点 改 造 一 些 医 用 抗 生 素 的 结 构, 以 增 加 用 途 或 提 高 药 效,3) 加 强 老 品 种 的 再 开 发, 以 拓 宽 其 用 途 5, 6 但 是, 我 国 目 前 在 农 业 上 应 用 于 防 治 作 物 真 菌 性 病 害 的 农 用 抗 生 素 还 十 分 缺 乏, 除 井 冈 霉 素 放 线 菌 酮 与 庆 丰 霉 素 等 少 数 几 个 抗 生 素 品 种 外, 农 用 抗 真 菌 抗 生 素 品 种 稀 缺, 远 远 不 能 满 足 农 业 生 产 的 需 要, 急 需 开 发 推 广 抗 真 菌 生 物 农 药, 因 此, 研 究 和 应 用 具 有 独 立 知 识 产 权 无 公 害 的 生 物 农 药 已 成 为 当 务 之 急, 而 将 列 入 药 典 并 已 在 国 外 广 泛 应 用 的 灰 黄 霉 素 进 行 农 用 化 具 有 非 常 广 阔 的 应 用 前 景

174 2. 试 验 方 法 2.1 试 验 材 料 图 1 灰 黄 霉 素 结 构 式 2.1.1 试 剂 灰 黄 霉 素, 苯 基 氨 基 硫 脲, 冰 醋 酸, 乙 醇, 二 氯 甲 烷, 乙 酸 乙 酯 2.1.2 实 验 器 具 及 仪 器 烧 杯, 试 管, 镊 子, 胶 头 滴 管, 铁 架 台, 通 风 橱, 玻 璃 刀, 硅 胶 柱, 药 匙, 硅 胶 板, 锥 形 瓶, 圆 底 反 应 瓶, 天 平, 磁 力 搅 拌 器, 量 筒, 旋 转 蒸 发 仪, 调 温 电 热 套, 蒸 馏 仪, 分 液 漏 斗, 真 空 泵, 电 烤 炉,BRUKER 核 磁 共 振 仪,Finnigan LCQ 质 谱 仪 2.2 灰 黄 霉 素 缩 羟 胺 的 合 成 MeO MeO Cl OOMe O O AcOH, MeOH, reflux MeO MeO 图 2 灰 黄 霉 素 缩 苯 基 氨 基 硫 脲 的 合 成 过 程 简 式 Cl OOMe 2.2.1 取 0.83 g 苯 基 氨 基 硫 脲 和 3.52 g 灰 黄 霉 素 加 入 40 ml 乙 醇 和 5 ml 醋 酸 中 2.2.2 78 加 热 回 流, 几 分 钟 后 混 合 液 变 澄 清, 薄 层 层 析 检 测, 如 图 5 所 示 2.2.3 继 续 反 应,2 h 后 有 黄 色 沉 淀 析 出 2.2.4 8 h 后, 停 止 反 应, 冷 却, 过 滤 收 集 沉 淀 2.2.5 质 谱 检 测 O HN N S HN

175 图 3 循 环 水 真 空 干 燥 图 4 薄 层 层 析 3. 试 验 结 果 G P R 图 5 薄 层 层 析 检 测 示 意 图 图 5 为 反 应 过 程 薄 层 层 析 检 测 G P R 分 别 代 表 灰 黄 霉 素, 苯 基 氨 基 硫 脲 和 反 应 液 从 图 中 可 以 看 出, 反 应 液 中 很 明 显 有 新 的 物 质 点 出 现 图 6 灰 黄 霉 素 缩 苯 基 氨 基 硫 脲 的 质 谱 图

176 图 6 为 灰 黄 霉 素 缩 苯 基 氨 基 硫 脲 的 质 谱 图 从 图 中 看 以 看 出, 主 要 有 两 个 峰, 一 个 501.9 峰, 一 个 523.9 峰 而 灰 黄 霉 素 缩 苯 基 氨 基 硫 脲 的 分 子 量 为 501.98. 因 而,501.9 峰 很 可 能 既 是 目 的 产 物, 而 523.9 则 为 质 谱 时 物 质 加 钠 的 结 果 4. 试 验 结 论 本 次 实 验 中, 结 合 最 终 的 质 谱, 证 明 合 成 的 物 质 就 是 目 的 产 物 说 明, 成 功 的 完 成 了 另 一 种 灰 黄 霉 素 席 夫 碱 衍 生 物 的 合 成, 得 到 了 灰 黄 霉 素 缩 苯 基 氨 基 硫 脲 在 接 下 来 的 实 验 中 还 会 继 续 合 成 灰 黄 霉 素 的 其 它 衍 生 物, 也 包 括 更 多 的 席 夫 碱 衍 生 物 的 合 成, 并 研 究 探 讨 它 们 的 水 溶 性 抗 真 菌 活 力 以 及 相 应 的 结 构 上 的 位 置 与 活 性 的 关 系 5 参 考 文 献 1) Fausther M, Villeneuve L, Cadrin M. Heat shock protein 70 expression, keratin phosphorylation and Mallory body formation in hepatocytes from griseofulvin intoxicatedmice[j]. Comparative Hepatology, 2004, 3: 5. 2) Finkelstein E, Amichai B, Grunwald M H. Griseofulvin and its uses[j]. Int J Antimicr ob Ag, 1996, 6: 189-194. 3) 李 国 勤, 孙 仁 寅 抗 动 物 皮 癣 菌 与 螨 虫 病 联 合 缓 释 剂 研 制 与 应 用 [J] 浙 江 农 业 学 报,2002,14(1): 24-27 4) 苏 明 星, 朱 育 菁, 刘 波, 等 生 物 杀 菌 剂 松 刚 霉 素 对 枯 萎 病 病 原 菌 抑 制 作 用 的 研 究 [J] 武 夷 科 学, 2004,20:8 5) 杨 丽 荣, 全 鑫, 刘 玉 霞, 等 农 用 微 生 物 杀 菌 剂 研 究 进 展 [J] 河 南 农 业 科 学,2009(9):131-134 6) 朱 昌 雄, 宋 渊 我 国 农 用 抗 生 素 的 现 状 与 发 展 趋 势 探 讨 [J] 中 国 农 业 科 技 导 报,2006,8(6):17-19 试 验 设 计 : 于 晓 杰, 李 智 聪 试 验 负 责 : 朱 育 菁, 李 智 聪, 于 晓 杰 试 验 人 员 : 于 晓 杰, 李 智 聪

177 2011-08-13 承 担 单 位 : 福 建 省 农 科 院 农 业 生 物 资 源 研 究 所 试 验 设 计 : 试 验 项 目 : 无 致 病 力 尖 孢 镰 刀 菌 FJAT-9290 在 番 茄 上 的 定 殖 特 性 研 究 ( 二 ) 试 验 人 员 : 杨 莹 莹 试 验 负 责 : 肖 荣 凤 报 告 日 期 :2011-08-13 计 数 月 份 :2011 年 8 月 研 究 资 格 系 数 (0.5-1.0) 实 验 设 计 系 数 (0.9-1.0 0.9-1.0) 报 告 得 分 总 分 实 验 设 计 实 验 记 载 实 验 分 析 实 验 简 报 实 验 文 章 1-20% 21-40% 41-60% 61-80% 81-100% 1%-5% 设 计 不 足, 实 施 错 误 6%-10% 设 计 不 全, 实 验 无 果 11%-15% 设 计 可 以, 实 施 不 全 16%-20% 设 计 完 整, 分 布 实 施 21%-25% 实 验 不 全, 记 载 无 果 26%-30% 实 验 不 足, 记 载 不 全 31%-35% 独 立 实 验, 记 载 不 全 36%-40% 分 布 实 验, 记 载 完 整 41%-45% 目 的 明 确, 实 验 完 成 46%-50% 实 验 完 整, 记 载 清 晰 51%-55% 实 验 系 统, 结 果 可 信 56%-60% 实 验 创 新, 分 析 清 晰 61%-65% 实 验 创 新, 结 论 清 晰 66%-70% 实 验 完 整, 统 计 清 晰 71%-75% 实 验 系 统, 数 据 可 靠 76%-80% 报 告 完 整, 文 章 雏 形 81%-85% 结 构 合 理, 分 析 有 据 86%-90% 逻 辑 清 晰, 统 计 合 理 91%-95% 图 表 完 整, 写 作 流 畅 96%-100% 文 献 完 整, 发 表 水 平 福 建 省 农 业 科 学 院 农 业 生 物 资 源 研 究 所 农 业 微 生 物 研 究 中 心 电 话 : 0591-87882571, 传 真 : 0591-87882571 fjat.yzxz.com

178 1. 试 验 目 的 据 报 道, 病 原 菌 侵 染 会 引 起 植 物 体 内 源 激 素 含 量 变 化, 进 而 激 活 植 物 防 御 反 应 基 因 的 表 达 在 寄 主 病 原 物 互 作 中, 受 病 原 菌 诱 导, 可 引 起 寄 主 体 内 病 组 织 或 邻 近 组 织 中 生 理 功 能 及 生 物 能 量 的 [1] 改 变 早 在 1964 年,Staples 等 人 就 研 究 了 菜 豆 受 菜 豆 单 孢 锈 菌 侵 染 后 几 种 酶 活 性 的 变 化 在 植 物 体 内, 除 了 酶 之 外, 还 有 其 它 物 质 的 变 化 本 实 验 通 过 对 番 茄 幼 苗 接 种 尖 孢 镰 刀 菌 无 致 病 力 菌 株 FJAT-9290 和 尖 孢 镰 刀 菌 致 病 菌 株 FJAT-282, 定 期 取 样, 对 全 植 株 的 水 提 取 液 进 行 全 波 长 扫 描, 提 供 关 于 尖 孢 镰 刀 菌 无 致 病 力 菌 株 FJAT-9290 的 免 疫 抗 病 机 制 一 些 基 础 数 据 2. 试 验 方 法 2.1 材 料 2.1.1 样 品 番 茄 幼 苗 购 于 厦 门 如 意, 生 长 期 为 20 天 尖 孢 镰 刀 菌 无 致 病 力 菌 株 FJAT-9290, 致 病 菌 株 FJAT-282 2.1.2 仪 器 Shimadzu 紫 外 - 可 见 光 光 谱 仪 UV-2550 2.2 试 验 方 法 尖 孢 镰 刀 菌 无 致 病 力 菌 株 FJAT-9290 和 致 病 菌 株 FJAT-282 摇 瓶 发 酵, 将 发 酵 液 稀 释 为 10 7 ( 以 孢 子 数 计 ) 后 浇 灌 接 种, 清 水 浇 灌 作 为 对 照, 每 隔 5 天 取 样 一 次, 称 取 香 蕉 组 织 5g, 研 磨 后 加 蒸 馏 水 30mL 提 取, 离 心 后 去 除 沉 淀, 上 清 液 用 紫 外 - 可 见 光 分 光 光 度 计 进 行 全 波 长 扫 描, 波 长 范 围 190nm-900nm, 2 个 平 行 3. 试 验 结 果 图 1 第 10 天 全 波 段 扫 描 结 果 (190nm-900nm)

179 如 图 1 所 示, 由 于 绝 大 多 数 物 质 的 最 大 吸 收 峰 在 400nm 以 下, 导 致 在 这 个 范 围 内 曲 线 较 为 复 杂, 难 以 分 析 对 比, 所 以 选 取 波 长 范 围 在 400nm-900nm 之 间 进 行 分 析 在 两 条 平 行 曲 线 间 有 细 微 差 别, 原 因 可 能 为 植 株 间 本 身 的 差 异 FJAT-282 FJAT-9290 CK 图 2 第 5 天 全 波 段 扫 描 结 果 FJAT-282 FJAT-9290 CK 图 3 第 10 天 全 波 段 扫 描 结 果

180 CK FJAT-282 FJAT-9290 图 4 第 15 天 全 波 段 扫 描 结 果 FJAT-282 FJAT-9290 CK 图 5 第 20 天 全 波 段 扫 描 结 果

181 FJAT-282 FJAT-9290 CK 图 6 第 25 天 全 波 段 扫 描 结 果 FJAT-282 CK FJAT-9290 图 7 第 30 天 全 波 段 扫 描 结 果

182 FJAT-9290 FJAT-282 CK 图 8 第 35 天 全 波 段 扫 描 结 果 FJAT-9290 CK FJAT-282 图 9 第 40 天 全 波 段 扫 描 结 果 如 图 2 所 示, 在 第 五 天 时, 用 无 致 病 力 菌 株 FJAT-9290 处 理 的 植 株 的 水 提 取 液 与 清 水 对 照 一 样, 在 波 长 为 680nm 左 右 有 一 个 较 强 吸 收 峰, 而 致 病 菌 株 FJAT-282 在 该 波 长 处 没 有 峰 出 现 ; 随 着 时 间 的 增 加, 在 680nm 处 的 吸 收 峰 强 度 逐 渐 减 弱, 峰 的 高 度 和 宽 度 均 变 小, 如 图 3- 图 8 所 示 ; 在 第 40 天 时,

183 三 种 处 理 方 式 的 全 植 株 水 提 取 液 在 波 长 300nm-900nm 范 围 内 的 曲 线 光 滑, 无 吸 收 峰 出 现, 如 图 9 所 示 4. 试 验 讨 论 本 实 验 通 过 对 番 茄 幼 苗 接 种 尖 孢 镰 刀 菌 无 致 病 力 菌 株 FJAT-9290 和 尖 孢 镰 刀 菌 致 病 菌 株 FJAT-282, 定 期 取 样, 对 全 植 株 的 水 提 取 液 进 行 全 波 长 扫 描, 结 果 发 现 : (1) 在 接 菌 初 期, 无 致 病 力 菌 株 FJAT-9290 处 理 的 植 株 的 水 提 取 液 与 清 水 对 照 在 波 长 680nm 处 均 出 现 一 个 较 强 的 吸 收 峰, 而 致 病 菌 株 FJAT-282 没 有 ; (2) 随 着 时 间 的 增 加, 该 吸 收 峰 的 强 度 逐 渐 减 弱 ; 在 第 40 天 时, 在 680nm 处 的 吸 收 峰 消 失 ; 根 据 文 献 可 知, 吸 收 波 长 在 680nm 的 物 质 对 应 的 颜 色 是 蓝 绿 色, 植 物 体 内 一 般 均 含 有 叶 绿 素, 因 此 全 植 株 的 水 提 取 液 在 680nm 处 有 吸 收 峰 而 经 过 致 病 菌 FJAT-282 处 理 的 植 株 维 管 束 发 生 褐 变, 叶 片 变 黄, 叶 绿 素 减 少, 全 植 株 的 水 提 取 液 在 680nm 处 的 吸 收 峰 也 降 低, 甚 至 消 失 ; 用 清 水 处 理 及 无 致 病 力 菌 株 处 理 的 植 株 在 种 植 前 期 生 长 情 况 良 好, 然 而 随 着 植 株 的 生 长, 盆 栽 土 壤 养 分 供 应 不 足, 最 终 也 导 致 植 株 叶 绿 素 减 少 5.. 参 考 文 献 [1]Staples R C, et al. Changs in proteins and several enzymes in susceptible bean leaves after infection by the bean rust fungus. Phytopathology, 1964, 54 : 760~764 [2]Sultana F,Hossain M M,Kubota M,et al. Induction of systemic resistence in Arabidopsis thaliana in response to a culture filtrate from a plant growth-promoting fungus, Phoma sp. GS8-3[J]. Plant Biol, 2009, 11(1): 97-104 [3] 谢 佳 霖. 苋 菜 色 素 提 取 条 件 的 研 究 [J]. 食 品 工 业 科 技,2005,4(26):153-154 [4] 武 汉 大 学. 分 析 化 学 [M]. 北 京 : 高 等 教 育 出 版 社,1982:456 试 验 负 责 肖 荣 凤 试 验 人 员 杨 莹 莹

184 2011-05-13 承 担 单 位 : 福 建 省 农 科 院 农 业 生 物 资 源 研 究 所 试 验 设 计 : 试 验 项 目 : 无 致 病 力 尖 孢 镰 刀 菌 FJAT-9290 在 香 蕉 上 的 定 殖 特 性 研 究 ( 三 ) 试 验 人 员 : 杨 莹 莹 试 验 负 责 : 肖 荣 凤 报 告 日 期 :2011-05-13 计 数 月 份 :2011 年 4 月 研 究 资 格 系 数 (0.5-1.0) 实 验 设 计 系 数 (0.9-1.0 0.9-1.0) 报 告 得 分 总 分 实 验 设 计 实 验 记 载 实 验 分 析 实 验 简 报 实 验 文 章 1-20% 21-40% 41-60% 61-80% 81-100% 1%-5% 设 计 不 足, 实 施 错 误 6%-10% 设 计 不 全, 实 验 无 果 11%-15% 设 计 可 以, 实 施 不 全 16%-20% 设 计 完 整, 分 布 实 施 21%-25% 实 验 不 全, 记 载 无 果 26%-30% 实 验 不 足, 记 载 不 全 31%-35% 独 立 实 验, 记 载 不 全 36%-40% 分 布 实 验, 记 载 完 整 41%-45% 目 的 明 确, 实 验 完 成 46%-50% 实 验 完 整, 记 载 清 晰 51%-55% 实 验 系 统, 结 果 可 信 56%-60% 实 验 创 新, 分 析 清 晰 61%-65% 实 验 创 新, 结 论 清 晰 66%-70% 实 验 完 整, 统 计 清 晰 71%-75% 实 验 系 统, 数 据 可 靠 76%-80% 报 告 完 整, 文 章 雏 形 81%-85% 结 构 合 理, 分 析 有 据 86%-90% 逻 辑 清 晰, 统 计 合 理 91%-95% 图 表 完 整, 写 作 流 畅 96%-100% 文 献 完 整, 发 表 水 平 福 建 省 农 业 科 学 院 农 业 生 物 资 源 研 究 所 农 业 微 生 物 研 究 中 心 电 话 : 0591-87882571, 传 真 : 0591-87882571 fjat.yzxz.com

185 1. 试 验 目 的 尖 孢 镰 刀 菌 可 以 引 起 农 作 物 枯 萎 病, 是 世 界 范 围 内 毁 灭 性 的 土 传 病 害, 造 成 损 失 平 均 高 达 20%~80%, 镰 刀 菌 所 有 的 菌 株 都 能 在 土 壤 有 机 质 以 及 多 种 植 物 组 织 中 生 长 并 存 活 多 年, 极 难 彻 底 根 除 目 前 主 要 采 用 以 抗 病 品 种 为 主 的 综 合 防 治 措 施, 但 抗 病 品 种 选 育 的 周 期 较 长, 费 用 较 高, 而 且, 新 的 病 原 菌 小 种 能 够 迅 速 克 服 品 种 的 抗 性 因 而, 近 年 来, 内 生 菌 诱 导 植 物 抗 性 (ISR) 受 到 越 来 越 多 植 物 研 究 者 的 重 视, 内 生 菌 寄 生 于 植 株 体 内, 与 寄 主 互 惠 共 生, 生 长 环 境 稳 定, 更 利 于 发 挥 作 用 经 过 对 镰 刀 菌 多 种 微 生 物 防 治 作 用 的 比 较 研 究 发 现, 镰 刀 菌 非 致 病 力 菌 株 是 防 效 最 好 最 稳 定 的 生 [2] 防 因 子 之 一 非 致 病 力 镰 刀 菌 应 用 了 弱 株 系 交 互 保 护 作 用, 特 别 是 与 病 原 菌 同 型 的 非 致 病 力 菌 株, 在 根 际 与 致 病 菌 进 行 营 养 和 侵 染 位 点 的 竞 争, 诱 导 植 株 产 生 抗 性, 阻 止 或 延 迟 致 病 菌 的 进 入 和 繁 殖, 从 而 达 到 防 病 的 效 果 本 实 验 通 过 对 番 茄 幼 苗 接 种 尖 孢 镰 刀 菌 无 致 病 力 菌 株 FJAT-9290 和 尖 孢 镰 刀 菌 致 病 菌 株 FJAT-282, 定 期 取 样 分 离, 确 定 菌 株 在 植 物 中 的 定 殖, 提 供 关 于 尖 孢 镰 刀 菌 无 致 病 力 菌 株 FJAT-9290 的 免 疫 抗 病 机 制 一 些 基 础 数 据 2. 试 验 方 法 2.1 材 料 2.1.1 样 品 番 茄 幼 苗 购 于 厦 门 如 意 集 团, 生 长 期 为 20 天 尖 孢 镰 刀 菌 无 致 病 力 菌 株 FJAT-9290, 致 病 菌 株 FJAT-282 2.1.2 培 养 基 PDA 培 养 基 ( 分 离 真 菌 ): 土 豆 200g, 葡 萄 糖 20g, 琼 脂 18g, 蒸 馏 水 1000mL,0.3g 链 霉 素,pH 自 然 2.1.3 试 剂 无 菌 水 75% 酒 精 10% 次 氯 酸 钠 2.2 仪 器 超 净 工 作 台 酒 精 灯 接 种 环 恒 温 培 养 箱 镊 子 2.3 实 验 步 骤 2.3.1 灌 根 尖 孢 镰 刀 菌 无 致 病 力 菌 株 FJAT-9290 和 致 病 菌 株 FJAT-282 摇 瓶 发 酵, 将 发 酵 液 稀 释 为 10 7 ( 以 孢 子 数 计 ) 后 浇 灌 接 种, 清 水 浇 灌 作 为 对 照, 每 隔 5 天 取 样 一 次 2.3.2 植 株 内 生 菌 的 分 离 接 菌 后, 每 隔 5 天 采 用 组 织 贴 片 法 对 内 生 菌 进 行 分 离, 具 体 过 程 如 下 : 自 来 水 冲 洗 干 净 植 株 根 部 泥 土 后, 酒 精 棉 球 擦 拭 干 净, 将 植 株 的 茎 中 部 茎 基 部 和 根 部 用 消 毒 后 的 刀 片 切 成 均 匀 片 状, 厚 度 约 为 2~3mm 将 切 成 片 状 的 植 物 组 织 在 75% 的 酒 精 溶 液 中 浸 泡 2~3s, 然 后 在 10% 的 次 氯 酸 钠 溶 液 中 浸 泡 消 毒 7~8m 后, 用 无 菌 水 漂 洗 三 次, 将 植 物 组 织 片 贴 到 已 经 凝 固 的 PDA 平 板 表 面, 倒 置 培 养 3~4 天, 观 察 内 生 菌 的 生 长 情 况 2.3.3 纯 化

186 观 察 分 离 培 养 的 菌 落, 将 要 纯 化 的 菌 落 标 记 由 于 本 次 试 验 目 的 是 观 察 菌 株 FJAT-9290 与 菌 株 FJAT-282 在 香 蕉 中 的 定 殖 情 况, 所 以 只 挑 取 形 态 类 似 FJAT-9290 的 菌 落 进 行 纯 化, 用 接 种 环 在 菌 落 边 缘 上 取 一 点 接 种 于 平 板 中 央, 培 养 7 天 后 进 一 步 进 行 分 子 鉴 定 2.3.4 菌 株 的 鉴 定 用 无 致 病 力 菌 株 FJAT-9290 的 特 异 性 引 物 进 行 PCR 反 应, 经 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 后 分 析 FJAT-9290 在 香 蕉 植 株 体 内 的 定 殖 情 况 无 致 病 力 菌 株 FJAT-9290 的 特 异 性 引 物 P12-R1:AATAGAGCCTGCAAAGCATG,P12-F2: GTATCCTCCGGATTTTGAGC 3. 试 验 结 果 部 分 分 离 照 片 如 下 所 示 : 图 1 清 水 对 照 第 25 天 分 离 ( 反 面 ) 图 2 清 水 对 照 第 25 天 分 离 ( 正 面 ) 图 3 FJAT-9290 第 25 天 分 离 ( 反 面 ) 图 4 FJAT-9290 第 25 天 分 离 ( 正 面 )

187 图 5 FJAT-9290 第 25 天 分 离 ( 反 面 ) 图 6 FJAT-9290 第 25 天 分 离 ( 正 面 ) 图 7 FJAT-282 第 24 天 分 离 ( 反 面 ) 图 8 FJAT-282 第 25 天 分 离 ( 正 面 ) 图 9 FJAT-282 第 25 天 分 离 ( 反 面 ) 图 10 FJAT-282 第 25 天 分 离 ( 正 面 )

188 M 1 2 3 4 5 6 7 8 阳 阴 阴 图 11 1.5% 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 图 如 图 11 所 示, 琼 脂 糖 电 泳 发 现, 所 有 菌 株 均 扩 增 出 1000bp 左 右 的 片 段, 与 预 计 的 目 的 片 段 大 小 相 同, 并 且 条 带 明 亮, 无 拖 尾 现 象 因 此 可 以 确 定 从 用 菌 株 FJAT-9290 处 理 的 香 蕉 体 内 分 离 到 的 是 无 致 病 力 菌 株 FJAT-9290 通 过 形 态 上 的 鉴 定, 可 以 确 定 从 用 菌 株 FJAT-282 处 理 的 香 蕉 体 内 分 离 到 的 为 尖 孢 镰 刀 菌 致 病 菌 株 FJAT-282 4. 试 验 讨 论 本 实 验 通 过 对 香 蕉 幼 苗 接 种 尖 孢 镰 刀 菌 无 致 病 力 菌 株 FJAT-9290 和 尖 孢 镰 刀 菌 致 病 菌 株 FJAT-282, 定 期 取 样 分 离 内 生 菌, 结 果 表 明 : 在 接 菌 后 的 第 5 天 至 第 40 天 内, 菌 株 FJAT-9290 和 菌 株 FJAT-282 在 香 蕉 体 内 稳 定 定 殖, 因 此 同 期 测 定 的 其 它 数 据, 如 酶 活 的 测 定 脂 肪 酸 的 测 定 等, 均 受 到 菌 株 FJAT-9290 和 菌 株 FJAT-282 的 影 响, 与 试 验 目 的 一 致, 达 到 了 预 期 效 果 5.. 参 考 文 献 [1] 沈 萍, 范 秀 荣, 李 广 武. 微 生 物 学 实 验 [M]. 北 京 : 高 等 教 育 出 版 社,1999 年. [2]Fuchs,L G.,Moenne Loccoz.Y.,Delagu.G.Nonpathogenic Fusarium oxysporum strain Fo47 induces resistance to Fusarium wilt in tomoto [J]. Plant Disease, 1997, 81: 492-496. 试 验 负 责 肖 荣 凤 试 验 人 员 杨 莹 莹

189 2011-08 承 担 单 位 : 福 建 省 农 科 院 农 业 生 物 资 源 研 究 所 试 验 设 计 : 试 验 项 目 : 师 大 双 安 楼 紫 外 诱 变 青 枯 雷 尔 氏 菌 FJAT-1458 致 死 率 试 验 人 员 : 孙 大 光 试 验 负 责 : 郑 雪 芳 报 告 日 期 :2011 年 08 月 计 数 月 份 :2011 年 08 月 研 究 资 格 系 数 (0.5-1.0) 实 验 设 计 系 数 (0.9-1.0 0.9-1.0) 报 告 得 分 总 分 实 验 设 计 实 验 记 载 实 验 分 析 实 验 简 报 实 验 文 章 1-20% 21-40% 41-60% 61-80% 81-100% 1%-5% 设 计 不 足, 实 施 错 误 6%-10% 设 计 不 全, 实 验 无 果 11%-15% 设 计 可 以, 实 施 不 全 16%-20% 设 计 完 整, 分 布 实 施 21%-25% 实 验 不 全, 记 载 无 果 26%-30% 实 验 不 足, 记 载 不 全 31%-35% 独 立 实 验, 记 载 不 全 36%-40% 分 布 实 验, 记 载 完 整 41%-45% 目 的 明 确, 实 验 完 成 46%-50% 实 验 完 整, 记 载 清 晰 51%-55% 实 验 系 统, 结 果 可 信 56%-60% 实 验 创 新, 分 析 清 晰 61%-65% 实 验 创 新, 结 论 清 晰 66%-70% 实 验 完 整, 统 计 清 晰 71%-75% 实 验 系 统, 数 据 可 靠 76%-80% 报 告 完 整, 文 章 雏 形 81%-85% 结 构 合 理, 分 析 有 据 86%-90% 逻 辑 清 晰, 统 计 合 理 1458%-95% 图 表 完 整, 写 作 流 畅 96%-100% 文 献 完 整, 发 表 水 平 福 建 省 农 业 科 学 院 农 业 生 物 资 源 研 究 所 农 业 微 生 物 研 究 中 心 电 话 : 051458-87882571, 传 真 : 051458-87882571 fjat.yzxz.com

190 1. 试 验 目 的 番 茄 细 菌 性 青 枯 病 是 由 青 枯 细 菌 ( Ralstonia solanacearum nov. comb) 所 引 起 的 世 界 范 围 发 生 的 重 大 病 害 该 病 害 在 我 国 各 地 区 番 茄 上 都 有 严 重 发 生, 是 番 茄 生 产 上 的 最 重 要 病 害 之 一 目 前 生 产 上 主 要 是 采 用 抗 病 品 种 和 轮 作 套 种 等 农 业 措 施 来 防 治 青 枯 病, 但 由 于 受 到 各 种 条 件 和 原 因 的 限 制, 防 治 效 果 仍 很 不 理 想 迄 今 为 止, 仍 未 有 高 抗 青 枯 病 的 番 茄 品 种 ; 大 量 使 用 化 学 农 药 造 成 环 境 污 染 且 至 今 还 没 有 一 种 化 学 农 药 可 有 效 地 控 制 青 枯 病 的 发 生 因 此 探 索 防 治 青 枯 病 新 方 法 和 新 技 术, 对 防 治 番 茄 青 枯 病 具 有 重 要 的 现 实 意 义 陈 庆 河 等 已 经 探 索 了 无 致 病 力 青 枯 菌 株 防 治 番 茄 青 枯 病 的 生 防 潜 能 以 微 生 物 的 自 然 变 易 作 为 基 础 的 筛 选 菌 种 的 机 率 并 不 很 高 因 为 自 发 突 变 率 小, 一 个 基 因 的 自 发 突 变 率 仅 为 10-6 ~10-10 左 右 为 了 加 大 突 变 频 率, 可 采 用 物 理 或 化 学 的 因 素 进 行 诱 发 突 变 物 理 因 素 中 目 前 使 用 得 最 方 便 且 十 分 有 效 是 UV,UV 诱 变 一 般 采 用 15w 的 紫 外 灭 菌 灯, 其 光 谱 比 较 集 中 在 253.7nm 处, 这 与 DNA 的 吸 收 波 长 一 致, 可 引 起 DNA 分 子 结 构 发 生 变 化, 特 别 是 嘧 啶 间 形 成 胸 腺 嘧 啶 二 聚 体, 从 而 引 起 菌 种 的 遗 传 特 性 发 生 变 易 在 生 产 和 科 研 中 可 利 用 此 法 获 得 突 变 株 本 文 介 绍 采 用 紫 外 诱 变 手 段 对 青 枯 雷 尔 氏 菌 FJAT-1458 进 过 处 理, 以 研 究 不 同 紫 外 照 射 时 间 对 青 枯 雷 尔 氏 菌 致 弱 的 影 响 为 紫 外 诱 变 构 建 弱 致 病 力 青 枯 雷 尔 氏 菌 库 奠 定 基 础 2. 试 验 材 料 和 方 法 2.1 试 验 材 料 FJAT-1458 强 致 病 力 青 枯 雷 尔 氏 菌, 超 净 工 作 台, 台 灯, 红 布, 平 板, 涂 布 棒 等 TTC 培 养 基 :10g 蛋 白 胨,1g 水 解 酪 蛋 白,5g 葡 萄 糖,17g 琼 脂,1000mL 蒸 馏 水,pH 值 调 节 到 约 7.4 左 右, 分 装,121 灭 菌 20min 灭 菌 后 当 冷 却 至 55 左 右 加 入 已 灭 菌 的 1% 的 TTC(2,3, 5 氯 化 三 苯 基 四 氮 唑 ) 水 溶 液 其 终 浓 度 为 0.005%, 最 终 ph 值 为 7.2 左 右 2.2 试 验 方 法 2.2.1 悬 液 的 制 备 出 发 菌 株 移 接 新 鲜 TTC 平 板 培 养 基,30 培 养 3d; 将 活 化 后 的 菌 株 接 种 于 液 体 培 养 基,30 150rpm 振 荡 培 养 过 夜 ( 约 18h) 取 4ml 培 养 液 与 5ml 离 心 管 中,10000rpm 离 心 3~5min, 弃 去 上 清 液, 加 4ml 无 菌 0.85% 生 理 盐 水, 重 新 悬 浮 菌 体, 再 离 心, 弃 去 上 清, 重 复 上 述 步 骤 用 生 理 盐 水 恢 复 成 菌 悬 液 ; 将 上 述 菌 悬 液 倒 入 装 有 小 玻 璃 珠 的 无 菌 三 角 瓶 内, 振 荡 20~30min, 以 打 散 细 胞 ; 取 诱 变 前 的 0.5ml 菌 悬 液 进 行 适 当 稀 释 分 离, 取 三 个 合 适 的 稀 释 度 倾 注 肉 汤 平 板, 每 一 梯 度 倾 注 两 皿, 每 皿 加 1ml 菌 液,37 倒 置 培 养 24~36h, 进 行 平 板 菌 落 计 数 2.2.2 UV 诱 变 将 紫 外 灯 打 开, 预 热 30min; 取 直 径 6cm 的 无 菌 培 养 皿 ( 含 转 子 ), 加 入 菌 悬 液 5ml, 控 制 细 胞 密 度 为 10 7 ~10 8 个 /ml; 将 待 处 理 的 培 养 皿 置 于 诱 变 箱 内 的 磁 力 搅 拌 仪 上, 静 止 1 分 钟 后 开 启 磁 力 搅 拌 仪 旋 纽 进 行 搅 拌, 然 后 打 开 皿 盖, 分 别 处 理 35s 照 射 完 毕 后 先 盖 上 皿 盖, 再 关 闭 搅 拌 和 紫 外 灯 ; 菌 液 进 行 适 当 稀 释 分 离, 取 三 个 合 适 的 稀 释 度 倾 注 TTC 平 板 进 行 计 数 ( 避 光 培 养 3d) 2.2.3 数 量 统 计 对 平 板 菌 落 进 行 计 数, 并 计 算 死 亡 率 照 射 前 活 菌 数 / ml 照 射 后 活 菌 数 / ml 死 亡 率 = 100% 照 射 前 活 菌 数 / ml

191 实 验 流 程 图 出 发 菌 株 斜 面 活 化 37,16~24hr 振 荡 培 养 37,110rpm 过 夜 翻 接 37,110rpm 2~4hr 取 4ml 离 心 收 集 菌 体 10000rpm, 5min 弃 上 清 液 悬 浮 沉 淀 于 4ml 无 菌 生 理 盐 水 离 心 10000rpm, 5min 弃 上 清 液 悬 浮 沉 淀 于 4ml 无 菌 生 理 盐 水 离 心 10000rpm, 5min 弃 上 清 液 悬 浮 沉 淀 于 4ml 无 菌 生 理 盐 水 玻 璃 珠 振 荡 20~30min 单 细 胞 菌 悬 液 平 板 菌 落 计 数 UV 诱 变 在 暗 室 中 培 养 3d 平 板 菌 落 计 数 3. 试 验 结 果 3.1 不 同 紫 外 照 射 时 间 对 青 枯 雷 尔 氏 菌 致 死 率 的 影 响 不 同 紫 外 照 射 时 间 对 青 枯 雷 尔 氏 菌 致 死 率 的 影 响 不 同 不 同 紫 外 照 射 时 间 处 理 后,TTC 平 板 上 出 现 的 菌 落 数 在 紫 外 照 射 时 间 为 45s 时, 其 致 死 率 为 82.1% 表 1 不 同 紫 外 照 射 时 间 平 板 菌 落 数 及 其 致 死 率 处 理 时 间 活 菌 含 量 致 死 率 0s 6.3 10 7 0% 15s 4.84 10 7 23.2% 30s 2.22 10 7 64.8% 45s 1.13 10 6 82.1% 60s 7.1 10 2 99.8%

192 100% 99.80% 90% 80% 82.10% 70% 60% 64.80% 致 死 率 50% 40% FJAT-1458 线 性 (FJAT-1458) 30% 20% 23.20% 10% 0% 0% 0s 15s 30s 45s 60s 紫 外 照 射 时 间 图 1 不 同 紫 外 照 射 时 间 处 理 青 枯 雷 尔 氏 菌 致 死 率 曲 线 图 化 青 枯 雷 尔 氏 菌 FJAT-1458 经 过 紫 外 线 照 射 60s 后 的 至 弱 效 果 如 图 2 所 示, 起 菌 落 形 态 无 明 显 变 图 2 青 枯 雷 尔 氏 菌 FJAT-1458 经 过 紫 外 线 后 照 射 至 弱 效 果 4. 试 验 讨 论 本 试 验 研 究 表 明, 青 枯 雷 尔 氏 菌 FJAT-1458 经 过 不 同 时 间 的 紫 外 诱 变, 其 致 死 率 确 实 有 很 大 不 同, 在 紫 外 照 射 时 间 为 45s 时, 其 致 死 率 为 82.1%, 一 般 致 死 率 为 75%-80% 为 最 优 致 死 率, 并 且 根 据 图 1, 我 们 可 以 看 出, 当 照 射 时 间 为 40s 时, 其 致 死 率 就 为 75% 左 右 同 时, 在 不 同 紫 外 照 射 时 间 的 处 理 下, FJAT-1458 的 菌 落 形 态 并 没 有 多 大 的 变 化, 但 是 其 致 病 力 的 强 弱 及 其 定 殖 能 力 并 不 能 够 通 过 菌 落 形 态 来 判 断 需 要 进 一 步 的 致 病 性 试 验 来 验 证 其 致 病 性

193 5 参 考 文 献 试 验 负 责 郑 雪 芳 试 验 人 员 孙 大 光

194 2011-08 承 担 单 位 : 福 建 省 农 科 院 农 业 生 物 资 源 研 究 所 试 验 设 计 : 试 验 项 目 : 师 大 双 安 楼 紫 外 诱 变 青 枯 雷 尔 氏 菌 FJAT-1458 效 果 试 验 人 员 : 孙 大 光 试 验 负 责 : 郑 雪 芳 报 告 日 期 :2011 年 08 月 计 数 月 份 :2011 年 08 月 研 究 资 格 系 数 (0.5-1.0) 实 验 设 计 系 数 (0.9-1.0 0.9-1.0) 报 告 得 分 总 分 实 验 设 计 实 验 记 载 实 验 分 析 实 验 简 报 实 验 文 章 1-20% 21-40% 41-60% 61-80% 81-100% 1%-5% 设 计 不 足, 实 施 错 误 6%-10% 设 计 不 全, 实 验 无 果 11%-15% 设 计 可 以, 实 施 不 全 16%-20% 设 计 完 整, 分 布 实 施 21%-25% 实 验 不 全, 记 载 无 果 26%-30% 实 验 不 足, 记 载 不 全 31%-35% 独 立 实 验, 记 载 不 全 36%-40% 分 布 实 验, 记 载 完 整 41%-45% 目 的 明 确, 实 验 完 成 46%-50% 实 验 完 整, 记 载 清 晰 51%-55% 实 验 系 统, 结 果 可 信 56%-60% 实 验 创 新, 分 析 清 晰 61%-65% 实 验 创 新, 结 论 清 晰 66%-70% 实 验 完 整, 统 计 清 晰 71%-75% 实 验 系 统, 数 据 可 靠 76%-80% 报 告 完 整, 文 章 雏 形 81%-85% 结 构 合 理, 分 析 有 据 86%-90% 逻 辑 清 晰, 统 计 合 理 1458%-95% 图 表 完 整, 写 作 流 畅 96%-100% 文 献 完 整, 发 表 水 平 福 建 省 农 业 科 学 院 农 业 生 物 资 源 研 究 所 农 业 微 生 物 研 究 中 心 电 话 : 051458-87882571, 传 真 : 051458-87882571 fjat.yzxz.com

195 1. 试 验 目 的 番 茄 细 菌 性 青 枯 病 是 由 青 枯 细 菌 ( Ralstonia solanacearum nov. comb) 所 引 起 的 世 界 范 围 发 生 的 重 大 病 害 该 病 害 在 我 国 各 地 区 番 茄 上 都 有 严 重 发 生, 是 番 茄 生 产 上 的 最 重 要 病 害 之 一 目 前 生 产 上 主 要 是 采 用 抗 病 品 种 和 轮 作 套 种 等 农 业 措 施 来 防 治 青 枯 病, 但 由 于 受 到 各 种 条 件 和 原 因 的 限 制, 防 治 效 果 仍 很 不 理 想 迄 今 为 止, 仍 未 有 高 抗 青 枯 病 的 番 茄 品 种 ; 大 量 使 用 化 学 农 药 造 成 环 境 污 染 且 至 今 还 没 有 一 种 化 学 农 药 可 有 效 地 控 制 青 枯 病 的 发 生 因 此 探 索 防 治 青 枯 病 新 方 法 和 新 技 术, 对 防 治 番 茄 青 枯 病 具 有 重 要 的 现 实 意 义 陈 庆 河 等 已 经 探 索 了 无 致 病 力 青 枯 菌 株 防 治 番 茄 青 枯 病 的 生 防 潜 能 以 微 生 物 的 自 然 变 易 作 为 基 础 的 筛 选 菌 种 的 机 率 并 不 很 高 因 为 自 发 突 变 率 小, 一 个 基 因 的 自 发 突 变 率 仅 为 10-6 ~10-10 左 右 为 了 加 大 突 变 频 率, 可 采 用 物 理 或 化 学 的 因 素 进 行 诱 发 突 变 物 理 因 素 中 目 前 使 用 得 最 方 便 且 十 分 有 效 是 UV,UV 诱 变 一 般 采 用 15w 的 紫 外 灭 菌 灯, 其 光 谱 比 较 集 中 在 253.7nm 处, 这 与 DNA 的 吸 收 波 长 一 致, 可 引 起 DNA 分 子 结 构 发 生 变 化, 特 别 是 嘧 啶 间 形 成 胸 腺 嘧 啶 二 聚 体, 从 而 引 起 菌 种 的 遗 传 特 性 发 生 变 易 在 生 产 和 科 研 中 可 利 用 此 法 获 得 突 变 株 本 文 介 绍 采 用 紫 外 诱 变 手 段 对 青 枯 雷 尔 氏 菌 FJAT-1458 进 过 处 理, 以 研 究 不 同 紫 外 照 射 时 间 对 青 枯 雷 尔 氏 菌 致 弱 的 影 响 为 紫 外 诱 变 构 建 弱 致 病 力 青 枯 雷 尔 氏 菌 库 奠 定 基 础 2. 试 验 材 料 和 方 法 2.1 试 验 材 料 FJAT-1458 强 致 病 力 青 枯 雷 尔 氏 菌, 超 净 工 作 台, 台 灯, 红 布, 平 板, 涂 布 棒 等 TTC 培 养 基 :10g 蛋 白 胨,1g 水 解 酪 蛋 白,5g 葡 萄 糖,17g 琼 脂,1000mL 蒸 馏 水,pH 值 调 节 到 约 7.4 左 右, 分 装,121 灭 菌 20min 灭 菌 后 当 冷 却 至 55 左 右 加 入 已 灭 菌 的 1% 的 TTC(2,3, 5 氯 化 三 苯 基 四 氮 唑 ) 水 溶 液 其 终 浓 度 为 0.005%, 最 终 ph 值 为 7.2 左 右 2.2 试 验 方 法 2.2.1 悬 液 的 制 备 出 发 菌 株 移 接 新 鲜 TTC 平 板 培 养 基,30 培 养 3d; 将 活 化 后 的 菌 株 接 种 于 液 体 培 养 基,30 150rpm 振 荡 培 养 过 夜 ( 约 18h) 取 4ml 培 养 液 与 5ml 离 心 管 中,10000rpm 离 心 3~5min, 弃 去 上 清 液, 加 4ml 无 菌 0.85% 生 理 盐 水, 重 新 悬 浮 菌 体, 再 离 心, 弃 去 上 清, 重 复 上 述 步 骤 用 生 理 盐 水 恢 复 成 菌 悬 液 ; 将 上 述 菌 悬 液 倒 入 装 有 小 玻 璃 珠 的 无 菌 三 角 瓶 内, 振 荡 20~30min, 以 打 散 细 胞 ; 取 诱 变 前 的 0.5ml 菌 悬 液 进 行 适 当 稀 释 分 离, 取 三 个 合 适 的 稀 释 度 倾 注 肉 汤 平 板, 每 一 梯 度 倾 注 两 皿, 每 皿 加 1ml 菌 液,37 倒 置 培 养 24~36h, 进 行 平 板 菌 落 计 数 2.2.2 UV 诱 变 将 紫 外 灯 打 开, 预 热 30min; 取 直 径 6cm 的 无 菌 培 养 皿 ( 含 转 子 ), 加 入 菌 悬 液 5ml, 控 制 细 胞 密 度 为 10 7 ~10 8 个 /ml; 将 待 处 理 的 培 养 皿 置 于 诱 变 箱 内 的 磁 力 搅 拌 仪 上, 静 止 1 分 钟 后 开 启 磁 力 搅 拌 仪 旋 纽 进 行 搅 拌, 然 后 打 开 皿 盖, 分 别 处 理 35s 照 射 完 毕 后 先 盖 上 皿 盖, 再 关 闭 搅 拌 和 紫 外 灯 ; 菌 液 进 行 适 当 稀 释 分 离, 取 三 个 合 适 的 稀 释 度 倾 注 TTC 平 板 进 行 计 数 ( 避 光 培 养 3d) 2.2.3 数 量 统 计 对 平 板 菌 落 进 行 计 数, 并 计 算 死 亡 率 照 射 前 活 菌 数 / ml 照 射 后 活 菌 数 / ml 死 亡 率 = 100% 照 射 前 活 菌 数 / ml

196 实 验 流 程 图 出 发 菌 株 斜 面 活 化 37,16~24hr 振 荡 培 养 37,110rpm 过 夜 翻 接 37,110rpm 2~4hr 取 4ml 离 心 收 集 菌 体 10000rpm, 5min 弃 上 清 液 悬 浮 沉 淀 于 4ml 无 菌 生 理 盐 水 离 心 10000rpm, 5min 弃 上 清 液 悬 浮 沉 淀 于 4ml 无 菌 生 理 盐 水 离 心 10000rpm, 5min 弃 上 清 液 悬 浮 沉 淀 于 4ml 无 菌 生 理 盐 水 玻 璃 珠 振 荡 20~30min 单 细 胞 菌 悬 液 平 板 菌 落 计 数 UV 诱 变 40s 在 暗 室 中 培 养 3d 平 板 菌 落 计 数 3. 试 验 结 果 3.1 经 过 40s 紫 外 照 射 后 FJAT-1458 形 态 及 其 筛 选 经 过 紫 外 诱 变,FJAT-1458 其 形 态 并 没 有 发 生 很 大 的 变 化, 并 对 诱 变 后 的 FJAT-1458 进 行 保 种, 命 名 U50-U68

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198 图 1 部 分 紫 外 诱 变 后 FJAT-1458 图 片 4. 试 验 讨 论 本 试 验 研 究 表 明, 青 枯 雷 尔 氏 菌 FJAT-1458 经 过 不 同 时 间 的 紫 外 诱 变, 其 致 死 率 确 实 有 很 大 不 同, 在 紫 外 照 射 时 间 为 45s 时, 其 致 死 率 为 82.1%, 一 般 致 死 率 为 75%-80% 为 最 优 致 死 率, 并 且 根 据 图 1, 我 们 可 以 看 出, 当 照 射 时 间 为 40s 时, 其 致 死 率 就 为 75% 左 右 同 时, 在 不 同 紫 外 照 射 时 间 的 处 理 下, FJAT-1458 的 菌 落 形 态 并 没 有 多 大 的 变 化, 但 是 其 致 病 力 的 强 弱 及 其 定 殖 能 力 并 不 能 够 通 过 菌 落 形 态 来 判 断 需 要 进 一 步 的 致 病 性 试 验 来 验 证 其 致 病 性 5 参 考 文 献 试 验 负 责 郑 雪 芳 试 验 人 员 孙 大 光

199 2011-08 承 担 单 位 : 福 建 省 农 科 院 农 业 生 物 资 源 研 究 所 试 验 设 计 : 试 验 项 目 : 师 大 双 安 楼 紫 外 诱 变 青 枯 雷 尔 氏 菌 FJAT-91 效 果 试 验 人 员 : 孙 大 光 试 验 负 责 : 郑 雪 芳 报 告 日 期 :2011 年 08 月 计 数 月 份 :2011 年 08 月 研 究 资 格 系 数 (0.5-1.0) 实 验 设 计 系 数 (0.9-1.0 0.9-1.0) 报 告 得 分 总 分 实 验 设 计 实 验 记 载 实 验 分 析 实 验 简 报 实 验 文 章 1-20% 21-40% 41-60% 61-80% 81-100% 1%-5% 设 计 不 足, 实 施 错 误 6%-10% 设 计 不 全, 实 验 无 果 11%-15% 设 计 可 以, 实 施 不 全 16%-20% 设 计 完 整, 分 布 实 施 21%-25% 实 验 不 全, 记 载 无 果 26%-30% 实 验 不 足, 记 载 不 全 31%-35% 独 立 实 验, 记 载 不 全 36%-40% 分 布 实 验, 记 载 完 整 41%-45% 目 的 明 确, 实 验 完 成 46%-50% 实 验 完 整, 记 载 清 晰 51%-55% 实 验 系 统, 结 果 可 信 56%-60% 实 验 创 新, 分 析 清 晰 61%-65% 实 验 创 新, 结 论 清 晰 66%-70% 实 验 完 整, 统 计 清 晰 71%-75% 实 验 系 统, 数 据 可 靠 76%-80% 报 告 完 整, 文 章 雏 形 81%-85% 结 构 合 理, 分 析 有 据 86%-90% 逻 辑 清 晰, 统 计 合 理 91%-95% 图 表 完 整, 写 作 流 畅 96%-100% 文 献 完 整, 发 表 水 平 福 建 省 农 业 科 学 院 农 业 生 物 资 源 研 究 所 农 业 微 生 物 研 究 中 心 电 话 : 0591-87882571, 传 真 : 0591-87882571 fjat.yzxz.com

200 1. 试 验 目 的 番 茄 细 菌 性 青 枯 病 是 由 青 枯 细 菌 ( Ralstonia solanacearum nov. comb) 所 引 起 的 世 界 范 围 发 生 的 重 大 病 害 该 病 害 在 我 国 各 地 区 番 茄 上 都 有 严 重 发 生, 是 番 茄 生 产 上 的 最 重 要 病 害 之 一 目 前 生 产 上 主 要 是 采 用 抗 病 品 种 和 轮 作 套 种 等 农 业 措 施 来 防 治 青 枯 病, 但 由 于 受 到 各 种 条 件 和 原 因 的 限 制, 防 治 效 果 仍 很 不 理 想 迄 今 为 止, 仍 未 有 高 抗 青 枯 病 的 番 茄 品 种 ; 大 量 使 用 化 学 农 药 造 成 环 境 污 染 且 至 今 还 没 有 一 种 化 学 农 药 可 有 效 地 控 制 青 枯 病 的 发 生 因 此 探 索 防 治 青 枯 病 新 方 法 和 新 技 术, 对 防 治 番 茄 青 枯 病 具 有 重 要 的 现 实 意 义 陈 庆 河 等 已 经 探 索 了 无 致 病 力 青 枯 菌 株 防 治 番 茄 青 枯 病 的 生 防 潜 能 以 微 生 物 的 自 然 变 易 作 为 基 础 的 筛 选 菌 种 的 机 率 并 不 很 高 因 为 自 发 突 变 率 小, 一 个 基 因 的 自 发 突 变 率 仅 为 10-6 ~10-10 左 右 为 了 加 大 突 变 频 率, 可 采 用 物 理 或 化 学 的 因 素 进 行 诱 发 突 变 物 理 因 素 中 目 前 使 用 得 最 方 便 且 十 分 有 效 是 UV,UV 诱 变 一 般 采 用 15w 的 紫 外 灭 菌 灯, 其 光 谱 比 较 集 中 在 253.7nm 处, 这 与 DNA 的 吸 收 波 长 一 致, 可 引 起 DNA 分 子 结 构 发 生 变 化, 特 别 是 嘧 啶 间 形 成 胸 腺 嘧 啶 二 聚 体, 从 而 引 起 菌 种 的 遗 传 特 性 发 生 变 易 在 生 产 和 科 研 中 可 利 用 此 法 获 得 突 变 株 本 文 介 绍 采 用 紫 外 诱 变 手 段 对 青 枯 雷 尔 氏 菌 FJAT-91 进 过 处 理, 以 研 究 不 同 紫 外 照 射 时 间 对 青 枯 雷 尔 氏 菌 致 弱 的 影 响 为 紫 外 诱 变 构 建 弱 致 病 力 青 枯 雷 尔 氏 菌 库 奠 定 基 础 2. 试 验 材 料 和 方 法 2.1 试 验 材 料 FJAT-91 强 致 病 力 青 枯 雷 尔 氏 菌, 超 净 工 作 台, 台 灯, 红 布, 平 板, 涂 布 棒 等 TTC 培 养 基 :10g 蛋 白 胨,1g 水 解 酪 蛋 白,5g 葡 萄 糖,17g 琼 脂,1000mL 蒸 馏 水,pH 值 调 节 到 约 7.4 左 右, 分 装,121 灭 菌 20min 灭 菌 后 当 冷 却 至 55 左 右 加 入 已 灭 菌 的 1% 的 TTC(2,3,5 氯 化 三 苯 基 四 氮 唑 ) 水 溶 液 其 终 浓 度 为 0.005%, 最 终 ph 值 为 7.2 左 右 2.2 试 验 方 法 2.2.1 悬 液 的 制 备 出 发 菌 株 移 接 新 鲜 TTC 平 板 培 养 基,30 培 养 3d; 将 活 化 后 的 菌 株 接 种 于 液 体 培 养 基,30 150rpm 振 荡 培 养 过 夜 ( 约 18h) 取 4ml 培 养 液 与 5ml 离 心 管 中,10000rpm 离 心 3~5min, 弃 去 上 清 液, 加 4ml 无 菌 0.85% 生 理 盐 水, 重 新 悬 浮 菌 体, 再 离 心, 弃 去 上 清, 重 复 上 述 步 骤 用 生 理 盐 水 恢 复 成 菌 悬 液 ; 将 上 述 菌 悬 液 倒 入 装 有 小 玻 璃 珠 的 无 菌 三 角 瓶 内, 振 荡 20~30min, 以 打 散 细 胞 ; 取 诱 变 前 的 0.5ml 菌 悬 液 进 行 适 当 稀 释 分 离, 取 三 个 合 适 的 稀 释 度 倾 注 肉 汤 平 板, 每 一 梯 度 倾 注 两 皿, 每 皿 加 1ml 菌 液,37 倒 置 培 养 24~36h, 进 行 平 板 菌 落 计 数 2.2.2UV 诱 变 将 紫 外 灯 打 开, 预 热 30min; 取 直 径 6cm 的 无 菌 培 养 皿 ( 含 转 子 ), 加 入 菌 悬 液 5ml, 控 制 细 胞 密 度 为 10 7 ~10 8 个 /ml; 将 待 处 理 的 培 养 皿 置 于 诱 变 箱 内 的 磁 力 搅 拌 仪 上, 静 止 1 分 钟 后 开 启 磁 力 搅 拌 仪 旋 纽 进 行 搅 拌, 然 后 打 开 皿 盖, 分 别 处 理 35s 照 射 完 毕 后 先 盖 上 皿 盖, 再 关 闭 搅 拌 和 紫 外 灯 ; 菌 液 进 行 适 当 稀 释 分 离, 取 三 个 合 适 的 稀 释 度 倾 注 TTC 平 板 进 行 计 数 ( 避 光 培 养 3d) 2.2.3 数 量 统 计 对 平 板 菌 落 进 行 计 数, 并 计 算 死 亡 率 照 射 前 活 菌 数 / ml 照 射 后 活 菌 数 / ml 死 亡 率 = 100% 照 射 前 活 菌 数 / ml

201 实 验 流 程 图 出 发 菌 株 斜 面 活 化 37,16~24hr 振 荡 培 养 37,110rpm 过 夜 翻 接 37,110rpm 2~4hr 取 4ml 离 心 收 集 菌 体 10000rpm, 5min 弃 上 清 液 悬 浮 沉 淀 于 4ml 无 菌 生 理 盐 水 离 心 10000rpm, 5min 弃 上 清 液 悬 浮 沉 淀 于 4ml 无 菌 生 理 盐 水 离 心 10000rpm, 5min 弃 上 清 液 悬 浮 沉 淀 于 4ml 无 菌 生 理 盐 水 玻 璃 珠 振 荡 20~30min 单 细 胞 菌 悬 液 平 板 菌 落 计 数 UV 诱 变 40s 在 暗 室 中 培 养 3d 平 板 菌 落 计 数 3. 试 验 结 果 3.1 经 过 40s 紫 外 照 射 后 FJAT-91 形 态 及 其 筛 选 经 过 紫 外 诱 变,FJAT-91 其 形 态 并 没 有 发 生 很 大 的 变 化, 并 对 诱 变 后 的 FJAT-91 进 行 保 种, 命 名 U50-U68

202 图 1 部 分 紫 外 诱 变 后 FJAT-91 图 片 4. 试 验 讨 论 本 试 验 研 究 表 明, 青 枯 雷 尔 氏 菌 FJAT-91 经 过 不 同 时 间 的 紫 外 诱 变, 其 致 死 率 确 实 有 很 大 不 同, 在 紫 外 照 射 时 间 为 45s 时, 其 致 死 率 为 82.1%, 一 般 致 死 率 为 75%-80% 为 最 优 致 死 率, 并 且 根 据 图 1, 我 们 可 以 看 出, 当 照 射 时 间 为 40s 时, 其 致 死 率 就 为 75% 左 右 同 时, 在 不 同 紫 外 照 射 时 间 的 处 理 下,FJAT-91 的 菌 落 形 态 并 没 有 多 大 的 变 化, 但 是 其 致 病 力 的 强 弱 及 其 定 殖 能 力 并 不 能 够 通 过 菌 落 形 态 来 判 断 需 要 进 一 步 的 致 病 性 试 验 来 验 证 其 致 病 性 5 参 考 文 献 试 验 负 责 郑 雪 芳 试 验 人 员 孙 大 光

203 2011-08 承 担 单 位 : 福 建 省 农 科 院 农 业 生 物 资 源 研 究 所 试 验 设 计 : 试 验 项 目 : 师 大 双 安 楼 紫 外 诱 变 青 枯 雷 尔 氏 菌 FJAT-91 致 死 率 摸 索 试 验 人 员 : 孙 大 光 试 验 负 责 : 郑 雪 芳 报 告 日 期 :2011 年 08 月 计 数 月 份 :2011 年 08 月 研 究 资 格 系 数 (0.5-1.0) 实 验 设 计 系 数 (0.9-1.0 0.9-1.0) 报 告 得 分 总 分 实 验 设 计 实 验 记 载 实 验 分 析 实 验 简 报 实 验 文 章 1-20% 21-40% 41-60% 61-80% 81-100% 1%-5% 设 计 不 足, 实 施 错 误 6%-10% 设 计 不 全, 实 验 无 果 11%-15% 设 计 可 以, 实 施 不 全 16%-20% 设 计 完 整, 分 布 实 施 21%-25% 实 验 不 全, 记 载 无 果 26%-30% 实 验 不 足, 记 载 不 全 31%-35% 独 立 实 验, 记 载 不 全 36%-40% 分 布 实 验, 记 载 完 整 41%-45% 目 的 明 确, 实 验 完 成 46%-50% 实 验 完 整, 记 载 清 晰 51%-55% 实 验 系 统, 结 果 可 信 56%-60% 实 验 创 新, 分 析 清 晰 61%-65% 实 验 创 新, 结 论 清 晰 66%-70% 实 验 完 整, 统 计 清 晰 71%-75% 实 验 系 统, 数 据 可 靠 76%-80% 报 告 完 整, 文 章 雏 形 81%-85% 结 构 合 理, 分 析 有 据 86%-90% 逻 辑 清 晰, 统 计 合 理 91%-95% 图 表 完 整, 写 作 流 畅 96%-100% 文 献 完 整, 发 表 水 平 福 建 省 农 业 科 学 院 农 业 生 物 资 源 研 究 所 农 业 微 生 物 研 究 中 心 电 话 : 0591-87882571, 传 真 : 0591-87882571 fjat.yzxz.com

204 1. 试 验 目 的 番 茄 细 菌 性 青 枯 病 是 由 青 枯 细 菌 ( Ralstonia solanacearum nov. comb) 所 引 起 的 世 界 范 围 发 生 的 重 大 病 害 该 病 害 在 我 国 各 地 区 番 茄 上 都 有 严 重 发 生, 是 番 茄 生 产 上 的 最 重 要 病 害 之 一 目 前 生 产 上 主 要 是 采 用 抗 病 品 种 和 轮 作 套 种 等 农 业 措 施 来 防 治 青 枯 病, 但 由 于 受 到 各 种 条 件 和 原 因 的 限 制, 防 治 效 果 仍 很 不 理 想 迄 今 为 止, 仍 未 有 高 抗 青 枯 病 的 番 茄 品 种 ; 大 量 使 用 化 学 农 药 造 成 环 境 污 染 且 至 今 还 没 有 一 种 化 学 农 药 可 有 效 地 控 制 青 枯 病 的 发 生 因 此 探 索 防 治 青 枯 病 新 方 法 和 新 技 术, 对 防 治 番 茄 青 枯 病 具 有 重 要 的 现 实 意 义 陈 庆 河 等 已 经 探 索 了 无 致 病 力 青 枯 菌 株 防 治 番 茄 青 枯 病 的 生 防 潜 能 以 微 生 物 的 自 然 变 易 作 为 基 础 的 筛 选 菌 种 的 机 率 并 不 很 高 因 为 自 发 突 变 率 小, 一 个 基 因 的 自 发 突 变 率 仅 为 10-6 ~10-10 左 右 为 了 加 大 突 变 频 率, 可 采 用 物 理 或 化 学 的 因 素 进 行 诱 发 突 变 物 理 因 素 中 目 前 使 用 得 最 方 便 且 十 分 有 效 是 UV,UV 诱 变 一 般 采 用 15w 的 紫 外 灭 菌 灯, 其 光 谱 比 较 集 中 在 253.7nm 处, 这 与 DNA 的 吸 收 波 长 一 致, 可 引 起 DNA 分 子 结 构 发 生 变 化, 特 别 是 嘧 啶 间 形 成 胸 腺 嘧 啶 二 聚 体, 从 而 引 起 菌 种 的 遗 传 特 性 发 生 变 易 在 生 产 和 科 研 中 可 利 用 此 法 获 得 突 变 株 本 文 介 绍 采 用 紫 外 诱 变 手 段 对 青 枯 雷 尔 氏 菌 FJAT-91 进 过 处 理, 以 研 究 不 同 紫 外 照 射 时 间 对 青 枯 雷 尔 氏 菌 致 弱 的 影 响 为 紫 外 诱 变 构 建 弱 致 病 力 青 枯 雷 尔 氏 菌 库 奠 定 基 础 2. 试 验 材 料 和 方 法 2.1 试 验 材 料 FJAT-91 强 致 病 力 青 枯 雷 尔 氏 菌, 超 净 工 作 台, 台 灯, 红 布, 平 板, 涂 布 棒 等 TTC 培 养 基 :10g 蛋 白 胨,1g 水 解 酪 蛋 白,5g 葡 萄 糖,17g 琼 脂,1000mL 蒸 馏 水,pH 值 调 节 到 约 7.4 左 右, 分 装,121 灭 菌 20min 灭 菌 后 当 冷 却 至 55 左 右 加 入 已 灭 菌 的 1% 的 TTC(2,3,5 氯 化 三 苯 基 四 氮 唑 ) 水 溶 液 其 终 浓 度 为 0.005%, 最 终 ph 值 为 7.2 左 右 2.2 试 验 方 法 2.2.1 悬 液 的 制 备 出 发 菌 株 移 接 新 鲜 TTC 平 板 培 养 基,30 培 养 3d; 将 活 化 后 的 菌 株 接 种 于 液 体 培 养 基,30 150rpm 振 荡 培 养 过 夜 ( 约 18h) 取 4ml 培 养 液 与 5ml 离 心 管 中,10000rpm 离 心 3~5min, 弃 去 上 清 液, 加 4ml 无 菌 0.85% 生 理 盐 水, 重 新 悬 浮 菌 体, 再 离 心, 弃 去 上 清, 重 复 上 述 步 骤 用 生 理 盐 水 恢 复 成 菌 悬 液 ; 将 上 述 菌 悬 液 倒 入 装 有 小 玻 璃 珠 的 无 菌 三 角 瓶 内, 振 荡 20~30min, 以 打 散 细 胞 ; 取 诱 变 前 的 0.5ml 菌 悬 液 进 行 适 当 稀 释 分 离, 取 三 个 合 适 的 稀 释 度 倾 注 肉 汤 平 板, 每 一 梯 度 倾 注 两 皿, 每 皿 加 1ml 菌 液,37 倒 置 培 养 24~36h, 进 行 平 板 菌 落 计 数 2.2.2UV 诱 变 将 紫 外 灯 打 开, 预 热 30min; 取 直 径 6cm 的 无 菌 培 养 皿 ( 含 转 子 ), 加 入 菌 悬 液 5ml, 控 制 细 胞 密 度 为 10 7 ~10 8 个 /ml; 将 待 处 理 的 培 养 皿 置 于 诱 变 箱 内 的 磁 力 搅 拌 仪 上, 静 止 1 分 钟 后 开 启 磁 力 搅 拌 仪 旋 纽 进 行 搅 拌, 然 后 打 开 皿 盖, 分 别 处 理 35s 照 射 完 毕 后 先 盖 上 皿 盖, 再 关 闭 搅 拌 和 紫 外 灯 ; 菌 液 进 行 适 当 稀 释 分 离, 取 三 个 合 适 的 稀 释 度 倾 注 TTC 平 板 进 行 计 数 ( 避 光 培 养 3d) 2.2.3 数 量 统 计 对 平 板 菌 落 进 行 计 数, 并 计 算 死 亡 率 照 射 前 活 菌 数 / ml 照 射 后 活 菌 数 / ml 死 亡 率 = 100% 照 射 前 活 菌 数 / ml

205 实 验 流 程 图 出 发 菌 株 斜 面 活 化 37,16~24hr 振 荡 培 养 37,110rpm 过 夜 翻 接 37,110rpm 2~4hr 取 4ml 离 心 收 集 菌 体 10000rpm, 5min 弃 上 清 液 悬 浮 沉 淀 于 4ml 无 菌 生 理 盐 水 离 心 10000rpm, 5min 弃 上 清 液 悬 浮 沉 淀 于 4ml 无 菌 生 理 盐 水 离 心 10000rpm, 5min 弃 上 清 液 悬 浮 沉 淀 于 4ml 无 菌 生 理 盐 水 玻 璃 珠 振 荡 20~30min 单 细 胞 菌 悬 液 平 板 菌 落 计 数 UV 诱 变 在 暗 室 中 培 养 3d 平 板 菌 落 计 数 3. 试 验 结 果 3.1 不 同 紫 外 照 射 时 间 对 青 枯 雷 尔 氏 菌 致 死 率 的 影 响 不 同 紫 外 照 射 时 间 对 青 枯 雷 尔 氏 菌 致 死 率 的 影 响 不 同 不 同 紫 外 照 射 时 间 处 理 后,TTC 平 板 上 出 现 的 菌 落 数 在 紫 外 照 射 时 间 为 45s 时, 其 致 死 率 为 83.4%

206 表 1 不 同 紫 外 照 射 时 间 平 板 菌 落 数 及 其 致 死 率 处 理 时 间 活 菌 含 量 致 死 率 0s 3.1 10 7 0% 15s 2.84 10 7 8.3% 30s 1.22 10 7 60.6% 45s 5.13 10 6 83.4% 60s 2.1 10 2 99.8% 100% 99.80% 80% 83.40% 60% 60.60% 致 死 率 40% 20% 0% -20% 8.30% 0% 0s 15s 30s 45s 60s 紫 外 照 射 时 间 图 1 不 同 紫 外 照 射 时 间 处 理 青 枯 雷 尔 氏 菌 致 死 率 曲 线 图 FJAT-91 线 性 (FJAT-91) 3.2 青 枯 雷 尔 氏 菌 FJAT-91 紫 外 诱 变 后 的 至 弱 效 果 青 枯 雷 尔 氏 菌 FJAT-91 经 过 紫 外 线 照 射 30s 后 的 至 弱 效 果 如 图 2 所 示, 菌 落 由 粉 红 表 面 突 起 湿 润 边 缘 有 白 色 圈, 变 为 深 红 表 面 干 燥 边 缘 无 白 圈 图 2 青 枯 雷 尔 氏 菌 FJAT-91 经 过 紫 外 线 后 照 射 至 弱 效 果

207 4. 试 验 讨 论 本 试 验 研 究 表 明, 青 枯 雷 尔 氏 菌 FJAT-91 经 过 不 同 时 间 的 紫 外 诱 变, 其 致 死 率 确 实 有 很 大 不 同, 在 紫 外 照 射 时 间 为 45s 时, 其 致 死 率 为 83.4%, 一 般 致 死 率 为 75%-80% 为 最 优 致 死 率, 并 且 根 据 图 1, 我 们 可 以 看 出, 当 照 射 时 间 为 40s 时, 其 致 死 率 就 为 75% 左 右 同 时, 当 照 射 时 间 为 30s 的 时 候, 强 制 病 青 枯 雷 尔 氏 菌 FJAT-91 号 菌 株 的 至 弱 现 象 比 较 明 显, 从 菌 落 形 态 上 可 以 初 步 判 断 经 过 紫 外 照 射 后 确 实 有 弱 致 病 力 菌 株 的 形 成 有 待 进 一 步 的 验 证 其 致 病 力 5 参 考 文 献 试 验 负 责 郑 雪 芳 试 验 人 员 孙 大 光

208 2011-08-05 承 担 单 位 : 福 建 省 农 科 院 农 业 生 物 资 源 研 究 所 试 验 设 计 : 试 验 项 目 : 青 枯 雷 尔 氏 菌 transposase 验 证 (RS982695) 试 验 人 员 : 林 海 云 试 验 负 责 : 车 建 美 刘 波 报 告 日 期 :2011-8-05 计 数 月 份 :2011 年 08 月 研 究 资 格 系 数 (0.5-1.0) 实 验 设 计 系 数 (0.9-1.0 0.9-1.0) 报 告 得 分 总 分 实 验 设 计 实 验 记 载 实 验 分 析 实 验 简 报 实 验 文 章 1-20% 21-40% 41-60% 61-80% 81-100% 1%-5% 设 计 不 足, 实 施 错 误 6%-10% 设 计 不 全, 实 验 无 果 11%-15% 设 计 可 以, 实 施 不 全 16%-20% 设 计 完 整, 分 布 实 施 21%-25% 实 验 不 全, 记 载 无 果 26%-30% 实 验 不 足, 记 载 不 全 31%-35% 独 立 实 验, 记 载 不 全 36%-40% 分 布 实 验, 记 载 完 整 41%-45% 目 的 明 确, 实 验 完 成 46%-50% 实 验 完 整, 记 载 清 晰 51%-55% 实 验 系 统, 结 果 可 信 56%-60% 实 验 创 新, 分 析 清 晰 61%-65% 实 验 创 新, 结 论 清 晰 66%-70% 实 验 完 整, 统 计 清 晰 71%-75% 实 验 系 统, 数 据 可 靠 76%-80% 报 告 完 整, 文 章 雏 形 81%-85% 结 构 合 理, 分 析 有 据 86%-90% 逻 辑 清 晰, 统 计 合 理 91%-95% 图 表 完 整, 写 作 流 畅 96%-100% 文 献 完 整, 发 表 水 平 福 建 省 农 业 科 学 院 农 业 生 物 资 源 研 究 所 农 业 微 生 物 研 究 中 心 电 话 : 0591-87882571, 传 真 : 0591-87882571 fjat.yzxz.com

209 1. 试 验 目 的 细 菌 性 青 枯 病 是 由 青 枯 雷 尔 氏 菌 引 起 的 一 种 重 要 土 传 植 物 病 害, 侵 染 寄 主 范 围 很 广 (Remenant, 2010), 据 报 道 青 枯 病 原 菌 可 侵 染 50 多 个 科 数 百 种 植 物, 包 括 花 生 番 茄 茄 子 和 辣 椒 等 经 济 作 物, 并 且 近 年 来 青 枯 病 在 中 国 继 续 加 重, 新 的 寄 主 也 在 不 断 地 被 发 现 ( 石 元 春, 2002), 其 中 茄 科 植 物 受 青 枯 病 危 害 最 重, 涉 及 的 作 物 种 类 最 多 ( 杨 玉 红, 2008) 青 枯 病 原 菌 是 一 个 复 杂 的 群 体, 在 寄 主 范 围 生 化 型 致 病 力 和 血 清 型 等 细 菌 学 特 性 上 差 异 很 大, 这 导 致 其 病 害 防 治 较 为 困 难, 使 其 成 为 世 界 上 危 害 最 大 分 布 最 广 和 造 成 损 失 最 为 严 重 的 植 物 病 害 之 一 ( 卫 红 萍, 2010) ; 由 于 青 枯 雷 尔 氏 菌 的 复 杂 性, 导 致 其 致 病 机 制 也 十 分 复 杂, 只 有 通 过 对 青 枯 雷 尔 氏 菌 致 病 机 制 的 更 深 入 地 研 究, 才 有 可 能 找 到 控 制 它 的 有 效 方 法 本 实 验 室 已 对 强 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 FJAT-91 和 弱 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 FJAT-1458 测 通 其 全 序 列, 测 序 结 果 分 析 可 知, 强 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 FJAT-91 和 弱 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 FJAT-1458 存 在 一 系 列 差 异 基 因, 其 中 在 强 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 FJAT-91 存 在 的 基 因 而 在 弱 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 FJAT-1458 不 存 在 的 基 因 有 225 个 ( 强 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 FJAT-91 特 异 性 获 得 基 因 ), 而 在 弱 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 FJAT-1458 存 在 而 在 强 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 不 存 在 的 基 因 有 360 个 ( 弱 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 特 异 性 获 得 基 因 ) 本 试 验 基 于 弱 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 FJAT-1458 特 异 性 获 得 基 因 transposase( 转 座 酶 ), 其 主 要 功 能 是 催 化 转 座 子 插 入 新 位 点, 该 基 因 在 本 试 验 中 的 编 号 为 RS98orf02695, 该 基 因 全 长 为 1326 bp, 本 试 验 基 于 批 处 理 软 件 设 计 了 一 对 引 物 (RS982695-1 和 RS9826953-2), 该 对 引 物 可 在 弱 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 FJAT-1458 扩 增 出 300 bp 目 的 条 带, 而 在 强 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 FJAT-91 不 能 扩 增 出 条 带 ( 已 在 梯 度 试 验 中 验 证 ), 本 试 验 利 用 该 对 引 物 对 菌 种 库 中 所 有 青 枯 雷 尔 氏 菌, 以 验 证 该 基 因 是 否 只 在 弱 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 存 在, 而 在 强 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 不 存 在? 以 进 一 步 对 青 枯 雷 尔 氏 菌 致 病 机 制 进 行 探 索 2. 试 验 方 法 2.1 试 验 材 料 2.1.1 菌 株 : 试 验 菌 株 及 来 源 见 表 1 表 1 菌 株 以 及 来 源 菌 株 编 号 名 称 来 源 物 种 分 离 基 物 菌 株 原 产 地 49 Rs-F.1.1-010615-04V 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 福 州 建 新 54 Rs-F.1.3-010702-09V 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 福 州 北 峰 80 Rs-F.1.3-010702-01V-f2 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 福 州 北 峰 81 Rs-F.1.3-010702-01V-f3 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 福 州 北 峰 91 Rs-F.1.3-010702-01V-f13 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 福 州 北 峰 442 Rs-F.352300-060722-5-1-1 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 宁 德 屏 南 443 Rs-F.352300-060722-5-1-2 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 宁 德 屏 南 445 Rs-F.352300-060722-5-2-2 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 宁 德 屏 南 447 Rs-F.352300-060722-6-1-2 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 宁 德 屏 南 448 Rs-F.352300-060722-6-2-1 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 宁 德 屏 南 449 Rs-F.352300-060722-6-2-2 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 宁 德 屏 南

210 450 Rs-F.352300-060722-7-1 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 宁 德 屏 南 451 Rs-F.352300-060722-7-2 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 宁 德 屏 南 1300 Rs-F.350112-070612-V2 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 福 州 营 口 1301 Rs-F.350112-070612-V3 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 福 州 营 口 1302 Rs-F.350112-070612-V4 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 福 州 营 口 1303 Rs-F.350112-070612-V5 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 福 州 营 口 1304 Rs-F.350112-070612-V6 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 福 州 营 口 1466 RSF-V-109 自 己 分 离 番 茄 根 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1468 RSF-V-117 自 己 分 离 番 茄 根 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1469 RSF-V-121 自 己 分 离 番 茄 根 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1470 RSF-V-125 自 己 分 离 番 茄 根 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1471 RSF-V-129 自 己 分 离 番 茄 根 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1445 RSF-V-14 自 己 分 离 番 茄 茎 基 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1446 RSF-V-99 自 己 分 离 番 茄 茎 基 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1447 RSF-V-100 自 己 分 离 番 茄 茎 基 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1448 RSF-V-103 自 己 分 离 番 茄 茎 基 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1449 RSF-V-106 自 己 分 离 番 茄 茎 基 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1452 RSF-A-26 自 己 分 离 番 茄 茎 中 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1453 RSF-A-27 自 己 分 离 番 茄 茎 中 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1454 RSF-A-30 自 己 分 离 番 茄 茎 中 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1455 RSF-A-31 自 己 分 离 番 茄 茎 中 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1457 RSF-V-97 自 己 分 离 番 茄 茎 中 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1458 RSF-A-98 自 己 分 离 番 茄 茎 中 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1459 RSF-V-102 自 己 分 离 番 茄 茎 中 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1460 RSF-V-115 自 己 分 离 番 茄 茎 中 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1461 RSF-V-116 自 己 分 离 番 茄 茎 中 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1462 RSF-V-119 自 己 分 离 番 茄 茎 中 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1463 RSF-V-122 自 己 分 离 番 茄 茎 中 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1473 RSF-V-111 自 己 分 离 番 茄 茎 中 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 青 枯 病 植 株 1102 Rs-F.351144-060928-14V 自 己 分 离 番 茄 1101 Rs-F.351144-060928-13V 自 己 分 离 番 茄 茎 顶 部 青 枯 病 植 株 茎 中 部 莆 田 东 洋 镇 莆 田 东 洋 镇 427 Rs-P.362200-060707-1-1 自 己 分 离 花 生 花 生 植 株 泉 州 晋 江 428 Rs-P.362200-060707-1-2 自 己 分 离 花 生 花 生 植 株 泉 州 晋 江

211 430 Rs-P.362200-060707-2-1 自 己 分 离 花 生 花 生 植 株 泉 州 晋 江 433 Rs-P.362200-060707-3-1 自 己 分 离 花 生 花 生 植 株 泉 州 晋 江 434 Rs-P.362200-060707-3-2 自 己 分 离 花 生 花 生 植 株 泉 州 晋 江 435 Rs-P.362200-060707-3-3 自 己 分 离 花 生 花 生 植 株 泉 州 晋 江 437 Rs-P.362200-060707-4-2 自 己 分 离 花 生 花 生 植 株 泉 州 晋 江 440 Rs-P.362200-060707-5-2 自 己 分 离 花 生 花 生 植 株 泉 州 晋 江 441 Rs-P.362200-060707-5-3 自 己 分 离 花 生 花 生 植 株 泉 州 晋 江 1441 RSJ-79-A 自 己 分 离 姜 茎 基 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1442 RSJ-86-A 自 己 分 离 姜 茎 基 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1443 RSJ-87-V 自 己 分 离 姜 茎 基 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1444 RSJ-88-A 自 己 分 离 姜 茎 基 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 74 Rs-L.1.4-010704-01V 自 己 分 离 辣 椒 辣 椒 植 株 福 州 永 泰 459 Rs-L.352300-060722-14-1-1 自 己 分 离 辣 椒 辣 椒 植 株 宁 德 屏 南 461 Rs-L.352300-060722-14-2-1 自 己 分 离 辣 椒 辣 椒 植 株 宁 德 屏 南 462 Rs-L.352300-060722-14-2-2 自 己 分 离 辣 椒 辣 椒 植 株 宁 德 屏 南 465 Rs-L.352300-060722-16-1-1 自 己 分 离 辣 椒 辣 椒 植 株 宁 德 屏 南 466 Rs-L.352300-060722-16-1-2 自 己 分 离 辣 椒 辣 椒 植 株 宁 德 屏 南 468 Rs-L.352300-060722-16-2-2 自 己 分 离 辣 椒 辣 椒 植 株 宁 德 屏 南 470 Rs-L.352300-060722-17-1-2 自 己 分 离 辣 椒 辣 椒 植 株 宁 德 屏 南 469 Eb-L.352300-060722-17-1-1 (Vibrio-hollisae) 自 己 分 离 辣 椒 辣 椒 植 株 宁 德 屏 南 472 Rs-L.352300-060722-17-2-2 自 己 分 离 辣 椒 辣 椒 植 株 宁 德 屏 南 473 Rs-L.352300-060722-18-1 自 己 分 离 辣 椒 辣 椒 植 株 宁 德 屏 南 474 Rs-L.352300-060722-18-2-1 自 己 分 离 辣 椒 辣 椒 植 株 宁 德 屏 南 475 Rs-L.352300-060722-18-2-2 自 己 分 离 辣 椒 辣 椒 植 株 宁 德 屏 南 476 Rs-L.352300-060722-20-1 自 己 分 离 辣 椒 辣 椒 植 株 宁 德 屏 南 健 康 植 株 根 1103 Rs-Q.351144-061019-01V 自 己 分 离 茄 子 部 莆 田 东 洋 镇 1307 Rs-Q.350112-070628-11V 自 己 分 离 茄 子 茄 子 - 根 福 州 营 口 70 Rs-Q.1.3-020626-5V 自 己 分 离 茄 子 茄 子 植 株 福 州 北 峰 73 Rs-Q.9.2-010620-V 自 己 分 离 茄 子 茄 子 植 株 南 平 452 Rs-Q.352300-060722-8-1-1 自 己 分 离 茄 子 茄 子 植 株 宁 德 屏 南 453 Rs-Q.352300-060722-8-2-1 自 己 分 离 茄 子 茄 子 植 株 宁 德 屏 南 454 Rs-Q.352300-060722-8-2-2 自 己 分 离 茄 子 茄 子 植 株 宁 德 屏 南 456 Rs-Q.352300-060722-9-1-2 自 己 分 离 茄 子 茄 子 植 株 宁 德 屏 南

212 458 Rs-Q.352300-060722-9-2-2 自 己 分 离 茄 子 茄 子 植 株 宁 德 屏 南 青 枯 病 植 株 1115 Rs-Q.351144-061107-11V 自 己 分 离 茄 子 1116 Rs-Q.351144-061107-12V 自 己 分 离 茄 子 1112 Rs-Q.351144-061024-12V 自 己 分 离 茄 子 根 部 青 枯 病 植 株 茎 基 部 青 枯 病 植 株 茎 基 部 莆 田 东 洋 镇 莆 田 东 洋 镇 莆 田 东 洋 镇 77 Rs-J.1.4-010704-01V 自 己 分 离 生 姜 生 姜 植 株 福 州 永 泰 78 Rs-J.1.4-010704-02A 自 己 分 离 生 姜 生 姜 植 株 福 州 永 泰 1231 Rs91-2-4# 自 己 分 离 培 养 基 本 实 验 室 1232 Rs91-3-5# 自 己 分 离 培 养 基 本 实 验 室 2.1.2 试 剂 与 仪 器 (1) 试 剂 ddw;dntp 购 自 福 州 博 海 生 物 技 术 有 限 公 司 ;Buffer,Taq 酶 购 自 北 京 天 根 生 化 科 技 有 限 公 司 ; 上 游 引 物 RS982695-1:5 -GGT GGA GTT GAT CGA CTG GT-3, 下 游 引 物 RS982695-2:5 -CGC TTG TTC ATC AGC AGG TA-3, 引 物 购 自 上 海 博 尚 有 限 公 司 ; 已 稀 释 青 枯 雷 尔 氏 菌 DNA 产 物 ;1500 bp Maker 购 自 上 海 英 竣 生 物 技 术 公 司 (2) 仪 器 UVP 凝 胶 成 像 仪 ;Biometra 梯 度 PCR 仪 ;BIO-RAD 电 泳 仪 ; 2.2 试 验 方 法 (1) 扩 增 体 系 ddw:18.7 μl ; Buffer:2.5 μl; dntp:0.5 μl; RS982695-1:1 μl; RS982695-2:1 μl; Taq:0.3 μl; DNA:1 μl (2)PCR 程 序 95 C, 预 变 性 5 min; 然 后 95 C 变 性 30 s,62 C 退 火 30 s,72 C 延 伸 1 min, 进 行 30 个 循 环 ; 最 后 72 C 7 min PCR 产 物 可 在 4 C 保 存 (3) 电 泳 采 用 的 1.5% 胶 浓 度, 上 样 量 为 7 μl, 电 压 为 100 V; 凝 胶 成 像 观 测 PCR 结 果 3 试 验 结 果 3.1 transposase 序 列 PCR 扩 增 结 果 试 验 结 果 见 图 1-4 由 PCR 扩 增 结 果 可 以 看 出, 菌 株 编 号 FJAT-447 FJAT-448 FJAT-449 FJAT-1466 FJAT-1468 FJAT-1469 FJAT-1470 FJAT-1471 FJAT-1445 FJAT-1446 FJAT-1447

213 FJAT-1448 FJAT-1449 FJAT-1452 FJAT-1453 FJAT-1454 FJAT-1455 FJAT-1457 FJAT-1458 FJAT-1459 FJAT-1460 FJAT-1461 FJAT-1462 FJAT-1463 FJAT-1473 FJAT-427 FJAT-428 FJAT-1441 FJAT-1442 FJAT-1443 FJAT-1444 FJAT-459 FJAT-461 FJAT-462 FJAT-465 FJAT-468 FJAT-469 FJAT-470 FJAT-472 FJAT-473 FJAT-474 FJAT-475 FJAT-476 FJAT-452 FJAT-456 FJAT-458 FJAT-1112 FJAT-77 和 FJAT-78 通 过 该 引 物 在 近 300 bp 处 出 现 单 一 条 带, 并 且 这 些 菌 株 只 有 FJAT-1303 FJAT-1452 FJAT-1453 FJAT-1458 FJAT-1463 FJAT-1112 FJAT-1443 FJAT-1444 FJAT-476 和 FJAT-469 在 形 态 上 是 属 于 弱 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌, 其 他 的 均 为 强 致 病 青 枯 雷 尔 氏 菌 其 余 的 菌 株 均 在 未 出 现 条 带, 其 中 FJAT-54 为 弱 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌, 其 余 的 强 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 图 1 不 同 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 在 引 物 RS982695PCR 扩 增 结 果 (1) 图 2 不 同 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 在 引 物 RS982695PCR 扩 增 结 果 (2) 图 3 不 同 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 在 引 物 RS982695PCR 扩 增 结 果 (3)

214 图 4 不 同 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 在 引 物 RS982695 PCR 扩 增 结 果 (4) 3.2 transposase 序 列 PCR 结 果 综 合 分 析 transposase 序 列 PCR 结 果 综 合 分 析 结 果 见 表 2 在 含 有 transposase 序 列 的 48 株 青 枯 雷 尔 氏 菌 中, 其 中 弱 化 指 数 在 强 致 病 性 区 域 24 株 青 枯 雷 尔 氏 菌 中 共 有 13 株 菌 株 含 有 transposase 序 列, 弱 化 指 数 在 过 渡 区 域 31 株 青 枯 雷 尔 氏 菌 中 共 有 20 株 菌 株 含 有 transposase 序 列, 弱 化 指 数 在 弱 致 病 性 区 域 29 株 青 枯 雷 尔 氏 菌 中 共 有 15 株 菌 株 含 有 transposase 序 列 表 2 transposase PCR 结 果 中 有 目 标 条 带 菌 株 综 合 结 果 菌 株 编 号 寄 主 菌 株 原 产 地 平 均 值 类 群 强 弱 判 断 是 否 有 条 带 FJAT-1455 番 茄 南 平 建 瓯 0.522 V + FJAT-1101 番 茄 莆 田 莆 田 0.581 V - FJAT-0475 辣 椒 宁 德 屏 南 0.591 V + FJAT-1469 番 茄 南 平 建 瓯 0.594 V + FJAT-1459 番 茄 南 平 建 瓯 0.640 V + FJAT-0091 番 茄 福 州 北 峰 0.651 V - FJAT-1300 番 茄 福 州 营 口 0.652 V - FJAT-1448 番 茄 南 平 建 瓯 0.660 V - FJAT-0074 辣 椒 福 州 永 泰 0.663 V - FJAT-1462 番 茄 南 平 建 瓯 0.666 V + FJAT-0435 花 生 泉 州 晋 江 0.680 V - FJAT-0080 番 茄 福 州 北 峰 0.680 V - Ⅰ<0.74 FJAT-1449 番 茄 南 平 建 瓯 0.694 V + FJAT-1461 番 茄 南 平 建 瓯 0.699 V + FJAT-0452 茄 子 宁 德 屏 南 0.712 V + FJAT-1468 番 茄 南 平 建 瓯 0.716 V + FJAT-1102 番 茄 莆 田 莆 田 0.730 V - FJAT-0078 生 姜 福 州 永 泰 0.717 V + FJAT-0437 花 生 泉 州 晋 江 0.716 V - FJAT-1470 番 茄 南 平 建 瓯 0.729 V + FJAT-1471 番 茄 南 平 建 瓯 0.729 V + FJAT-0433 花 生 泉 州 晋 江 0.732 V - FJAT-1457 番 茄 南 平 建 瓯 0.736 V + FJAT-0442 番 茄 宁 德 屏 南 0.730 V - FJAT-1445 番 茄 南 平 建 瓯 0.746 0.74<Ⅱ<0.825 V +

215 FJAT-0441 花 生 泉 州 晋 江 0.747 V - FJAT-1454 番 茄 南 平 建 瓯 0.753 V + FJAT-1446 番 茄 南 平 建 瓯 0.759 V + FJAT-0081 番 茄 福 州 北 峰 0.763 V - FJAT-1463 番 茄 南 平 建 瓯 0.767 A + FJAT-0434 花 生 泉 州 晋 江 0.768 V - FJAT-0469 辣 椒 宁 德 屏 南 0.772 A + FJAT-0465 辣 椒 宁 德 屏 南 0.772 V + FJAT-1307 茄 子 福 州 营 口 0.775 V - FJAT-1231 番 茄 本 实 验 室 0.775 V + FJAT-0449 番 茄 宁 德 屏 南 0.779 V + FJAT-0473 辣 椒 宁 德 屏 南 0.784 V + FJAT-0430 花 生 泉 州 晋 江 0.787 V - FJAT-1441 姜 南 平 建 瓯 0.786 A + FJAT-0427 花 生 泉 州 晋 江 0.791 V + FJAT-1460 番 茄 南 平 建 瓯 0.795 V + FJAT-1458 番 茄 南 平 建 瓯 0.796 A + FJAT-1473 番 茄 南 平 建 瓯 0.796 V + FJAT-1112 茄 子 莆 田 东 洋 镇 0.799 A - FJAT-1466 番 茄 南 平 建 瓯 0.800 V + FJAT-0474 辣 椒 宁 德 屏 南 0.804 V + FJAT-0443 番 茄 宁 德 屏 南 0.808 V - FJAT-0462 辣 椒 宁 德 屏 南 0.809 V + FJAT-0049 番 茄 福 州 建 新 0.810 V - FJAT-0447 番 茄 宁 德 屏 南 0.814 V + FJAT-0428 花 生 泉 州 晋 江 0.812 V + FJAT-1302 番 茄 福 州 营 口 0.817 V - FJAT-0440 花 生 泉 州 晋 江 0.819 V - FJAT-0472 辣 椒 宁 德 屏 南 0.820 V + FJAT-1443 姜 南 平 建 瓯 0.822 V - FJAT-0448 番 茄 宁 德 屏 南 0.829 V + FJAT-1447 番 茄 南 平 建 瓯 0.830 V + FJAT-1442 姜 南 平 建 瓯 0.836 A + FJAT-0054 番 茄 福 州 北 峰 0.838 A + FJAT-1115 茄 子 莆 田 莆 田 0.847 V - FJAT-1301 番 茄 福 州 营 口 0.848 V - FJAT-0456 茄 子 宁 德 屏 南 0.850 V + 0.825<Ⅲ FJAT-1444 姜 南 平 建 瓯 0.855 A + FJAT-1303 番 茄 福 州 营 口 0.859 A - FJAT-1116 茄 子 莆 田 莆 田 0.859 V - FJAT-0070 茄 子 福 州 北 峰 0.865 V - FJAT-0470 辣 椒 宁 德 屏 南 0.865 V + FJAT-0461 辣 椒 宁 德 屏 南 0.867 V + FJAT-0073 茄 子 南 平 0.868 V -

216 FJAT-0458 茄 子 宁 德 屏 南 0.869 V + FJAT-1232 番 茄 本 实 验 室 0.870 V - FJAT-1453 番 茄 南 平 建 瓯 0.871 A + FJAT-0476 辣 椒 宁 德 屏 南 0.873 A + FJAT-0459 辣 椒 宁 德 屏 南 0.874 V + FJAT-0451 番 茄 宁 德 屏 南 0.875 V - FJAT-1103 茄 子 莆 田 东 洋 镇 0.887 V - FJAT-0453 番 茄 宁 德 屏 南 0.897 V - FJAT-0450 番 茄 宁 德 屏 南 0.899 V - FJAT-0445 番 茄 宁 德 屏 南 0.907 V - FJAT-0077 生 姜 福 州 永 泰 0.927 A + FJAT-0468 辣 椒 宁 德 屏 南 0.934 V + FJAT-1452 番 茄 南 平 建 瓯 0.935 A + FJAT-1304 番 茄 福 州 营 口 0.953 V - 4 试 验 讨 论 (1) 由 PCR 扩 增 结 果 可 以 看 出, 菌 株 编 号 FJAT-447 FJAT-448 FJAT-449 FJAT-1466 FJAT-1468 FJAT-1469 FJAT-1470 FJAT-1471 FJAT-1445 FJAT-1446 FJAT-1447 FJAT-1448 FJAT-1449 FJAT-1452 FJAT-1453 FJAT-1454 FJAT-1455 FJAT-1457 FJAT-1458 FJAT-1459 FJAT-1460 FJAT-1461 FJAT-1462 FJAT-1463 FJAT-1473 FJAT-427 FJAT-428 FJAT-1441 FJAT-1442 FJAT-1443 FJAT-1444 FJAT-459 FJAT-461 FJAT-462 FJAT-465 FJAT-468 FJAT-469 FJAT-470 FJAT-472 FJAT-473 FJAT-474 FJAT-475 FJAT-476 FJAT-452 FJAT-456 FJAT-458 FJAT-1112 FJAT-77 和 FJAT-78 通 过 该 引 物 在 近 300 bp 处 出 现 单 一 条 带, 并 且 这 些 菌 株 只 有 FJAT-1303 FJAT-1452 FJAT-1453 FJAT-1458 FJAT-1463 FJAT-1112 FJAT-1443 FJAT-1444 FJAT-476 和 FJAT-469 在 形 态 上 是 属 于 弱 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌, 其 他 的 均 为 强 致 病 青 枯 雷 尔 氏 菌 其 余 的 菌 株 均 在 未 出 现 条 带, 其 中 FJAT-54 为 弱 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌, 其 余 的 强 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 (2) 在 含 有 transposase 序 列 的 48 株 青 枯 雷 尔 氏 菌 中, 其 中 弱 化 指 数 在 强 致 病 性 区 域 24 株 青 枯 雷 尔 氏 菌 中 共 有 13 株 菌 株 含 有 transposase 序 列, 弱 化 指 数 在 过 渡 区 域 31 株 青 枯 雷 尔 氏 菌 中 共 有 20 株 菌 株 含 有 transposase 序 列, 弱 化 指 数 在 弱 致 病 性 区 域 29 株 青 枯 雷 尔 氏 菌 中 共 有 15 株 菌 株 含 有 transposase 序 列 5.. 参 考 文 献 [1] Renmenant B, Coupat-Goutaland B, Guidot A, et al. Genomes of three tomato pathogens within the Ralstonia solanacearum species complex reveal significant evolutionary divergence[j]. BMC Genomics 2010, 11:379-395. [2] 石 元 春, 主 编, 2002, 20 世 纪 中 国 学 术 大 典 农 业 科 学, 福 建 教 育 出 版 社, 中 国, 福 州, pp. 277-278. [3] 杨 玉 红, 2008, 茄 科 植 物 青 枯 菌 病 害 研 究 进 展, 江 西 农 业 学 报, 20(5):54-55, 58 [4] 卫 红 萍, 2010, 茄 科 植 物 青 枯 病 发 生 及 防 治 策 略 研 究, 咸 宁 学 院 学 报, 30(8):164-16 试 验 负 责 车 建 美 刘 波 试 验 人 员 林 海 云

217 附 录 : RS98orf02695 序 列 : ATGGCGCGAGAATCGGACGGCTGGGCACACAAGGAGTTGGAAGGCGTGAATCTGGGTGACGC GAGACGCAACGAACGCGCGAAGACGCTGCTGACGAGGTTTGCCGAGAAGCCGACGGAGAGC ATCCCGCACGCGTGCCACGGCTGGAGCGAGACGATCGGCGCGTATCGTTTCATGGAGAACCCG GCGTTCGAGTGGGGCGACATCATGGAGCCGCATTGGGAGCGCACGGTGCAACGCATGGGTGAG CACGAAGTCGTGCTGTGCATTGCGGACACAACCGAACTGGACTTCAACGGCCAGGAGGCCAG CGGTCTGGGACCGCTGAACTACGAAGCGCGGCGCGGCATGTATGTGCATCCGACCTATGCGGT GAGCACGGATCGCGTGGGGCTGGGCGTGCTGGATGCCTGGATGTGGGCGCGCGAGCCCAAGG ATGCCGACGGCGAGCGTGGCGGCATCAAGGAGAGCGCGCGCTGGATCGAGGGGTACGAGCGG GTCGCCGAACTCGCCTCGCAGTTGCCGAGCACGCGGCTGGTGTACGTGGCCGATCGGGAAGCG GACATCACGGCGCTGATGCAGCGAGCCGCCGAGCTTGGGACACCGGCGGACTGGCTGATCCGC TCGACGCACAATCGCAGCCTGGACGGTGGCGAGAAGCTCTGGCCGACAGTGCTCAAGACCGA GGCGGTGGGCGAAATCGAGTTCGTCATGGCGGCTCGTGAGGGGCAGAAGGCTCGCACGGTGA AACAGGCGTTGCGTATGAAGCAGGTGACGTTGCGGTGCGGGCTTGCGCTGACGTGCGTGATCG CCAAGGAAATCGCCCCGCCGGCAGGCGTCAAGCCAGTCGAATGGCGCTTGCTCACCAATCGAG TGCCGGCCGGCGCAGACGAGCTGGTGGAGTTGATCGACTGGTACCGGGCCAGATGGGAGATTG AGATGTTCTTCCACGTGCTCAAGAACGGCTGCCGTGTCCAAGCGTTGCAGCTCTCGGCCGTTGA TCGCATCGAACGCGCGCTGGCGCTGTTCATGATCGTGGCATGGCGCATCGCTTATCTGATGCGC CTGGGCAGAACCTGTCCTGACCTGGATGCGGCGCTGTTCTTCGACCCTGATGAGATTCATGGAG CCTACCTGCTGATGAACAAGCGTAGGCCCAAGGGCGCGCCAACCCTGAACGAAGTGCTGCGCC TGGTGGCGCAAGTGGGTGGCTTCCTTGCCCGCAAGGGCGACGGCGAGCCCGGTGCCAAGACC ATCTGGGAGGGCTTGCAGCAGGTCATGACCGCCGCTCGGACACTACGCGCGCTTCGCAGTGAA GCCGCTTGA

218 2011-08-06 承 担 单 位 : 福 建 省 农 科 院 农 业 生 物 资 源 研 究 所 试 验 设 计 : 试 验 项 目 : 青 枯 雷 尔 氏 菌 peptidase U35 phage prohead HK97 验 证 (RS983416) 试 验 人 员 : 林 海 云 试 验 负 责 : 车 建 美 刘 波 报 告 日 期 :2011-8-06 计 数 月 份 :2011 年 08 月 研 究 资 格 系 数 (0.5-1.0) 实 验 设 计 系 数 (0.9-1.0 0.9-1.0) 报 告 得 分 总 分 实 验 设 计 实 验 记 载 实 验 分 析 实 验 简 报 实 验 文 章 1-20% 21-40% 41-60% 61-80% 81-100% 1%-5% 设 计 不 足, 实 施 错 误 6%-10% 设 计 不 全, 实 验 无 果 11%-15% 设 计 可 以, 实 施 不 全 16%-20% 设 计 完 整, 分 布 实 施 21%-25% 实 验 不 全, 记 载 无 果 26%-30% 实 验 不 足, 记 载 不 全 31%-35% 独 立 实 验, 记 载 不 全 36%-40% 分 布 实 验, 记 载 完 整 41%-45% 目 的 明 确, 实 验 完 成 46%-50% 实 验 完 整, 记 载 清 晰 51%-55% 实 验 系 统, 结 果 可 信 56%-60% 实 验 创 新, 分 析 清 晰 61%-65% 实 验 创 新, 结 论 清 晰 66%-70% 实 验 完 整, 统 计 清 晰 71%-75% 实 验 系 统, 数 据 可 靠 76%-80% 报 告 完 整, 文 章 雏 形 81%-85% 结 构 合 理, 分 析 有 据 86%-90% 逻 辑 清 晰, 统 计 合 理 91%-95% 图 表 完 整, 写 作 流 畅 96%-100% 文 献 完 整, 发 表 水 平 福 建 省 农 业 科 学 院 农 业 生 物 资 源 研 究 所 农 业 微 生 物 研 究 中 心 电 话 : 0591-87882571, 传 真 : 0591-87882571 fjat.yzxz.com

219 1. 试 验 目 的 细 菌 性 青 枯 病 是 由 青 枯 雷 尔 氏 菌 引 起 的 一 种 重 要 土 传 植 物 病 害, 侵 染 寄 主 范 围 很 广 (Remenant, 2010), 据 报 道 青 枯 病 原 菌 可 侵 染 50 多 个 科 数 百 种 植 物, 包 括 花 生 番 茄 茄 子 和 辣 椒 等 经 济 作 物, 并 且 近 年 来 青 枯 病 在 中 国 继 续 加 重, 新 的 寄 主 也 在 不 断 地 被 发 现 ( 石 元 春, 2002), 其 中 茄 科 植 物 受 青 枯 病 危 害 最 重, 涉 及 的 作 物 种 类 最 多 ( 杨 玉 红, 2008) 青 枯 病 原 菌 是 一 个 复 杂 的 群 体, 在 寄 主 范 围 生 化 型 致 病 力 和 血 清 型 等 细 菌 学 特 性 上 差 异 很 大, 这 导 致 其 病 害 防 治 较 为 困 难, 使 其 成 为 世 界 上 危 害 最 大 分 布 最 广 和 造 成 损 失 最 为 严 重 的 植 物 病 害 之 一 ( 卫 红 萍, 2010) ; 由 于 青 枯 雷 尔 氏 菌 的 复 杂 性, 导 致 其 致 病 机 制 也 十 分 复 杂, 只 有 通 过 对 青 枯 雷 尔 氏 菌 致 病 机 制 的 更 深 入 地 研 究, 才 有 可 能 找 到 控 制 它 的 有 效 方 法 本 实 验 室 已 对 强 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 FJAT-91 和 弱 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 FJAT-1458 测 通 其 全 序 列, 测 序 结 果 分 析 可 知, 强 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 FJAT-91 和 弱 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 FJAT-1458 存 在 一 系 列 差 异 基 因, 其 中 在 强 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 FJAT-91 存 在 的 基 因 而 在 弱 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 FJAT-1458 不 存 在 的 基 因 有 225 个 ( 强 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 FJAT-91 特 异 性 获 得 基 因 ), 而 在 弱 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 FJAT-1458 存 在 而 在 强 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 不 存 在 的 基 因 有 360 个 ( 弱 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 特 异 性 获 得 基 因 ) 本 试 验 基 于 弱 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 FJAT-1458 特 异 性 获 得 基 因 peptidase U35 phage prohead HK97, 该 基 因 在 本 试 验 中 的 编 号 为 RS98orf03416, 该 基 因 全 长 为 699 bp, 本 试 验 基 于 批 处 理 软 件 设 计 了 一 对 引 物 (RS983416-1 和 RS9834163-2), 该 对 引 物 可 在 弱 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 FJAT-1458 扩 增 出 300 bp 目 的 条 带, 而 在 强 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 FJAT-91 不 能 扩 增 出 条 带 ( 已 在 梯 度 试 验 中 验 证 ), 本 试 验 利 用 该 对 引 物 对 菌 种 库 中 所 有 青 枯 雷 尔 氏 菌, 以 验 证 该 基 因 是 否 只 在 弱 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 存 在, 而 在 强 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 不 存 在? 以 进 一 步 对 青 枯 雷 尔 氏 菌 致 病 机 制 进 行 探 索 2. 试 验 方 法 2.1 试 验 材 料 2.1.1 菌 株 : 试 验 菌 株 及 来 源 见 表 1 表 1 菌 株 以 及 来 源 菌 株 编 号 名 称 来 源 物 种 分 离 基 物 菌 株 原 产 地 49 Rs-F.1.1-010615-04V 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 福 州 建 新 54 Rs-F.1.3-010702-09V 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 福 州 北 峰 80 Rs-F.1.3-010702-01V-f2 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 福 州 北 峰 81 Rs-F.1.3-010702-01V-f3 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 福 州 北 峰 91 Rs-F.1.3-010702-01V-f13 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 福 州 北 峰 442 Rs-F.352300-060722-5-1-1 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 宁 德 屏 南 443 Rs-F.352300-060722-5-1-2 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 宁 德 屏 南 445 Rs-F.352300-060722-5-2-2 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 宁 德 屏 南 447 Rs-F.352300-060722-6-1-2 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 宁 德 屏 南 448 Rs-F.352300-060722-6-2-1 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 宁 德 屏 南 449 Rs-F.352300-060722-6-2-2 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 宁 德 屏 南

220 450 Rs-F.352300-060722-7-1 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 宁 德 屏 南 451 Rs-F.352300-060722-7-2 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 宁 德 屏 南 1300 Rs-F.350112-070612-V2 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 福 州 营 口 1301 Rs-F.350112-070612-V3 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 福 州 营 口 1302 Rs-F.350112-070612-V4 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 福 州 营 口 1303 Rs-F.350112-070612-V5 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 福 州 营 口 1304 Rs-F.350112-070612-V6 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 福 州 营 口 1466 RSF-V-109 自 己 分 离 番 茄 根 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1468 RSF-V-117 自 己 分 离 番 茄 根 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1469 RSF-V-121 自 己 分 离 番 茄 根 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1470 RSF-V-125 自 己 分 离 番 茄 根 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1471 RSF-V-129 自 己 分 离 番 茄 根 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1445 RSF-V-14 自 己 分 离 番 茄 茎 基 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1446 RSF-V-99 自 己 分 离 番 茄 茎 基 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1447 RSF-V-100 自 己 分 离 番 茄 茎 基 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1448 RSF-V-103 自 己 分 离 番 茄 茎 基 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1449 RSF-V-106 自 己 分 离 番 茄 茎 基 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1452 RSF-A-26 自 己 分 离 番 茄 茎 中 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1453 RSF-A-27 自 己 分 离 番 茄 茎 中 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1454 RSF-A-30 自 己 分 离 番 茄 茎 中 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1455 RSF-A-31 自 己 分 离 番 茄 茎 中 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1457 RSF-V-97 自 己 分 离 番 茄 茎 中 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1458 RSF-A-98 自 己 分 离 番 茄 茎 中 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1459 RSF-V-102 自 己 分 离 番 茄 茎 中 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1460 RSF-V-115 自 己 分 离 番 茄 茎 中 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1461 RSF-V-116 自 己 分 离 番 茄 茎 中 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1462 RSF-V-119 自 己 分 离 番 茄 茎 中 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1463 RSF-V-122 自 己 分 离 番 茄 茎 中 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1473 RSF-V-111 自 己 分 离 番 茄 茎 中 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 青 枯 病 植 株 1102 Rs-F.351144-060928-14V 自 己 分 离 番 茄 1101 Rs-F.351144-060928-13V 自 己 分 离 番 茄 茎 顶 部 青 枯 病 植 株 茎 中 部 莆 田 东 洋 镇 莆 田 东 洋 镇 427 Rs-P.362200-060707-1-1 自 己 分 离 花 生 花 生 植 株 泉 州 晋 江 428 Rs-P.362200-060707-1-2 自 己 分 离 花 生 花 生 植 株 泉 州 晋 江

221 430 Rs-P.362200-060707-2-1 自 己 分 离 花 生 花 生 植 株 泉 州 晋 江 433 Rs-P.362200-060707-3-1 自 己 分 离 花 生 花 生 植 株 泉 州 晋 江 434 Rs-P.362200-060707-3-2 自 己 分 离 花 生 花 生 植 株 泉 州 晋 江 435 Rs-P.362200-060707-3-3 自 己 分 离 花 生 花 生 植 株 泉 州 晋 江 437 Rs-P.362200-060707-4-2 自 己 分 离 花 生 花 生 植 株 泉 州 晋 江 440 Rs-P.362200-060707-5-2 自 己 分 离 花 生 花 生 植 株 泉 州 晋 江 441 Rs-P.362200-060707-5-3 自 己 分 离 花 生 花 生 植 株 泉 州 晋 江 1441 RSJ-79-A 自 己 分 离 姜 茎 基 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1442 RSJ-86-A 自 己 分 离 姜 茎 基 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1443 RSJ-87-V 自 己 分 离 姜 茎 基 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1444 RSJ-88-A 自 己 分 离 姜 茎 基 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 74 Rs-L.1.4-010704-01V 自 己 分 离 辣 椒 辣 椒 植 株 福 州 永 泰 459 Rs-L.352300-060722-14-1-1 自 己 分 离 辣 椒 辣 椒 植 株 宁 德 屏 南 461 Rs-L.352300-060722-14-2-1 自 己 分 离 辣 椒 辣 椒 植 株 宁 德 屏 南 462 Rs-L.352300-060722-14-2-2 自 己 分 离 辣 椒 辣 椒 植 株 宁 德 屏 南 465 Rs-L.352300-060722-16-1-1 自 己 分 离 辣 椒 辣 椒 植 株 宁 德 屏 南 466 Rs-L.352300-060722-16-1-2 自 己 分 离 辣 椒 辣 椒 植 株 宁 德 屏 南 468 Rs-L.352300-060722-16-2-2 自 己 分 离 辣 椒 辣 椒 植 株 宁 德 屏 南 470 Rs-L.352300-060722-17-1-2 自 己 分 离 辣 椒 辣 椒 植 株 宁 德 屏 南 469 Eb-L.352300-060722-17-1-1 (Vibrio-hollisae) 自 己 分 离 辣 椒 辣 椒 植 株 宁 德 屏 南 472 Rs-L.352300-060722-17-2-2 自 己 分 离 辣 椒 辣 椒 植 株 宁 德 屏 南 473 Rs-L.352300-060722-18-1 自 己 分 离 辣 椒 辣 椒 植 株 宁 德 屏 南 474 Rs-L.352300-060722-18-2-1 自 己 分 离 辣 椒 辣 椒 植 株 宁 德 屏 南 475 Rs-L.352300-060722-18-2-2 自 己 分 离 辣 椒 辣 椒 植 株 宁 德 屏 南 476 Rs-L.352300-060722-20-1 自 己 分 离 辣 椒 辣 椒 植 株 宁 德 屏 南 健 康 植 株 根 1103 Rs-Q.351144-061019-01V 自 己 分 离 茄 子 部 莆 田 东 洋 镇 1307 Rs-Q.350112-070628-11V 自 己 分 离 茄 子 茄 子 - 根 福 州 营 口 70 Rs-Q.1.3-020626-5V 自 己 分 离 茄 子 茄 子 植 株 福 州 北 峰 73 Rs-Q.9.2-010620-V 自 己 分 离 茄 子 茄 子 植 株 南 平 452 Rs-Q.352300-060722-8-1-1 自 己 分 离 茄 子 茄 子 植 株 宁 德 屏 南 453 Rs-Q.352300-060722-8-2-1 自 己 分 离 茄 子 茄 子 植 株 宁 德 屏 南 454 Rs-Q.352300-060722-8-2-2 自 己 分 离 茄 子 茄 子 植 株 宁 德 屏 南 456 Rs-Q.352300-060722-9-1-2 自 己 分 离 茄 子 茄 子 植 株 宁 德 屏 南

222 458 Rs-Q.352300-060722-9-2-2 自 己 分 离 茄 子 茄 子 植 株 宁 德 屏 南 青 枯 病 植 株 1115 Rs-Q.351144-061107-11V 自 己 分 离 茄 子 1116 Rs-Q.351144-061107-12V 自 己 分 离 茄 子 1112 Rs-Q.351144-061024-12V 自 己 分 离 茄 子 根 部 青 枯 病 植 株 茎 基 部 青 枯 病 植 株 茎 基 部 莆 田 东 洋 镇 莆 田 东 洋 镇 莆 田 东 洋 镇 77 Rs-J.1.4-010704-01V 自 己 分 离 生 姜 生 姜 植 株 福 州 永 泰 78 Rs-J.1.4-010704-02A 自 己 分 离 生 姜 生 姜 植 株 福 州 永 泰 1231 Rs91-2-4# 自 己 分 离 培 养 基 本 实 验 室 1232 Rs91-3-5# 自 己 分 离 培 养 基 本 实 验 室 2.1.2 试 剂 与 仪 器 (1) 试 剂 ddw;dntp 购 自 福 州 博 海 生 物 技 术 有 限 公 司 ;Buffer,Taq 酶 购 自 北 京 天 根 生 化 科 技 有 限 公 司 ; 上 游 引 物 RS983416-1:5'-TCC CTA TCT GGA GGA GCT GA-3', 下 游 引 物 RS983416-2:5'-GAC AGT TCG TAG GGT TCC CA-3', 引 物 购 自 上 海 博 尚 有 限 公 司 ; 已 稀 释 青 枯 雷 尔 氏 菌 DNA 产 物 ;1500 bp Maker 购 自 上 海 英 竣 生 物 技 术 公 司 (2) 仪 器 UVP 凝 胶 成 像 仪 ;Biometra 梯 度 PCR 仪 ;BIO-RAD 电 泳 仪 ; 2.2 试 验 方 法 (4) 扩 增 体 系 ddw:18.7 μl ; Buffer:2.5 μl; dntp:0.5 μl; RS983416-1:1 μl; RS983416-2:1 μl; Taq:0.3 μl; DNA:1 μl (2)PCR 程 序 95 C, 预 变 性 5 min; 然 后 95 C 变 性 30 s,64 C 退 火 30 s,72 C 延 伸 1 min, 进 行 30 个 循 环 ; 最 后 72 C 7 min PCR 产 物 可 在 4 C 保 存 (2) 电 泳 采 用 的 1.5% 胶 浓 度, 上 样 量 为 7 μl, 电 压 为 100 V; 凝 胶 成 像 观 测 PCR 结 果 3 试 验 结 果 3.1 peptidase U35 phage prohead HK97 序 列 PCR 扩 增 结 果 试 验 结 果 见 图 1-4 由 PCR 扩 增 结 果 可 以 看 出, 菌 株 编 号 FJAT-448 FJAT-449 FJAT-1466 FJAT-1468 FJAT-1469 FJAT-1470 FJAT-1471 FJAT-1447 FJAT-1452 FJAT-1453 FJAT-1454

223 FJAT-1455 FJAT-1457 FJAT-1458 FJAT-1459 FJAT-1460 FJAT-1461 FJAT-1462 FJAT-1463 FJAT-1473 FJAT-473 FJAT-474 FJAT-475 FJAT-1103 FJAT-73 FJAT-452 FJAT-453 FJAT-456 和 FJAT-458 通 过 该 引 物 在 近 300 bp 处 出 现 单 一 条 带, 并 且 这 些 菌 株 只 有 FJAT-1452 FJAT-1453 FJAT-1458 和 FJAT-1463 在 形 态 上 是 属 于 弱 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌, 其 他 的 均 为 强 致 病 青 枯 雷 尔 氏 菌 其 余 的 菌 株 均 在 未 出 现 条 带, 其 中 FJAT-54 FJAT-1441 FJAT-1442 FJAT-1443 FJAT-1444 FJAT-1112 FJAT-77 FJAT-476 和 FJAT-469 为 弱 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌, 其 余 的 强 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 图 1 不 同 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 在 引 物 RS983416PCR 扩 增 结 果 (1) 图 2 不 同 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 在 引 物 RS983416PCR 扩 增 结 果 (2) 图 3 不 同 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 在 引 物 RS983416PCR 扩 增 结 果 (3)

224 图 4 不 同 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 在 引 物 RS983416 PCR 扩 增 结 果 (4) 3.2 peptidase U35 phage prohead HK97 序 列 PCR 结 果 综 合 分 析 peptidase U35 phage prohead HK97 序 列 PCR 结 果 综 合 分 析 结 果 见 表 2 在 含 有 peptidase U35 phage prohead HK97 序 列 的 29 株 青 枯 雷 尔 氏 菌 中, 其 中 弱 化 指 数 在 强 致 病 性 区 域 24 株 青 枯 雷 尔 氏 菌 中 共 有 11 株 菌 株 含 有 peptidase U35 phage prohead HK97 序 列, 弱 化 指 数 在 过 渡 区 域 31 株 青 枯 雷 尔 氏 菌 中 共 有 9 株 菌 株 含 有 peptidase U35 phage prohead HK97 序 列, 弱 化 指 数 在 弱 致 病 性 区 域 29 株 青 枯 雷 尔 氏 菌 中 共 有 9 株 菌 株 含 有 peptidase U35 phage prohead HK97 序 列 表 2 peptidase U35 phage prohead HK97 PCR 结 果 中 有 目 标 条 带 菌 株 综 合 结 果 菌 株 编 号 寄 主 菌 株 原 产 地 平 均 值 类 群 强 弱 判 断 是 否 有 条 带 FJAT-1455 番 茄 南 平 建 瓯 0.522 V + FJAT-1101 番 茄 莆 田 莆 田 0.581 V - FJAT-0475 辣 椒 宁 德 屏 南 0.591 V + FJAT-1469 番 茄 南 平 建 瓯 0.594 V + FJAT-1459 番 茄 南 平 建 瓯 0.640 V + FJAT-0091 番 茄 福 州 北 峰 0.651 V - FJAT-1300 番 茄 福 州 营 口 0.652 V - FJAT-1448 番 茄 南 平 建 瓯 0.660 V - FJAT-0074 辣 椒 福 州 永 泰 0.663 V - FJAT-1462 番 茄 南 平 建 瓯 0.666 V + FJAT-0435 花 生 泉 州 晋 江 0.680 V - Ⅰ<0.74 FJAT-0080 番 茄 福 州 北 峰 0.680 V - FJAT-1449 番 茄 南 平 建 瓯 0.694 V - FJAT-1461 番 茄 南 平 建 瓯 0.699 V + FJAT-0452 茄 子 宁 德 屏 南 0.712 V + FJAT-1468 番 茄 南 平 建 瓯 0.716 V + FJAT-1102 番 茄 莆 田 莆 田 0.730 V - FJAT-0078 生 姜 福 州 永 泰 0.717 V - FJAT-0437 花 生 泉 州 晋 江 0.716 V - FJAT-1470 番 茄 南 平 建 瓯 0.729 V + FJAT-1471 番 茄 南 平 建 瓯 0.729 V + FJAT-0433 花 生 泉 州 晋 江 0.732 V -

225 FJAT-1457 番 茄 南 平 建 瓯 0.736 V + FJAT-0442 番 茄 宁 德 屏 南 0.730 V - FJAT-1445 番 茄 南 平 建 瓯 0.746 V - FJAT-0441 花 生 泉 州 晋 江 0.747 V - FJAT-1454 番 茄 南 平 建 瓯 0.753 V + FJAT-1446 番 茄 南 平 建 瓯 0.759 V - FJAT-0081 番 茄 福 州 北 峰 0.763 V - FJAT-1463 番 茄 南 平 建 瓯 0.767 A + FJAT-0434 花 生 泉 州 晋 江 0.768 V - FJAT-0469 辣 椒 宁 德 屏 南 0.772 A - FJAT-0465 辣 椒 宁 德 屏 南 0.772 V - FJAT-1307 茄 子 福 州 营 口 0.775 V - FJAT-1231 番 茄 本 实 验 室 0.775 V - FJAT-0449 番 茄 宁 德 屏 南 0.779 V + FJAT-0473 辣 椒 宁 德 屏 南 0.784 V + FJAT-0430 花 生 泉 州 晋 江 0.787 V - FJAT-1441 姜 南 平 建 瓯 0.786 A - FJAT-0427 花 生 泉 州 晋 江 0.791 0.74<Ⅱ<0.825 V - FJAT-1460 番 茄 南 平 建 瓯 0.795 V + FJAT-1458 番 茄 南 平 建 瓯 0.796 A + FJAT-1473 番 茄 南 平 建 瓯 0.796 V + FJAT-1112 茄 子 莆 田 东 洋 镇 0.799 A - FJAT-1466 番 茄 南 平 建 瓯 0.800 V + FJAT-0474 辣 椒 宁 德 屏 南 0.804 V + FJAT-0443 番 茄 宁 德 屏 南 0.808 V - FJAT-0462 辣 椒 宁 德 屏 南 0.809 V - FJAT-0049 番 茄 福 州 建 新 0.810 V - FJAT-0447 番 茄 宁 德 屏 南 0.814 V - FJAT-0428 花 生 泉 州 晋 江 0.812 V - FJAT-1302 番 茄 福 州 营 口 0.817 V - FJAT-0440 花 生 泉 州 晋 江 0.819 V - FJAT-0472 辣 椒 宁 德 屏 南 0.820 V - FJAT-1443 姜 南 平 建 瓯 0.822 V - FJAT-0448 番 茄 宁 德 屏 南 0.829 V + FJAT-1447 番 茄 南 平 建 瓯 0.830 V + FJAT-1442 姜 南 平 建 瓯 0.836 A - FJAT-0054 番 茄 福 州 北 峰 0.838 A - FJAT-1115 茄 子 莆 田 莆 田 0.847 V - FJAT-1301 番 茄 福 州 营 口 0.848 0.825<Ⅲ V - FJAT-0456 茄 子 宁 德 屏 南 0.850 V + FJAT-1444 姜 南 平 建 瓯 0.855 A - FJAT-1303 番 茄 福 州 营 口 0.859 A - FJAT-1116 茄 子 莆 田 莆 田 0.859 V - FJAT-0070 茄 子 福 州 北 峰 0.865 V -

226 FJAT-0470 辣 椒 宁 德 屏 南 0.865 V - FJAT-0461 辣 椒 宁 德 屏 南 0.867 V - FJAT-0073 茄 子 南 平 0.868 V + FJAT-0458 茄 子 宁 德 屏 南 0.869 V + FJAT-1232 番 茄 本 实 验 室 0.870 V - FJAT-1453 番 茄 南 平 建 瓯 0.871 A + FJAT-0476 辣 椒 宁 德 屏 南 0.873 A - FJAT-0459 辣 椒 宁 德 屏 南 0.874 V - FJAT-0451 番 茄 宁 德 屏 南 0.875 V - FJAT-1103 茄 子 莆 田 东 洋 镇 0.887 V + FJAT-0453 番 茄 宁 德 屏 南 0.897 V + FJAT-0450 番 茄 宁 德 屏 南 0.899 V - FJAT-0445 番 茄 宁 德 屏 南 0.907 V - FJAT-0077 生 姜 福 州 永 泰 0.927 A - FJAT-0468 辣 椒 宁 德 屏 南 0.934 V - FJAT-1452 番 茄 南 平 建 瓯 0.935 A + FJAT-1304 番 茄 福 州 营 口 0.953 V - 4. 试 验 讨 论 (1) 由 PCR 扩 增 结 果 可 以 看 出, 菌 株 编 号 FJAT-448 FJAT-449 FJAT-1466 FJAT-1468 FJAT-1469 FJAT-1470 FJAT-1471 FJAT-1447 FJAT-1452 FJAT-1453 FJAT-1454 FJAT-1455 FJAT-1457 FJAT-1458 FJAT-1459 FJAT-1460 FJAT-1461 FJAT-1462 FJAT-1463 FJAT-1473 FJAT-473 FJAT-474 FJAT-475 FJAT-1103 FJAT-73 FJAT-452 FJAT-453 FJAT-456 和 FJAT-458 通 过 该 引 物 在 近 300 bp 处 出 现 单 一 条 带, 并 且 这 些 菌 株 只 有 FJAT-1452 FJAT-1453 FJAT-1458 和 FJAT-1463 在 形 态 上 是 属 于 弱 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌, 其 他 的 均 为 强 致 病 青 枯 雷 尔 氏 菌 其 余 的 菌 株 均 在 未 出 现 条 带, 其 中 FJAT-54 FJAT-1441 FJAT-1442 FJAT-1443 FJAT-1444 FJAT-1112 FJAT-77 FJAT-476 和 FJAT-469 为 弱 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌, 其 余 的 强 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 (2) 在 含 有 peptidase U35 phage prohead HK97 序 列 的 29 株 青 枯 雷 尔 氏 菌 中, 其 中 弱 化 指 数 强 致 病 性 区 域 24 株 青 枯 雷 尔 氏 菌 中 共 有 11 株 菌 株 含 有 peptidase U35 phage prohead HK97 序 列, 弱 化 指 数 在 过 渡 区 域 31 株 青 枯 雷 尔 氏 菌 中 共 有 9 株 菌 株 含 有 peptidase U35 phage prohead HK97 序 列, 弱 化 指 数 在 弱 致 病 性 区 域 29 株 青 枯 雷 尔 氏 菌 中 共 有 9 株 菌 株 含 有 peptidase U35 phage prohead HK97 序 列 5.. 参 考 文 献 [1] Renmenant B, Coupat-Goutaland B, Guidot A, et al. Genomes of three tomato pathogens within the Ralstonia solanacearum species complex reveal significant evolutionary divergence[j]. BMC Genomics 2010, 11:379-395. [2] 石 元 春, 主 编, 2002, 20 世 纪 中 国 学 术 大 典 农 业 科 学, 福 建 教 育 出 版 社, 中 国, 福 州, pp. 277-278. [3] 杨 玉 红, 2008, 茄 科 植 物 青 枯 菌 病 害 研 究 进 展, 江 西 农 业 学 报, 20(5):54-55, 58 [4] 卫 红 萍, 2010, 茄 科 植 物 青 枯 病 发 生 及 防 治 策 略 研 究, 咸 宁 学 院 学 报, 30(8):164-16 试 验 负 责 车 建 美 刘 波 试 验 人 员 林 海 云

227 附 录 RS98orf03416 序 列 : ATGCCTGTGCTTCAAGAAGCCGCGCCGCGCCGCGAACAGCGCGACATGCCGCTGGCGAGCCGC TCGGCCGCCGTGCGCACGGTCAATACCGACAGCCGGACCGTCGATCTTGTCTGGACGACCGGC GCGCGCGTGCTGCGCTACGACTGGTGGAACGACCGTCCCTATCTGGAGGAGCTGAGCCTGGAT CCTGCGCACGTGCGCATGGGCCGGCTGCAATCCGGCGCGGCGAATCTGCTGAACACCCATTCG AGCTCGGATCTGAGCGACGTGCTCGGCGTGGTCACCGGCGCGCAGCTGGACGGCGGCGCCGG CACGGCGACGGTGCGTTTCAGCCAGCGCCCGGACGTGCAGCCCGTGTTTCAGGACGTGGTCGA CGGGATCGTGCGCAGCGTCTCGGTCGGCTACGCCATCTACAAGGTCGAGCGCATCGCGCCGGC CGTCGACGGCGATCCGTGGATCTACCGCGTCATCGACTGGGAACCCTACGAACTGTCCCTGGTG GCGGTGCCGGCCGACCCGGGGGCAACCACGCGCGCGGACCCGTCCGCCGGGCCGCGCGCCTC CGGCATCCAGCAGCGCACGTTCGCGTGCGAGTTCATCGAGCAGTCCAACCCGCCGGCAGCCGC CGGCACCCGTACGAGAGAGGAAAACACCATGCCTGGTGAAACGACCACCCAGCCGGCGGCGC AGACCCCT

228 2011-08-07 承 担 单 位 : 福 建 省 农 科 院 农 业 生 物 资 源 研 究 所 试 验 设 计 : 试 验 项 目 : 青 枯 雷 尔 氏 菌 bacteriophage protein GP46 验 证 (RS983442) 试 验 人 员 : 林 海 云 试 验 负 责 : 车 建 美 刘 波 报 告 日 期 :2011-7-08 计 数 月 份 :2011 年 08 月 研 究 资 格 系 数 (0.5-1.0) 实 验 设 计 系 数 (0.9-1.0 0.9-1.0) 报 告 得 分 总 分 实 验 设 计 实 验 记 载 实 验 分 析 实 验 简 报 实 验 文 章 1-20% 21-40% 41-60% 61-80% 81-100% 1%-5% 设 计 不 足, 实 施 错 误 6%-10% 设 计 不 全, 实 验 无 果 11%-15% 设 计 可 以, 实 施 不 全 16%-20% 设 计 完 整, 分 布 实 施 21%-25% 实 验 不 全, 记 载 无 果 26%-30% 实 验 不 足, 记 载 不 全 31%-35% 独 立 实 验, 记 载 不 全 36%-40% 分 布 实 验, 记 载 完 整 41%-45% 目 的 明 确, 实 验 完 成 46%-50% 实 验 完 整, 记 载 清 晰 51%-55% 实 验 系 统, 结 果 可 信 56%-60% 实 验 创 新, 分 析 清 晰 61%-65% 实 验 创 新, 结 论 清 晰 66%-70% 实 验 完 整, 统 计 清 晰 71%-75% 实 验 系 统, 数 据 可 靠 76%-80% 报 告 完 整, 文 章 雏 形 81%-85% 结 构 合 理, 分 析 有 据 86%-90% 逻 辑 清 晰, 统 计 合 理 91%-95% 图 表 完 整, 写 作 流 畅 96%-100% 文 献 完 整, 发 表 水 平 福 建 省 农 业 科 学 院 农 业 生 物 资 源 研 究 所 农 业 微 生 物 研 究 中 心 电 话 : 0591-87882571, 传 真 : 0591-87882571 fjat.yzxz.com

229 1. 试 验 目 的 细 菌 性 青 枯 病 是 由 青 枯 雷 尔 氏 菌 引 起 的 一 种 重 要 土 传 植 物 病 害, 侵 染 寄 主 范 围 很 广 (Remenant, 2010), 据 报 道 青 枯 病 原 菌 可 侵 染 50 多 个 科 数 百 种 植 物, 包 括 花 生 番 茄 茄 子 和 辣 椒 等 经 济 作 物, 并 且 近 年 来 青 枯 病 在 中 国 继 续 加 重, 新 的 寄 主 也 在 不 断 地 被 发 现 ( 石 元 春, 2002), 其 中 茄 科 植 物 受 青 枯 病 危 害 最 重, 涉 及 的 作 物 种 类 最 多 ( 杨 玉 红, 2008) 青 枯 病 原 菌 是 一 个 复 杂 的 群 体, 在 寄 主 范 围 生 化 型 致 病 力 和 血 清 型 等 细 菌 学 特 性 上 差 异 很 大, 这 导 致 其 病 害 防 治 较 为 困 难, 使 其 成 为 世 界 上 危 害 最 大 分 布 最 广 和 造 成 损 失 最 为 严 重 的 植 物 病 害 之 一 ( 卫 红 萍, 2010) ; 由 于 青 枯 雷 尔 氏 菌 的 复 杂 性, 导 致 其 致 病 机 制 也 十 分 复 杂, 只 有 通 过 对 青 枯 雷 尔 氏 菌 致 病 机 制 的 更 深 入 地 研 究, 才 有 可 能 找 到 控 制 它 的 有 效 方 法 本 实 验 室 已 对 强 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 FJAT-91 和 弱 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 FJAT-1458 测 通 其 全 序 列, 测 序 结 果 分 析 可 知, 强 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 FJAT-91 和 弱 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 FJAT-1458 存 在 一 系 列 差 异 基 因, 其 中 在 强 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 FJAT-91 存 在 的 基 因 而 在 弱 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 FJAT-1458 不 存 在 的 基 因 有 225 个 ( 强 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 FJAT-91 特 异 性 获 得 基 因 ), 而 在 弱 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 FJAT-1458 存 在 而 在 强 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 不 存 在 的 基 因 有 360 个 ( 弱 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 特 异 性 获 得 基 因 ) 本 试 验 基 于 弱 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 FJAT-1458 特 异 性 获 得 基 因 bacteriophage protein GP46( 噬 菌 体 蛋 白 GP46), 该 基 因 在 本 试 验 中 的 编 号 为 RS98orf03442, 该 基 因 全 长 为 459 bp, 本 试 验 基 于 批 处 理 软 件 设 计 了 一 对 引 物 ( RS983442-1 和 RS9834423-2), 该 对 引 物 可 在 弱 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 FJAT-1458 扩 增 出 300 bp 目 的 条 带, 而 在 强 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 FJAT-91 不 能 扩 增 出 条 带 ( 已 在 梯 度 试 验 中 验 证 ), 本 试 验 利 用 该 对 引 物 对 菌 种 库 中 所 有 青 枯 雷 尔 氏 菌, 以 验 证 该 基 因 是 否 只 在 弱 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 存 在, 而 在 强 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 不 存 在? 以 进 一 步 对 青 枯 雷 尔 氏 菌 致 病 机 制 进 行 探 索 2. 试 验 方 法 2.1 试 验 材 料 2.1.1 菌 株 : 试 验 菌 株 及 来 源 见 表 1 表 1 菌 株 以 及 来 源 菌 株 编 号 名 称 来 源 物 种 分 离 基 物 菌 株 原 产 地 49 Rs-F.1.1-010615-04V 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 福 州 建 新 54 Rs-F.1.3-010702-09V 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 福 州 北 峰 80 Rs-F.1.3-010702-01V-f2 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 福 州 北 峰 81 Rs-F.1.3-010702-01V-f3 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 福 州 北 峰 91 Rs-F.1.3-010702-01V-f13 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 福 州 北 峰 442 Rs-F.352300-060722-5-1-1 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 宁 德 屏 南 443 Rs-F.352300-060722-5-1-2 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 宁 德 屏 南 445 Rs-F.352300-060722-5-2-2 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 宁 德 屏 南 447 Rs-F.352300-060722-6-1-2 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 宁 德 屏 南 448 Rs-F.352300-060722-6-2-1 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 宁 德 屏 南

230 449 Rs-F.352300-060722-6-2-2 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 宁 德 屏 南 450 Rs-F.352300-060722-7-1 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 宁 德 屏 南 451 Rs-F.352300-060722-7-2 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 宁 德 屏 南 1300 Rs-F.350112-070612-V2 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 福 州 营 口 1301 Rs-F.350112-070612-V3 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 福 州 营 口 1302 Rs-F.350112-070612-V4 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 福 州 营 口 1303 Rs-F.350112-070612-V5 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 福 州 营 口 1304 Rs-F.350112-070612-V6 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 福 州 营 口 1466 RSF-V-109 自 己 分 离 番 茄 根 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1468 RSF-V-117 自 己 分 离 番 茄 根 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1469 RSF-V-121 自 己 分 离 番 茄 根 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1470 RSF-V-125 自 己 分 离 番 茄 根 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1471 RSF-V-129 自 己 分 离 番 茄 根 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1445 RSF-V-14 自 己 分 离 番 茄 茎 基 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1446 RSF-V-99 自 己 分 离 番 茄 茎 基 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1447 RSF-V-100 自 己 分 离 番 茄 茎 基 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1448 RSF-V-103 自 己 分 离 番 茄 茎 基 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1449 RSF-V-106 自 己 分 离 番 茄 茎 基 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1452 RSF-A-26 自 己 分 离 番 茄 茎 中 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1453 RSF-A-27 自 己 分 离 番 茄 茎 中 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1454 RSF-A-30 自 己 分 离 番 茄 茎 中 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1455 RSF-A-31 自 己 分 离 番 茄 茎 中 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1457 RSF-V-97 自 己 分 离 番 茄 茎 中 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1458 RSF-A-98 自 己 分 离 番 茄 茎 中 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1459 RSF-V-102 自 己 分 离 番 茄 茎 中 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1460 RSF-V-115 自 己 分 离 番 茄 茎 中 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1461 RSF-V-116 自 己 分 离 番 茄 茎 中 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1462 RSF-V-119 自 己 分 离 番 茄 茎 中 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1463 RSF-V-122 自 己 分 离 番 茄 茎 中 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1473 RSF-V-111 自 己 分 离 番 茄 茎 中 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 青 枯 病 植 株 1102 Rs-F.351144-060928-14V 自 己 分 离 番 茄 1101 Rs-F.351144-060928-13V 自 己 分 离 番 茄 茎 顶 部 青 枯 病 植 株 茎 中 部 莆 田 东 洋 镇 莆 田 东 洋 镇 427 Rs-P.362200-060707-1-1 自 己 分 离 花 生 花 生 植 株 泉 州 晋 江

231 428 Rs-P.362200-060707-1-2 自 己 分 离 花 生 花 生 植 株 泉 州 晋 江 430 Rs-P.362200-060707-2-1 自 己 分 离 花 生 花 生 植 株 泉 州 晋 江 433 Rs-P.362200-060707-3-1 自 己 分 离 花 生 花 生 植 株 泉 州 晋 江 434 Rs-P.362200-060707-3-2 自 己 分 离 花 生 花 生 植 株 泉 州 晋 江 435 Rs-P.362200-060707-3-3 自 己 分 离 花 生 花 生 植 株 泉 州 晋 江 437 Rs-P.362200-060707-4-2 自 己 分 离 花 生 花 生 植 株 泉 州 晋 江 440 Rs-P.362200-060707-5-2 自 己 分 离 花 生 花 生 植 株 泉 州 晋 江 441 Rs-P.362200-060707-5-3 自 己 分 离 花 生 花 生 植 株 泉 州 晋 江 1441 RSJ-79-A 自 己 分 离 姜 茎 基 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1442 RSJ-86-A 自 己 分 离 姜 茎 基 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1443 RSJ-87-V 自 己 分 离 姜 茎 基 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1444 RSJ-88-A 自 己 分 离 姜 茎 基 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 74 Rs-L.1.4-010704-01V 自 己 分 离 辣 椒 辣 椒 植 株 福 州 永 泰 459 Rs-L.352300-060722-14-1-1 自 己 分 离 辣 椒 辣 椒 植 株 宁 德 屏 南 461 Rs-L.352300-060722-14-2-1 自 己 分 离 辣 椒 辣 椒 植 株 宁 德 屏 南 462 Rs-L.352300-060722-14-2-2 自 己 分 离 辣 椒 辣 椒 植 株 宁 德 屏 南 465 Rs-L.352300-060722-16-1-1 自 己 分 离 辣 椒 辣 椒 植 株 宁 德 屏 南 466 Rs-L.352300-060722-16-1-2 自 己 分 离 辣 椒 辣 椒 植 株 宁 德 屏 南 468 Rs-L.352300-060722-16-2-2 自 己 分 离 辣 椒 辣 椒 植 株 宁 德 屏 南 470 Rs-L.352300-060722-17-1-2 自 己 分 离 辣 椒 辣 椒 植 株 宁 德 屏 南 469 Eb-L.352300-060722-17-1-1 (Vibrio-hollisae) 自 己 分 离 辣 椒 辣 椒 植 株 宁 德 屏 南 472 Rs-L.352300-060722-17-2-2 自 己 分 离 辣 椒 辣 椒 植 株 宁 德 屏 南 473 Rs-L.352300-060722-18-1 自 己 分 离 辣 椒 辣 椒 植 株 宁 德 屏 南 474 Rs-L.352300-060722-18-2-1 自 己 分 离 辣 椒 辣 椒 植 株 宁 德 屏 南 475 Rs-L.352300-060722-18-2-2 自 己 分 离 辣 椒 辣 椒 植 株 宁 德 屏 南 476 Rs-L.352300-060722-20-1 自 己 分 离 辣 椒 辣 椒 植 株 宁 德 屏 南 健 康 植 株 根 1103 Rs-Q.351144-061019-01V 自 己 分 离 茄 子 部 莆 田 东 洋 镇 1307 Rs-Q.350112-070628-11V 自 己 分 离 茄 子 茄 子 - 根 福 州 营 口 70 Rs-Q.1.3-020626-5V 自 己 分 离 茄 子 茄 子 植 株 福 州 北 峰 73 Rs-Q.9.2-010620-V 自 己 分 离 茄 子 茄 子 植 株 南 平 452 Rs-Q.352300-060722-8-1-1 自 己 分 离 茄 子 茄 子 植 株 宁 德 屏 南 453 Rs-Q.352300-060722-8-2-1 自 己 分 离 茄 子 茄 子 植 株 宁 德 屏 南 454 Rs-Q.352300-060722-8-2-2 自 己 分 离 茄 子 茄 子 植 株 宁 德 屏 南

232 456 Rs-Q.352300-060722-9-1-2 自 己 分 离 茄 子 茄 子 植 株 宁 德 屏 南 458 Rs-Q.352300-060722-9-2-2 自 己 分 离 茄 子 茄 子 植 株 宁 德 屏 南 青 枯 病 植 株 1115 Rs-Q.351144-061107-11V 自 己 分 离 茄 子 1116 Rs-Q.351144-061107-12V 自 己 分 离 茄 子 1112 Rs-Q.351144-061024-12V 自 己 分 离 茄 子 根 部 青 枯 病 植 株 茎 基 部 青 枯 病 植 株 茎 基 部 莆 田 东 洋 镇 莆 田 东 洋 镇 莆 田 东 洋 镇 77 Rs-J.1.4-010704-01V 自 己 分 离 生 姜 生 姜 植 株 福 州 永 泰 78 Rs-J.1.4-010704-02A 自 己 分 离 生 姜 生 姜 植 株 福 州 永 泰 1231 Rs91-2-4# 自 己 分 离 培 养 基 本 实 验 室 1232 Rs91-3-5# 自 己 分 离 培 养 基 本 实 验 室 2.1.2 试 剂 与 仪 器 (1) 试 剂 ddw;dntp 购 自 福 州 博 海 生 物 技 术 有 限 公 司 ;Buffer,Taq 酶 购 自 北 京 天 根 生 化 科 技 有 限 公 司 ; 上 游 引 物 RS983442-1:5'-GAT CAT GAC CTG AAA ACC GC-3', 下 游 引 物 RS983442-2:5'-AAT CGA ATT TGA ATG CCA CC-3', 引 物 购 自 上 海 博 尚 有 限 公 司 ; 已 稀 释 青 枯 雷 尔 氏 菌 DNA 产 物 ;1500 bp Maker 购 自 上 海 英 竣 生 物 技 术 公 司 (2) 仪 器 UVP 凝 胶 成 像 仪 ;Biometra 梯 度 PCR 仪 ;BIO-RAD 电 泳 仪 ; 2.2 试 验 方 法 1. 扩 增 体 系 ddw:18.7 μl ; Buffer:2.5 μl; dntp:0.5 μl; RS983442-1:1 μl; RS983442-2:1 μl; Taq:0.3 μl; DNA:1 μl (2)PCR 程 序 95 C, 预 变 性 5 min; 然 后 95 C 变 性 30 s,64 C 退 火 30 s,72 C 延 伸 1 min, 进 行 30 个 循 环 ; 最 后 72 C 7 min PCR 产 物 可 在 4 C 保 存 (3) 电 泳 采 用 的 1.5% 胶 浓 度, 上 样 量 为 7 μl, 电 压 为 100 V; 凝 胶 成 像 观 测 PCR 结 果 3 试 验 结 果 3.1 bacteriophage protein GP46 序 列 PCR 扩 增 结 果 试 验 结 果 见 图 1-4 由 PCR 扩 增 结 果 可 以 看 出, 菌 株 编 号 FJAT-447 FJAT-448 FJAT-449

233 FJAT-1303 FJAT-1466 FJAT-1468 FJAT-1469 FJAT-1470 FJAT-1471 FJAT-1447 FJAT-1452 FJAT-1453 FJAT-1454 FJAT-1455 FJAT-1457 FJAT-1458 FJAT-1459 FJAT-1460 FJAT-1461 FJAT-1462 FJAT-1463 FJAT-1473 FJAT-428 FJAT-1307 FJAT-473 FJAT-474 FJAT-475 FJAT-73 FJAT-452 FJAT-453 FJAT-456 和 FJAT-458 通 过 该 引 物 在 近 400 bp 处 出 现 单 一 条 带, 并 且 这 些 菌 株 只 有 FJAT-1452 FJAT-1453 FJAT-1458 和 FJAT-1463 在 形 态 上 是 属 于 弱 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌, 其 他 的 均 为 强 致 病 青 枯 雷 尔 氏 菌 其 余 的 菌 株 均 在 未 出 现 条 带, 其 中 FJAT-54 FJAT-1441 FJAT-1442 FJAT-1443 FJAT-1444 FJAT-1112 FJAT-77 FJAT-476 和 FJAT-469 为 弱 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌, 其 余 的 强 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 图 1 不 同 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 在 引 物 RS983442PCR 扩 增 结 果 (1) 图 2 不 同 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 在 引 物 RS983442PCR 扩 增 结 果 (2) 图 3 不 同 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 在 引 物 RS983442PCR 扩 增 结 果 (3)

234 图 4 不 同 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 在 引 物 RS983442 PCR 扩 增 结 果 (4) 3.2 bacteriophage protein GP46 序 列 PCR 结 果 综 合 分 析 bacteriophage protein GP46 序 列 PCR 结 果 综 合 分 析 结 果 见 表 2 在 含 有 bacteriophage protein GP46 序 列 的 32 株 青 枯 雷 尔 氏 菌 中, 其 中 弱 化 指 数 在 强 致 病 性 区 域 24 株 青 枯 雷 尔 氏 菌 中 共 有 11 株 菌 株 含 有 bacteriophage protein GP46 序 列, 弱 化 指 数 在 过 渡 区 域 31 株 青 枯 雷 尔 氏 菌 中 共 有 12 株 菌 株 含 有 bacteriophage protein GP46 序 列, 弱 化 指 数 在 弱 致 病 性 区 域 29 株 青 枯 雷 尔 氏 菌 中 共 有 9 株 菌 株 含 有 bacteriophage protein GP46 序 列 表 2 bacteriophage protein GP46 PCR 结 果 中 有 目 标 条 带 菌 株 综 合 结 果 菌 株 编 号 寄 主 菌 株 原 产 地 平 均 值 类 群 强 弱 判 断 是 否 有 条 带 FJAT-1455 番 茄 南 平 建 瓯 0.522 V + FJAT-1101 番 茄 莆 田 莆 田 0.581 V - FJAT-0475 辣 椒 宁 德 屏 南 0.591 V + FJAT-1469 番 茄 南 平 建 瓯 0.594 V + FJAT-1459 番 茄 南 平 建 瓯 0.640 V + FJAT-0091 番 茄 福 州 北 峰 0.651 V - FJAT-1300 番 茄 福 州 营 口 0.652 V - FJAT-1448 番 茄 南 平 建 瓯 0.660 V - FJAT-0074 辣 椒 福 州 永 泰 0.663 V - FJAT-1462 番 茄 南 平 建 瓯 0.666 V + FJAT-0435 花 生 泉 州 晋 江 0.680 V - FJAT-0080 番 茄 福 州 北 峰 0.680 Ⅰ<0.74 V - FJAT-1449 番 茄 南 平 建 瓯 0.694 V - FJAT-1461 番 茄 南 平 建 瓯 0.699 V + FJAT-0452 茄 子 宁 德 屏 南 0.712 V + FJAT-1468 番 茄 南 平 建 瓯 0.716 V + FJAT-1102 番 茄 莆 田 莆 田 0.730 V - FJAT-0078 生 姜 福 州 永 泰 0.717 V - FJAT-0437 花 生 泉 州 晋 江 0.716 V - FJAT-1470 番 茄 南 平 建 瓯 0.729 V + FJAT-1471 番 茄 南 平 建 瓯 0.729 V + FJAT-0433 花 生 泉 州 晋 江 0.732 V - FJAT-1457 番 茄 南 平 建 瓯 0.736 V +

235 FJAT-0442 番 茄 宁 德 屏 南 0.730 V - FJAT-1445 番 茄 南 平 建 瓯 0.746 V - FJAT-0441 花 生 泉 州 晋 江 0.747 V - FJAT-1454 番 茄 南 平 建 瓯 0.753 V + FJAT-1446 番 茄 南 平 建 瓯 0.759 V - FJAT-0081 番 茄 福 州 北 峰 0.763 V - FJAT-1463 番 茄 南 平 建 瓯 0.767 A + FJAT-0434 花 生 泉 州 晋 江 0.768 V - FJAT-0469 辣 椒 宁 德 屏 南 0.772 A - FJAT-0465 辣 椒 宁 德 屏 南 0.772 V - FJAT-1307 茄 子 福 州 营 口 0.775 V + FJAT-1231 番 茄 本 实 验 室 0.775 V - FJAT-0449 番 茄 宁 德 屏 南 0.779 V + FJAT-0473 辣 椒 宁 德 屏 南 0.784 V + FJAT-0430 花 生 泉 州 晋 江 0.787 V - FJAT-1441 姜 南 平 建 瓯 0.786 A - FJAT-0427 花 生 泉 州 晋 江 0.791 0.74<Ⅱ<0.825 V - FJAT-1460 番 茄 南 平 建 瓯 0.795 V + FJAT-1458 番 茄 南 平 建 瓯 0.796 A + FJAT-1473 番 茄 南 平 建 瓯 0.796 V + FJAT-1112 茄 子 莆 田 东 洋 镇 0.799 A - FJAT-1466 番 茄 南 平 建 瓯 0.800 V + FJAT-0474 辣 椒 宁 德 屏 南 0.804 V + FJAT-0443 番 茄 宁 德 屏 南 0.808 V - FJAT-0462 辣 椒 宁 德 屏 南 0.809 V - FJAT-0049 番 茄 福 州 建 新 0.810 V - FJAT-0447 番 茄 宁 德 屏 南 0.814 V + FJAT-0428 花 生 泉 州 晋 江 0.812 V + FJAT-1302 番 茄 福 州 营 口 0.817 V - FJAT-0440 花 生 泉 州 晋 江 0.819 V - FJAT-0472 辣 椒 宁 德 屏 南 0.820 V - FJAT-1443 姜 南 平 建 瓯 0.822 V - FJAT-0448 番 茄 宁 德 屏 南 0.829 V + FJAT-1447 番 茄 南 平 建 瓯 0.830 V + FJAT-1442 姜 南 平 建 瓯 0.836 A - FJAT-0054 番 茄 福 州 北 峰 0.838 A - FJAT-1115 茄 子 莆 田 莆 田 0.847 V - FJAT-1301 番 茄 福 州 营 口 0.848 V - 0.825<Ⅲ FJAT-0456 茄 子 宁 德 屏 南 0.850 V + FJAT-1444 姜 南 平 建 瓯 0.855 A - FJAT-1303 番 茄 福 州 营 口 0.859 A + FJAT-1116 茄 子 莆 田 莆 田 0.859 V - FJAT-0070 茄 子 福 州 北 峰 0.865 V - FJAT-0470 辣 椒 宁 德 屏 南 0.865 V -

236 FJAT-0461 辣 椒 宁 德 屏 南 0.867 V - FJAT-0073 茄 子 南 平 0.868 V + FJAT-0458 茄 子 宁 德 屏 南 0.869 V + FJAT-1232 番 茄 本 实 验 室 0.870 V - FJAT-1453 番 茄 南 平 建 瓯 0.871 A + FJAT-0476 辣 椒 宁 德 屏 南 0.873 A - FJAT-0459 辣 椒 宁 德 屏 南 0.874 V - FJAT-0451 番 茄 宁 德 屏 南 0.875 V - FJAT-1103 茄 子 莆 田 东 洋 镇 0.887 V - FJAT-0453 番 茄 宁 德 屏 南 0.897 V + FJAT-0450 番 茄 宁 德 屏 南 0.899 V - FJAT-0445 番 茄 宁 德 屏 南 0.907 V - FJAT-0077 生 姜 福 州 永 泰 0.927 A - FJAT-0468 辣 椒 宁 德 屏 南 0.934 V - FJAT-1452 番 茄 南 平 建 瓯 0.935 A + FJAT-1304 番 茄 福 州 营 口 0.953 V - 4 试 验 讨 论 (1) 由 PCR 扩 增 结 果 可 以 看 出, 菌 株 编 号 FJAT-447 FJAT-448 FJAT-449 FJAT-1303 FJAT-1466 FJAT-1468 FJAT-1469 FJAT-1470 FJAT-1471 FJAT-1447 FJAT-1452 FJAT-1453 FJAT-1454 FJAT-1455 FJAT-1457 FJAT-1458 FJAT-1459 FJAT-1460 FJAT-1461 FJAT-1462 FJAT-1463 FJAT-1473 FJAT-428 FJAT-1307 FJAT-473 FJAT-474 FJAT-475 FJAT-73 FJAT-452 FJAT-453 FJAT-456 和 FJAT-458 通 过 该 引 物 在 近 400 bp 处 出 现 单 一 条 带, 并 且 这 些 菌 株 只 有 FJAT-1452 FJAT-1453 FJAT-1458 和 FJAT-1463 在 形 态 上 是 属 于 弱 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌, 其 他 的 均 为 强 致 病 青 枯 雷 尔 氏 菌 其 余 的 菌 株 均 在 未 出 现 条 带, 其 中 FJAT-54 FJAT-1441 FJAT-1442 FJAT-1443 FJAT-1444 FJAT-1112 FJAT-77 FJAT-476 和 FJAT-469 为 弱 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌, 其 余 的 强 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 (2) 在 含 有 bacteriophage protein GP46 序 列 的 32 株 青 枯 雷 尔 氏 菌 中, 其 中 弱 化 指 数 在 强 致 病 性 区 域 24 株 青 枯 雷 尔 氏 菌 中 共 有 11 株 菌 株 含 有 bacteriophage protein GP46 序 列, 弱 化 指 数 在 过 渡 区 域 31 株 青 枯 雷 尔 氏 菌 中 共 有 12 株 菌 株 含 有 bacteriophage protein GP46 序 列, 弱 化 指 数 在 弱 致 病 性 区 域 29 株 青 枯 雷 尔 氏 菌 中 共 有 9 株 菌 株 含 有 bacteriophage protein GP46 序 列 5.. 参 考 文 献 [1] Renmenant B, Coupat-Goutaland B, Guidot A, et al. Genomes of three tomato pathogens within the Ralstonia solanacearum species complex reveal significant evolutionary divergence[j]. BMC Genomics 2010, 11:379-395. [2] 石 元 春, 主 编, 2002, 20 世 纪 中 国 学 术 大 典 农 业 科 学, 福 建 教 育 出 版 社, 中 国, 福 州, pp. 277-278. [3] 杨 玉 红, 2008, 茄 科 植 物 青 枯 菌 病 害 研 究 进 展, 江 西 农 业 学 报, 20(5):54-55, 58 [4] 卫 红 萍, 2010, 茄 科 植 物 青 枯 病 发 生 及 防 治 策 略 研 究, 咸 宁 学 院 学 报, 30(8):164-16 试 验 负 责 车 建 美 刘 波 试 验 人 员 林 海 云

237 附 录 RS98orf03442 序 列 : ATGGATATCGAGCTTTTCTGGAACGCCGACGAGTGCCGTTGCGAATGGCGGCAGCGCCCGGAT GGCCAACTGGCGGTCGATCATGACCTGAAAACCGCAGCGCTGGTTTCGCTGTTCACCTGGCGC CGCGCCGAGGCGGGCGACCGCTTGCCGGACCCGAAGGGGCCGCGGCGCGGCTGGTGGGGTGA CCTGCTGGGCGCCAAGCCGATCGGCTCGCGCTTGTGGTTGCTCTCGCGCGAGAAACAGACCGC CGAGGTGGTGCGGCTGGCCAAGGAATACGCGGAGGAGGCGCTGGCCTGGCTGGTCGAGGACG GCGTCTGCAAGAGCGTCGACGTGATGAGCGAGATCGTGCGACCAGGCATGTTGGGGCTGCGGT GCCGCTTCACTCGGCCGGATGCTTCCCAGGTGGCATTCAAATTCGATTTCGCCTGGCAAAACCT CTCAACGATGACGAGCTGA

238 2011-08-08 承 担 单 位 : 福 建 省 农 科 院 农 业 生 物 资 源 研 究 所 试 验 设 计 : 试 验 项 目 : 青 枯 雷 尔 氏 菌 Integrase catalytic region 验 证 (RS980089) 试 验 人 员 : 林 海 云 试 验 负 责 : 车 建 美 刘 波 报 告 日 期 :2011-8-08 计 数 月 份 :2011 年 08 月 研 究 资 格 系 数 (0.5-1.0) 实 验 设 计 系 数 (0.9-1.0 0.9-1.0) 报 告 得 分 总 分 实 验 设 计 实 验 记 载 实 验 分 析 实 验 简 报 实 验 文 章 1-20% 21-40% 41-60% 61-80% 81-100% 1%-5% 设 计 不 足, 实 施 错 误 6%-10% 设 计 不 全, 实 验 无 果 11%-15% 设 计 可 以, 实 施 不 全 16%-20% 设 计 完 整, 分 布 实 施 21%-25% 实 验 不 全, 记 载 无 果 26%-30% 实 验 不 足, 记 载 不 全 31%-35% 独 立 实 验, 记 载 不 全 36%-40% 分 布 实 验, 记 载 完 整 41%-45% 目 的 明 确, 实 验 完 成 46%-50% 实 验 完 整, 记 载 清 晰 51%-55% 实 验 系 统, 结 果 可 信 56%-60% 实 验 创 新, 分 析 清 晰 61%-65% 实 验 创 新, 结 论 清 晰 66%-70% 实 验 完 整, 统 计 清 晰 71%-75% 实 验 系 统, 数 据 可 靠 76%-80% 报 告 完 整, 文 章 雏 形 81%-85% 结 构 合 理, 分 析 有 据 86%-90% 逻 辑 清 晰, 统 计 合 理 91%-95% 图 表 完 整, 写 作 流 畅 96%-100% 文 献 完 整, 发 表 水 平 福 建 省 农 业 科 学 院 农 业 生 物 资 源 研 究 所 农 业 微 生 物 研 究 中 心 电 话 : 0591-87882571, 传 真 : 0591-87882571 fjat.yzxz.com

239 1. 试 验 目 的 细 菌 性 青 枯 病 是 由 青 枯 雷 尔 氏 菌 引 起 的 一 种 重 要 土 传 植 物 病 害, 侵 染 寄 主 范 围 很 广 (Remenant, 2010), 据 报 道 青 枯 病 原 菌 可 侵 染 50 多 个 科 数 百 种 植 物, 包 括 花 生 番 茄 茄 子 和 辣 椒 等 经 济 作 物, 并 且 近 年 来 青 枯 病 在 中 国 继 续 加 重, 新 的 寄 主 也 在 不 断 地 被 发 现 ( 石 元 春, 2002), 其 中 茄 科 植 物 受 青 枯 病 危 害 最 重, 涉 及 的 作 物 种 类 最 多 ( 杨 玉 红, 2008) 青 枯 病 原 菌 是 一 个 复 杂 的 群 体, 在 寄 主 范 围 生 化 型 致 病 力 和 血 清 型 等 细 菌 学 特 性 上 差 异 很 大, 这 导 致 其 病 害 防 治 较 为 困 难, 使 其 成 为 世 界 上 危 害 最 大 分 布 最 广 和 造 成 损 失 最 为 严 重 的 植 物 病 害 之 一 ( 卫 红 萍, 2010) ; 由 于 青 枯 雷 尔 氏 菌 的 复 杂 性, 导 致 其 致 病 机 制 也 十 分 复 杂, 只 有 通 过 对 青 枯 雷 尔 氏 菌 致 病 机 制 的 更 深 入 地 研 究, 才 有 可 能 找 到 控 制 它 的 有 效 方 法 本 实 验 室 已 对 强 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 FJAT-91 和 弱 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 FJAT-1458 测 通 其 全 序 列, 测 序 结 果 分 析 可 知, 强 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 FJAT-91 和 弱 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 FJAT-1458 存 在 一 系 列 差 异 基 因, 其 中 在 强 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 FJAT-91 存 在 的 基 因 而 在 弱 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 FJAT-1458 不 存 在 的 基 因 有 225 个 ( 强 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 FJAT-91 特 异 性 获 得 基 因 ), 而 在 弱 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 FJAT-1458 存 在 而 在 强 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 不 存 在 的 基 因 有 360 个 ( 弱 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 特 异 性 获 得 基 因 ) 本 试 验 基 于 弱 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 FJAT-1458 特 异 性 获 得 基 因 Integrase catalytic region( 整 合 酶 催 化 区 域 ), 整 合 酶 (Integrase) 是 帮 助 逆 转 录 病 毒 把 携 带 病 毒 遗 传 信 息 的 DNA 整 合 到 宿 主 的 DNA 的 酶 通 常 由 病 毒 自 身 携 带, 并 且 不 存 在 于 宿 主 细 胞 该 基 因 在 本 试 验 中 的 编 号 为 RS98orf00089, 该 基 因 全 长 为 2841 bp, 本 试 验 基 于 批 处 理 软 件 设 计 了 一 对 引 物 (RS980089-1 和 RS9800893-2), 该 对 引 物 可 在 弱 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 FJAT-1458 扩 增 出 300 bp 目 的 条 带, 而 在 强 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 FJAT-91 不 能 扩 增 出 条 带 ( 已 在 梯 度 试 验 中 验 证 ), 本 试 验 利 用 该 对 引 物 对 菌 种 库 中 所 有 青 枯 雷 尔 氏 菌, 以 验 证 该 基 因 是 否 只 在 弱 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 存 在, 而 在 强 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 不 存 在? 以 进 一 步 对 青 枯 雷 尔 氏 菌 致 病 机 制 进 行 探 索 2. 试 验 方 法 2.1 试 验 材 料 2.1.1 菌 株 : 试 验 菌 株 及 来 源 见 表 1 表 1 菌 株 以 及 来 源 菌 株 编 号 名 称 来 源 物 种 分 离 基 物 菌 株 原 产 地 49 Rs-F.1.1-010615-04V 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 福 州 建 新 54 Rs-F.1.3-010702-09V 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 福 州 北 峰 80 Rs-F.1.3-010702-01V-f2 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 福 州 北 峰 81 Rs-F.1.3-010702-01V-f3 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 福 州 北 峰 91 Rs-F.1.3-010702-01V-f13 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 福 州 北 峰 442 Rs-F.352300-060722-5-1-1 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 宁 德 屏 南 443 Rs-F.352300-060722-5-1-2 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 宁 德 屏 南 445 Rs-F.352300-060722-5-2-2 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 宁 德 屏 南 447 Rs-F.352300-060722-6-1-2 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 宁 德 屏 南 448 Rs-F.352300-060722-6-2-1 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 宁 德 屏 南

240 449 Rs-F.352300-060722-6-2-2 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 宁 德 屏 南 450 Rs-F.352300-060722-7-1 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 宁 德 屏 南 451 Rs-F.352300-060722-7-2 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 宁 德 屏 南 1300 Rs-F.350112-070612-V2 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 福 州 营 口 1301 Rs-F.350112-070612-V3 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 福 州 营 口 1302 Rs-F.350112-070612-V4 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 福 州 营 口 1303 Rs-F.350112-070612-V5 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 福 州 营 口 1304 Rs-F.350112-070612-V6 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 福 州 营 口 1466 RSF-V-109 自 己 分 离 番 茄 根 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1468 RSF-V-117 自 己 分 离 番 茄 根 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1469 RSF-V-121 自 己 分 离 番 茄 根 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1470 RSF-V-125 自 己 分 离 番 茄 根 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1471 RSF-V-129 自 己 分 离 番 茄 根 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1445 RSF-V-14 自 己 分 离 番 茄 茎 基 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1446 RSF-V-99 自 己 分 离 番 茄 茎 基 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1447 RSF-V-100 自 己 分 离 番 茄 茎 基 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1448 RSF-V-103 自 己 分 离 番 茄 茎 基 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1449 RSF-V-106 自 己 分 离 番 茄 茎 基 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1452 RSF-A-26 自 己 分 离 番 茄 茎 中 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1453 RSF-A-27 自 己 分 离 番 茄 茎 中 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1454 RSF-A-30 自 己 分 离 番 茄 茎 中 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1455 RSF-A-31 自 己 分 离 番 茄 茎 中 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1457 RSF-V-97 自 己 分 离 番 茄 茎 中 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1458 RSF-A-98 自 己 分 离 番 茄 茎 中 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1459 RSF-V-102 自 己 分 离 番 茄 茎 中 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1460 RSF-V-115 自 己 分 离 番 茄 茎 中 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1461 RSF-V-116 自 己 分 离 番 茄 茎 中 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1462 RSF-V-119 自 己 分 离 番 茄 茎 中 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1463 RSF-V-122 自 己 分 离 番 茄 茎 中 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1473 RSF-V-111 自 己 分 离 番 茄 茎 中 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 青 枯 病 植 株 1102 Rs-F.351144-060928-14V 自 己 分 离 番 茄 1101 Rs-F.351144-060928-13V 自 己 分 离 番 茄 茎 顶 部 青 枯 病 植 株 茎 中 部 莆 田 东 洋 镇 莆 田 东 洋 镇 427 Rs-P.362200-060707-1-1 自 己 分 离 花 生 花 生 植 株 泉 州 晋 江

241 428 Rs-P.362200-060707-1-2 自 己 分 离 花 生 花 生 植 株 泉 州 晋 江 430 Rs-P.362200-060707-2-1 自 己 分 离 花 生 花 生 植 株 泉 州 晋 江 433 Rs-P.362200-060707-3-1 自 己 分 离 花 生 花 生 植 株 泉 州 晋 江 434 Rs-P.362200-060707-3-2 自 己 分 离 花 生 花 生 植 株 泉 州 晋 江 435 Rs-P.362200-060707-3-3 自 己 分 离 花 生 花 生 植 株 泉 州 晋 江 437 Rs-P.362200-060707-4-2 自 己 分 离 花 生 花 生 植 株 泉 州 晋 江 440 Rs-P.362200-060707-5-2 自 己 分 离 花 生 花 生 植 株 泉 州 晋 江 441 Rs-P.362200-060707-5-3 自 己 分 离 花 生 花 生 植 株 泉 州 晋 江 1441 RSJ-79-A 自 己 分 离 姜 茎 基 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1442 RSJ-86-A 自 己 分 离 姜 茎 基 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1443 RSJ-87-V 自 己 分 离 姜 茎 基 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1444 RSJ-88-A 自 己 分 离 姜 茎 基 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 74 Rs-L.1.4-010704-01V 自 己 分 离 辣 椒 辣 椒 植 株 福 州 永 泰 459 Rs-L.352300-060722-14-1-1 自 己 分 离 辣 椒 辣 椒 植 株 宁 德 屏 南 461 Rs-L.352300-060722-14-2-1 自 己 分 离 辣 椒 辣 椒 植 株 宁 德 屏 南 462 Rs-L.352300-060722-14-2-2 自 己 分 离 辣 椒 辣 椒 植 株 宁 德 屏 南 465 Rs-L.352300-060722-16-1-1 自 己 分 离 辣 椒 辣 椒 植 株 宁 德 屏 南 466 Rs-L.352300-060722-16-1-2 自 己 分 离 辣 椒 辣 椒 植 株 宁 德 屏 南 468 Rs-L.352300-060722-16-2-2 自 己 分 离 辣 椒 辣 椒 植 株 宁 德 屏 南 470 Rs-L.352300-060722-17-1-2 自 己 分 离 辣 椒 辣 椒 植 株 宁 德 屏 南 469 Eb-L.352300-060722-17-1-1 (Vibrio-hollisae) 自 己 分 离 辣 椒 辣 椒 植 株 宁 德 屏 南 472 Rs-L.352300-060722-17-2-2 自 己 分 离 辣 椒 辣 椒 植 株 宁 德 屏 南 473 Rs-L.352300-060722-18-1 自 己 分 离 辣 椒 辣 椒 植 株 宁 德 屏 南 474 Rs-L.352300-060722-18-2-1 自 己 分 离 辣 椒 辣 椒 植 株 宁 德 屏 南 475 Rs-L.352300-060722-18-2-2 自 己 分 离 辣 椒 辣 椒 植 株 宁 德 屏 南 476 Rs-L.352300-060722-20-1 自 己 分 离 辣 椒 辣 椒 植 株 宁 德 屏 南 健 康 植 株 根 1103 Rs-Q.351144-061019-01V 自 己 分 离 茄 子 部 莆 田 东 洋 镇 1307 Rs-Q.350112-070628-11V 自 己 分 离 茄 子 茄 子 - 根 福 州 营 口 70 Rs-Q.1.3-020626-5V 自 己 分 离 茄 子 茄 子 植 株 福 州 北 峰 73 Rs-Q.9.2-010620-V 自 己 分 离 茄 子 茄 子 植 株 南 平 452 Rs-Q.352300-060722-8-1-1 自 己 分 离 茄 子 茄 子 植 株 宁 德 屏 南 453 Rs-Q.352300-060722-8-2-1 自 己 分 离 茄 子 茄 子 植 株 宁 德 屏 南 454 Rs-Q.352300-060722-8-2-2 自 己 分 离 茄 子 茄 子 植 株 宁 德 屏 南

242 456 Rs-Q.352300-060722-9-1-2 自 己 分 离 茄 子 茄 子 植 株 宁 德 屏 南 458 Rs-Q.352300-060722-9-2-2 自 己 分 离 茄 子 茄 子 植 株 宁 德 屏 南 青 枯 病 植 株 1115 Rs-Q.351144-061107-11V 自 己 分 离 茄 子 1116 Rs-Q.351144-061107-12V 自 己 分 离 茄 子 1112 Rs-Q.351144-061024-12V 自 己 分 离 茄 子 根 部 青 枯 病 植 株 茎 基 部 青 枯 病 植 株 茎 基 部 莆 田 东 洋 镇 莆 田 东 洋 镇 莆 田 东 洋 镇 77 Rs-J.1.4-010704-01V 自 己 分 离 生 姜 生 姜 植 株 福 州 永 泰 78 Rs-J.1.4-010704-02A 自 己 分 离 生 姜 生 姜 植 株 福 州 永 泰 1231 Rs91-2-4# 自 己 分 离 培 养 基 本 实 验 室 1232 Rs91-3-5# 自 己 分 离 培 养 基 本 实 验 室 2.1.2 试 剂 与 仪 器 (1) 试 剂 ddw;dntp 购 自 福 州 博 海 生 物 技 术 有 限 公 司 ;Buffer,Taq 酶 购 自 北 京 天 根 生 化 科 技 有 限 公 司 ; 上 游 引 物 RS980089-1:5'-ATG ATG GTC ATT CGG GAC AT -3', 下 游 引 物 RS980089-2:5'-GTG GTC ACT CCT GAG TGG GT-3', 引 物 购 自 上 海 博 尚 有 限 公 司 ; 已 稀 释 青 枯 雷 尔 氏 菌 DNA 产 物 ;1500 bp Maker 购 自 上 海 英 竣 生 物 技 术 公 司 (2) 仪 器 UVP 凝 胶 成 像 仪 ;Biometra 梯 度 PCR 仪 ;BIO-RAD 电 泳 仪 ; 2.2 试 验 方 法 1. 扩 增 体 系 ddw:18.7 μl ; Buffer:2.5 μl; dntp:0.5 μl; RS980089-1:1 μl; RS980089-2:1 μl; Taq:0.3 μl; DNA:1 μl (2)PCR 程 序 95 C, 预 变 性 5 min; 然 后 95 C 变 性 30 s,64 C 退 火 30 s,72 C 延 伸 1 min, 进 行 30 个 循 环 ; 最 后 72 C 7 min PCR 产 物 可 在 4 C 保 存 2. 电 泳 采 用 的 1.5% 胶 浓 度, 上 样 量 为 7 μl, 电 压 为 100 V; 凝 胶 成 像 观 测 PCR 结 果 3. 试 验 结 果 3.1 Integrase catalytic region 序 列 PCR 扩 增 结 果 试 验 结 果 见 图 1-4 由 PCR 扩 增 结 果 可 以 看 出, 菌 株 编 号 FJAT-447 FJAT-448 FJAT-449

243 FJAT-1303 FJAT-1466 FJAT-1468 FJAT-1469 FJAT-1470 FJAT-1471 FJAT-1447 FJAT-1452 FJAT-1453 FJAT-1454 FJAT-1455 FJAT-1457 FJAT-1458 FJAT-1459 FJAT-1460 FJAT-1461 FJAT-1462 FJAT-1463 FJAT-1473 FJAT-1307 FJAT-452 FJAT-453 FJAT-456 和 FJAT-458 通 过 该 引 物 在 近 400 bp 处 出 现 单 一 条 带, 并 且 这 些 菌 株 只 有 FJAT-1452 FJAT-1453 FJAT-1458 和 FJAT-1463 在 形 态 上 是 属 于 弱 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌, 其 他 的 均 为 强 致 病 青 枯 雷 尔 氏 菌 其 余 的 菌 株 均 在 未 出 现 条 带, 其 中 FJAT-54 FJAT-1441 FJAT-1442 FJAT-1443 FJAT-1444 FJAT-1112 FJAT-77 FJAT-476 和 FJAT-469 为 弱 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌, 其 余 的 强 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 图 1 不 同 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 在 引 物 RS980089PCR 扩 增 结 果 (1) 图 2 不 同 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 在 引 物 RS980089PCR 扩 增 结 果 (2) 图 3 不 同 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 在 引 物 RS980089PCR 扩 增 结 果 (3)

244 图 4 不 同 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 在 引 物 RS980089 PCR 扩 增 结 果 (4) 3.2 Integrase catalytic region 序 列 PCR 结 果 综 合 分 析 Integrase catalytic region 序 列 PCR 结 果 综 合 分 析 结 果 见 表 2 在 含 有 Integrase catalytic region 序 列 的 27 株 青 枯 雷 尔 氏 菌 中, 其 中 弱 化 指 数 在 强 致 病 性 区 域 24 株 青 枯 雷 尔 氏 菌 中 共 有 10 株 菌 株 含 有 Integrase catalytic region 序 列, 弱 化 指 数 在 过 渡 区 域 31 株 青 枯 雷 尔 氏 菌 中 共 有 9 株 菌 株 含 有 Integrase catalytic region 序 列, 弱 化 指 数 在 弱 致 病 性 区 域 29 株 青 枯 雷 尔 氏 菌 中 共 有 8 株 菌 株 含 有 Integrase catalytic region 序 列 表 2 Integrase catalytic region PCR 结 果 中 有 目 标 条 带 菌 株 综 合 结 果 菌 株 编 号 寄 主 菌 株 原 产 地 平 均 值 类 群 强 弱 判 断 是 否 有 条 带 FJAT-1455 番 茄 南 平 建 瓯 0.522 V + FJAT-1101 番 茄 莆 田 莆 田 0.581 V - FJAT-0475 辣 椒 宁 德 屏 南 0.591 V - FJAT-1469 番 茄 南 平 建 瓯 0.594 V + FJAT-1459 番 茄 南 平 建 瓯 0.640 V + FJAT-0091 番 茄 福 州 北 峰 0.651 V - FJAT-1300 番 茄 福 州 营 口 0.652 V - FJAT-1448 番 茄 南 平 建 瓯 0.660 V - FJAT-0074 辣 椒 福 州 永 泰 0.663 V - FJAT-1462 番 茄 南 平 建 瓯 0.666 V + FJAT-0435 花 生 泉 州 晋 江 0.680 Ⅰ<0.74 V - FJAT-0080 番 茄 福 州 北 峰 0.680 V - FJAT-1449 番 茄 南 平 建 瓯 0.694 V - FJAT-1461 番 茄 南 平 建 瓯 0.699 V + FJAT-0452 茄 子 宁 德 屏 南 0.712 V + FJAT-1468 番 茄 南 平 建 瓯 0.716 V + FJAT-1102 番 茄 莆 田 莆 田 0.730 V - FJAT-0078 生 姜 福 州 永 泰 0.717 V - FJAT-0437 花 生 泉 州 晋 江 0.716 V - FJAT-1470 番 茄 南 平 建 瓯 0.729 V + FJAT-1471 番 茄 南 平 建 瓯 0.729 V +

245 FJAT-0433 花 生 泉 州 晋 江 0.732 V - FJAT-1457 番 茄 南 平 建 瓯 0.736 V + FJAT-0442 番 茄 宁 德 屏 南 0.730 V - FJAT-1445 番 茄 南 平 建 瓯 0.746 V - FJAT-0441 花 生 泉 州 晋 江 0.747 V - FJAT-1454 番 茄 南 平 建 瓯 0.753 V + FJAT-1446 番 茄 南 平 建 瓯 0.759 V - FJAT-0081 番 茄 福 州 北 峰 0.763 V - FJAT-1463 番 茄 南 平 建 瓯 0.767 A + FJAT-0434 花 生 泉 州 晋 江 0.768 V - FJAT-0469 辣 椒 宁 德 屏 南 0.772 A - FJAT-0465 辣 椒 宁 德 屏 南 0.772 V - FJAT-1307 茄 子 福 州 营 口 0.775 V + FJAT-1231 番 茄 本 实 验 室 0.775 V - FJAT-0449 番 茄 宁 德 屏 南 0.779 V + FJAT-0473 辣 椒 宁 德 屏 南 0.784 V - FJAT-0430 花 生 泉 州 晋 江 0.787 V - FJAT-1441 姜 南 平 建 瓯 0.786 A - FJAT-0427 花 生 泉 州 晋 江 0.791 0.74<Ⅱ<0.825 V - FJAT-1460 番 茄 南 平 建 瓯 0.795 V + FJAT-1458 番 茄 南 平 建 瓯 0.796 A + FJAT-1473 番 茄 南 平 建 瓯 0.796 V + FJAT-1112 茄 子 莆 田 东 洋 镇 0.799 A - FJAT-1466 番 茄 南 平 建 瓯 0.800 V + FJAT-0474 辣 椒 宁 德 屏 南 0.804 V - FJAT-0443 番 茄 宁 德 屏 南 0.808 V - FJAT-0462 辣 椒 宁 德 屏 南 0.809 V - FJAT-0049 番 茄 福 州 建 新 0.810 V - FJAT-0447 番 茄 宁 德 屏 南 0.814 V + FJAT-0428 花 生 泉 州 晋 江 0.812 V - FJAT-1302 番 茄 福 州 营 口 0.817 V - FJAT-0440 花 生 泉 州 晋 江 0.819 V - FJAT-0472 辣 椒 宁 德 屏 南 0.820 V - FJAT-1443 姜 南 平 建 瓯 0.822 V - FJAT-0448 番 茄 宁 德 屏 南 0.829 V + FJAT-1447 番 茄 南 平 建 瓯 0.830 V + FJAT-1442 姜 南 平 建 瓯 0.836 A - FJAT-0054 番 茄 福 州 北 峰 0.838 A - FJAT-1115 茄 子 莆 田 莆 田 0.847 V - 0.825<Ⅲ FJAT-1301 番 茄 福 州 营 口 0.848 V - FJAT-0456 茄 子 宁 德 屏 南 0.850 V + FJAT-1444 姜 南 平 建 瓯 0.855 A - FJAT-1303 番 茄 福 州 营 口 0.859 A + FJAT-1116 茄 子 莆 田 莆 田 0.859 V -

246 FJAT-0070 茄 子 福 州 北 峰 0.865 V - FJAT-0470 辣 椒 宁 德 屏 南 0.865 V - FJAT-0461 辣 椒 宁 德 屏 南 0.867 V - FJAT-0073 茄 子 南 平 0.868 V - FJAT-0458 茄 子 宁 德 屏 南 0.869 V + FJAT-1232 番 茄 本 实 验 室 0.870 V - FJAT-1453 番 茄 南 平 建 瓯 0.871 A + FJAT-0476 辣 椒 宁 德 屏 南 0.873 A - FJAT-0459 辣 椒 宁 德 屏 南 0.874 V - FJAT-0451 番 茄 宁 德 屏 南 0.875 V - FJAT-1103 茄 子 莆 田 东 洋 镇 0.887 V - FJAT-0453 番 茄 宁 德 屏 南 0.897 V + FJAT-0450 番 茄 宁 德 屏 南 0.899 V - FJAT-0445 番 茄 宁 德 屏 南 0.907 V - FJAT-0077 生 姜 福 州 永 泰 0.927 A - FJAT-0468 辣 椒 宁 德 屏 南 0.934 V - FJAT-1452 番 茄 南 平 建 瓯 0.935 A + FJAT-1304 番 茄 福 州 营 口 0.953 V - 4. 试 验 讨 论 (1) 由 PCR 扩 增 结 果 可 以 看 出, 菌 株 编 号 FJAT-447 FJAT-448 FJAT-449 FJAT-1303 FJAT-1466 FJAT-1468 FJAT-1469 FJAT-1470 FJAT-1471 FJAT-1447 FJAT-1452 FJAT-1453 FJAT-1454 FJAT-1455 FJAT-1457 FJAT-1458 FJAT-1459 FJAT-1460 FJAT-1461 FJAT-1462 FJAT-1463 FJAT-1473 FJAT-1307 FJAT-452 FJAT-453 FJAT-456 和 FJAT-458 通 过 该 引 物 在 近 400 bp 处 出 现 单 一 条 带, 并 且 这 些 菌 株 只 有 FJAT-1452 FJAT-1453 FJAT-1458 和 FJAT-1463 在 形 态 上 是 属 于 弱 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌, 其 他 的 均 为 强 致 病 青 枯 雷 尔 氏 菌 其 余 的 菌 株 均 在 未 出 现 条 带, 其 中 FJAT-54 FJAT-1441 FJAT-1442 FJAT-1443 FJAT-1444 FJAT-1112 FJAT-77 FJAT-476 和 FJAT-469 为 弱 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌, 其 余 的 强 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 (4) 在 含 有 Integrase catalytic region 序 列 的 27 株 青 枯 雷 尔 氏 菌 中, 其 中 弱 化 指 数 在 强 致 病 性 区 域 24 株 青 枯 雷 尔 氏 菌 中 共 有 10 株 菌 株 含 有 Integrase catalytic region 序 列, 弱 化 指 数 在 过 渡 区 域 31 株 青 枯 雷 尔 氏 菌 中 共 有 9 株 菌 株 含 有 Integrase catalytic region 序 列, 弱 化 指 数 在 弱 致 病 性 区 域 29 株 青 枯 雷 尔 氏 菌 中 共 有 8 株 菌 株 含 有 Integrase catalytic region 序 列 5.. 参 考 文 献 [1] Renmenant B, Coupat-Goutaland B, Guidot A, et al. Genomes of three tomato pathogens within the Ralstonia solanacearum species complex reveal significant evolutionary divergence[j]. BMC Genomics 2010, 11:379-395. [2] 石 元 春, 主 编, 2002, 20 世 纪 中 国 学 术 大 典 农 业 科 学, 福 建 教 育 出 版 社, 中 国, 福 州, pp. 277-278. [3] 杨 玉 红, 2008, 茄 科 植 物 青 枯 菌 病 害 研 究 进 展, 江 西 农 业 学 报, 20(5):54-55, 58 [4] 卫 红 萍, 2010, 茄 科 植 物 青 枯 病 发 生 及 防 治 策 略 研 究, 咸 宁 学 院 学 报, 30(8):164-16 试 验 负 责 车 建 美 刘 波 试 验 人 员 林 海 云

247 附 录 RS98orf00089 序 列 : ATGAGGCTTGCTTCGACCGAACCCGCCTTCCAGCCGAAGTGGGTCGCCATTGAAGCCGCGTGGTCAGACGGCA ATCCCTTTGGTCGGGACGTGCTCCCCCCGTACTCCGACGCGGAGCTCGAAGGTCTCTTTGATGAATGGGGAACG CCCCCTTCGGGGCGGGCCTTCGTGAGGCGAGCCCGGCGCGATGGGCCGGTACGTGAGGTCGAGTCGCGGAGAG GCAACCTCATCTCGCGCTACACGCCGCGAAAGATGAACGGCCGTCGCCAATCGACCGAGAGCCTCGGGCCGGA GTATGCGGCTGTGATTCGCTATGACCTGGACAACTTCACGCGGGAGTTCTACTGCCAGCCAGGCACAGTCCGCG TCAACATCAAGGTGGAGCGAAAAGCAAAGGAGGGGGAGAAGACGTTTACAACCCAGTCCGTCGAGTGCACGC CGGACATTCTGTGCATTACGCCGCACGGCCTATTTATCGATGAATGGAAAACGGAACATGACCTCCTAAAGTTGC TGGAGAAGTATCCGCATCGATTTCAGAAGTGCGATGGGGACTGGCAGTGTCCAGAACGTGAGGCGTACTTTCGC GATAACTTGGGGATTACGTATCGCTTGCGGTCCTCTGCGGAACACAACCCTCGCTTTGTATCAAACCTGGAGTTT CTGCGGGACTACCTGTGTGGCGTATCGACACCACTGTCTTCCACTGCGTGGAAGGCGATGTCGTCGGTGTTGGA GCCTGTGGGCCGAATTTCACTTCAACGCTTGCTCGAGCATGCCCGGCAGCCGCTGACGCCATGGGATTTTTCGTG CATCGACGAGACGACAGTTGATGGATTTACTGTCGACGACATCTACAAGGCTATCGCCGAGCAAAAGGTCTTTG TCGACTTGTTCCACGACGACCTCACTGAACCCCACGAAACGGTACTCTGCTGCTCGCGCGAACAGCTCGAATGG GTTCGTGCCAGCAGACCAGTTCGACATGCCATATCCGAGGAGGTGGCCTTCAATGTGCATGAGGGAACGTCTTT CGTTCGAGGGCGAGAAGTATGCACGGTCAAGAGCGTGGGCAATGAGAACCTCAGTTTTGTGAGCGAAGGTGGT GAGGAGGCCAGCATGCCGTTGGCGCTCTTCGAAAAGATGCTCGACCGACGCGACGTGCAAATCCTGCGACCGC TTCAGAGCACCGAGGACCGCCTCGCAGAACTTGAGAATCCAGGTGACCAGCGTATTGCGGAGGCTTTGCGGCG TTTTCAGCTCGTGGAGGCATCCAAACATGGCAAGCCAAAGCATCAACACTCGCTTCGTACGCTTCAGCGTTACA AGGAAGCAGTAAAGAGGGCCGGCCCCGCCTACTGGGACCAAGTACATAGCTTGACGCCGAAAAAGCCTGGCGG AGGGAGGGCCCAAATATCGGCATTGGCATTGGAGCTTATCCGAGAGGTTGCACGCCAAACGAATACACCGGAGA ACCCTCTGGATGCCAACGCATATCGGCGCTACGTAAAGCTGAGTCGGGAGAAGGGTGTGCCCACCGTCTCACGC AAGACTTTCTATGTCCACTTTGGTCTCGAGAAGGATGTTCTGAAGAGACAAGGTAGTCGCGCCGCTTACAACGA AGAGCCTGCGGCTTGGTACTTGTCCCGCCAAGACAAGATTCACGGTGGCAGACCATTTCACATCGTTCACATCG ACCATACAAAGCTCGACATCCTCATCAAGATTCAAGGGCATGGCGGACGTTGGCATACCTACCGTCCCTGGCTCA CGGTGGCGATTGATGCGGAGACCCGCTCGGTGGTCGGCTTCTATTTGAGCATCCATACGCCGAGTACCGTCTCCT GCATGATGGTCATTCGGGACATGGTGTCTCGACACAGGCGAATGCCGGAAATCATTCTCGTCGATAACGGAAAG GAGTTTCGTTCCGCTGCATTCGAGATGCTGTGCGCCAAAGCTCGGACAACCCTACGGTTCCGTCCACCGCACAA ATCACGGTTCGGTTCGGTTTGCGAAAGGCTGTTTGGAACCACAAACACACTGCTGATTCACAACCTCATTGGCA ATACCAAGGCGTTACAAAAGGTTCGGACGGTGACGCGTTCGGTGGACCCACTCAGGAGTGACCACCTCACATTC CCCCAACTGCACGGTATCTTGGAATACTTCTTCTTCGACCAGTACAACAATCGCGTTCACCCAGCACACGACCAT ACTCCGAATGAATACATGACTCGGCGTTTCGCCGAGACGGGGCTTCGTTTGGAAAGGCATGTTCCCTTCAATCAA AGGTTTCTGATTGAGACCTGCGTGCCGCCCGTTCGCAACGTACCGCACTCAATTGACCGTCAGATGGGCATCAA GATTGGGCCCGTTCACTATTGGGCGGACGACTTCGCTGACCGCCGGTTCAACCAGAAGAAGGCCGAGGTCCGG ATAGATATGTGGGATGTGTCGACTATCTGGGCCAACATCAGCGGCGTTTGGGTTAAATGCGTGTCGAAGCTGCTC ATGCAATTTCGTCAGCTCACTAGCATCGAGTTGCGCTACGCATTCGACTACATACGGAAGCGCTTGGGCGGCTCA CTCCGCAACCCGACGGAAAAGGAAATTGTCGCGTCGACGAGTGACTACCTCCAGCAATTGCAGCTCGGGAACG TTGGCCAAGCGACAGCCTCAACCGCTGAGACCTATGCCGCGAAGGGCACGGCCGCGACCACAGTGCGCGCCGA ACCGACCAGTCCCTCGCATCCCGTACCAGCGCCTCCGACCCCGTCGGTCGCCCGGAAGGCATCGGATTACCAGT ATGGTTCTCGCGGGACGCTAAAGCAGCTTTGA

248 2011-08-09 承 担 单 位 : 福 建 省 农 科 院 农 业 生 物 资 源 研 究 所 试 验 设 计 : 试 验 项 目 : 青 枯 雷 尔 氏 菌 DNA-dependent RNA polymerase 验 证 (RS980192) 试 验 人 员 : 林 海 云 试 验 负 责 : 车 建 美 刘 波 报 告 日 期 :2011-8-09 计 数 月 份 :2011 年 08 月 研 究 资 格 系 数 (0.5-1.0) 实 验 设 计 系 数 (0.9-1.0 0.9-1.0) 报 告 得 分 总 分 实 验 设 计 实 验 记 载 实 验 分 析 实 验 简 报 实 验 文 章 1-20% 21-40% 41-60% 61-80% 81-100% 1%-5% 设 计 不 足, 实 施 错 误 6%-10% 设 计 不 全, 实 验 无 果 11%-15% 设 计 可 以, 实 施 不 全 16%-20% 设 计 完 整, 分 布 实 施 21%-25% 实 验 不 全, 记 载 无 果 26%-30% 实 验 不 足, 记 载 不 全 31%-35% 独 立 实 验, 记 载 不 全 36%-40% 分 布 实 验, 记 载 完 整 41%-45% 目 的 明 确, 实 验 完 成 46%-50% 实 验 完 整, 记 载 清 晰 51%-55% 实 验 系 统, 结 果 可 信 56%-60% 实 验 创 新, 分 析 清 晰 61%-65% 实 验 创 新, 结 论 清 晰 66%-70% 实 验 完 整, 统 计 清 晰 71%-75% 实 验 系 统, 数 据 可 靠 76%-80% 报 告 完 整, 文 章 雏 形 81%-85% 结 构 合 理, 分 析 有 据 86%-90% 逻 辑 清 晰, 统 计 合 理 91%-95% 图 表 完 整, 写 作 流 畅 96%-100% 文 献 完 整, 发 表 水 平 福 建 省 农 业 科 学 院 农 业 生 物 资 源 研 究 所 农 业 微 生 物 研 究 中 心 电 话 : 0591-87882571, 传 真 : 0591-87882571 fjat.yzxz.com

249 1. 试 验 目 的 细 菌 性 青 枯 病 是 由 青 枯 雷 尔 氏 菌 引 起 的 一 种 重 要 土 传 植 物 病 害, 侵 染 寄 主 范 围 很 广 (Remenant, 2010), 据 报 道 青 枯 病 原 菌 可 侵 染 50 多 个 科 数 百 种 植 物, 包 括 花 生 番 茄 茄 子 和 辣 椒 等 经 济 作 物, 并 且 近 年 来 青 枯 病 在 中 国 继 续 加 重, 新 的 寄 主 也 在 不 断 地 被 发 现 ( 石 元 春, 2002), 其 中 茄 科 植 物 受 青 枯 病 危 害 最 重, 涉 及 的 作 物 种 类 最 多 ( 杨 玉 红, 2008) 青 枯 病 原 菌 是 一 个 复 杂 的 群 体, 在 寄 主 范 围 生 化 型 致 病 力 和 血 清 型 等 细 菌 学 特 性 上 差 异 很 大, 这 导 致 其 病 害 防 治 较 为 困 难, 使 其 成 为 世 界 上 危 害 最 大 分 布 最 广 和 造 成 损 失 最 为 严 重 的 植 物 病 害 之 一 ( 卫 红 萍, 2010) ; 由 于 青 枯 雷 尔 氏 菌 的 复 杂 性, 导 致 其 致 病 机 制 也 十 分 复 杂, 只 有 通 过 对 青 枯 雷 尔 氏 菌 致 病 机 制 的 更 深 入 地 研 究, 才 有 可 能 找 到 控 制 它 的 有 效 方 法 本 实 验 室 已 对 强 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 FJAT-91 和 弱 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 FJAT-1458 测 通 其 全 序 列, 测 序 结 果 分 析 可 知, 强 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 FJAT-91 和 弱 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 FJAT-1458 存 在 一 系 列 差 异 基 因, 其 中 在 强 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 FJAT-91 存 在 的 基 因 而 在 弱 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 FJAT-1458 不 存 在 的 基 因 有 225 个 ( 强 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 FJAT-91 特 异 性 获 得 基 因 ), 而 在 弱 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 FJAT-1458 存 在 而 在 强 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 不 存 在 的 基 因 有 360 个 ( 弱 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 特 异 性 获 得 基 因 ) 本 试 验 基 于 弱 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 FJAT-1458 特 异 性 获 得 基 因 DNA-dependent RNA polymeraseic region( 依 赖 DNA 的 RNA 聚 合 酶 区 域 ),RNA 聚 合 酶 在 基 因 表 达 中 起 着 转 录 调 节 的 重 要 作 用, 真 核 和 原 核 细 胞 内 都 存 在 有 RNA 聚 合 酶, 大 肠 杆 菌 RNA 聚 合 酶 的 研 究 得 比 较 透 彻 的, 这 是 一 个 分 子 量 达 50 多 万, 全 酶 由 五 咱 亚 基 组 成, 去 掉 δ 亚 基 的 部 分 称 为 核 心 酶, 核 心 酶 本 身 就 能 催 化 苷 酸 间 磷 酸 二 酸 键 形 成 利 福 平 和 利 福 霉 素 能 结 合 在 β 亚 基 上 而 对 此 酶 发 生 强 烈 的 抑 制 作 用 β 亚 基 似 乎 是 酶 和 核 苷 酸 底 物 结 合 的 部 位 细 胞 内 转 录 是 在 DNA 特 定 的 起 始 点 上 开 始 的,δ 亚 基 的 功 能 是 辨 认 转 录 起 始 点 的 β 亚 基 是 酶 与 DNA 模 板 结 合 的 主 要 成 分 α 亚 基 可 能 与 转 录 基 因 的 类 型 和 种 类 有 关 该 基 因 在 本 试 验 中 的 编 号 为 RS98orf00192, 该 基 因 全 长 为 2283 bp, 本 试 验 基 于 批 处 理 软 件 设 计 了 一 对 引 物 (RS980192-1 和 RS9801923-2), 该 对 引 物 可 在 弱 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 FJAT-1458 扩 增 出 400 bp 目 的 条 带, 而 在 强 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 FJAT-91 不 能 扩 增 出 条 带 ( 已 在 梯 度 试 验 中 验 证 ), 本 试 验 利 用 该 对 引 物 对 菌 种 库 中 所 有 青 枯 雷 尔 氏 菌, 以 验 证 该 基 因 是 否 只 在 弱 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 存 在, 而 在 强 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 不 存 在? 以 进 一 步 对 青 枯 雷 尔 氏 菌 致 病 机 制 进 行 探 索 2. 试 验 方 法 2.1 试 验 材 料 2.1.1 菌 株 : 试 验 菌 株 及 来 源 见 表 1 表 1 菌 株 以 及 来 源 菌 株 编 号 名 称 来 源 物 种 分 离 基 物 菌 株 原 产 地 49 Rs-F.1.1-010615-04V 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 福 州 建 新 54 Rs-F.1.3-010702-09V 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 福 州 北 峰 80 Rs-F.1.3-010702-01V-f2 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 福 州 北 峰 81 Rs-F.1.3-010702-01V-f3 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 福 州 北 峰 91 Rs-F.1.3-010702-01V-f13 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 福 州 北 峰

250 442 Rs-F.352300-060722-5-1-1 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 宁 德 屏 南 443 Rs-F.352300-060722-5-1-2 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 宁 德 屏 南 445 Rs-F.352300-060722-5-2-2 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 宁 德 屏 南 447 Rs-F.352300-060722-6-1-2 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 宁 德 屏 南 448 Rs-F.352300-060722-6-2-1 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 宁 德 屏 南 449 Rs-F.352300-060722-6-2-2 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 宁 德 屏 南 450 Rs-F.352300-060722-7-1 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 宁 德 屏 南 451 Rs-F.352300-060722-7-2 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 宁 德 屏 南 1300 Rs-F.350112-070612-V2 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 福 州 营 口 1301 Rs-F.350112-070612-V3 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 福 州 营 口 1302 Rs-F.350112-070612-V4 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 福 州 营 口 1303 Rs-F.350112-070612-V5 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 福 州 营 口 1304 Rs-F.350112-070612-V6 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 福 州 营 口 1466 RSF-V-109 自 己 分 离 番 茄 根 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1468 RSF-V-117 自 己 分 离 番 茄 根 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1469 RSF-V-121 自 己 分 离 番 茄 根 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1470 RSF-V-125 自 己 分 离 番 茄 根 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1471 RSF-V-129 自 己 分 离 番 茄 根 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1445 RSF-V-14 自 己 分 离 番 茄 茎 基 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1446 RSF-V-99 自 己 分 离 番 茄 茎 基 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1447 RSF-V-100 自 己 分 离 番 茄 茎 基 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1448 RSF-V-103 自 己 分 离 番 茄 茎 基 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1449 RSF-V-106 自 己 分 离 番 茄 茎 基 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1452 RSF-A-26 自 己 分 离 番 茄 茎 中 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1453 RSF-A-27 自 己 分 离 番 茄 茎 中 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1454 RSF-A-30 自 己 分 离 番 茄 茎 中 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1455 RSF-A-31 自 己 分 离 番 茄 茎 中 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1457 RSF-V-97 自 己 分 离 番 茄 茎 中 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1458 RSF-A-98 自 己 分 离 番 茄 茎 中 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1459 RSF-V-102 自 己 分 离 番 茄 茎 中 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1460 RSF-V-115 自 己 分 离 番 茄 茎 中 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1461 RSF-V-116 自 己 分 离 番 茄 茎 中 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1462 RSF-V-119 自 己 分 离 番 茄 茎 中 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1463 RSF-V-122 自 己 分 离 番 茄 茎 中 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1473 RSF-V-111 自 己 分 离 番 茄 茎 中 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村

251 1102 Rs-F.351144-060928-14V 自 己 分 离 番 茄 1101 Rs-F.351144-060928-13V 自 己 分 离 番 茄 青 枯 病 植 株 茎 顶 部 青 枯 病 植 株 茎 中 部 莆 田 东 洋 镇 莆 田 东 洋 镇 427 Rs-P.362200-060707-1-1 自 己 分 离 花 生 花 生 植 株 泉 州 晋 江 428 Rs-P.362200-060707-1-2 自 己 分 离 花 生 花 生 植 株 泉 州 晋 江 430 Rs-P.362200-060707-2-1 自 己 分 离 花 生 花 生 植 株 泉 州 晋 江 433 Rs-P.362200-060707-3-1 自 己 分 离 花 生 花 生 植 株 泉 州 晋 江 434 Rs-P.362200-060707-3-2 自 己 分 离 花 生 花 生 植 株 泉 州 晋 江 435 Rs-P.362200-060707-3-3 自 己 分 离 花 生 花 生 植 株 泉 州 晋 江 437 Rs-P.362200-060707-4-2 自 己 分 离 花 生 花 生 植 株 泉 州 晋 江 440 Rs-P.362200-060707-5-2 自 己 分 离 花 生 花 生 植 株 泉 州 晋 江 441 Rs-P.362200-060707-5-3 自 己 分 离 花 生 花 生 植 株 泉 州 晋 江 1441 RSJ-79-A 自 己 分 离 姜 茎 基 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1442 RSJ-86-A 自 己 分 离 姜 茎 基 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1443 RSJ-87-V 自 己 分 离 姜 茎 基 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1444 RSJ-88-A 自 己 分 离 姜 茎 基 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 74 Rs-L.1.4-010704-01V 自 己 分 离 辣 椒 辣 椒 植 株 福 州 永 泰 459 Rs-L.352300-060722-14-1-1 自 己 分 离 辣 椒 辣 椒 植 株 宁 德 屏 南 461 Rs-L.352300-060722-14-2-1 自 己 分 离 辣 椒 辣 椒 植 株 宁 德 屏 南 462 Rs-L.352300-060722-14-2-2 自 己 分 离 辣 椒 辣 椒 植 株 宁 德 屏 南 465 Rs-L.352300-060722-16-1-1 自 己 分 离 辣 椒 辣 椒 植 株 宁 德 屏 南 466 Rs-L.352300-060722-16-1-2 自 己 分 离 辣 椒 辣 椒 植 株 宁 德 屏 南 468 Rs-L.352300-060722-16-2-2 自 己 分 离 辣 椒 辣 椒 植 株 宁 德 屏 南 470 Rs-L.352300-060722-17-1-2 自 己 分 离 辣 椒 辣 椒 植 株 宁 德 屏 南 469 Eb-L.352300-060722-17-1-1 (Vibrio-hollisae) 自 己 分 离 辣 椒 辣 椒 植 株 宁 德 屏 南 472 Rs-L.352300-060722-17-2-2 自 己 分 离 辣 椒 辣 椒 植 株 宁 德 屏 南 473 Rs-L.352300-060722-18-1 自 己 分 离 辣 椒 辣 椒 植 株 宁 德 屏 南 474 Rs-L.352300-060722-18-2-1 自 己 分 离 辣 椒 辣 椒 植 株 宁 德 屏 南 475 Rs-L.352300-060722-18-2-2 自 己 分 离 辣 椒 辣 椒 植 株 宁 德 屏 南 476 Rs-L.352300-060722-20-1 自 己 分 离 辣 椒 辣 椒 植 株 宁 德 屏 南 健 康 植 株 根 1103 Rs-Q.351144-061019-01V 自 己 分 离 茄 子 部 莆 田 东 洋 镇 1307 Rs-Q.350112-070628-11V 自 己 分 离 茄 子 茄 子 - 根 福 州 营 口

252 70 Rs-Q.1.3-020626-5V 自 己 分 离 茄 子 茄 子 植 株 福 州 北 峰 73 Rs-Q.9.2-010620-V 自 己 分 离 茄 子 茄 子 植 株 南 平 452 Rs-Q.352300-060722-8-1-1 自 己 分 离 茄 子 茄 子 植 株 宁 德 屏 南 453 Rs-Q.352300-060722-8-2-1 自 己 分 离 茄 子 茄 子 植 株 宁 德 屏 南 454 Rs-Q.352300-060722-8-2-2 自 己 分 离 茄 子 茄 子 植 株 宁 德 屏 南 456 Rs-Q.352300-060722-9-1-2 自 己 分 离 茄 子 茄 子 植 株 宁 德 屏 南 458 Rs-Q.352300-060722-9-2-2 自 己 分 离 茄 子 茄 子 植 株 宁 德 屏 南 青 枯 病 植 株 1115 Rs-Q.351144-061107-11V 自 己 分 离 茄 子 1116 Rs-Q.351144-061107-12V 自 己 分 离 茄 子 1112 Rs-Q.351144-061024-12V 自 己 分 离 茄 子 根 部 青 枯 病 植 株 茎 基 部 青 枯 病 植 株 茎 基 部 莆 田 东 洋 镇 莆 田 东 洋 镇 莆 田 东 洋 镇 77 Rs-J.1.4-010704-01V 自 己 分 离 生 姜 生 姜 植 株 福 州 永 泰 78 Rs-J.1.4-010704-02A 自 己 分 离 生 姜 生 姜 植 株 福 州 永 泰 1231 Rs91-2-4# 自 己 分 离 培 养 基 本 实 验 室 1232 Rs91-3-5# 自 己 分 离 培 养 基 本 实 验 室 2.1.2 试 剂 与 仪 器 (1) 试 剂 ddw;dntp 购 自 福 州 博 海 生 物 技 术 有 限 公 司 ;Buffer,Taq 酶 购 自 北 京 天 根 生 化 科 技 有 限 公 司 ; 上 游 引 物 RS980192-1:5'-AAG AAC CCA GTT AAC GCC CT-3', 下 游 引 物 RS980192-2:5'-CCT GAA CAG GAG CGT AGA GG', 引 物 购 自 上 海 博 尚 有 限 公 司 ; 已 稀 释 青 枯 雷 尔 氏 菌 DNA 产 物 ;1500 bp Maker 购 自 上 海 英 竣 生 物 技 术 公 司 (2) 仪 器 UVP 凝 胶 成 像 仪 ;Biometra 梯 度 PCR 仪 ;BIO-RAD 电 泳 仪 ; 2.2 试 验 方 法 (5) 扩 增 体 系 ddw:18.7 μl ; Buffer:2.5 μl; dntp:0.5 μl; RS980192-1:1 μl; RS980192-2:1 μl; Taq:0.3 μl; DNA:1 μl (2)PCR 程 序 95 C, 预 变 性 5 min; 然 后 95 C 变 性 30 s,64 C 退 火 30 s,72 C 延 伸 1 min, 进 行 30 个 循 环 ; 最 后 72 C 7 min PCR 产 物 可 在 4 C 保 存

253 5. 电 泳 采 用 的 1.5% 胶 浓 度, 上 样 量 为 7 μl, 电 压 为 100 V; 凝 胶 成 像 观 测 PCR 结 果 3 试 验 结 果 3.1 DNA-dependent RNA polymeraseic region 序 列 PCR 扩 增 结 果 试 验 结 果 见 图 1-4 由 PCR 扩 增 结 果 可 以 看 出, 菌 株 编 号 FJAT-447 FJAT-448 FJAT-449 FJAT-1466 FJAT-1468 FJAT-1469 FJAT-1470 FJAT-1471 FJAT-1447 FJAT-1452 FJAT-1453 FJAT-1454 FJAT-1455 FJAT-1457 FJAT-1458 FJAT-1459 FJAT-1460 FJAT-1461 FJAT-1462 FJAT-1463 FJAT-1473 FJAT-452 FJAT-453 FJAT-456 和 FJAT-458 通 过 该 引 物 在 400 bp 处 出 现 单 一 条 带, 并 且 这 些 菌 株 只 有 FJAT-1452 FJAT-1453 FJAT-1458 和 FJAT-1463 在 形 态 上 是 属 于 弱 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌, 其 他 的 均 为 强 致 病 青 枯 雷 尔 氏 菌 其 余 的 菌 株 均 在 未 出 现 条 带, 其 中 FJAT-54 FJAT-1303 FJAT-1441 FJAT-1442 FJAT-1443 FJAT-1444 FJAT-1112 FJAT-77 FJAT-476 和 FJAT-469 为 弱 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌, 其 余 的 强 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 图 1 不 同 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 在 引 物 RS980192PCR 扩 增 结 果 (1) 图 2 不 同 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 在 引 物 RS980192PCR 扩 增 结 果 (2) 图 3 不 同 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 在 引 物 RS980192PCR 扩 增 结 果 (3)

254 图 4 不 同 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 在 引 物 RS980192 PCR 扩 增 结 果 (4) 3.2 DNA-dependent RNA polymeraseic region 序 列 PCR 结 果 综 合 分 析 DNA-dependent RNA polymeraseic region 序 列 PCR 结 果 综 合 分 析 结 果 见 表 2 在 含 有 Integrase catalytic region 序 列 的 25 株 青 枯 雷 尔 氏 菌 中, 其 中 弱 化 指 数 在 强 致 病 性 区 域 24 株 青 枯 雷 尔 氏 菌 中 共 有 10 株 菌 株 含 有 Integrase catalytic region 序 列, 弱 化 指 数 在 过 渡 区 域 31 株 青 枯 雷 尔 氏 菌 中 共 有 8 株 菌 株 含 有 Integrase catalytic region 序 列, 弱 化 指 数 在 弱 致 病 性 区 域 29 株 青 枯 雷 尔 氏 菌 中 共 有 7 株 菌 株 含 有 Integrase catalytic region 序 列 表 2 DNA-dependent RNA polymeraseic region PCR 结 果 中 有 目 标 条 带 菌 株 综 合 结 果 菌 株 编 号 寄 主 菌 株 原 产 地 平 均 值 类 群 强 弱 判 断 是 否 有 条 带 FJAT-1455 番 茄 南 平 建 瓯 0.522 V + FJAT-1101 番 茄 莆 田 莆 田 0.581 V - FJAT-0475 辣 椒 宁 德 屏 南 0.591 V - FJAT-1469 番 茄 南 平 建 瓯 0.594 V + FJAT-1459 番 茄 南 平 建 瓯 0.640 V + FJAT-0091 番 茄 福 州 北 峰 0.651 V - FJAT-1300 番 茄 福 州 营 口 0.652 V - FJAT-1448 番 茄 南 平 建 瓯 0.660 V - FJAT-0074 辣 椒 福 州 永 泰 0.663 V - FJAT-1462 番 茄 南 平 建 瓯 0.666 V + FJAT-0435 花 生 泉 州 晋 江 0.680 V - Ⅰ<0.74 FJAT-0080 番 茄 福 州 北 峰 0.680 V - FJAT-1449 番 茄 南 平 建 瓯 0.694 V - FJAT-1461 番 茄 南 平 建 瓯 0.699 V + FJAT-0452 茄 子 宁 德 屏 南 0.712 V + FJAT-1468 番 茄 南 平 建 瓯 0.716 V + FJAT-1102 番 茄 莆 田 莆 田 0.730 V - FJAT-0078 生 姜 福 州 永 泰 0.717 V - FJAT-0437 花 生 泉 州 晋 江 0.716 V - FJAT-1470 番 茄 南 平 建 瓯 0.729 V + FJAT-1471 番 茄 南 平 建 瓯 0.729 V + FJAT-0433 花 生 泉 州 晋 江 0.732 V -

255 FJAT-1457 番 茄 南 平 建 瓯 0.736 V + FJAT-0442 番 茄 宁 德 屏 南 0.730 V - FJAT-1445 番 茄 南 平 建 瓯 0.746 V - FJAT-0441 花 生 泉 州 晋 江 0.747 V - FJAT-1454 番 茄 南 平 建 瓯 0.753 V + FJAT-1446 番 茄 南 平 建 瓯 0.759 V - FJAT-0081 番 茄 福 州 北 峰 0.763 V - FJAT-1463 番 茄 南 平 建 瓯 0.767 A + FJAT-0434 花 生 泉 州 晋 江 0.768 V - FJAT-0469 辣 椒 宁 德 屏 南 0.772 A - FJAT-0465 辣 椒 宁 德 屏 南 0.772 V - FJAT-1307 茄 子 福 州 营 口 0.775 V - FJAT-1231 番 茄 本 实 验 室 0.775 V - FJAT-0449 番 茄 宁 德 屏 南 0.779 V + FJAT-0473 辣 椒 宁 德 屏 南 0.784 V - FJAT-0430 花 生 泉 州 晋 江 0.787 V - FJAT-1441 姜 南 平 建 瓯 0.786 A - FJAT-0427 花 生 泉 州 晋 江 0.791 0.74<Ⅱ<0.825 V - FJAT-1460 番 茄 南 平 建 瓯 0.795 V + FJAT-1458 番 茄 南 平 建 瓯 0.796 A + FJAT-1473 番 茄 南 平 建 瓯 0.796 V + FJAT-1112 茄 子 莆 田 东 洋 镇 0.799 A - FJAT-1466 番 茄 南 平 建 瓯 0.800 V + FJAT-0474 辣 椒 宁 德 屏 南 0.804 V - FJAT-0443 番 茄 宁 德 屏 南 0.808 V - FJAT-0462 辣 椒 宁 德 屏 南 0.809 V - FJAT-0049 番 茄 福 州 建 新 0.810 V - FJAT-0447 番 茄 宁 德 屏 南 0.814 V + FJAT-0428 花 生 泉 州 晋 江 0.812 V - FJAT-1302 番 茄 福 州 营 口 0.817 V - FJAT-0440 花 生 泉 州 晋 江 0.819 V - FJAT-0472 辣 椒 宁 德 屏 南 0.820 V - FJAT-1443 姜 南 平 建 瓯 0.822 V - FJAT-0448 番 茄 宁 德 屏 南 0.829 V + FJAT-1447 番 茄 南 平 建 瓯 0.830 V + FJAT-1442 姜 南 平 建 瓯 0.836 A - FJAT-0054 番 茄 福 州 北 峰 0.838 A - FJAT-1115 茄 子 莆 田 莆 田 0.847 V - FJAT-1301 番 茄 福 州 营 口 0.848 0.825<Ⅲ V - FJAT-0456 茄 子 宁 德 屏 南 0.850 V + FJAT-1444 姜 南 平 建 瓯 0.855 A - FJAT-1303 番 茄 福 州 营 口 0.859 A - FJAT-1116 茄 子 莆 田 莆 田 0.859 V - FJAT-0070 茄 子 福 州 北 峰 0.865 V -

256 FJAT-0470 辣 椒 宁 德 屏 南 0.865 V - FJAT-0461 辣 椒 宁 德 屏 南 0.867 V - FJAT-0073 茄 子 南 平 0.868 V - FJAT-0458 茄 子 宁 德 屏 南 0.869 V + FJAT-1232 番 茄 本 实 验 室 0.870 V - FJAT-1453 番 茄 南 平 建 瓯 0.871 A + FJAT-0476 辣 椒 宁 德 屏 南 0.873 A - FJAT-0459 辣 椒 宁 德 屏 南 0.874 V - FJAT-0451 番 茄 宁 德 屏 南 0.875 V - FJAT-1103 茄 子 莆 田 东 洋 镇 0.887 V - FJAT-0453 番 茄 宁 德 屏 南 0.897 V + FJAT-0450 番 茄 宁 德 屏 南 0.899 V - FJAT-0445 番 茄 宁 德 屏 南 0.907 V - FJAT-0077 生 姜 福 州 永 泰 0.927 A - FJAT-0468 辣 椒 宁 德 屏 南 0.934 V - FJAT-1452 番 茄 南 平 建 瓯 0.935 A + FJAT-1304 番 茄 福 州 营 口 0.953 V - 4 试 验 讨 论 (1) 由 PCR 扩 增 结 果 可 以 看 出, 菌 株 编 号 FJAT-447 FJAT-448 FJAT-449 FJAT-1466 FJAT-1468 FJAT-1469 FJAT-1470 FJAT-1471 FJAT-1447 FJAT-1452 FJAT-1453 FJAT-1454 FJAT-1455 FJAT-1457 FJAT-1458 FJAT-1459 FJAT-1460 FJAT-1461 FJAT-1462 FJAT-1463 FJAT-1473 FJAT-452 FJAT-453 FJAT-456 和 FJAT-458 通 过 该 引 物 在 400 bp 处 出 现 单 一 条 带, 并 且 这 些 菌 株 只 有 FJAT-1452 FJAT-1453 FJAT-1458 和 FJAT-1463 在 形 态 上 是 属 于 弱 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌, 其 他 的 均 为 强 致 病 青 枯 雷 尔 氏 菌 其 余 的 菌 株 均 在 未 出 现 条 带, 其 中 FJAT-54 FJAT-1303 FJAT-1441 FJAT-1442 FJAT-1443 FJAT-1444 FJAT-1112 FJAT-77 FJAT-476 和 FJAT-469 为 弱 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌, 其 余 的 强 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 [1]. 在 含 有 Integrase catalytic region 序 列 的 25 株 青 枯 雷 尔 氏 菌 中, 其 中 弱 化 指 数 在 强 致 病 性 区 域 24 株 青 枯 雷 尔 氏 菌 中 共 有 10 株 菌 株 含 有 Integrase catalytic region 序 列, 弱 化 指 数 在 过 渡 区 域 31 株 青 枯 雷 尔 氏 菌 中 共 有 8 株 菌 株 含 有 Integrase catalytic region 序 列, 弱 化 指 数 在 弱 致 病 性 区 域 29 株 青 枯 雷 尔 氏 菌 中 共 有 7 株 菌 株 含 有 Integrase catalytic region 序 列 5.. 参 考 文 献 [1] Renmenant B, Coupat-Goutaland B, Guidot A, et al. Genomes of three tomato pathogens within the Ralstonia solanacearum species complex reveal significant evolutionary divergence[j]. BMC Genomics 2010, 11:379-395. [2] 石 元 春, 主 编, 2002, 20 世 纪 中 国 学 术 大 典 农 业 科 学, 福 建 教 育 出 版 社, 中 国, 福 州, pp. 277-278. [3] 杨 玉 红, 2008, 茄 科 植 物 青 枯 菌 病 害 研 究 进 展, 江 西 农 业 学 报, 20(5):54-55, 58 [4] 卫 红 萍, 2010, 茄 科 植 物 青 枯 病 发 生 及 防 治 策 略 研 究, 咸 宁 学 院 学 报, 30(8):164-16 试 验 负 责 车 建 美 刘 波 试 验 人 员 林 海 云

257 附 录 : RS98orf00192 序 列 : GTGGGCCGCCTTATTCAAGATGGGTACGCCCAGGCCGTGCGTCGGCAGCTTGCGCGAGAGGCG GCAAGTGAACGCAAGATTAGCGAGGCAGATTTGCAGCGTGACGCCATCGAGCGCGGGCTATCT GCGTTCCGTGATGCTTTGGCGACAGCGAGCGAAGTACGCGAGTCGGCGCGTAGTCCCAAGCGG GTACCGGCCAAGATCGTGCACTACGGCCGAGCTAAGAACCCAGTTAACGCCCTGAGTGCCGAG CAACAGGCCGCCGCTTGCTGGACGACTTTGTGTAGCTATCTAGGGAAACTGGCCGAGCCGGAG GGCGTGCCGGTGCAGGCTGTAGCAGGGGGGATCGGGCGGCGCTTGAGGGACGCATGCGGCGG CGCAGAGGCGTACGGGCGTCTCGGCTATGAGCGCGCCGGCCTGGTGCTGCTGGACTGGCTGGG CCATGTCACGGGCTGGGTGGAAGAGCGCACCGGAGACCGCGCCTTCGGGTCCGCACGGCAGG AAACAAACAGCCTGCACATTACGCAGAAGTTCCTAGATGACACGCTAGGCGGCGATGAACCCA TCGAGTTCATGGAGCGCAAGCCGATGCTTGTCCCTCCTGTGCCGTGGACGCCCTCTGCTCGCGA TGGTGGGTTCCTCTACGCTCCTGTTCAGGCGATCCGAGGGGTACGTAAGGGTATCGGGTCGGAG GCGATTGTGGGCGCTCTGAACGCTTTGCAGGGCACGCCTTGGCGAGTCAACGCGCGCTTGCTG GCCGTGGCCCGCTCCTTTGAGCGCAACGCCGAGGACTTCGACGGCGGCTCCGTGGTTATGGGC AAGGTGCTGGAGGTACGGCACGACGTGCCCCACGAGCAGCAGCGTAGCAAAACGATTCGCAG CGCGTTGACGCTGGCCGCCTTTGGGGAACTGGAGCACGAAGACGCGTTCTACTTCCCGTGGAA TCTGGACTGGCGGGGCCGGATGTACCCGGCAACCACGCTGGTAAGTCCACAAGGGTCGGACCT GTGTAAAGGGCTGTTGGAGTTCGCGAACGGAACGCCGCTAGGGAGGGATGGAGGCCGCTGGC TCGCTATCCACCTGTGTAACCTCGCAGGGGCGGACAGGCGCGTGGAGGGTGGAGAGTACGTGA CGCTCACGCCTGACGAGCGCGAAGCCTGGGCGCTAGAGCACTCCGACACGCTGTGCGCAATCG CTGCCGATCCCGCCAGTAATACCCAGTGGCGCGACGCAGGAGCATTCGGACTGTGCAAGCTGA AGGGAAATGGCACGCGGCCGGTAGCTCCTGATAAGCCGTGGCAATTCCTCGCAGCGTGCTTCG AGTGGGCTGACTATCAGGCAGAGGGGCCGGGCTTCCGTAGCCGTCTTGCCGGTGCGTTAGACG GGTCGTGCTCGGGCGTGCAGATGCTCTCGGGGATGACGCGGGATGAGAGCGCAGGTGCGATGG TGAACCTCACGCCGACCGAGCGCGGGGCGGACTACTACCGCACTATGTCGGAGGCTCTGGACC GCCGCCTGTGCCGCCTCGCGGATTCTGCTGGTGTGGATGACATGGTGCACTTGAAGCACTGGG CCGGGCATGCTCTGGACCGGGACCTATTGAAGGCCCCGAGTATGACGAAGGTGTACAGCGCAG GCGTGTTCACGTTTGGGGAGCAAGTGGCGGCCAAGACCGGGGCGAGCGAATCGGAATGCCTTT GGCTGGCCCGGCATATCAATGAATGCTTCCGTGACGTTGCGCCGGGCATGCTGGACGCAATGGA GTATCTGCAAGGCGTGGCTGACGTGCTTACGAATGCTGAGCATGGCATGCACTGGGTGACGCCT GTCGGTCTGGAGGTCGAGCAATGCCGCTATGGGACGGAATCTCACATTCTGGAGACGGTTTCTC CGGGGACAGGCAAAAAGCGTAAGCGGGCGTTCAAGGTCACCAGTGACATCCTGAGCAAGCGC GGGCAGCGTGCCGGTGTCTCCCCGAACTTTGTGCACGGAGTCGATGCGGCGCACATGGTGTTG ACCATCAATGCGCTGTACCGACAGGGCGTGCGTAACTTCTGGATGGTGCATGACTCCTTTGGTG CGCCGTTCGCGCAGTGCGACGACGTGTACGCGACAACGCGCGCCATGTTCGTGGAGCTTATGT CCGCTGACCTGTTGGACGCCTGGACGCAGCAGGTAGCCGCCCCGCTCACACAGGAACAACGC GACAAGCTGCCCCCTTTACCGGCGTACGGCGCGCTTGATCTAGGCGAAGTGCGGGCGAGCACG TTTGCGTGGTTCTGA

258 2011-08-10 承 担 单 位 : 福 建 省 农 科 院 农 业 生 物 资 源 研 究 所 试 验 设 计 : 试 验 项 目 : 青 枯 雷 尔 氏 菌 HK97 family phage protein (RS980373) 试 验 人 员 : 林 海 云 试 验 负 责 : 车 建 美 刘 波 报 告 日 期 :2011-8-10 计 数 月 份 :2011 年 08 月 验 证 研 究 资 格 系 数 (0.5-1.0) 实 验 设 计 系 数 (0.9-1.0 0.9-1.0) 报 告 得 分 总 分 实 验 设 计 实 验 记 载 实 验 分 析 实 验 简 报 实 验 文 章 1-20% 21-40% 41-60% 61-80% 81-100% 1%-5% 设 计 不 足, 实 施 错 误 6%-10% 设 计 不 全, 实 验 无 果 11%-15% 设 计 可 以, 实 施 不 全 16%-20% 设 计 完 整, 分 布 实 施 21%-25% 实 验 不 全, 记 载 无 果 26%-30% 实 验 不 足, 记 载 不 全 31%-35% 独 立 实 验, 记 载 不 全 36%-40% 分 布 实 验, 记 载 完 整 41%-45% 目 的 明 确, 实 验 完 成 46%-50% 实 验 完 整, 记 载 清 晰 51%-55% 实 验 系 统, 结 果 可 信 56%-60% 实 验 创 新, 分 析 清 晰 61%-65% 实 验 创 新, 结 论 清 晰 66%-70% 实 验 完 整, 统 计 清 晰 71%-75% 实 验 系 统, 数 据 可 靠 76%-80% 报 告 完 整, 文 章 雏 形 81%-85% 结 构 合 理, 分 析 有 据 86%-90% 逻 辑 清 晰, 统 计 合 理 91%-95% 图 表 完 整, 写 作 流 畅 96%-100% 文 献 完 整, 发 表 水 平 福 建 省 农 业 科 学 院 农 业 生 物 资 源 研 究 所 农 业 微 生 物 研 究 中 心 电 话 : 0591-87882571, 传 真 : 0591-87882571 fjat.yzxz.com

259 1. 试 验 目 的 细 菌 性 青 枯 病 是 由 青 枯 雷 尔 氏 菌 引 起 的 一 种 重 要 土 传 植 物 病 害, 侵 染 寄 主 范 围 很 广 (Remenant, 2010), 据 报 道 青 枯 病 原 菌 可 侵 染 50 多 个 科 数 百 种 植 物, 包 括 花 生 番 茄 茄 子 和 辣 椒 等 经 济 作 物, 并 且 近 年 来 青 枯 病 在 中 国 继 续 加 重, 新 的 寄 主 也 在 不 断 地 被 发 现 ( 石 元 春, 2002), 其 中 茄 科 植 物 受 青 枯 病 危 害 最 重, 涉 及 的 作 物 种 类 最 多 ( 杨 玉 红, 2008) 青 枯 病 原 菌 是 一 个 复 杂 的 群 体, 在 寄 主 范 围 生 化 型 致 病 力 和 血 清 型 等 细 菌 学 特 性 上 差 异 很 大, 这 导 致 其 病 害 防 治 较 为 困 难, 使 其 成 为 世 界 上 危 害 最 大 分 布 最 广 和 造 成 损 失 最 为 严 重 的 植 物 病 害 之 一 ( 卫 红 萍, 2010) ; 由 于 青 枯 雷 尔 氏 菌 的 复 杂 性, 导 致 其 致 病 机 制 也 十 分 复 杂, 只 有 通 过 对 青 枯 雷 尔 氏 菌 致 病 机 制 的 更 深 入 地 研 究, 才 有 可 能 找 到 控 制 它 的 有 效 方 法 本 实 验 室 已 对 强 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 FJAT-91 和 弱 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 FJAT-1458 测 通 其 全 序 列, 测 序 结 果 分 析 可 知, 强 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 FJAT-91 和 弱 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 FJAT-1458 存 在 一 系 列 差 异 基 因, 其 中 在 强 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 FJAT-91 存 在 的 基 因 而 在 弱 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 FJAT-1458 不 存 在 的 基 因 有 225 个 ( 强 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 FJAT-91 特 异 性 获 得 基 因 ), 而 在 弱 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 FJAT-1458 存 在 而 在 强 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 不 存 在 的 基 因 有 360 个 ( 弱 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 特 异 性 获 得 基 因 ) 本 试 验 基 于 弱 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 FJAT-1458 特 异 性 获 得 基 因 HK97 family phage protein(hk97 家 族 噬 菌 体 蛋 白 ), 该 基 因 在 本 试 验 中 的 编 号 为 RS98orf00373, 该 基 因 全 长 为 348bp, 本 试 验 基 于 批 处 理 软 件 设 计 了 一 对 引 物 (RS980373-1 和 RS9803733-2), 该 对 引 物 可 在 弱 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 FJAT-1458 扩 增 出 400 bp 目 的 条 带, 而 在 强 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 FJAT-91 不 能 扩 增 出 条 带 ( 已 在 梯 度 试 验 中 验 证 ), 本 试 验 利 用 该 对 引 物 对 菌 种 库 中 所 有 青 枯 雷 尔 氏 菌, 以 验 证 该 基 因 是 否 只 在 弱 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 存 在, 而 在 强 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 不 存 在? 以 进 一 步 对 青 枯 雷 尔 氏 菌 致 病 机 制 进 行 探 索 2. 试 验 方 法 2.1 试 验 材 料 2.1.1 菌 株 : 试 验 菌 株 及 来 源 见 表 1 表 1 菌 株 以 及 来 源 菌 株 编 号 名 称 来 源 物 种 分 离 基 物 菌 株 原 产 地 49 Rs-F.1.1-010615-04V 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 福 州 建 新 54 Rs-F.1.3-010702-09V 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 福 州 北 峰 80 Rs-F.1.3-010702-01V-f2 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 福 州 北 峰 81 Rs-F.1.3-010702-01V-f3 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 福 州 北 峰 91 Rs-F.1.3-010702-01V-f13 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 福 州 北 峰 442 Rs-F.352300-060722-5-1-1 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 宁 德 屏 南 443 Rs-F.352300-060722-5-1-2 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 宁 德 屏 南 445 Rs-F.352300-060722-5-2-2 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 宁 德 屏 南 447 Rs-F.352300-060722-6-1-2 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 宁 德 屏 南 448 Rs-F.352300-060722-6-2-1 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 宁 德 屏 南

260 449 Rs-F.352300-060722-6-2-2 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 宁 德 屏 南 450 Rs-F.352300-060722-7-1 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 宁 德 屏 南 451 Rs-F.352300-060722-7-2 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 宁 德 屏 南 1300 Rs-F.350112-070612-V2 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 福 州 营 口 1301 Rs-F.350112-070612-V3 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 福 州 营 口 1302 Rs-F.350112-070612-V4 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 福 州 营 口 1303 Rs-F.350112-070612-V5 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 福 州 营 口 1304 Rs-F.350112-070612-V6 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 福 州 营 口 1466 RSF-V-109 自 己 分 离 番 茄 根 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1468 RSF-V-117 自 己 分 离 番 茄 根 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1469 RSF-V-121 自 己 分 离 番 茄 根 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1470 RSF-V-125 自 己 分 离 番 茄 根 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1471 RSF-V-129 自 己 分 离 番 茄 根 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1445 RSF-V-14 自 己 分 离 番 茄 茎 基 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1446 RSF-V-99 自 己 分 离 番 茄 茎 基 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1447 RSF-V-100 自 己 分 离 番 茄 茎 基 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1448 RSF-V-103 自 己 分 离 番 茄 茎 基 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1449 RSF-V-106 自 己 分 离 番 茄 茎 基 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1452 RSF-A-26 自 己 分 离 番 茄 茎 中 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1453 RSF-A-27 自 己 分 离 番 茄 茎 中 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1454 RSF-A-30 自 己 分 离 番 茄 茎 中 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1455 RSF-A-31 自 己 分 离 番 茄 茎 中 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1457 RSF-V-97 自 己 分 离 番 茄 茎 中 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1458 RSF-A-98 自 己 分 离 番 茄 茎 中 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1459 RSF-V-102 自 己 分 离 番 茄 茎 中 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1460 RSF-V-115 自 己 分 离 番 茄 茎 中 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1461 RSF-V-116 自 己 分 离 番 茄 茎 中 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1462 RSF-V-119 自 己 分 离 番 茄 茎 中 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1463 RSF-V-122 自 己 分 离 番 茄 茎 中 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1473 RSF-V-111 自 己 分 离 番 茄 茎 中 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 青 枯 病 植 株 1102 Rs-F.351144-060928-14V 自 己 分 离 番 茄 1101 Rs-F.351144-060928-13V 自 己 分 离 番 茄 茎 顶 部 青 枯 病 植 株 茎 中 部 莆 田 东 洋 镇 莆 田 东 洋 镇 427 Rs-P.362200-060707-1-1 自 己 分 离 花 生 花 生 植 株 泉 州 晋 江

261 428 Rs-P.362200-060707-1-2 自 己 分 离 花 生 花 生 植 株 泉 州 晋 江 430 Rs-P.362200-060707-2-1 自 己 分 离 花 生 花 生 植 株 泉 州 晋 江 433 Rs-P.362200-060707-3-1 自 己 分 离 花 生 花 生 植 株 泉 州 晋 江 434 Rs-P.362200-060707-3-2 自 己 分 离 花 生 花 生 植 株 泉 州 晋 江 435 Rs-P.362200-060707-3-3 自 己 分 离 花 生 花 生 植 株 泉 州 晋 江 437 Rs-P.362200-060707-4-2 自 己 分 离 花 生 花 生 植 株 泉 州 晋 江 440 Rs-P.362200-060707-5-2 自 己 分 离 花 生 花 生 植 株 泉 州 晋 江 441 Rs-P.362200-060707-5-3 自 己 分 离 花 生 花 生 植 株 泉 州 晋 江 1441 RSJ-79-A 自 己 分 离 姜 茎 基 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1442 RSJ-86-A 自 己 分 离 姜 茎 基 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1443 RSJ-87-V 自 己 分 离 姜 茎 基 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1444 RSJ-88-A 自 己 分 离 姜 茎 基 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 74 Rs-L.1.4-010704-01V 自 己 分 离 辣 椒 辣 椒 植 株 福 州 永 泰 459 Rs-L.352300-060722-14-1-1 自 己 分 离 辣 椒 辣 椒 植 株 宁 德 屏 南 461 Rs-L.352300-060722-14-2-1 自 己 分 离 辣 椒 辣 椒 植 株 宁 德 屏 南 462 Rs-L.352300-060722-14-2-2 自 己 分 离 辣 椒 辣 椒 植 株 宁 德 屏 南 465 Rs-L.352300-060722-16-1-1 自 己 分 离 辣 椒 辣 椒 植 株 宁 德 屏 南 466 Rs-L.352300-060722-16-1-2 自 己 分 离 辣 椒 辣 椒 植 株 宁 德 屏 南 468 Rs-L.352300-060722-16-2-2 自 己 分 离 辣 椒 辣 椒 植 株 宁 德 屏 南 470 Rs-L.352300-060722-17-1-2 自 己 分 离 辣 椒 辣 椒 植 株 宁 德 屏 南 469 Eb-L.352300-060722-17-1-1 (Vibrio-hollisae) 自 己 分 离 辣 椒 辣 椒 植 株 宁 德 屏 南 472 Rs-L.352300-060722-17-2-2 自 己 分 离 辣 椒 辣 椒 植 株 宁 德 屏 南 473 Rs-L.352300-060722-18-1 自 己 分 离 辣 椒 辣 椒 植 株 宁 德 屏 南 474 Rs-L.352300-060722-18-2-1 自 己 分 离 辣 椒 辣 椒 植 株 宁 德 屏 南 475 Rs-L.352300-060722-18-2-2 自 己 分 离 辣 椒 辣 椒 植 株 宁 德 屏 南 476 Rs-L.352300-060722-20-1 自 己 分 离 辣 椒 辣 椒 植 株 宁 德 屏 南 健 康 植 株 根 1103 Rs-Q.351144-061019-01V 自 己 分 离 茄 子 部 莆 田 东 洋 镇 1307 Rs-Q.350112-070628-11V 自 己 分 离 茄 子 茄 子 - 根 福 州 营 口 70 Rs-Q.1.3-020626-5V 自 己 分 离 茄 子 茄 子 植 株 福 州 北 峰 73 Rs-Q.9.2-010620-V 自 己 分 离 茄 子 茄 子 植 株 南 平 452 Rs-Q.352300-060722-8-1-1 自 己 分 离 茄 子 茄 子 植 株 宁 德 屏 南 453 Rs-Q.352300-060722-8-2-1 自 己 分 离 茄 子 茄 子 植 株 宁 德 屏 南 454 Rs-Q.352300-060722-8-2-2 自 己 分 离 茄 子 茄 子 植 株 宁 德 屏 南

262 456 Rs-Q.352300-060722-9-1-2 自 己 分 离 茄 子 茄 子 植 株 宁 德 屏 南 458 Rs-Q.352300-060722-9-2-2 自 己 分 离 茄 子 茄 子 植 株 宁 德 屏 南 青 枯 病 植 株 1115 Rs-Q.351144-061107-11V 自 己 分 离 茄 子 1116 Rs-Q.351144-061107-12V 自 己 分 离 茄 子 1112 Rs-Q.351144-061024-12V 自 己 分 离 茄 子 根 部 青 枯 病 植 株 茎 基 部 青 枯 病 植 株 茎 基 部 莆 田 东 洋 镇 莆 田 东 洋 镇 莆 田 东 洋 镇 77 Rs-J.1.4-010704-01V 自 己 分 离 生 姜 生 姜 植 株 福 州 永 泰 78 Rs-J.1.4-010704-02A 自 己 分 离 生 姜 生 姜 植 株 福 州 永 泰 1231 Rs91-2-4# 自 己 分 离 培 养 基 本 实 验 室 1232 Rs91-3-5# 自 己 分 离 培 养 基 本 实 验 室 2.1.2 试 剂 与 仪 器 (1) 试 剂 ddw;dntp 购 自 福 州 博 海 生 物 技 术 有 限 公 司 ;Buffer,Taq 酶 购 自 北 京 天 根 生 化 科 技 有 限 公 司 ; 上 游 引 物 RS980373-1:5'-CCG TCT TCA AGC AGG AAA TC-3', 下 游 引 物 RS980373-2:5'-ACG CTC TAA CGC CTC CAA TA-3', 引 物 购 自 上 海 博 尚 有 限 公 司 ; 已 稀 释 青 枯 雷 尔 氏 菌 DNA 产 物 ;1500 bp Maker 购 自 上 海 英 竣 生 物 技 术 公 司 (2) 仪 器 UVP 凝 胶 成 像 仪 ;Biometra 梯 度 PCR 仪 ;BIO-RAD 电 泳 仪 ; 2.2 试 验 方 法 1) 扩 增 体 系 ddw:18.7 μl ; Buffer:2.5 μl; dntp:0.5 μl; RS980373-1:1 μl; RS980373-2:1 μl; Taq:0.3 μl; DNA:1 μl (2)PCR 程 序 95 C, 预 变 性 5 min; 然 后 95 C 变 性 30 s,60 C 退 火 30 s,72 C 延 伸 1 min, 进 行 30 个 循 环 ; 最 后 72 C 7 min PCR 产 物 可 在 4 C 保 存 (3) 电 泳 采 用 的 1.5% 胶 浓 度, 上 样 量 为 7 μl, 电 压 为 100 V; 凝 胶 成 像 观 测 PCR 结 果 3 试 验 结 果 3.1 HK97 family phage protein 序 列 PCR 扩 增 结 果 试 验 结 果 见 图 1-4 由 PCR 扩 增 结 果 可 以 看 出, 菌 株 编 号 FJAT-447 FJAT-448 FJAT-449 FJAT-450

263 FJAT-1300 FJAT-1303 FJAT-1466 FJAT-1469 FJAT-1470 FJAT-1471 FJAT-1447 FJAT-1452 FJAT-1453 FJAT-1454 FJAT-1455 FJAT-1457 FJAT-1458 FJAT-1459 FJAT-1460 FJAT-1461 FJAT-1462 FJAT-1463 FJAT-1473 FJAT-427 FJAT-1307 FJAT-452 FJAT-453 FJAT-456 和 FJAT-458 通 过 该 引 物 在 400 bp 处 出 现 单 一 条 带, 并 且 这 些 菌 株 只 有 FJAT-1452 FJAT-1453 FJAT-1458 和 FJAT-1463 在 形 态 上 是 属 于 弱 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌, 其 他 的 均 为 强 致 病 青 枯 雷 尔 氏 菌 其 余 的 菌 株 均 在 未 出 现 条 带, 其 中 FJAT-54 FJAT-1441 FJAT-1442 FJAT-1443 FJAT-1444 FJAT-1112 FJAT-77 FJAT-476 和 FJAT-469 为 弱 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌, 其 余 的 强 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 图 1 不 同 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 在 引 物 RS980373PCR 扩 增 结 果 (1) 图 2 不 同 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 在 引 物 RS980373PCR 扩 增 结 果 (2) 图 3 不 同 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 在 引 物 RS980373PCR 扩 增 结 果 (3)

264 图 4 不 同 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 在 引 物 RS980373 PCR 扩 增 结 果 (4) 3.2 HK97 family phage protein 序 列 PCR 结 果 综 合 分 析 HK97 family phage protein 序 列 PCR 结 果 综 合 分 析 结 果 见 表 2 在 含 有 HK97 family phage protein 序 列 的 29 株 青 枯 雷 尔 氏 菌 中, 其 中 弱 化 指 数 在 强 致 病 性 区 域 24 株 青 枯 雷 尔 氏 菌 中 共 有 10 株 菌 株 含 有 HK97 family phage protein 序 列, 弱 化 指 数 在 过 渡 区 域 31 株 青 枯 雷 尔 氏 菌 中 共 有 10 株 菌 株 含 有 HK97 family phage protein 序 列, 弱 化 指 数 在 弱 致 病 性 区 域 29 株 青 枯 雷 尔 氏 菌 中 共 有 9 株 菌 株 含 有 HK97 family phage protein 序 列 表 2 HK97 family phage protein PCR 结 果 中 有 目 标 条 带 菌 株 综 合 结 果 菌 株 编 号 寄 主 菌 株 原 产 地 平 均 值 类 群 强 弱 判 断 是 否 有 条 带 FJAT-1455 番 茄 南 平 建 瓯 0.522 V + FJAT-1101 番 茄 莆 田 莆 田 0.581 V - FJAT-0475 辣 椒 宁 德 屏 南 0.591 V - FJAT-1469 番 茄 南 平 建 瓯 0.594 V + FJAT-1459 番 茄 南 平 建 瓯 0.640 V + FJAT-0091 番 茄 福 州 北 峰 0.651 V - FJAT-1300 番 茄 福 州 营 口 0.652 V + FJAT-1448 番 茄 南 平 建 瓯 0.660 V - FJAT-0074 辣 椒 福 州 永 泰 0.663 V - FJAT-1462 番 茄 南 平 建 瓯 0.666 V + FJAT-0435 花 生 泉 州 晋 江 0.680 V - FJAT-0080 番 茄 福 州 北 峰 0.680 Ⅰ<0.74 V - FJAT-1449 番 茄 南 平 建 瓯 0.694 V - FJAT-1461 番 茄 南 平 建 瓯 0.699 V + FJAT-0452 茄 子 宁 德 屏 南 0.712 V + FJAT-1468 番 茄 南 平 建 瓯 0.716 V - FJAT-1102 番 茄 莆 田 莆 田 0.730 V - FJAT-0078 生 姜 福 州 永 泰 0.717 V - FJAT-0437 花 生 泉 州 晋 江 0.716 V - FJAT-1470 番 茄 南 平 建 瓯 0.729 V + FJAT-1471 番 茄 南 平 建 瓯 0.729 V + FJAT-0433 花 生 泉 州 晋 江 0.732 V - FJAT-1457 番 茄 南 平 建 瓯 0.736 V +

265 FJAT-0442 番 茄 宁 德 屏 南 0.730 V - FJAT-1445 番 茄 南 平 建 瓯 0.746 V - FJAT-0441 花 生 泉 州 晋 江 0.747 V - FJAT-1454 番 茄 南 平 建 瓯 0.753 V + FJAT-1446 番 茄 南 平 建 瓯 0.759 V - FJAT-0081 番 茄 福 州 北 峰 0.763 V - FJAT-1463 番 茄 南 平 建 瓯 0.767 A + FJAT-0434 花 生 泉 州 晋 江 0.768 V - FJAT-0469 辣 椒 宁 德 屏 南 0.772 A - FJAT-0465 辣 椒 宁 德 屏 南 0.772 V - FJAT-1307 茄 子 福 州 营 口 0.775 V + FJAT-1231 番 茄 本 实 验 室 0.775 V - FJAT-0449 番 茄 宁 德 屏 南 0.779 V + FJAT-0473 辣 椒 宁 德 屏 南 0.784 V - FJAT-0430 花 生 泉 州 晋 江 0.787 V - FJAT-1441 姜 南 平 建 瓯 0.786 A - FJAT-0427 花 生 泉 州 晋 江 0.791 0.74<Ⅱ<0.825 V + FJAT-1460 番 茄 南 平 建 瓯 0.795 V + FJAT-1458 番 茄 南 平 建 瓯 0.796 A + FJAT-1473 番 茄 南 平 建 瓯 0.796 V + FJAT-1112 茄 子 莆 田 东 洋 镇 0.799 A - FJAT-1466 番 茄 南 平 建 瓯 0.800 V + FJAT-0474 辣 椒 宁 德 屏 南 0.804 V - FJAT-0443 番 茄 宁 德 屏 南 0.808 V - FJAT-0462 辣 椒 宁 德 屏 南 0.809 V - FJAT-0049 番 茄 福 州 建 新 0.810 V - FJAT-0447 番 茄 宁 德 屏 南 0.814 V + FJAT-0428 花 生 泉 州 晋 江 0.812 V - FJAT-1302 番 茄 福 州 营 口 0.817 V - FJAT-0440 花 生 泉 州 晋 江 0.819 V - FJAT-0472 辣 椒 宁 德 屏 南 0.820 V - FJAT-1443 姜 南 平 建 瓯 0.822 V - FJAT-0448 番 茄 宁 德 屏 南 0.829 V + FJAT-1447 番 茄 南 平 建 瓯 0.830 V + FJAT-1442 姜 南 平 建 瓯 0.836 A - FJAT-0054 番 茄 福 州 北 峰 0.838 A - FJAT-1115 茄 子 莆 田 莆 田 0.847 V - FJAT-1301 番 茄 福 州 营 口 0.848 V - 0.825<Ⅲ FJAT-0456 茄 子 宁 德 屏 南 0.850 V + FJAT-1444 姜 南 平 建 瓯 0.855 A - FJAT-1303 番 茄 福 州 营 口 0.859 A + FJAT-1116 茄 子 莆 田 莆 田 0.859 V - FJAT-0070 茄 子 福 州 北 峰 0.865 V - FJAT-0470 辣 椒 宁 德 屏 南 0.865 V -

266 FJAT-0461 辣 椒 宁 德 屏 南 0.867 V - FJAT-0073 茄 子 南 平 0.868 V - FJAT-0458 茄 子 宁 德 屏 南 0.869 V + FJAT-1232 番 茄 本 实 验 室 0.870 V - FJAT-1453 番 茄 南 平 建 瓯 0.871 A + FJAT-0476 辣 椒 宁 德 屏 南 0.873 A - FJAT-0459 辣 椒 宁 德 屏 南 0.874 V - FJAT-0451 番 茄 宁 德 屏 南 0.875 V - FJAT-1103 茄 子 莆 田 东 洋 镇 0.887 V - FJAT-0453 番 茄 宁 德 屏 南 0.897 V + FJAT-0450 番 茄 宁 德 屏 南 0.899 V + FJAT-0445 番 茄 宁 德 屏 南 0.907 V - FJAT-0077 生 姜 福 州 永 泰 0.927 A - FJAT-0468 辣 椒 宁 德 屏 南 0.934 V - FJAT-1452 番 茄 南 平 建 瓯 0.935 A + FJAT-1304 番 茄 福 州 营 口 0.953 V - 4 试 验 讨 论 (1) 菌 株 编 号 FJAT-447 FJAT-448 FJAT-449 FJAT-450 FJAT-1300 FJAT-1303 FJAT-1466 FJAT-1469 FJAT-1470 FJAT-1471 FJAT-1447 FJAT-1452 FJAT-1453 FJAT-1454 FJAT-1455 FJAT-1457 FJAT-1458 FJAT-1459 FJAT-1460 FJAT-1461 FJAT-1462 FJAT-1463 FJAT-1473 FJAT-427 FJAT-1307 FJAT-452 FJAT-453 FJAT-456 和 FJAT-458 通 过 该 引 物 在 400 bp 处 出 现 单 一 条 带, 并 且 这 些 菌 株 只 有 FJAT-1452 FJAT-1453 FJAT-1458 和 FJAT-1463 在 形 态 上 是 属 于 弱 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌, 其 他 的 均 为 强 致 病 青 枯 雷 尔 氏 菌 其 余 的 菌 株 均 在 未 出 现 条 带, 其 中 FJAT-54 FJAT-1441 FJAT-1442 FJAT-1443 FJAT-1444 FJAT-1112 FJAT-77 FJAT-476 和 FJAT-469 为 弱 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌, 其 余 的 强 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 (6) 在 含 有 HK97 family phage protein 序 列 的 29 株 青 枯 雷 尔 氏 菌 中, 其 中 弱 化 指 数 在 强 致 病 性 区 域 24 株 青 枯 雷 尔 氏 菌 中 共 有 10 株 菌 株 含 有 HK97 family phage protein 序 列, 弱 化 指 数 在 过 渡 区 域 31 株 青 枯 雷 尔 氏 菌 中 共 有 10 株 菌 株 含 有 HK97 family phage protein 序 列, 弱 化 指 数 在 弱 致 病 性 区 域 29 株 青 枯 雷 尔 氏 菌 中 共 有 9 株 菌 株 含 有 HK97 family phage protein 序 列 5.. 参 考 文 献 [1] Renmenant B, Coupat-Goutaland B, Guidot A, et al. Genomes of three tomato pathogens within the Ralstonia solanacearum species complex reveal significant evolutionary divergence[j]. BMC Genomics 2010, 11:379-395. [2] 石 元 春, 主 编, 2002, 20 世 纪 中 国 学 术 大 典 农 业 科 学, 福 建 教 育 出 版 社, 中 国, 福 州, pp. 277-278. [3] 杨 玉 红, 2008, 茄 科 植 物 青 枯 菌 病 害 研 究 进 展, 江 西 农 业 学 报, 20(5):54-55, 58 [4] 卫 红 萍, 2010, 茄 科 植 物 青 枯 病 发 生 及 防 治 策 略 研 究, 咸 宁 学 院 学 报, 30(8):164-16 试 验 负 责 车 建 美 刘 波 试 验 人 员 林 海 云

267 附 录 RS98orf00373 序 列 : TTGCGTCAAGCAATCGCGGCAGCGGCCACCGTCTTCAAGCAGGAAATCGTACTCCGCGCGCCT CGCCGCACGGGTGACTTGTCGCGTGGCGTGACTGTCGCTTACGTCCCTGAGGAATCGCGTACG GGCGCCGTCGCTACCTACATAACGACCTTCATCGGTCGCGCACGAAATCGCGAGAACGGCAAG CCCGGTATGCGCCTCGCGGACGTGGCCCGCTGGCTCGAATACGGCACGTCAAAGATGGCAGCA AGCCCGTTCATTCGCCCTTCCTTCGACGCAAAGAAGGAGCAGGCCCTACAGACCGCAGAGGCG AAGATATTGGAGGCGTTAGAGCGTGGCGGGTAG

268 2011-08-11 承 担 单 位 : 福 建 省 农 科 院 农 业 生 物 资 源 研 究 所 试 验 设 计 : 试 验 项 目 : 青 枯 雷 尔 氏 菌 caudovirus prohead protease 验 证 (RS980384) 试 验 人 员 : 林 海 云 试 验 负 责 : 车 建 美 刘 波 报 告 日 期 :2011-8-11 计 数 月 份 :2011 年 08 月 研 究 资 格 系 数 (0.5-1.0) 实 验 设 计 系 数 (0.9-1.0 0.9-1.0) 报 告 得 分 总 分 实 验 设 计 实 验 记 载 实 验 分 析 实 验 简 报 实 验 文 章 1-20% 21-40% 41-60% 61-80% 81-100% 1%-5% 设 计 不 足, 实 施 错 误 6%-10% 设 计 不 全, 实 验 无 果 11%-15% 设 计 可 以, 实 施 不 全 16%-20% 设 计 完 整, 分 布 实 施 21%-25% 实 验 不 全, 记 载 无 果 26%-30% 实 验 不 足, 记 载 不 全 31%-35% 独 立 实 验, 记 载 不 全 36%-40% 分 布 实 验, 记 载 完 整 41%-45% 目 的 明 确, 实 验 完 成 46%-50% 实 验 完 整, 记 载 清 晰 51%-55% 实 验 系 统, 结 果 可 信 56%-60% 实 验 创 新, 分 析 清 晰 61%-65% 实 验 创 新, 结 论 清 晰 66%-70% 实 验 完 整, 统 计 清 晰 71%-75% 实 验 系 统, 数 据 可 靠 76%-80% 报 告 完 整, 文 章 雏 形 81%-85% 结 构 合 理, 分 析 有 据 86%-90% 逻 辑 清 晰, 统 计 合 理 91%-95% 图 表 完 整, 写 作 流 畅 96%-100% 文 献 完 整, 发 表 水 平 福 建 省 农 业 科 学 院 农 业 生 物 资 源 研 究 所 农 业 微 生 物 研 究 中 心 电 话 : 0591-87882571, 传 真 : 0591-87882571 fjat.yzxz.com

269 1. 试 验 目 的 细 菌 性 青 枯 病 是 由 青 枯 雷 尔 氏 菌 引 起 的 一 种 重 要 土 传 植 物 病 害, 侵 染 寄 主 范 围 很 广 (Remenant, 2010), 据 报 道 青 枯 病 原 菌 可 侵 染 50 多 个 科 数 百 种 植 物, 包 括 花 生 番 茄 茄 子 和 辣 椒 等 经 济 作 物, 并 且 近 年 来 青 枯 病 在 中 国 继 续 加 重, 新 的 寄 主 也 在 不 断 地 被 发 现 ( 石 元 春, 2002), 其 中 茄 科 植 物 受 青 枯 病 危 害 最 重, 涉 及 的 作 物 种 类 最 多 ( 杨 玉 红, 2008) 青 枯 病 原 菌 是 一 个 复 杂 的 群 体, 在 寄 主 范 围 生 化 型 致 病 力 和 血 清 型 等 细 菌 学 特 性 上 差 异 很 大, 这 导 致 其 病 害 防 治 较 为 困 难, 使 其 成 为 世 界 上 危 害 最 大 分 布 最 广 和 造 成 损 失 最 为 严 重 的 植 物 病 害 之 一 ( 卫 红 萍, 2010) ; 由 于 青 枯 雷 尔 氏 菌 的 复 杂 性, 导 致 其 致 病 机 制 也 十 分 复 杂, 只 有 通 过 对 青 枯 雷 尔 氏 菌 致 病 机 制 的 更 深 入 地 研 究, 才 有 可 能 找 到 控 制 它 的 有 效 方 法 本 实 验 室 已 对 强 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 FJAT-91 和 弱 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 FJAT-1458 测 通 其 全 序 列, 测 序 结 果 分 析 可 知, 强 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 FJAT-91 和 弱 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 FJAT-1458 存 在 一 系 列 差 异 基 因, 其 中 在 强 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 FJAT-91 存 在 的 基 因 而 在 弱 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 FJAT-1458 不 存 在 的 基 因 有 225 个 ( 强 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 FJAT-91 特 异 性 获 得 基 因 ), 而 在 弱 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 FJAT-1458 存 在 而 在 强 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 不 存 在 的 基 因 有 360 个 ( 弱 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 特 异 性 获 得 基 因 ) 本 试 验 基 于 弱 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 FJAT-1458 特 异 性 获 得 基 因 caudovirus prohead protease (caudovirus 前 体 蛋 白 酶 ), 该 基 因 在 本 试 验 中 的 编 号 为 RS98orf00384, 该 基 因 全 长 为 348bp, 本 试 验 基 于 批 处 理 软 件 设 计 了 一 对 引 物 (RS980384-1 和 RS9803843-2), 该 对 引 物 可 在 弱 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 FJAT-1458 扩 增 出 300 bp 目 的 条 带, 而 在 强 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 FJAT-91 不 能 扩 增 出 条 带 ( 已 在 梯 度 试 验 中 验 证 ), 本 试 验 利 用 该 对 引 物 对 菌 种 库 中 所 有 青 枯 雷 尔 氏 菌, 以 验 证 该 基 因 是 否 只 在 弱 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 存 在, 而 在 强 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 不 存 在? 以 进 一 步 对 青 枯 雷 尔 氏 菌 致 病 机 制 进 行 探 索 2. 试 验 方 法 2.1 试 验 材 料 2.1.1 菌 株 : 试 验 菌 株 及 来 源 见 表 1 表 1 菌 株 以 及 来 源 菌 株 编 号 名 称 来 源 物 种 分 离 基 物 菌 株 原 产 地 49 Rs-F.1.1-010615-04V 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 福 州 建 新 54 Rs-F.1.3-010702-09V 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 福 州 北 峰 80 Rs-F.1.3-010702-01V-f2 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 福 州 北 峰 81 Rs-F.1.3-010702-01V-f3 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 福 州 北 峰 91 Rs-F.1.3-010702-01V-f13 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 福 州 北 峰 442 Rs-F.352300-060722-5-1-1 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 宁 德 屏 南 443 Rs-F.352300-060722-5-1-2 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 宁 德 屏 南 445 Rs-F.352300-060722-5-2-2 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 宁 德 屏 南 447 Rs-F.352300-060722-6-1-2 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 宁 德 屏 南 448 Rs-F.352300-060722-6-2-1 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 宁 德 屏 南

270 449 Rs-F.352300-060722-6-2-2 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 宁 德 屏 南 450 Rs-F.352300-060722-7-1 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 宁 德 屏 南 451 Rs-F.352300-060722-7-2 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 宁 德 屏 南 1300 Rs-F.350112-070612-V2 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 福 州 营 口 1301 Rs-F.350112-070612-V3 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 福 州 营 口 1302 Rs-F.350112-070612-V4 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 福 州 营 口 1303 Rs-F.350112-070612-V5 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 福 州 营 口 1304 Rs-F.350112-070612-V6 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 福 州 营 口 1466 RSF-V-109 自 己 分 离 番 茄 根 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1468 RSF-V-117 自 己 分 离 番 茄 根 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1469 RSF-V-121 自 己 分 离 番 茄 根 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1470 RSF-V-125 自 己 分 离 番 茄 根 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1471 RSF-V-129 自 己 分 离 番 茄 根 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1445 RSF-V-14 自 己 分 离 番 茄 茎 基 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1446 RSF-V-99 自 己 分 离 番 茄 茎 基 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1447 RSF-V-100 自 己 分 离 番 茄 茎 基 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1448 RSF-V-103 自 己 分 离 番 茄 茎 基 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1449 RSF-V-106 自 己 分 离 番 茄 茎 基 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1452 RSF-A-26 自 己 分 离 番 茄 茎 中 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1453 RSF-A-27 自 己 分 离 番 茄 茎 中 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1454 RSF-A-30 自 己 分 离 番 茄 茎 中 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1455 RSF-A-31 自 己 分 离 番 茄 茎 中 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1457 RSF-V-97 自 己 分 离 番 茄 茎 中 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1458 RSF-A-98 自 己 分 离 番 茄 茎 中 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1459 RSF-V-102 自 己 分 离 番 茄 茎 中 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1460 RSF-V-115 自 己 分 离 番 茄 茎 中 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1461 RSF-V-116 自 己 分 离 番 茄 茎 中 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1462 RSF-V-119 自 己 分 离 番 茄 茎 中 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1463 RSF-V-122 自 己 分 离 番 茄 茎 中 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1473 RSF-V-111 自 己 分 离 番 茄 茎 中 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 青 枯 病 植 株 1102 Rs-F.351144-060928-14V 自 己 分 离 番 茄 1101 Rs-F.351144-060928-13V 自 己 分 离 番 茄 茎 顶 部 青 枯 病 植 株 茎 中 部 莆 田 东 洋 镇 莆 田 东 洋 镇 427 Rs-P.362200-060707-1-1 自 己 分 离 花 生 花 生 植 株 泉 州 晋 江

271 428 Rs-P.362200-060707-1-2 自 己 分 离 花 生 花 生 植 株 泉 州 晋 江 430 Rs-P.362200-060707-2-1 自 己 分 离 花 生 花 生 植 株 泉 州 晋 江 433 Rs-P.362200-060707-3-1 自 己 分 离 花 生 花 生 植 株 泉 州 晋 江 434 Rs-P.362200-060707-3-2 自 己 分 离 花 生 花 生 植 株 泉 州 晋 江 435 Rs-P.362200-060707-3-3 自 己 分 离 花 生 花 生 植 株 泉 州 晋 江 437 Rs-P.362200-060707-4-2 自 己 分 离 花 生 花 生 植 株 泉 州 晋 江 440 Rs-P.362200-060707-5-2 自 己 分 离 花 生 花 生 植 株 泉 州 晋 江 441 Rs-P.362200-060707-5-3 自 己 分 离 花 生 花 生 植 株 泉 州 晋 江 1441 RSJ-79-A 自 己 分 离 姜 茎 基 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1442 RSJ-86-A 自 己 分 离 姜 茎 基 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1443 RSJ-87-V 自 己 分 离 姜 茎 基 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1444 RSJ-88-A 自 己 分 离 姜 茎 基 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 74 Rs-L.1.4-010704-01V 自 己 分 离 辣 椒 辣 椒 植 株 福 州 永 泰 459 Rs-L.352300-060722-14-1-1 自 己 分 离 辣 椒 辣 椒 植 株 宁 德 屏 南 461 Rs-L.352300-060722-14-2-1 自 己 分 离 辣 椒 辣 椒 植 株 宁 德 屏 南 462 Rs-L.352300-060722-14-2-2 自 己 分 离 辣 椒 辣 椒 植 株 宁 德 屏 南 465 Rs-L.352300-060722-16-1-1 自 己 分 离 辣 椒 辣 椒 植 株 宁 德 屏 南 466 Rs-L.352300-060722-16-1-2 自 己 分 离 辣 椒 辣 椒 植 株 宁 德 屏 南 468 Rs-L.352300-060722-16-2-2 自 己 分 离 辣 椒 辣 椒 植 株 宁 德 屏 南 470 Rs-L.352300-060722-17-1-2 自 己 分 离 辣 椒 辣 椒 植 株 宁 德 屏 南 469 Eb-L.352300-060722-17-1-1 (Vibrio-hollisae) 自 己 分 离 辣 椒 辣 椒 植 株 宁 德 屏 南 472 Rs-L.352300-060722-17-2-2 自 己 分 离 辣 椒 辣 椒 植 株 宁 德 屏 南 473 Rs-L.352300-060722-18-1 自 己 分 离 辣 椒 辣 椒 植 株 宁 德 屏 南 474 Rs-L.352300-060722-18-2-1 自 己 分 离 辣 椒 辣 椒 植 株 宁 德 屏 南 475 Rs-L.352300-060722-18-2-2 自 己 分 离 辣 椒 辣 椒 植 株 宁 德 屏 南 476 Rs-L.352300-060722-20-1 自 己 分 离 辣 椒 辣 椒 植 株 宁 德 屏 南 健 康 植 株 根 1103 Rs-Q.351144-061019-01V 自 己 分 离 茄 子 部 莆 田 东 洋 镇 1307 Rs-Q.350112-070628-11V 自 己 分 离 茄 子 茄 子 - 根 福 州 营 口 70 Rs-Q.1.3-020626-5V 自 己 分 离 茄 子 茄 子 植 株 福 州 北 峰 73 Rs-Q.9.2-010620-V 自 己 分 离 茄 子 茄 子 植 株 南 平 452 Rs-Q.352300-060722-8-1-1 自 己 分 离 茄 子 茄 子 植 株 宁 德 屏 南 453 Rs-Q.352300-060722-8-2-1 自 己 分 离 茄 子 茄 子 植 株 宁 德 屏 南 454 Rs-Q.352300-060722-8-2-2 自 己 分 离 茄 子 茄 子 植 株 宁 德 屏 南

272 456 Rs-Q.352300-060722-9-1-2 自 己 分 离 茄 子 茄 子 植 株 宁 德 屏 南 458 Rs-Q.352300-060722-9-2-2 自 己 分 离 茄 子 茄 子 植 株 宁 德 屏 南 青 枯 病 植 株 1115 Rs-Q.351144-061107-11V 自 己 分 离 茄 子 1116 Rs-Q.351144-061107-12V 自 己 分 离 茄 子 1112 Rs-Q.351144-061024-12V 自 己 分 离 茄 子 根 部 青 枯 病 植 株 茎 基 部 青 枯 病 植 株 茎 基 部 莆 田 东 洋 镇 莆 田 东 洋 镇 莆 田 东 洋 镇 77 Rs-J.1.4-010704-01V 自 己 分 离 生 姜 生 姜 植 株 福 州 永 泰 78 Rs-J.1.4-010704-02A 自 己 分 离 生 姜 生 姜 植 株 福 州 永 泰 1231 Rs91-2-4# 自 己 分 离 培 养 基 本 实 验 室 1232 Rs91-3-5# 自 己 分 离 培 养 基 本 实 验 室 2.1.2 试 剂 与 仪 器 (1) 试 剂 ddw;dntp 购 自 福 州 博 海 生 物 技 术 有 限 公 司 ;Buffer,Taq 酶 购 自 北 京 天 根 生 化 科 技 有 限 公 司 ; 上 游 引 物 RS980384-1:5'-GTC CAC TAC GAA AAG GCA GC-3', 下 游 引 物 RS980384-2:5'-CGG AAG TGA GAG ACA GGG AG-3', 引 物 购 自 上 海 博 尚 有 限 公 司 ; 已 稀 释 青 枯 雷 尔 氏 菌 DNA 产 物 ;1500 bp Maker 购 自 上 海 英 竣 生 物 技 术 公 司 (2) 仪 器 UVP 凝 胶 成 像 仪 ;Biometra 梯 度 PCR 仪 ;BIO-RAD 电 泳 仪 ; 2.2 试 验 方 法 (5) 扩 增 体 系 ddw:18.7 μl ; Buffer:2.5 μl; dntp:0.5 μl; RS980384-1:1 μl; RS980384-2:1 μl; Taq:0.3 μl; DNA:1 μl (2)PCR 程 序 95 C, 预 变 性 5 min; 然 后 95 C 变 性 30 s,65 C 退 火 30 s,72 C 延 伸 1 min, 进 行 30 个 循 环 ; 最 后 72 C 7 min PCR 产 物 可 在 4 C 保 存 (3) 电 泳 采 用 的 1.5% 胶 浓 度, 上 样 量 为 7 μl, 电 压 为 100 V; 凝 胶 成 像 观 测 PCR 结 果 3. 试 验 结 果 3.1 caudovirus prohead protease 序 列 PCR 扩 增 结 果 试 验 结 果 见 图 1-4 由 PCR 扩 增 结 果 可 以 看 出, 菌 株 编 号 FJAT-447 FJAT-448 FJAT-449

273 FJAT-1303 FJAT-1466 FJAT-1468 FJAT-1469 FJAT-1470 FJAT-1471 FJAT-1447 FJAT-1452 FJAT-1453 FJAT-1454 FJAT-1455 FJAT-1457 FJAT-1458 FJAT-1459 FJAT-1460 FJAT-1461 FJAT-1462 FJAT-1463 FJAT-1473 FJAT-1307 FJAT-452 FJAT-453 FJAT-456 和 FJAT-458 通 过 该 引 物 在 300 bp 处 出 现 单 一 条 带, 并 且 这 些 菌 株 只 有 FJAT-1452 FJAT-1453 FJAT-1458 和 FJAT-1463 在 形 态 上 是 属 于 弱 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌, 其 他 的 均 为 强 致 病 青 枯 雷 尔 氏 菌 其 余 的 菌 株 均 在 未 出 现 条 带, 其 中 FJAT-54 FJAT-1441 FJAT-1442 FJAT-1443 FJAT-1444 FJAT-1112 FJAT-77 FJAT-476 和 FJAT-469 为 弱 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌, 其 余 的 强 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 图 1 不 同 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 在 引 物 RS980384PCR 扩 增 结 果 (1) 图 2 不 同 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 在 引 物 RS980384PCR 扩 增 结 果 (2) 图 3 不 同 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 在 引 物 RS980384PCR 扩 增 结 果 (3)

274 图 4 不 同 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 在 引 物 RS980384 PCR 扩 增 结 果 (4) 3.2 caudovirus prohead protease 序 列 PCR 结 果 综 合 分 析 caudovirus prohead protease 序 列 PCR 结 果 综 合 分 析 结 果 见 表 2 在 含 有 caudovirus prohead protease 序 列 的 27 株 青 枯 雷 尔 氏 菌 中, 其 中 弱 化 指 数 在 强 致 病 性 区 域 24 株 青 枯 雷 尔 氏 菌 中 共 有 10 株 菌 株 含 有 caudovirus prohead protease 序 列, 弱 化 指 数 在 过 渡 区 域 31 株 青 枯 雷 尔 氏 菌 中 共 有 9 株 菌 株 含 有 caudovirus prohead protease 序 列, 弱 化 指 数 在 弱 致 病 性 区 域 29 株 青 枯 雷 尔 氏 菌 中 共 有 8 株 菌 株 含 有 caudovirus prohead protease 序 列 表 2 caudovirus prohead protease PCR 结 果 中 有 目 标 条 带 菌 株 综 合 结 果 菌 株 编 号 寄 主 菌 株 原 产 地 平 均 值 类 群 强 弱 判 断 是 否 有 条 带 FJAT-1455 番 茄 南 平 建 瓯 0.522 V + FJAT-1101 番 茄 莆 田 莆 田 0.581 V - FJAT-0475 辣 椒 宁 德 屏 南 0.591 V - FJAT-1469 番 茄 南 平 建 瓯 0.594 V + FJAT-1459 番 茄 南 平 建 瓯 0.640 V + FJAT-0091 番 茄 福 州 北 峰 0.651 V - FJAT-1300 番 茄 福 州 营 口 0.652 V - FJAT-1448 番 茄 南 平 建 瓯 0.660 V - FJAT-0074 辣 椒 福 州 永 泰 0.663 V - FJAT-1462 番 茄 南 平 建 瓯 0.666 V + FJAT-0435 花 生 泉 州 晋 江 0.680 V - Ⅰ<0.74 FJAT-0080 番 茄 福 州 北 峰 0.680 V - FJAT-1449 番 茄 南 平 建 瓯 0.694 V - FJAT-1461 番 茄 南 平 建 瓯 0.699 V + FJAT-0452 茄 子 宁 德 屏 南 0.712 V + FJAT-1468 番 茄 南 平 建 瓯 0.716 V + FJAT-1102 番 茄 莆 田 莆 田 0.730 V - FJAT-0078 生 姜 福 州 永 泰 0.717 V - FJAT-0437 花 生 泉 州 晋 江 0.716 V - FJAT-1470 番 茄 南 平 建 瓯 0.729 V + FJAT-1471 番 茄 南 平 建 瓯 0.729 V + FJAT-0433 花 生 泉 州 晋 江 0.732 V -

275 FJAT-1457 番 茄 南 平 建 瓯 0.736 V + FJAT-0442 番 茄 宁 德 屏 南 0.730 V - FJAT-1445 番 茄 南 平 建 瓯 0.746 V - FJAT-0441 花 生 泉 州 晋 江 0.747 V - FJAT-1454 番 茄 南 平 建 瓯 0.753 V + FJAT-1446 番 茄 南 平 建 瓯 0.759 V - FJAT-0081 番 茄 福 州 北 峰 0.763 V - FJAT-1463 番 茄 南 平 建 瓯 0.767 A + FJAT-0434 花 生 泉 州 晋 江 0.768 V - FJAT-0469 辣 椒 宁 德 屏 南 0.772 A - FJAT-0465 辣 椒 宁 德 屏 南 0.772 V - FJAT-1307 茄 子 福 州 营 口 0.775 V + FJAT-1231 番 茄 本 实 验 室 0.775 V - FJAT-0449 番 茄 宁 德 屏 南 0.779 V + FJAT-0473 辣 椒 宁 德 屏 南 0.784 V - FJAT-0430 花 生 泉 州 晋 江 0.787 V - FJAT-1441 姜 南 平 建 瓯 0.786 A - FJAT-0427 花 生 泉 州 晋 江 0.791 0.74<Ⅱ<0.825 V - FJAT-1460 番 茄 南 平 建 瓯 0.795 V + FJAT-1458 番 茄 南 平 建 瓯 0.796 A + FJAT-1473 番 茄 南 平 建 瓯 0.796 V + FJAT-1112 茄 子 莆 田 东 洋 镇 0.799 A - FJAT-1466 番 茄 南 平 建 瓯 0.800 V + FJAT-0474 辣 椒 宁 德 屏 南 0.804 V - FJAT-0443 番 茄 宁 德 屏 南 0.808 V - FJAT-0462 辣 椒 宁 德 屏 南 0.809 V - FJAT-0049 番 茄 福 州 建 新 0.810 V - FJAT-0447 番 茄 宁 德 屏 南 0.814 V + FJAT-0428 花 生 泉 州 晋 江 0.812 V - FJAT-1302 番 茄 福 州 营 口 0.817 V - FJAT-0440 花 生 泉 州 晋 江 0.819 V - FJAT-0472 辣 椒 宁 德 屏 南 0.820 V - FJAT-1443 姜 南 平 建 瓯 0.822 V - FJAT-0448 番 茄 宁 德 屏 南 0.829 V + FJAT-1447 番 茄 南 平 建 瓯 0.830 V + FJAT-1442 姜 南 平 建 瓯 0.836 A - FJAT-0054 番 茄 福 州 北 峰 0.838 A - FJAT-1115 茄 子 莆 田 莆 田 0.847 V - FJAT-1301 番 茄 福 州 营 口 0.848 0.825<Ⅲ V - FJAT-0456 茄 子 宁 德 屏 南 0.850 V + FJAT-1444 姜 南 平 建 瓯 0.855 A - FJAT-1303 番 茄 福 州 营 口 0.859 A + FJAT-1116 茄 子 莆 田 莆 田 0.859 V - FJAT-0070 茄 子 福 州 北 峰 0.865 V -

276 FJAT-0470 辣 椒 宁 德 屏 南 0.865 V - FJAT-0461 辣 椒 宁 德 屏 南 0.867 V - FJAT-0073 茄 子 南 平 0.868 V - FJAT-0458 茄 子 宁 德 屏 南 0.869 V + FJAT-1232 番 茄 本 实 验 室 0.870 V - FJAT-1453 番 茄 南 平 建 瓯 0.871 A + FJAT-0476 辣 椒 宁 德 屏 南 0.873 A - FJAT-0459 辣 椒 宁 德 屏 南 0.874 V - FJAT-0451 番 茄 宁 德 屏 南 0.875 V - FJAT-1103 茄 子 莆 田 东 洋 镇 0.887 V - FJAT-0453 番 茄 宁 德 屏 南 0.897 V + FJAT-0450 番 茄 宁 德 屏 南 0.899 V - FJAT-0445 番 茄 宁 德 屏 南 0.907 V - FJAT-0077 生 姜 福 州 永 泰 0.927 A - FJAT-0468 辣 椒 宁 德 屏 南 0.934 V - FJAT-1452 番 茄 南 平 建 瓯 0.935 A + FJAT-1304 番 茄 福 州 营 口 0.953 V - 4. 试 验 讨 论 (1) 由 PCR 扩 增 结 果 可 以 看 出, 菌 株 编 号 FJAT-447 FJAT-448 FJAT-449 FJAT-1303 FJAT-1466 FJAT-1468 FJAT-1469 FJAT-1470 FJAT-1471 FJAT-1447 FJAT-1452 FJAT-1453 FJAT-1454 FJAT-1455 FJAT-1457 FJAT-1458 FJAT-1459 FJAT-1460 FJAT-1461 FJAT-1462 FJAT-1463 FJAT-1473 FJAT-1307 FJAT-452 FJAT-453 FJAT-456 和 FJAT-458 通 过 该 引 物 在 300 bp 处 出 现 单 一 条 带, 并 且 这 些 菌 株 只 有 FJAT-1452 FJAT-1453 FJAT-1458 和 FJAT-1463 在 形 态 上 是 属 于 弱 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌, 其 他 的 均 为 强 致 病 青 枯 雷 尔 氏 菌 其 余 的 菌 株 均 在 未 出 现 条 带, 其 中 FJAT-54 FJAT-1441 FJAT-1442 FJAT-1443 FJAT-1444 FJAT-1112 FJAT-77 FJAT-476 和 FJAT-469 为 弱 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌, 其 余 的 强 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 (2) 在 含 有 caudovirus prohead protease 序 列 的 27 株 青 枯 雷 尔 氏 菌 中, 其 中 弱 化 指 数 在 强 致 病 性 区 域 24 株 青 枯 雷 尔 氏 菌 中 共 有 10 株 菌 株 含 有 caudovirus prohead protease 序 列, 弱 化 指 数 在 过 渡 区 域 31 株 青 枯 雷 尔 氏 菌 中 共 有 9 株 菌 株 含 有 caudovirus prohead protease 序 列, 弱 化 指 数 在 弱 致 病 性 区 域 29 株 青 枯 雷 尔 氏 菌 中 共 有 8 株 菌 株 含 有 caudovirus prohead protease 序 列 5.. 参 考 文 献 [1] Renmenant B, Coupat-Goutaland B, Guidot A, et al. Genomes of three tomato pathogens within the Ralstonia solanacearum species complex reveal significant evolutionary divergence[j]. BMC Genomics 2010, 11:379-395. [2] 石 元 春, 主 编, 2002, 20 世 纪 中 国 学 术 大 典 农 业 科 学, 福 建 教 育 出 版 社, 中 国, 福 州, pp. 277-278. [3] 杨 玉 红, 2008, 茄 科 植 物 青 枯 菌 病 害 研 究 进 展, 江 西 农 业 学 报, 20(5):54-55, 58 [4] 卫 红 萍, 2010, 茄 科 植 物 青 枯 病 发 生 及 防 治 策 略 研 究, 咸 宁 学 院 学 报, 30(8):164-16 试 验 负 责 车 建 美 刘 波 试 验 人 员 林 海 云

277 附 录 : RS98orf00384 序 列 : GTGAAGGCCCGCACAGACGAAGCGTGGCACTCGGTGAAGAGCGGGATCATCAAGGGCACGTC CATCGGGTTTATTCCCCAGGAATACAACTACAAAGACGACGGCGGCGTCCACTACGAAAAGGC AGCCGTGCACGAGCTGTCCCTCACCGCGATTCCCTGCAATCCCGAGGCCGTGATTACGGCTTTC AAGAGCCTGCAAACACTTCACGATGACGCGCCAGCGTCAGCGGAAGAACCGGGCGAAGACCC CGCGCAGCAACCGGCCACGCCCGCCCCCAGCACGTCGGCAGGCAGCGAAGCAGCCCCGGCAC CTCAACCCGAAGTTAAGGCCGTTCGCGCCCTGCTTCTCCCTGTCTCTCACTTCCGCACATAA

278 2011-08-12 承 担 单 位 : 福 建 省 农 科 院 农 业 生 物 资 源 研 究 所 试 验 设 计 : 试 验 项 目 : 青 枯 雷 尔 氏 菌 hypothetical protein Bmul_0496 验 证 (RS980442) 试 验 人 员 : 林 海 云 试 验 负 责 : 车 建 美 刘 波 报 告 日 期 :2011-8-12 计 数 月 份 :2011 年 08 月 研 究 资 格 系 数 (0.5-1.0) 实 验 设 计 系 数 (0.9-1.0 0.9-1.0) 报 告 得 分 总 分 实 验 设 计 实 验 记 载 实 验 分 析 实 验 简 报 实 验 文 章 1-20% 21-40% 41-60% 61-80% 81-100% 1%-5% 设 计 不 足, 实 施 错 误 6%-10% 设 计 不 全, 实 验 无 果 11%-15% 设 计 可 以, 实 施 不 全 16%-20% 设 计 完 整, 分 布 实 施 21%-25% 实 验 不 全, 记 载 无 果 26%-30% 实 验 不 足, 记 载 不 全 31%-35% 独 立 实 验, 记 载 不 全 36%-40% 分 布 实 验, 记 载 完 整 41%-45% 目 的 明 确, 实 验 完 成 46%-50% 实 验 完 整, 记 载 清 晰 51%-55% 实 验 系 统, 结 果 可 信 56%-60% 实 验 创 新, 分 析 清 晰 61%-65% 实 验 创 新, 结 论 清 晰 66%-70% 实 验 完 整, 统 计 清 晰 71%-75% 实 验 系 统, 数 据 可 靠 76%-80% 报 告 完 整, 文 章 雏 形 81%-85% 结 构 合 理, 分 析 有 据 86%-90% 逻 辑 清 晰, 统 计 合 理 91%-95% 图 表 完 整, 写 作 流 畅 96%-100% 文 献 完 整, 发 表 水 平 福 建 省 农 业 科 学 院 农 业 生 物 资 源 研 究 所 农 业 微 生 物 研 究 中 心 电 话 : 0591-87882571, 传 真 : 0591-87882571 fjat.yzxz.com

279 1. 试 验 目 的 细 菌 性 青 枯 病 是 由 青 枯 雷 尔 氏 菌 引 起 的 一 种 重 要 土 传 植 物 病 害, 侵 染 寄 主 范 围 很 广 (Remenant, 2010), 据 报 道 青 枯 病 原 菌 可 侵 染 50 多 个 科 数 百 种 植 物, 包 括 花 生 番 茄 茄 子 和 辣 椒 等 经 济 作 物, 并 且 近 年 来 青 枯 病 在 中 国 继 续 加 重, 新 的 寄 主 也 在 不 断 地 被 发 现 ( 石 元 春, 2002), 其 中 茄 科 植 物 受 青 枯 病 危 害 最 重, 涉 及 的 作 物 种 类 最 多 ( 杨 玉 红, 2008) 青 枯 病 原 菌 是 一 个 复 杂 的 群 体, 在 寄 主 范 围 生 化 型 致 病 力 和 血 清 型 等 细 菌 学 特 性 上 差 异 很 大, 这 导 致 其 病 害 防 治 较 为 困 难, 使 其 成 为 世 界 上 危 害 最 大 分 布 最 广 和 造 成 损 失 最 为 严 重 的 植 物 病 害 之 一 ( 卫 红 萍, 2010) ; 由 于 青 枯 雷 尔 氏 菌 的 复 杂 性, 导 致 其 致 病 机 制 也 十 分 复 杂, 只 有 通 过 对 青 枯 雷 尔 氏 菌 致 病 机 制 的 更 深 入 地 研 究, 才 有 可 能 找 到 控 制 它 的 有 效 方 法 本 实 验 室 已 对 强 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 FJAT-91 和 弱 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 FJAT-1458 测 通 其 全 序 列, 测 序 结 果 分 析 可 知, 强 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 FJAT-91 和 弱 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 FJAT-1458 存 在 一 系 列 差 异 基 因, 其 中 在 强 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 FJAT-91 存 在 的 基 因 而 在 弱 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 FJAT-1458 不 存 在 的 基 因 有 225 个 ( 强 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 FJAT-91 特 异 性 获 得 基 因 ), 而 在 弱 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 FJAT-1458 存 在 而 在 强 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 不 存 在 的 基 因 有 360 个 ( 弱 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 特 异 性 获 得 基 因 ) 本 试 验 基 于 弱 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 FJAT-1458 特 异 性 获 得 基 因 hypothetical protein Bmul_0496, 该 基 因 在 本 试 验 中 的 编 号 为 RS98orf00442, 该 基 因 全 长 为 348bp, 本 试 验 基 于 批 处 理 软 件 设 计 了 一 对 引 物 (RS980442-1 和 RS9804423-2), 该 对 引 物 可 在 弱 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 FJAT-1458 扩 增 出 300 bp 目 的 条 带, 而 在 强 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 FJAT-91 不 能 扩 增 出 条 带 ( 已 在 梯 度 试 验 中 验 证 ), 本 试 验 利 用 该 对 引 物 对 菌 种 库 中 所 有 青 枯 雷 尔 氏 菌, 以 验 证 该 基 因 是 否 只 在 弱 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 存 在, 而 在 强 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 不 存 在? 以 进 一 步 对 青 枯 雷 尔 氏 菌 致 病 机 制 进 行 探 索 2. 试 验 方 法 2.1 试 验 材 料 2.1.1 菌 株 : 试 验 菌 株 及 来 源 见 表 1 表 1 菌 株 以 及 来 源 菌 株 编 号 名 称 来 源 物 种 分 离 基 物 菌 株 原 产 地 49 Rs-F.1.1-010615-04V 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 福 州 建 新 54 Rs-F.1.3-010702-09V 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 福 州 北 峰 80 Rs-F.1.3-010702-01V-f2 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 福 州 北 峰 81 Rs-F.1.3-010702-01V-f3 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 福 州 北 峰 91 Rs-F.1.3-010702-01V-f13 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 福 州 北 峰 442 Rs-F.352300-060722-5-1-1 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 宁 德 屏 南 443 Rs-F.352300-060722-5-1-2 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 宁 德 屏 南 445 Rs-F.352300-060722-5-2-2 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 宁 德 屏 南 447 Rs-F.352300-060722-6-1-2 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 宁 德 屏 南 448 Rs-F.352300-060722-6-2-1 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 宁 德 屏 南 449 Rs-F.352300-060722-6-2-2 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 宁 德 屏 南

280 450 Rs-F.352300-060722-7-1 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 宁 德 屏 南 451 Rs-F.352300-060722-7-2 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 宁 德 屏 南 1300 Rs-F.350112-070612-V2 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 福 州 营 口 1301 Rs-F.350112-070612-V3 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 福 州 营 口 1302 Rs-F.350112-070612-V4 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 福 州 营 口 1303 Rs-F.350112-070612-V5 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 福 州 营 口 1304 Rs-F.350112-070612-V6 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 福 州 营 口 1466 RSF-V-109 自 己 分 离 番 茄 根 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1468 RSF-V-117 自 己 分 离 番 茄 根 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1469 RSF-V-121 自 己 分 离 番 茄 根 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1470 RSF-V-125 自 己 分 离 番 茄 根 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1471 RSF-V-129 自 己 分 离 番 茄 根 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1445 RSF-V-14 自 己 分 离 番 茄 茎 基 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1446 RSF-V-99 自 己 分 离 番 茄 茎 基 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1447 RSF-V-100 自 己 分 离 番 茄 茎 基 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1448 RSF-V-103 自 己 分 离 番 茄 茎 基 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1449 RSF-V-106 自 己 分 离 番 茄 茎 基 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1452 RSF-A-26 自 己 分 离 番 茄 茎 中 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1453 RSF-A-27 自 己 分 离 番 茄 茎 中 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1454 RSF-A-30 自 己 分 离 番 茄 茎 中 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1455 RSF-A-31 自 己 分 离 番 茄 茎 中 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1457 RSF-V-97 自 己 分 离 番 茄 茎 中 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1458 RSF-A-98 自 己 分 离 番 茄 茎 中 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1459 RSF-V-102 自 己 分 离 番 茄 茎 中 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1460 RSF-V-115 自 己 分 离 番 茄 茎 中 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1461 RSF-V-116 自 己 分 离 番 茄 茎 中 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1462 RSF-V-119 自 己 分 离 番 茄 茎 中 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1463 RSF-V-122 自 己 分 离 番 茄 茎 中 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1473 RSF-V-111 自 己 分 离 番 茄 茎 中 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 青 枯 病 植 株 1102 Rs-F.351144-060928-14V 自 己 分 离 番 茄 1101 Rs-F.351144-060928-13V 自 己 分 离 番 茄 茎 顶 部 青 枯 病 植 株 茎 中 部 莆 田 东 洋 镇 莆 田 东 洋 镇 427 Rs-P.362200-060707-1-1 自 己 分 离 花 生 花 生 植 株 泉 州 晋 江 428 Rs-P.362200-060707-1-2 自 己 分 离 花 生 花 生 植 株 泉 州 晋 江

281 430 Rs-P.362200-060707-2-1 自 己 分 离 花 生 花 生 植 株 泉 州 晋 江 433 Rs-P.362200-060707-3-1 自 己 分 离 花 生 花 生 植 株 泉 州 晋 江 434 Rs-P.362200-060707-3-2 自 己 分 离 花 生 花 生 植 株 泉 州 晋 江 435 Rs-P.362200-060707-3-3 自 己 分 离 花 生 花 生 植 株 泉 州 晋 江 437 Rs-P.362200-060707-4-2 自 己 分 离 花 生 花 生 植 株 泉 州 晋 江 440 Rs-P.362200-060707-5-2 自 己 分 离 花 生 花 生 植 株 泉 州 晋 江 441 Rs-P.362200-060707-5-3 自 己 分 离 花 生 花 生 植 株 泉 州 晋 江 1441 RSJ-79-A 自 己 分 离 姜 茎 基 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1442 RSJ-86-A 自 己 分 离 姜 茎 基 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1443 RSJ-87-V 自 己 分 离 姜 茎 基 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1444 RSJ-88-A 自 己 分 离 姜 茎 基 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 74 Rs-L.1.4-010704-01V 自 己 分 离 辣 椒 辣 椒 植 株 福 州 永 泰 459 Rs-L.352300-060722-14-1-1 自 己 分 离 辣 椒 辣 椒 植 株 宁 德 屏 南 461 Rs-L.352300-060722-14-2-1 自 己 分 离 辣 椒 辣 椒 植 株 宁 德 屏 南 462 Rs-L.352300-060722-14-2-2 自 己 分 离 辣 椒 辣 椒 植 株 宁 德 屏 南 465 Rs-L.352300-060722-16-1-1 自 己 分 离 辣 椒 辣 椒 植 株 宁 德 屏 南 466 Rs-L.352300-060722-16-1-2 自 己 分 离 辣 椒 辣 椒 植 株 宁 德 屏 南 468 Rs-L.352300-060722-16-2-2 自 己 分 离 辣 椒 辣 椒 植 株 宁 德 屏 南 470 Rs-L.352300-060722-17-1-2 自 己 分 离 辣 椒 辣 椒 植 株 宁 德 屏 南 469 Eb-L.352300-060722-17-1-1 (Vibrio-hollisae) 自 己 分 离 辣 椒 辣 椒 植 株 宁 德 屏 南 472 Rs-L.352300-060722-17-2-2 自 己 分 离 辣 椒 辣 椒 植 株 宁 德 屏 南 473 Rs-L.352300-060722-18-1 自 己 分 离 辣 椒 辣 椒 植 株 宁 德 屏 南 474 Rs-L.352300-060722-18-2-1 自 己 分 离 辣 椒 辣 椒 植 株 宁 德 屏 南 475 Rs-L.352300-060722-18-2-2 自 己 分 离 辣 椒 辣 椒 植 株 宁 德 屏 南 476 Rs-L.352300-060722-20-1 自 己 分 离 辣 椒 辣 椒 植 株 宁 德 屏 南 健 康 植 株 根 1103 Rs-Q.351144-061019-01V 自 己 分 离 茄 子 部 莆 田 东 洋 镇 1307 Rs-Q.350112-070628-11V 自 己 分 离 茄 子 茄 子 - 根 福 州 营 口 70 Rs-Q.1.3-020626-5V 自 己 分 离 茄 子 茄 子 植 株 福 州 北 峰 73 Rs-Q.9.2-010620-V 自 己 分 离 茄 子 茄 子 植 株 南 平 452 Rs-Q.352300-060722-8-1-1 自 己 分 离 茄 子 茄 子 植 株 宁 德 屏 南 453 Rs-Q.352300-060722-8-2-1 自 己 分 离 茄 子 茄 子 植 株 宁 德 屏 南 454 Rs-Q.352300-060722-8-2-2 自 己 分 离 茄 子 茄 子 植 株 宁 德 屏 南 456 Rs-Q.352300-060722-9-1-2 自 己 分 离 茄 子 茄 子 植 株 宁 德 屏 南

282 458 Rs-Q.352300-060722-9-2-2 自 己 分 离 茄 子 茄 子 植 株 宁 德 屏 南 青 枯 病 植 株 1115 Rs-Q.351144-061107-11V 自 己 分 离 茄 子 1116 Rs-Q.351144-061107-12V 自 己 分 离 茄 子 1112 Rs-Q.351144-061024-12V 自 己 分 离 茄 子 根 部 青 枯 病 植 株 茎 基 部 青 枯 病 植 株 茎 基 部 莆 田 东 洋 镇 莆 田 东 洋 镇 莆 田 东 洋 镇 77 Rs-J.1.4-010704-01V 自 己 分 离 生 姜 生 姜 植 株 福 州 永 泰 78 Rs-J.1.4-010704-02A 自 己 分 离 生 姜 生 姜 植 株 福 州 永 泰 1231 Rs91-2-4# 自 己 分 离 培 养 基 本 实 验 室 1232 Rs91-3-5# 自 己 分 离 培 养 基 本 实 验 室 2.1.2 试 剂 与 仪 器 (1) 试 剂 ddw;dntp 购 自 福 州 博 海 生 物 技 术 有 限 公 司 ;Buffer,Taq 酶 购 自 北 京 天 根 生 化 科 技 有 限 公 司 ; 上 游 引 物 RS980442-1:5'-GCA CGA GTT CAT GCT CGT AA-3', 下 游 引 物 RS980442-2:5'-GTT CCG CGA CAT GGT TAA GT-3', 引 物 购 自 上 海 博 尚 有 限 公 司 ; 已 稀 释 青 枯 雷 尔 氏 菌 DNA 产 物 ;1500 bp Maker 购 自 上 海 英 竣 生 物 技 术 公 司 (2) 仪 器 UVP 凝 胶 成 像 仪 ;Biometra 梯 度 PCR 仪 ;BIO-RAD 电 泳 仪 ; 2.2 试 验 方 法 5. 扩 增 体 系 ddw:18.7 μl ; Buffer:2.5 μl; dntp:0.5 μl; RS980442-1:1 μl; RS980442-2:1 μl; Taq:0.3 μl; DNA:1 μl (2)PCR 程 序 95 C, 预 变 性 5 min; 然 后 95 C 变 性 30 s,65 C 退 火 30 s,72 C 延 伸 1 min, 进 行 30 个 循 环 ; 最 后 72 C 7 min PCR 产 物 可 在 4 C 保 存 (6) 电 泳 采 用 的 1.5% 胶 浓 度, 上 样 量 为 7 μl, 电 压 为 100 V; 凝 胶 成 像 观 测 PCR 结 果 3 试 验 结 果 3.1 hypothetical protein Bmul_0496 序 列 PCR 扩 增 结 果 试 验 结 果 见 图 1-4 由 PCR 扩 增 结 果 可 以 看 出, 菌 株 编 号 FJAT-49 FJAT-447 FJAT-448 FJAT-449 FJAT-1303 FJAT-1466 FJAT-1468 FJAT-1469 FJAT-1470 FJAT-1471 FJAT-1447 FJAT-1452

283 FJAT-1453 FJAT-1454 FJAT-1455 FJAT-1457 FJAT-1458 FJAT-1459 FJAT-1460 FJAT-1461 FJAT-1462 FJAT-1463 FJAT-1473 FJAT-1307 FJAT-452 FJAT-453 FJAT-456 和 FJAT-458 通 过 该 引 物 在 300 bp 处 出 现 单 一 条 带, 并 且 这 些 菌 株 只 有 FJAT-1452 FJAT-1453 FJAT-1458 和 FJAT-1463 在 形 态 上 是 属 于 弱 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌, 其 他 的 均 为 强 致 病 青 枯 雷 尔 氏 菌 其 余 的 菌 株 均 在 未 出 现 条 带, 其 中 FJAT-54 FJAT-1441 FJAT-1442 FJAT-1443 FJAT-1444 FJAT-1112 FJAT-77 FJAT-476 和 FJAT-469 为 弱 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌, 其 余 的 强 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 图 1 不 同 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 在 引 物 RS980442PCR 扩 增 结 果 (1) 图 2 不 同 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 在 引 物 RS980442PCR 扩 增 结 果 (2) 图 3 不 同 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 在 引 物 RS980442PCR 扩 增 结 果 (3)

284 图 4 不 同 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 在 引 物 RS980442 PCR 扩 增 结 果 (4) 3.2 hypothetical protein Bmul_0496 序 列 PCR 结 果 综 合 分 析 hypothetical protein Bmul_0496 序 列 PCR 结 果 综 合 分 析 结 果 见 表 2 在 含 有 hypothetical protein Bmul_0496 序 列 的 28 株 青 枯 雷 尔 氏 菌 中, 其 中 弱 化 指 数 在 强 致 病 性 区 域 24 株 青 枯 雷 尔 氏 菌 中 共 有 10 株 菌 株 含 有 hypothetical protein Bmul_0496 序 列, 弱 化 指 数 在 过 渡 区 域 31 株 青 枯 雷 尔 氏 菌 中 共 有 10 株 菌 株 含 有 hypothetical protein Bmul_0496 序 列, 弱 化 指 数 在 弱 致 病 性 区 域 29 株 青 枯 雷 尔 氏 菌 中 共 有 8 株 菌 株 含 有 hypothetical protein Bmul_0496 序 列 表 2 hypothetical protein Bmul_0496 PCR 结 果 中 有 目 标 条 带 菌 株 综 合 结 果 菌 株 编 号 寄 主 菌 株 原 产 地 平 均 值 类 群 强 弱 判 断 是 否 有 条 带 FJAT-1455 番 茄 南 平 建 瓯 0.522 V + FJAT-1101 番 茄 莆 田 莆 田 0.581 V - FJAT-0475 辣 椒 宁 德 屏 南 0.591 V - FJAT-1469 番 茄 南 平 建 瓯 0.594 V + FJAT-1459 番 茄 南 平 建 瓯 0.640 V + FJAT-0091 番 茄 福 州 北 峰 0.651 V - FJAT-1300 番 茄 福 州 营 口 0.652 V - FJAT-1448 番 茄 南 平 建 瓯 0.660 V - FJAT-0074 辣 椒 福 州 永 泰 0.663 V - FJAT-1462 番 茄 南 平 建 瓯 0.666 V + FJAT-0435 花 生 泉 州 晋 江 0.680 V - FJAT-0080 番 茄 福 州 北 峰 0.680 Ⅰ<0.74 V - FJAT-1449 番 茄 南 平 建 瓯 0.694 V - FJAT-1461 番 茄 南 平 建 瓯 0.699 V + FJAT-0452 茄 子 宁 德 屏 南 0.712 V + FJAT-1468 番 茄 南 平 建 瓯 0.716 V + FJAT-1102 番 茄 莆 田 莆 田 0.730 V - FJAT-0078 生 姜 福 州 永 泰 0.717 V - FJAT-0437 花 生 泉 州 晋 江 0.716 V - FJAT-1470 番 茄 南 平 建 瓯 0.729 V + FJAT-1471 番 茄 南 平 建 瓯 0.729 V + FJAT-0433 花 生 泉 州 晋 江 0.732 V - FJAT-1457 番 茄 南 平 建 瓯 0.736 V +

285 FJAT-0442 番 茄 宁 德 屏 南 0.730 V - FJAT-1445 番 茄 南 平 建 瓯 0.746 V - FJAT-0441 花 生 泉 州 晋 江 0.747 V - FJAT-1454 番 茄 南 平 建 瓯 0.753 V + FJAT-1446 番 茄 南 平 建 瓯 0.759 V - FJAT-0081 番 茄 福 州 北 峰 0.763 V - FJAT-1463 番 茄 南 平 建 瓯 0.767 A + FJAT-0434 花 生 泉 州 晋 江 0.768 V - FJAT-0469 辣 椒 宁 德 屏 南 0.772 A - FJAT-0465 辣 椒 宁 德 屏 南 0.772 V - FJAT-1307 茄 子 福 州 营 口 0.775 V + FJAT-1231 番 茄 本 实 验 室 0.775 V - FJAT-0449 番 茄 宁 德 屏 南 0.779 V + FJAT-0473 辣 椒 宁 德 屏 南 0.784 V - FJAT-0430 花 生 泉 州 晋 江 0.787 V - FJAT-1441 姜 南 平 建 瓯 0.786 A - FJAT-0427 花 生 泉 州 晋 江 0.791 0.74<Ⅱ<0.825 V - FJAT-1460 番 茄 南 平 建 瓯 0.795 V + FJAT-1458 番 茄 南 平 建 瓯 0.796 A + FJAT-1473 番 茄 南 平 建 瓯 0.796 V + FJAT-1112 茄 子 莆 田 东 洋 镇 0.799 A - FJAT-1466 番 茄 南 平 建 瓯 0.800 V + FJAT-0474 辣 椒 宁 德 屏 南 0.804 V - FJAT-0443 番 茄 宁 德 屏 南 0.808 V - FJAT-0462 辣 椒 宁 德 屏 南 0.809 V - FJAT-0049 番 茄 福 州 建 新 0.810 V + FJAT-0447 番 茄 宁 德 屏 南 0.814 V + FJAT-0428 花 生 泉 州 晋 江 0.812 V - FJAT-1302 番 茄 福 州 营 口 0.817 V - FJAT-0440 花 生 泉 州 晋 江 0.819 V - FJAT-0472 辣 椒 宁 德 屏 南 0.820 V - FJAT-1443 姜 南 平 建 瓯 0.822 V - FJAT-0448 番 茄 宁 德 屏 南 0.829 V + FJAT-1447 番 茄 南 平 建 瓯 0.830 V + FJAT-1442 姜 南 平 建 瓯 0.836 A - FJAT-0054 番 茄 福 州 北 峰 0.838 A - FJAT-1115 茄 子 莆 田 莆 田 0.847 V - FJAT-1301 番 茄 福 州 营 口 0.848 V - 0.825<Ⅲ FJAT-0456 茄 子 宁 德 屏 南 0.850 V + FJAT-1444 姜 南 平 建 瓯 0.855 A - FJAT-1303 番 茄 福 州 营 口 0.859 A + FJAT-1116 茄 子 莆 田 莆 田 0.859 V - FJAT-0070 茄 子 福 州 北 峰 0.865 V - FJAT-0470 辣 椒 宁 德 屏 南 0.865 V -

286 FJAT-0461 辣 椒 宁 德 屏 南 0.867 V - FJAT-0073 茄 子 南 平 0.868 V - FJAT-0458 茄 子 宁 德 屏 南 0.869 V + FJAT-1232 番 茄 本 实 验 室 0.870 V - FJAT-1453 番 茄 南 平 建 瓯 0.871 A + FJAT-0476 辣 椒 宁 德 屏 南 0.873 A - FJAT-0459 辣 椒 宁 德 屏 南 0.874 V - FJAT-0451 番 茄 宁 德 屏 南 0.875 V - FJAT-1103 茄 子 莆 田 东 洋 镇 0.887 V - FJAT-0453 番 茄 宁 德 屏 南 0.897 V + FJAT-0450 番 茄 宁 德 屏 南 0.899 V - FJAT-0445 番 茄 宁 德 屏 南 0.907 V - FJAT-0077 生 姜 福 州 永 泰 0.927 A - FJAT-0468 辣 椒 宁 德 屏 南 0.934 V - FJAT-1452 番 茄 南 平 建 瓯 0.935 A + FJAT-1304 番 茄 福 州 营 口 0.953 V - 2. 试 验 讨 论 (1) 菌 株 编 号 FJAT-49 FJAT-447 FJAT-448 FJAT-449 FJAT-1303 FJAT-1466 FJAT-1468 FJAT-1469 FJAT-1470 FJAT-1471 FJAT-1447 FJAT-1452 FJAT-1453 FJAT-1454 FJAT-1455 FJAT-1457 FJAT-1458 FJAT-1459 FJAT-1460 FJAT-1461 FJAT-1462 FJAT-1463 FJAT-1473 FJAT-1307 FJAT-452 FJAT-453 FJAT-456 和 FJAT-458 通 过 该 引 物 在 300 bp 处 出 现 单 一 条 带, 并 且 这 些 菌 株 只 有 FJAT-1452 FJAT-1453 FJAT-1458 和 FJAT-1463 在 形 态 上 是 属 于 弱 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌, 其 他 的 均 为 强 致 病 青 枯 雷 尔 氏 菌 其 余 的 菌 株 均 在 未 出 现 条 带, 其 中 FJAT-54 FJAT-1441 FJAT-1442 FJAT-1443 FJAT-1444 FJAT-1112 FJAT-77 FJAT-476 和 FJAT-469 为 弱 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌, 其 余 的 强 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 (2) 在 含 有 hypothetical protein Bmul_0496 序 列 的 28 株 青 枯 雷 尔 氏 菌 中, 其 中 弱 化 指 数 在 强 致 病 性 区 域 24 株 青 枯 雷 尔 氏 菌 中 共 有 10 株 菌 株 含 有 hypothetical protein Bmul_0496 序 列, 弱 化 指 数 在 过 渡 区 域 31 株 青 枯 雷 尔 氏 菌 中 共 有 10 株 菌 株 含 有 hypothetical protein Bmul_0496 序 列, 弱 化 指 数 在 弱 致 病 性 区 域 29 株 青 枯 雷 尔 氏 菌 中 共 有 8 株 菌 株 含 有 hypothetical protein Bmul_0496 序 列 5.. 参 考 文 献 [1] Renmenant B, Coupat-Goutaland B, Guidot A, et al. Genomes of three tomato pathogens within the Ralstonia solanacearum species complex reveal significant evolutionary divergence[j]. BMC Genomics 2010, 11:379-395. [2] 石 元 春, 主 编, 2002, 20 世 纪 中 国 学 术 大 典 农 业 科 学, 福 建 教 育 出 版 社, 中 国, 福 州, pp. 277-278. [3] 杨 玉 红, 2008, 茄 科 植 物 青 枯 菌 病 害 研 究 进 展, 江 西 农 业 学 报, 20(5):54-55, 58 [4] 卫 红 萍, 2010, 茄 科 植 物 青 枯 病 发 生 及 防 治 策 略 研 究, 咸 宁 学 院 学 报, 30(8):164-16 试 验 负 责 车 建 美 刘 波 试 验 人 员 林 海 云

287 2011-08-12 承 担 单 位 : 福 建 省 农 科 院 农 业 生 物 资 源 研 究 所 试 验 设 计 : 试 验 项 目 : 青 枯 雷 尔 氏 菌 PBCV-1 DNA ligase(rs98orf00203) 验 证 试 验 人 员 : 林 海 云 试 验 负 责 : 车 建 美 刘 波 报 告 日 期 :2011-8-12 计 数 月 份 :2011 年 07 月 研 究 资 格 系 数 (0.5-1.0) 实 验 设 计 系 数 (0.9-1.0 0.9-1.0) 报 告 得 分 总 分 实 验 设 计 实 验 记 载 实 验 分 析 实 验 简 报 实 验 文 章 1-20% 21-40% 41-60% 61-80% 81-100% 1%-5% 设 计 不 足, 实 施 错 误 6%-10% 设 计 不 全, 实 验 无 果 11%-15% 设 计 可 以, 实 施 不 全 16%-20% 设 计 完 整, 分 布 实 施 21%-25% 实 验 不 全, 记 载 无 果 26%-30% 实 验 不 足, 记 载 不 全 31%-35% 独 立 实 验, 记 载 不 全 36%-40% 分 布 实 验, 记 载 完 整 41%-45% 目 的 明 确, 实 验 完 成 46%-50% 实 验 完 整, 记 载 清 晰 51%-55% 实 验 系 统, 结 果 可 信 56%-60% 实 验 创 新, 分 析 清 晰 61%-65% 实 验 创 新, 结 论 清 晰 66%-70% 实 验 完 整, 统 计 清 晰 71%-75% 实 验 系 统, 数 据 可 靠 76%-80% 报 告 完 整, 文 章 雏 形 81%-85% 结 构 合 理, 分 析 有 据 86%-90% 逻 辑 清 晰, 统 计 合 理 91%-95% 图 表 完 整, 写 作 流 畅 96%-100% 文 献 完 整, 发 表 水 平 福 建 省 农 业 科 学 院 农 业 生 物 资 源 研 究 所 农 业 微 生 物 研 究 中 心 电 话 : 0591-87882571, 传 真 : 0591-87882571 fjat.yzxz.com

288 1. 试 验 目 的 细 菌 性 青 枯 病 是 由 青 枯 雷 尔 氏 菌 引 起 的 一 种 重 要 土 传 植 物 病 害, 侵 染 寄 主 范 围 很 广 (Remenant, 2010), 据 报 道 青 枯 病 原 菌 可 侵 染 50 多 个 科 数 百 种 植 物, 包 括 花 生 番 茄 茄 子 和 辣 椒 等 经 济 作 物, 并 且 近 年 来 青 枯 病 在 中 国 继 续 加 重, 新 的 寄 主 也 在 不 断 地 被 发 现 ( 石 元 春, 2002), 其 中 茄 科 植 物 受 青 枯 病 危 害 最 重, 涉 及 的 作 物 种 类 最 多 ( 杨 玉 红, 2008) 青 枯 病 原 菌 是 一 个 复 杂 的 群 体, 在 寄 主 范 围 生 化 型 致 病 力 和 血 清 型 等 细 菌 学 特 性 上 差 异 很 大, 这 导 致 其 病 害 防 治 较 为 困 难, 使 其 成 为 世 界 上 危 害 最 大 分 布 最 广 和 造 成 损 失 最 为 严 重 的 植 物 病 害 之 一 ( 卫 红 萍, 2010) ; 由 于 青 枯 雷 尔 氏 菌 的 复 杂 性, 导 致 其 致 病 机 制 也 十 分 复 杂, 只 有 通 过 对 青 枯 雷 尔 氏 菌 致 病 机 制 的 更 深 入 地 研 究, 才 有 可 能 找 到 控 制 它 的 有 效 方 法 本 实 验 室 已 对 强 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 FJAT-91 和 弱 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 FJAT-1458 测 通 其 全 序 列, 测 序 结 果 分 析 可 知, 强 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 FJAT-91 和 弱 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 FJAT-1458 存 在 一 系 列 差 异 基 因, 其 中 在 强 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 FJAT-91 存 在 的 基 因 而 在 弱 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 FJAT-1458 不 存 在 的 基 因 有 225 个 ( 强 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 FJAT-91 特 异 性 获 得 基 因 ), 而 在 弱 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 FJAT-1458 存 在 而 在 强 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 不 存 在 的 基 因 有 360 个 ( 弱 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 特 异 性 获 得 基 因 ) 本 试 验 基 于 弱 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 FJAT-1458 特 异 性 获 得 基 因 PBCV-1 DNA ligase(pbcv-1 DNA 连 接 酶 ), 小 球 藻 病 毒 PBCV-1 是 能 够 编 码 一 个 298 氨 基 酸 ATP 依 赖 的 DNA 连 接 酶, 它 是 核 酸 转 移 酶 超 家 族 中 的 最 小 的 一 个 成 员, 主 要 包 括 ATP 依 赖 的 DNA 连 接 酶 以 及 GTP 依 赖 的 RNA 加 帽 酶 在 纯 化 重 组 蛋 白 过 程 中 PBCV-1 DNA 连 接 酶 被 研 究, 在 镁 离 子 与 ATP 存 在 的 情 况 下, 该 酶 可 以 有 效 将 带 切 口 的 DNA 有 效 的 连 接 起 来 (Ho K C., 1997) 该 基 因 在 本 试 验 中 的 编 号 为 RS98orf00203, 该 基 因 全 长 为 870 bp, 本 试 验 基 于 批 处 理 软 件 设 计 了 一 对 引 物 (RS980203-1 和 RS980203-2), 该 对 引 物 可 在 弱 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 FJAT-1458 扩 增 出 300 bp 目 的 条 带, 而 在 强 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 FJAT-91 不 能 扩 增 出 条 带 ( 已 在 梯 度 试 验 中 验 证 ), 本 试 验 利 用 该 对 引 物 对 菌 种 库 中 所 有 青 枯 雷 尔 氏 菌, 以 验 证 该 基 因 是 否 只 在 弱 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 存 在, 而 在 强 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 不 存 在? 以 进 一 步 对 青 枯 雷 尔 氏 菌 致 病 机 制 进 行 探 索 2. 试 验 方 法 2.1 试 验 材 料 2.1.1 菌 株 : 试 验 菌 株 及 来 源 见 表 1 表 1 菌 株 以 及 来 源 菌 株 编 号 名 称 来 源 物 种 分 离 基 物 菌 株 原 产 地 49 Rs-F.1.1-010615-04V 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 福 州 建 新 54 Rs-F.1.3-010702-09V 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 福 州 北 峰 80 Rs-F.1.3-010702-01V-f2 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 福 州 北 峰 81 Rs-F.1.3-010702-01V-f3 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 福 州 北 峰 91 Rs-F.1.3-010702-01V-f13 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 福 州 北 峰 442 Rs-F.352300-060722-5-1-1 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 宁 德 屏 南 443 Rs-F.352300-060722-5-1-2 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 宁 德 屏 南

289 445 Rs-F.352300-060722-5-2-2 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 宁 德 屏 南 447 Rs-F.352300-060722-6-1-2 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 宁 德 屏 南 448 Rs-F.352300-060722-6-2-1 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 宁 德 屏 南 449 Rs-F.352300-060722-6-2-2 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 宁 德 屏 南 450 Rs-F.352300-060722-7-1 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 宁 德 屏 南 451 Rs-F.352300-060722-7-2 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 宁 德 屏 南 1300 Rs-F.350112-070612-V2 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 福 州 营 口 1301 Rs-F.350112-070612-V3 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 福 州 营 口 1302 Rs-F.350112-070612-V4 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 福 州 营 口 1303 Rs-F.350112-070612-V5 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 福 州 营 口 1304 Rs-F.350112-070612-V6 自 己 分 离 番 茄 番 茄 植 株 福 州 营 口 1466 RSF-V-109 自 己 分 离 番 茄 根 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1468 RSF-V-117 自 己 分 离 番 茄 根 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1469 RSF-V-121 自 己 分 离 番 茄 根 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1470 RSF-V-125 自 己 分 离 番 茄 根 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1471 RSF-V-129 自 己 分 离 番 茄 根 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1445 RSF-V-14 自 己 分 离 番 茄 茎 基 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1446 RSF-V-99 自 己 分 离 番 茄 茎 基 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1447 RSF-V-100 自 己 分 离 番 茄 茎 基 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1448 RSF-V-103 自 己 分 离 番 茄 茎 基 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1449 RSF-V-106 自 己 分 离 番 茄 茎 基 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1452 RSF-A-26 自 己 分 离 番 茄 茎 中 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1453 RSF-A-27 自 己 分 离 番 茄 茎 中 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1454 RSF-A-30 自 己 分 离 番 茄 茎 中 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1455 RSF-A-31 自 己 分 离 番 茄 茎 中 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1457 RSF-V-97 自 己 分 离 番 茄 茎 中 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1458 RSF-A-98 自 己 分 离 番 茄 茎 中 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1459 RSF-V-102 自 己 分 离 番 茄 茎 中 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1460 RSF-V-115 自 己 分 离 番 茄 茎 中 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1461 RSF-V-116 自 己 分 离 番 茄 茎 中 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1462 RSF-V-119 自 己 分 离 番 茄 茎 中 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1463 RSF-V-122 自 己 分 离 番 茄 茎 中 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1473 RSF-V-111 自 己 分 离 番 茄 茎 中 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 青 枯 病 植 株 1102 Rs-F.351144-060928-14V 自 己 分 离 番 茄 茎 顶 部 莆 田 东 洋 镇

290 1101 Rs-F.351144-060928-13V 自 己 分 离 番 茄 青 枯 病 植 株 茎 中 部 莆 田 东 洋 镇 427 Rs-P.362200-060707-1-1 自 己 分 离 花 生 花 生 植 株 泉 州 晋 江 428 Rs-P.362200-060707-1-2 自 己 分 离 花 生 花 生 植 株 泉 州 晋 江 430 Rs-P.362200-060707-2-1 自 己 分 离 花 生 花 生 植 株 泉 州 晋 江 433 Rs-P.362200-060707-3-1 自 己 分 离 花 生 花 生 植 株 泉 州 晋 江 434 Rs-P.362200-060707-3-2 自 己 分 离 花 生 花 生 植 株 泉 州 晋 江 435 Rs-P.362200-060707-3-3 自 己 分 离 花 生 花 生 植 株 泉 州 晋 江 437 Rs-P.362200-060707-4-2 自 己 分 离 花 生 花 生 植 株 泉 州 晋 江 440 Rs-P.362200-060707-5-2 自 己 分 离 花 生 花 生 植 株 泉 州 晋 江 441 Rs-P.362200-060707-5-3 自 己 分 离 花 生 花 生 植 株 泉 州 晋 江 1441 RSJ-79-A 自 己 分 离 姜 茎 基 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1442 RSJ-86-A 自 己 分 离 姜 茎 基 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1443 RSJ-87-V 自 己 分 离 姜 茎 基 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 1444 RSJ-88-A 自 己 分 离 姜 茎 基 福 建 省 建 瓯 玉 山 镇 榧 村 村 74 Rs-L.1.4-010704-01V 自 己 分 离 辣 椒 辣 椒 植 株 福 州 永 泰 459 Rs-L.352300-060722-14-1-1 自 己 分 离 辣 椒 辣 椒 植 株 宁 德 屏 南 461 Rs-L.352300-060722-14-2-1 自 己 分 离 辣 椒 辣 椒 植 株 宁 德 屏 南 462 Rs-L.352300-060722-14-2-2 自 己 分 离 辣 椒 辣 椒 植 株 宁 德 屏 南 465 Rs-L.352300-060722-16-1-1 自 己 分 离 辣 椒 辣 椒 植 株 宁 德 屏 南 466 Rs-L.352300-060722-16-1-2 自 己 分 离 辣 椒 辣 椒 植 株 宁 德 屏 南 468 Rs-L.352300-060722-16-2-2 自 己 分 离 辣 椒 辣 椒 植 株 宁 德 屏 南 470 Rs-L.352300-060722-17-1-2 自 己 分 离 辣 椒 辣 椒 植 株 宁 德 屏 南 469 Eb-L.352300-060722-17-1-1 (Vibrio-hollisae) 自 己 分 离 辣 椒 辣 椒 植 株 宁 德 屏 南 472 Rs-L.352300-060722-17-2-2 自 己 分 离 辣 椒 辣 椒 植 株 宁 德 屏 南 473 Rs-L.352300-060722-18-1 自 己 分 离 辣 椒 辣 椒 植 株 宁 德 屏 南 474 Rs-L.352300-060722-18-2-1 自 己 分 离 辣 椒 辣 椒 植 株 宁 德 屏 南 475 Rs-L.352300-060722-18-2-2 自 己 分 离 辣 椒 辣 椒 植 株 宁 德 屏 南 476 Rs-L.352300-060722-20-1 自 己 分 离 辣 椒 辣 椒 植 株 宁 德 屏 南 健 康 植 株 根 1103 Rs-Q.351144-061019-01V 自 己 分 离 茄 子 部 莆 田 东 洋 镇 1307 Rs-Q.350112-070628-11V 自 己 分 离 茄 子 茄 子 - 根 福 州 营 口 70 Rs-Q.1.3-020626-5V 自 己 分 离 茄 子 茄 子 植 株 福 州 北 峰 73 Rs-Q.9.2-010620-V 自 己 分 离 茄 子 茄 子 植 株 南 平

291 452 Rs-Q.352300-060722-8-1-1 自 己 分 离 茄 子 茄 子 植 株 宁 德 屏 南 453 Rs-Q.352300-060722-8-2-1 自 己 分 离 茄 子 茄 子 植 株 宁 德 屏 南 454 Rs-Q.352300-060722-8-2-2 自 己 分 离 茄 子 茄 子 植 株 宁 德 屏 南 456 Rs-Q.352300-060722-9-1-2 自 己 分 离 茄 子 茄 子 植 株 宁 德 屏 南 458 Rs-Q.352300-060722-9-2-2 自 己 分 离 茄 子 茄 子 植 株 宁 德 屏 南 青 枯 病 植 株 1115 Rs-Q.351144-061107-11V 自 己 分 离 茄 子 1116 Rs-Q.351144-061107-12V 自 己 分 离 茄 子 1112 Rs-Q.351144-061024-12V 自 己 分 离 茄 子 根 部 青 枯 病 植 株 茎 基 部 青 枯 病 植 株 茎 基 部 莆 田 东 洋 镇 莆 田 东 洋 镇 莆 田 东 洋 镇 77 Rs-J.1.4-010704-01V 自 己 分 离 生 姜 生 姜 植 株 福 州 永 泰 78 Rs-J.1.4-010704-02A 自 己 分 离 生 姜 生 姜 植 株 福 州 永 泰 1231 Rs91-2-4# 自 己 分 离 培 养 基 本 实 验 室 1232 Rs91-3-5# 自 己 分 离 培 养 基 本 实 验 室 2.1.2 试 剂 与 仪 器 (1) 试 剂 ddw;dntp 购 自 福 州 博 海 生 物 技 术 有 限 公 司 ;Buffer,Taq 酶 购 自 北 京 天 根 生 化 科 技 有 限 公 司 ; 上 游 引 物 RS980203-1:5'-AAC CCG TTT GTT CAG GAG TG-3', 下 游 引 物 RS980203-2:5'-ACC TGG TCC GTC ACA AGT TC-3', 引 物 购 自 上 海 博 尚 有 限 公 司 ; 已 稀 释 青 枯 雷 尔 氏 菌 DNA 产 物 ;3000 bp Maker 购 自 上 海 英 竣 生 物 技 术 公 司 (2) 仪 器 UVP 凝 胶 成 像 仪 ;Biometra 梯 度 PCR 仪 ;BIO-RAD 电 泳 仪 ; 2.2 试 验 方 法 (7) 扩 增 体 系 ddw:18.7 μl ; Buffer:2.5 μl; dntp:0.5 μl; RS980203-1:1 μl; RS980203-2:1 μl; Taq:0.3 μl; DNA:1 μl (2)PCR 程 序 95 C, 预 变 性 5 min; 然 后 95 C 变 性 30 s,62 C 退 火 30 s,72 C 延 伸 1 min, 进 行 30 个 循 环 ; 最 后 72 C 7 min PCR 产 物 可 在 4 C 保 存 (4) 电 泳 采 用 的 1.5% 胶 浓 度, 上 样 量 为 7 μl, 电 压 为 100 V; 凝 胶 成 像 观 测 PCR 结 果

292 3 试 验 结 果 3.1 PBCV-1 DNA ligase 序 列 PCR 扩 增 结 果 试 验 结 果 见 图 1-4 由 PCR 扩 增 结 果 可 以 看 出, 菌 株 编 号 FJAT-49 FJAT-447 FJAT-448 FJAT-449 FJAT-1303 FJAT-1466 FJAT-1468 FJAT-1470 FJAT-1471 FJAT-1452 FJAT-1453 FJAT-1454 FJAT-1455 FJAT-1457 FJAT-1458 FJAT-1459 FJAT-1460 FJAT-1461 FJAT-1462 FJAT-1463 FJAT-1473 FJAT-1307 FJAT-452 FJAT-453 FJAT-456 FJAT-458 FJAT-1112 和 FJAT-77 通 过 该 引 物 在 近 300 bp 处 出 现 单 一 条 带, 并 且 这 些 菌 株 只 有 FJAT-1452 FJAT-1453 FJAT-1458 和 FJAT-1463 在 形 态 上 是 属 于 弱 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌, 其 他 的 均 为 强 致 病 青 枯 雷 尔 氏 菌 其 余 的 菌 株 均 在 未 出 现 条 带, 其 中 FJAT-54 FJAT-1441 FJAT-1442 FJAT-1443 FJAT-1444 FJAT-476 和 FJAT-469 为 弱 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌, 其 余 的 强 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 图 1 不 同 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 在 引 物 RS980203 PCR 扩 增 结 果 (1) 图 2 不 同 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 在 引 物 RS980203 PCR 扩 增 结 果 (2) 图 3 不 同 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 在 引 物 RS980203 PCR 扩 增 结 果 (3)

293 图 4 不 同 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 在 引 物 RS980203 PCR 扩 增 结 果 (4) 3.2 PBCV-1 DNA ligase 序 列 PCR 结 果 综 合 分 析 PBCV-1 DNA ligase 序 列 PCR 结 果 综 合 分 析 结 果 见 表 2 在 含 有 PBCV-1 DNA ligase 序 列 的 28 株 青 枯 雷 尔 氏 菌 中, 其 中 弱 化 指 数 在 强 致 病 性 区 域 24 株 青 枯 雷 尔 氏 菌 中 共 有 10 株 菌 株 含 有 PBCV-1 DNA ligase 序 列, 弱 化 指 数 在 过 渡 区 域 31 株 青 枯 雷 尔 氏 菌 中 共 有 11 株 菌 株 含 有 PBCV-1 DNA ligase 序 列, 弱 化 指 数 在 弱 致 病 性 区 域 29 株 青 枯 雷 尔 氏 菌 中 共 有 7 株 菌 株 含 有 PBCV-1 DNA ligase 序 列 表 2 PBCV-1 DNA ligase PCR 结 果 中 有 目 标 条 带 菌 株 综 合 结 果 菌 株 编 号 寄 主 菌 株 原 产 地 平 均 值 类 群 强 弱 判 断 是 否 有 条 带 FJAT-1455 番 茄 南 平 建 瓯 0.522 V + FJAT-1101 番 茄 莆 田 莆 田 0.581 V - FJAT-0475 辣 椒 宁 德 屏 南 0.591 V - FJAT-1469 番 茄 南 平 建 瓯 0.594 V + FJAT-1459 番 茄 南 平 建 瓯 0.640 V + FJAT-0091 番 茄 福 州 北 峰 0.651 V - FJAT-1300 番 茄 福 州 营 口 0.652 V - FJAT-1448 番 茄 南 平 建 瓯 0.660 V - FJAT-0074 辣 椒 福 州 永 泰 0.663 V - FJAT-1462 番 茄 南 平 建 瓯 0.666 V + FJAT-0435 花 生 泉 州 晋 江 0.680 V - FJAT-0080 番 茄 福 州 北 峰 0.680 V - Ⅰ<0.74 FJAT-1449 番 茄 南 平 建 瓯 0.694 V - FJAT-1461 番 茄 南 平 建 瓯 0.699 V + FJAT-0452 茄 子 宁 德 屏 南 0.712 V + FJAT-1468 番 茄 南 平 建 瓯 0.716 V + FJAT-1102 番 茄 莆 田 莆 田 0.730 V - FJAT-0078 生 姜 福 州 永 泰 0.717 V - FJAT-0437 花 生 泉 州 晋 江 0.716 V - FJAT-1470 番 茄 南 平 建 瓯 0.729 V + FJAT-1471 番 茄 南 平 建 瓯 0.729 V + FJAT-0433 花 生 泉 州 晋 江 0.732 V - FJAT-1457 番 茄 南 平 建 瓯 0.736 V + FJAT-0442 番 茄 宁 德 屏 南 0.730 V - FJAT-1445 番 茄 南 平 建 瓯 0.746 V - 0.74<Ⅱ<0.825 FJAT-0441 花 生 泉 州 晋 江 0.747 V -

294 FJAT-1454 番 茄 南 平 建 瓯 0.753 V + FJAT-1446 番 茄 南 平 建 瓯 0.759 V - FJAT-0081 番 茄 福 州 北 峰 0.763 V - FJAT-1463 番 茄 南 平 建 瓯 0.767 A + FJAT-0434 花 生 泉 州 晋 江 0.768 V - FJAT-0469 辣 椒 宁 德 屏 南 0.772 A - FJAT-0465 辣 椒 宁 德 屏 南 0.772 V - FJAT-1307 茄 子 福 州 营 口 0.775 V + FJAT-1231 番 茄 本 实 验 室 0.775 V - FJAT-0449 番 茄 宁 德 屏 南 0.779 V + FJAT-0473 辣 椒 宁 德 屏 南 0.784 V - FJAT-0430 花 生 泉 州 晋 江 0.787 V - FJAT-1441 姜 南 平 建 瓯 0.786 A - FJAT-0427 花 生 泉 州 晋 江 0.791 V - FJAT-1460 番 茄 南 平 建 瓯 0.795 V + FJAT-1458 番 茄 南 平 建 瓯 0.796 A + FJAT-1473 番 茄 南 平 建 瓯 0.796 V + FJAT-1112 茄 子 莆 田 东 洋 镇 0.799 V + FJAT-1466 番 茄 南 平 建 瓯 0.800 V + FJAT-0474 辣 椒 宁 德 屏 南 0.804 V - FJAT-0443 番 茄 宁 德 屏 南 0.808 V - FJAT-0462 辣 椒 宁 德 屏 南 0.809 V - FJAT-0049 番 茄 福 州 建 新 0.810 V + FJAT-0447 番 茄 宁 德 屏 南 0.814 V + FJAT-0428 花 生 泉 州 晋 江 0.812 V - FJAT-1302 番 茄 福 州 营 口 0.817 V - FJAT-0440 花 生 泉 州 晋 江 0.819 V - FJAT-0472 辣 椒 宁 德 屏 南 0.820 V - FJAT-1443 姜 南 平 建 瓯 0.822 V - FJAT-0448 番 茄 宁 德 屏 南 0.829 V + FJAT-1447 番 茄 南 平 建 瓯 0.830 V - FJAT-1442 姜 南 平 建 瓯 0.836 A - FJAT-0054 番 茄 福 州 北 峰 0.838 A - FJAT-1115 茄 子 莆 田 莆 田 0.847 V - FJAT-1301 番 茄 福 州 营 口 0.848 V - FJAT-0456 茄 子 宁 德 屏 南 0.850 V + FJAT-1444 姜 南 平 建 瓯 0.855 0.825<Ⅲ A - FJAT-1303 番 茄 福 州 营 口 0.859 A - FJAT-1116 茄 子 莆 田 莆 田 0.859 V - FJAT-0070 茄 子 福 州 北 峰 0.865 V - FJAT-0470 辣 椒 宁 德 屏 南 0.865 V - FJAT-0461 辣 椒 宁 德 屏 南 0.867 V - FJAT-0073 茄 子 南 平 0.868 V - FJAT-0458 茄 子 宁 德 屏 南 0.869 V +

295 FJAT-1232 番 茄 本 实 验 室 0.870 V - FJAT-1453 番 茄 南 平 建 瓯 0.871 A + FJAT-0476 辣 椒 宁 德 屏 南 0.873 A - FJAT-0459 辣 椒 宁 德 屏 南 0.874 V - FJAT-0451 番 茄 宁 德 屏 南 0.875 V - FJAT-1103 茄 子 莆 田 东 洋 镇 0.887 V - FJAT-0453 番 茄 宁 德 屏 南 0.897 V + FJAT-0450 番 茄 宁 德 屏 南 0.899 V - FJAT-0466 辣 椒 宁 德 屏 南 0.900 V - FJAT-0445 番 茄 宁 德 屏 南 0.907 V - FJAT-0077 生 姜 福 州 永 泰 0.927 A + FJAT-0468 辣 椒 宁 德 屏 南 0.934 V - FJAT-1452 番 茄 南 平 建 瓯 0.935 A + FJAT-1304 番 茄 福 州 营 口 0.953 V - 4 试 验 讨 论 (1) 由 PCR 扩 增 结 果 可 以 看 出, 菌 株 编 号 FJAT-49 FJAT-447 FJAT-448 FJAT-449 FJAT-1303 FJAT-1466 FJAT-1468 FJAT-1470 FJAT-1471 FJAT-1452 FJAT-1453 FJAT-1454 FJAT-1455 FJAT-1457 FJAT-1458 FJAT-1459 FJAT-1460 FJAT-1461 FJAT-1462 FJAT-1463 FJAT-1473 FJAT-1307 FJAT-452 FJAT-453 FJAT-456 FJAT-458 FJAT-1112 和 FJAT-77 通 过 该 引 物 在 近 300 bp 处 出 现 单 一 条 带, 并 且 这 些 菌 株 只 有 FJAT-1452 FJAT-1453 FJAT-1458 和 FJAT-1463 在 形 态 上 是 属 于 弱 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌, 其 他 的 均 为 强 致 病 青 枯 雷 尔 氏 菌 其 余 的 菌 株 均 在 未 出 现 条 带, 其 中 FJAT-54 FJAT-1441 FJAT-1442 FJAT-1443 FJAT-1444 FJAT-476 和 FJAT-469 为 弱 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌, 其 余 的 强 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 2) 在 含 有 PBCV-1 DNA ligase 序 列 的 28 株 青 枯 雷 尔 氏 菌 中, 其 中 弱 化 指 数 在 强 致 病 性 区 域 24 株 青 枯 雷 尔 氏 菌 中 共 有 10 株 菌 株 含 有 PBCV-1 DNA ligase 序 列, 弱 化 指 数 在 过 渡 区 域 31 株 青 枯 雷 尔 氏 菌 中 共 有 11 株 菌 株 含 有 PBCV-1 DNA ligase 序 列, 弱 化 指 数 在 弱 致 病 性 区 域 29 株 青 枯 雷 尔 氏 菌 中 共 有 7 株 菌 株 含 有 PBCV-1 DNA ligase 序 列 5.. 参 考 文 献 [1] Renmenant B, Coupat-Goutaland B, Guidot A, et al. Genomes of three tomato pathogens within the Ralstonia solanacearum species complex reveal significant evolutionary divergence[j]. BMC Genomics 2010, 11:379-395. [2] 石 元 春, 主 编, 2002, 20 世 纪 中 国 学 术 大 典 农 业 科 学, 福 建 教 育 出 版 社, 中 国, 福 州, pp. 277-278. [3] 杨 玉 红, 2008, 茄 科 植 物 青 枯 菌 病 害 研 究 进 展, 江 西 农 业 学 报, 20(5):54-55, 58 [4] 卫 红 萍, 2010, 茄 科 植 物 青 枯 病 发 生 及 防 治 策 略 研 究, 咸 宁 学 院 学 报, 30(8):164-16 [5] Ho K O., Van Etten J L., Shuman S., 1997, Characterization of an ATP-Dependent DNAligase encoded by Chlorella virus PBCV-1[J]. Journal of Virology, 71(3):1931-1937. 试 验 负 责 车 建 美 刘 波 试 验 人 员 林 海 云 附 录

296 RS98orf00203 序 列 : ATGCTCACCAAGCCGGAACTCATCAAGTTTCCCGTGTGGGCTTCGCCAAAGATTGACGGCGTG CGTTGCGTGATTTTCGGCGGCGTTGCGTATAGCCGCAGCCTCAAGCCGATTCCGAACCCGTTTG TTCAGGAGTGGGCCGCAGCGAACTGTTGCGAGCTTGAGGGCCTGGACGGTGAGCTTGTGGTA GGCAGCGCCACCGCCTCCGACTGTATGCAGAACACCACTTCGGGCGTGATGAAGAAGACCGGC GAACCTGATTTCTCCTTCCATGCATTCGACTTCGTGGGAACCGACTGGCCGTTTGCGACTCGCT GCGAGCAGCTTGAACGCTGGCGCAAGCGCGGCGACTCCGAAGCGATCCGCGTGCACATCGTCT CGCAGGAACTTGTGACGGACCAGGTAGACCTTGCGATGAAGGAGGCGCAATTCCTTGACGAG GGCTACGAAGGAATGATGATCCGTGCTCACGATGGCCGGTACAAGTTCGGACGCAGCACGGAG CGAGAGGGCGGCCTAGTGAAGGTCAAGCGCTTTGACGACGCCGAGGCCGAGGTAATCGGCTA CGAAGAGGAAATGCACAATGCGAATGAGGCAAAGACGAATGCGCTGGGCCAGACGGAACGCA GCACGGTACAGGCCAACTTGGTCGGTAAGCGCACCCTCGGCGCCCTCGTATGCCGAACCGCGT CAGGCGTGGCGTTTTCTGTCGGCACTGGCTTTTCTTCCGCTGACCGTGCCTCGCTATGGCGCGA GCGTGCTGCACTTGTCGGGCGTGTAGTCAAGTACAAGCACTTCGACCACGGCACGGTAGACGC CCCGCGCCACCCCGTGTTCCTCGGCTTCCGTGCGCCGGAGGACATGGCGTGA

297 2011-8-29 承 担 单 位 : 福 建 省 农 科 院 农 业 生 物 资 源 研 究 所 试 验 设 计 : 试 验 项 目 : 两 个 未 知 基 因 的 注 释 及 在 青 枯 雷 尔 氏 菌 中 搜 索 同 源 基 因 试 验 人 员 : 林 爱 婷 试 验 负 责 : 报 告 日 期 :2011-8-29 计 数 月 份 :2011 年 8 月 研 究 资 格 系 数 (0.5-1.0) 实 验 设 计 系 数 (0.9-1.0 0.9-1.0) 报 告 得 分 总 分 实 验 设 计 实 验 记 载 实 验 分 析 实 验 简 报 实 验 文 章 1-20% 21-40% 41-60% 61-80% 81-100% 1%-5% 设 计 不 足, 实 施 错 误 6%-10% 设 计 不 全, 实 验 无 果 11%-15% 设 计 可 以, 实 施 不 全 16%-20% 设 计 完 整, 分 布 实 施 21%-25% 实 验 不 全, 记 载 无 果 26%-30% 实 验 不 足, 记 载 不 全 31%-35% 独 立 实 验, 记 载 不 全 36%-40% 分 布 实 验, 记 载 完 整 41%-45% 目 的 明 确, 实 验 完 成 46%-50% 实 验 完 整, 记 载 清 晰 51%-55% 实 验 系 统, 结 果 可 信 56%-60% 实 验 创 新, 分 析 清 晰 61%-65% 实 验 创 新, 结 论 清 晰 66%-70% 实 验 完 整, 统 计 清 晰 71%-75% 实 验 系 统, 数 据 可 靠 76%-80% 报 告 完 整, 文 章 雏 形 81%-85% 结 构 合 理, 分 析 有 据 86%-90% 逻 辑 清 晰, 统 计 合 理 91%-95% 图 表 完 整, 写 作 流 畅 96%-100% 文 献 完 整, 发 表 水 平 福 建 省 农 业 科 学 院 农 业 生 物 资 源 研 究 所 农 业 微 生 物 研 究 中 心 电 话 : 0591-87882571, 传 真 : 0591-87882571 fjat.yzxz.com

298 1. 试 验 目 的 对 两 条 未 知 的 基 因 序 列 进 行 BLAST 比 对, 获 得 基 因 的 同 源 注 释, 并 在 青 枯 雷 尔 氏 菌 GMI1000 强 致 病 力 菌 株 RS91 和 无 致 病 力 菌 株 RS98 中 搜 索 同 源 基 因 2. 试 验 方 法 2.1 同 源 注 释 未 知 基 因 利 用 NCBI 的 BLAST(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) 工 具 进 行 同 源 比 对, 获 得 两 个 未 知 基 因 的 注 释 信 息 比 对 时 选 择 Megablast 对 核 酸 数 据 库 Nucleotide collection(nr/nt) 进 行 搜 索 2.2 在 RS 基 因 组 中 鉴 定 目 标 基 因 利 用 两 条 未 知 的 基 因 DNA 序 列, 在 3 种 青 枯 雷 尔 氏 菌 基 因 组 GMI1000 RS91 和 RS98 中 搜 索 同 源 基 因, 所 用 程 序 为 BLASTN, 搜 索 相 似 性 identity 大 于 80% 的, 分 值 score 大 于 250, 长 度 length 长 于 100 个 碱 基,E 值 小 于 1E-10 的 匹 配 序 列 需 要 用 到 的 blastall 参 数 : -p 程 序 名, 这 里 是 blastn -d 数 据 库 -i 查 询 序 列 文 件, 两 条 未 知 序 列 -o 结 果 输 出 文 件 -e E 值 限 制,1E-10 2.3 多 序 列 联 配 对 这 2 个 基 因 在 3 个 青 枯 雷 尔 氏 菌 基 因 组 中 搜 索 得 到 的 同 源 序 列, 分 别 进 行 多 序 列 比 对, 使 用 的 程 序 是 ClustalX, 用 BioEdit7(http://www.mbio.ncsu.edu/BioEdit /BioEdit.html) 编 辑 多 序 列 比 对 结 果, 观 察 同 源 基 因 序 列 在 这 3 个 菌 株 的 比 对 情 况

299 3. 试 验 结 果 3.1 基 因 序 列 比 对 及 注 释 结 果 两 条 未 知 的 基 因 序 列 如 下 : >seq1 ACACAATTCATCGATGATGGTTGGCTTGCCAGTCAGGTCATGCTCGACCAGCAGGC GCCGGAACTTCAGCAGCGTGGTCGCGTCCGGCACGTTCTCGACCGCCAGATCAAT GCCGGCGAACGCACGCATCGCCATGCTGTCGTACAACGCATCTTCCAGTCCTTCGT CCGACAGCCCGTACCACTGCTGCAAGAAATAAATGCGCAGCATCCTCTGCAGGTCG ACTCTAGAGGATCCCCGCCAC >seq2 ACACAATTCATCGATGATGGTTGGGCACCGCGTGGCGCGCGGCAATGTCGCGTACC ACCTCGCTCAGCTGCGGGTCGAGCAGTTGGGCATCCGACAGATTCACTGCGGCGT GCAGGTCCGGTTGGCGGGCCGTGCCGGCACGCTCGGCCTCTTCGCGCTGCAGGT CGACTCTAGAGGATCCCCGCCAC Seq1, 长 度 244 碱 基, 在 nt(ncbi 的 核 酸 数 据 库 ) 的 比 对 结 果 如 下 :

300 从 结 果 可 看 出, 搜 索 到 的 同 源 序 列 大 多 来 自 Ralstonia solanacearum, 其 中, 有 5 条 同 源 序 列 与 Seq1 达 到 很 高 的 匹 配 度, 一 致 性 100%,E 值 4e-97,score 为 363, 具 体 如 下 :

301 从 序 列 的 描 述 得 知,Seq1 匹 配 到 的 基 因 中, 来 自 Ralstonia solanacearum rip 系 列 菌 株 的 同 源 基 因 属 于 Ⅲ 型 分 泌 系 统 效 应 蛋 白 III 型 分 泌 系 统 (typeiii secretion system,t3ss) 广 泛 存 在 于 动 植 物 病 原 细 菌 中, 病 原 细 菌 通 过 III 型 分 泌 系 统 将 效 应 蛋 白 注 入 到 寄 主 细 胞 后 或 引 起 寄 主 感 病 或 激 发 抗 病 反 应 Seq1 在 菌 株 GMI1000 中 匹 配 到 大 质 粒 的 基 因 序 列, 匹 配 的 对 应 位 点 基 因 是 tis1021 型 转 座 蛋 白 在 菌 株 Ralstonia solanacearum hpx22 中 的 同 源 基 因 也 与 转 座 有 关 在 nt 数 据 库 上 匹 配 到 的 其 他 结 果, 一 致 性 和 score 等 指 标 都 没 有 前 5 个 同 源 序 列 好, 从 Description 一 栏 可 知, 这 些 基 因 绝 大 多 数 也 与 转 座 有 关 因 此, 预 测 该 Seq1 序 列 可 能 是 转 座 蛋 白 基 因 序 列 的 一 部 分 Seq2, 长 度 188 碱 基, 比 对 结 果 如 下 : Seq2 的 比 对 结 果 不 如 Seq1 理 想, 可 能 是 因 为 序 列 太 短 从 结 果 可 看 出, 有 一 条 同 源 序 列 达 到 较

302 高 的 匹 配, 一 致 性 100%,E 值 9e-68,score 为 265, 是 来 自 GMI1000 大 质 粒 的 序 列 接 下 来 另 一 条 较 相 似 的 同 源 序 列 是 来 自 CMR15 的 质 粒 序 列 两 条 序 列 的 具 体 情 况 如 下 : 从 序 列 的 描 述 得 知, 来 自 GMI1000 质 粒 的 同 源 基 因 是 可 能 的 信 号 转 导 蛋 白, 具 有 EAL-ggdef 结 构 域 同 样, 来 自 CMR15 质 粒 的 同 源 基 因 是 潜 在 的 diguanylate 磷 酸 二 酯 酶 ( 信 号 转 导 蛋 白,EAL 结 构 域 ) 在 nt 数 据 库 上 匹 配 到 的 其 他 结 果, 大 部 分 都 来 自 Ralstonia solanacearum, 同 源 基 因 的 产 物 也 大 部 分 是 信 号 转 导 蛋 白, 因 此, 可 以 预 测 该 Seq2 序 列 可 能 是 信 号 转 导 蛋 白 基 因 序 列 的 一 部 分 3.3 多 序 列 联 配 结 果 在 青 枯 雷 尔 氏 菌 基 因 组 中 鉴 定 搜 索 基 因,Seq1 在 GMI1000 大 质 粒 RS91 和 RS98 各 分 别 搜 索 到 2 条 14 条 和 8 条 同 源 序 列 ( 在 GMI1000 的 环 状 基 因 组 DNA 上 没 有 搜 索 到 ), 长 度 都 为 987 个 碱 基, 将 这 些 序 列 进 行 比 对, 结 果 如 下 :

303

304

305 可 见, 这 24 条 序 列 在 菌 株 间 非 常 保 守, 达 到 非 常 高 的 相 似 性 在 各 菌 株 内 的 同 源 序 列 则 是 完 全 一 致 的, 只 是 在 基 因 组 的 位 置 不 同, 属 于 重 复 的 基 因 序 列 从 比 对 结 果 可 看 出,RS91 与 RS98 的 序 列 有 更 高 的 相 似 度, 只 在 第 138 碱 基 处 有 差 异 (T/C);RS91 RS98 与 GMI1000 则 主 要 在 第 472 711 712 788 和 951 碱 基 位 点 处 存 在 差 异 Seq2 在 GMI1000 大 质 粒 RS91 和 RS98 都 只 分 别 搜 索 到 1 条 同 源 序 列 ( 在 GMI1000 的 环 状 基 因 组 DNA 上 没 有 搜 索 到 ), 比 对 结 果 如 下 :

306 RS91 RS98 中 的 同 源 序 列 都 是 不 完 整 的 基 因 片 段, 特 别 是 RS91 的 基 因 序 列 很 短, 有 待 进 一 步 的 拼 接, 比 对 时, 只 在 碱 基 范 围 676~1010bp 内 与 GMI1000 的 同 源 基 因 有 好 的 匹 配 4. 试 验 讨 论 5.. 参 考 文 献 Brumbley S M, Denny T P. Cloning of wild-type Pseudomonas solanacearum phca, a gene that when mutated alters expression of multiple traits that contribute to virulence. J Bacteriol,1990, 172 (10): 5677-5685. Brumbley S M, Carney B F, et al. Phenotype conversion in Pseudomonas solanacearum due to spontaneous inactivation of PhcA, a putative LysR transcriptional regulator. J Bacteriol, 1993, 175 (17): 5477-5487.

307 Clough S J, Schell M A, et al. Evidence for involvement of a volatile extracellular factor in Pseudomonas solanacearum virulence gene expression. Molecular Plant Microbe Interactions, 1994, 7 (5): 621-630. Clough S J, Lee K, et al. A two-component system in Ralstonia (Pseudomonas) solanacearum modulates production of PhcA-regulated virulence factors in response to 3-hydroxypalmitic acid methyl ester. Journal of Bacteriology, 1997, 179 (11): 3639-3648. 试 验 负 责 试 验 人 员 林 爱 婷

308 2011-8-25 承 担 单 位 : 福 建 省 农 科 院 农 业 生 物 资 源 研 究 所 试 验 设 计 : 试 验 项 目 : 短 短 芽 孢 杆 菌 JK-2 全 基 因 组 SNP 的 预 测 和 分 析 试 验 人 员 : 林 爱 婷 试 验 负 责 : 报 告 日 期 :2011-08-25 计 数 月 份 :2011 年 8 月 研 究 资 格 系 数 (0.5-1.0) 实 验 设 计 系 数 (0.9-1.0 0.9-1.0) 报 告 得 分 总 分 实 验 设 计 实 验 记 载 实 验 分 析 实 验 简 报 实 验 文 章 1-20% 21-40% 41-60% 61-80% 81-100% 1%-5% 设 计 不 足, 实 施 错 误 6%-10% 设 计 不 全, 实 验 无 果 11%-15% 设 计 可 以, 实 施 不 全 16%-20% 设 计 完 整, 分 布 实 施 21%-25% 实 验 不 全, 记 载 无 果 26%-30% 实 验 不 足, 记 载 不 全 31%-35% 独 立 实 验, 记 载 不 全 36%-40% 分 布 实 验, 记 载 完 整 41%-45% 目 的 明 确, 实 验 完 成 46%-50% 实 验 完 整, 记 载 清 晰 51%-55% 实 验 系 统, 结 果 可 信 56%-60% 实 验 创 新, 分 析 清 晰 61%-65% 实 验 创 新, 结 论 清 晰 66%-70% 实 验 完 整, 统 计 清 晰 71%-75% 实 验 系 统, 数 据 可 靠 76%-80% 报 告 完 整, 文 章 雏 形 81%-85% 结 构 合 理, 分 析 有 据 86%-90% 逻 辑 清 晰, 统 计 合 理 91%-95% 图 表 完 整, 写 作 流 畅 96%-100% 文 献 完 整, 发 表 水 平 福 建 省 农 业 科 学 院 农 业 生 物 资 源 研 究 所 农 业 微 生 物 研 究 中 心 电 话 : 0591-87882571, 传 真 : 0591-87882571 fjat.yzxz.com

309 1. 试 验 目 的 短 短 芽 胞 杆 菌 (Brevibacillus brevis) 是 一 类 革 兰 氏 染 色 阳 性 细 菌, 有 较 强 的 蛋 白 分 泌 能 力 ( 邱 孙 全 等,2009), 同 时 也 具 有 广 谱 抗 菌 活 性, 该 菌 能 以 活 体 形 式 寄 居 到 大 量 的 真 菌 植 物 病 原 体 中, 包 括 灰 葡 萄 孢 (Botrytis cinerea) 苍 耳 单 丝 壳 菌 (Sphaerotheca fuliginea) 及 终 极 腐 霉 (Pythium ultimum), 并 且 可 以 通 过 分 泌 抗 菌 代 谢 物 短 杆 菌 肽 S(gramicidin S) 来 抑 制 真 菌 或 细 菌 的 生 长 ( 侯 仲 轲,2000) 短 短 芽 孢 杆 菌 JK2 是 本 实 验 室 从 西 瓜 根 际 土 壤 中 分 离 得 到 一 株 芽 孢 杆 菌 菌 株 ( 郑 雪 芳 等,2006), 研 究 表 明 它 对 西 瓜 枯 萎 病 菌 大 丽 轮 枝 菌 苦 瓜 炭 疽 病 菌 桃 褐 腐 病 菌 番 茄 青 枯 雷 尔 氏 菌 禽 致 病 性 大 肠 杆 菌 K88 菌 株 都 具 有 强 的 抑 制 作 用, 是 一 株 具 有 广 谱 抗 菌 活 性 的 生 防 菌 ( 葛 慈 斌 等,2009) 当 前 仅 有 一 株 短 短 芽 孢 杆 菌 Brevibacillus brevis NBRC 100599 已 获 得 全 基 因 组 序 列, 本 文 研 究 的 芽 孢 杆 菌 JK2 已 由 生 物 研 究 所 完 成 测 序, 对 其 进 行 全 基 因 组 SNP 的 预 测 及 分 析, 阐 述 该 菌 种 的 多 态 性, 从 而 指 导 短 短 芽 胞 杆 菌 基 因 组 多 态 性 的 研 究 SNP 是 指 基 因 组 水 平 上 由 单 个 核 苷 酸 的 变 异 所 引 起 的 DNA 序 列 多 态 性, 是 可 遗 传 变 异 中 最 常 见 的 一 种, 在 群 体 中 的 发 生 频 率 不 小 于 1% 包 括 单 个 碱 基 的 转 换 颠 换 插 入 和 缺 失 等, 但 通 常 所 说 的 SNP 主 要 是 指 转 换 和 颠 换 所 谓 转 换 是 指 同 型 碱 基 之 间 的 转 换, 如 嘌 呤 与 嘌 呤 ( G/A) 嘧 啶 与 嘧 啶 ( T/C) 间 的 替 换 ; 所 谓 颠 换 是 指 发 生 在 嘌 呤 与 嘧 啶 (A/T A/C C/G G/T) 之 间 的 替 换 依 据 排 列 组 合 原 理,SNP 一 共 可 以 有 6 种 替 换 情 况, 即 A/G A/T A/C C/G C/T 和 G/T, 颠 换 种 类 偏 多, 但 事 实 上, 转 换 的 发 生 频 率 占 多 数, 而 且 是 C/T 转 换 为 主, 其 原 因 是 CpG 二 核 苷 酸 上 的 的 C 是 甲 基 化 的, 容 易 自 发 脱 氨 基 形 成 胸 腺 嘧 啶 T,CpG 也 因 此 变 为 突 变 热 点 理 论 上 讲,SNP 既 可 能 是 二 等 位 多 态 性, 也 可 能 是 3 个 或 4 个 等 位 多 态 性, 但 实 际 上, 后 两 者 非 常 少 见, 几 乎 可 以 忽 略 因 此, 通 常 所 说 的 SNP 都 是 二 等 位 多 态 性 的 在 基 因 组 DNA 中, 任 何 碱 基 均 有 可 能 发 生 变 异, 因 此 SNP 既 有 可 能 在 基 因 序 列 内, 也 有 可 能 在 基 因 以 外 的 非 编 码 序 列 上 因 为 细 菌 基 因 组 小, 重 复 序 列 少, 大 部 分 区 域 都 属 于 编 码 区, 因 此 位 于 编 码 区 内 的 SNP(coding SNP,cSNP) 比 较 多, 这 一 点 跟 真 核 生 物 的 不 同 从 对 生 物 的 遗 传 性 状 的 影 响 上 来 看, csnp 又 可 分 为 2 种 : 一 种 是 同 义 csnp(synonymous csnp), 即 SNP 所 致 的 编 码 序 列 的 改 变 并 不 影 响 其 所 翻 译 的 蛋 白 质 的 氨 基 酸 序 列, 突 变 碱 基 与 未 突 变 碱 基 的 含 义 相 同 ; 另 一 种 是 非 同 义 csnp(non-synonymous csnp), 指 碱 基 序 列 的 改 变 可 使 以 其 为 蓝 本 翻 译 的 蛋 白 质 序 列 发 生 改 变, 从 而 影 响 了 蛋 白 质 的 功 能 这 种 改 变 常 是 导 致 生 物 性 状 改 变 的 直 接 原 因 csnp 中, 同 义 csnp 占 了 大 多 数

310 2. 试 验 方 法 2.1 短 短 芽 孢 杆 菌 JK2 全 基 因 组 的 SNP 预 测 SNP 预 测 之 前, 需 要 进 行 读 段 的 定 位, 定 位 所 需 条 件 : 1 参 考 序 列 : 短 短 芽 孢 杆 菌 JK2 拼 接 好 的 基 因 组 框 架 图 (Scaffold 序 列,wls327.all_scaf.fasta), 其 中 舍 弃 长 度 低 于 500bp 的 较 短 序 列 2 reads reads( 读 段 ): 用 Illumina GA 高 通 量 测 序 仪 对 菌 株 基 因 组 DNA 进 行 测 序 所 获 得 的 reads 序 列, 长 度 100bp, 已 对 低 质 量 碱 基 进 行 质 量 校 正 使 用 Bowtie 软 件 将 读 段 定 位 至 框 架 图 上, 采 用 -v 2 模 式, 即 允 许 2 个 错 配, 保 存 为 SAM 格 式 ( 参 数 -S ), 利 用 SAMTools 处 理 SAM 文 件, 并 利 用 BEDTools 的 genomecoveragebed 程 序 计 算 per-base coverage, 即 单 碱 基 覆 盖 率 ( 参 数 -d ), 计 算 框 架 图 的 总 覆 盖 深 度 利 用 SAMTools 的 mpileup 生 成 pileup 文 件,Pileup 格 式 的 定 位 结 果 文 件 说 明 如 下 : 每 行 由 序 列 名 称 序 列 坐 标 位 点 参 考 碱 基 覆 盖 深 度 读 段 的 碱 基 序 列 和 对 应 碱 基 质 量 组 成 在 读 段 碱 基 序 列 这 一 列 中,. 代 表 正 向 链 上 与 参 考 碱 基 匹 配 的 一 个 碱 基 位 点,, 代 表 反 向 链 上 的 匹 配 位 点 ACGTN 代 表 正 向 链 上 的 mismatch 碱 基, acgtn 代 表 反 向 链 上 的 mismatch 碱 基 符 号 ^ 标 志 着 读 段 的 起 始, 紧 随 ^ 的 字 符 的 ASCII 值 减 33 所 得 结 果 即 是 mapping quality $ 符 号 标 志 着 读 段 结 束 模 式 \ + [0-9] + [ACGTNacgtn] + 表 示 在 对 应 参 考 位 置 有 一 段 插 入 序 列, 长 度 由 [] 中 的 整 数 给 出, 后 跟 插 入 序 列 同 样, 模 式 - [0-9] + [ACGTNacgtn] + 表 示 存 在 一 段 缺 失 序 列 SNP 预 测 的 参 数 设 定 : 1 最 低 覆 盖 深 度 :30(reads) 2 最 高 覆 盖 深 度 :500(reads) 3 检 测 位 点 的 差 异 碱 基 数 ( 绝 对 值 ):5 4 检 测 位 点 的 差 异 碱 基 比 率 :2% 满 足 以 上 条 件 的 mismatch 位 点 ( 错 误 匹 配 的 碱 基 位 点 ) 才 是 一 个 有 效 的 SNP 位 点 编 写 一 个 perl 脚 本 pileup_snpfilter.pl, 包 含 以 上 的 参 数 设 定, 对 定 位 的 结 果 文 件 进 行 SNP 扫 描, 获 得 菌 种 JK2 的 全 基 因 组 SNP:JK2.pileup.snp 2.2 转 换 与 颠 换 SNP 类 型 的 统 计 统 计 短 短 芽 孢 杆 菌 JK2 在 全 基 因 组 检 测 到 的 SNP 数 目, 计 算 平 均 密 度, 并 分 别 计 算 转 换 (C/T

311 G/A) 与 颠 换 (C/G A/T C/A G/T) 类 型 的 SNP 数 SNP 密 度 的 计 算 :SNP 数 / 参 考 序 列 长 度 转 换 与 颠 换 SNP 数 的 计 算 : 用 shell 命 令 cal_snp.sh 2.3 每 一 个 基 因 中 SNP 数 的 统 计 SNP 在 基 因 组 的 任 何 碱 基 均 有 可 能 发 生 变 异, 在 细 菌 中 位 于 编 码 区 的 SNP 比 较 多, 在 遗 传 研 究 中 具 有 很 重 要 的 意 义 菌 种 JK2 共 有 5666 条 基 因 序 列, 可 从 文 件 wls327.annotation.txt 获 知 利 用 shell 命 令 snp_in_gene.sh 算 出 每 一 个 基 因 中 分 布 的 SNP, 并 统 计 个 数 3. 试 验 结 果 3.1 转 换 与 颠 换 类 型 的 SNP 数 统 计 获 得 菌 种 JK2 的 全 基 因 组 SNP:JK2.pileup.snp, 一 行 代 表 一 个 突 变 二 等 位 的 SNP 每 行 总 共 七 列, 分 别 为 序 列 名 称 SNP 坐 标 位 点 参 考 碱 基 覆 盖 深 度 突 变 碱 基 突 变 碱 基 个 数 和 比 率, 如 下 所 示 : scaffold9 12486 T 70 G 5 7.14% scaffold9 16039 A 53 C 6 11.32% scaffold9 17403 A 49 G 6 12.24% scaffold9 22304 T 80 G 8 10.00% 三 等 位 的 SNP 有 10 列, 多 了 3 列, 分 别 是 第 三 位 的 突 变 碱 基 突 变 碱 基 个 数 和 比 率, 如 下 : scaffold9 4926 T 87 C 5 5.75% G 1 1.15% scaffold9 30671 T 78 G 7 8.97% N 1 1.28% 以 此 类 推, 四 等 位 的 SNP 有 13 列 : scaffold16 38852 A 118 C 9 7.63% G 1 0.85% T 1 0.85% 三 等 位 和 四 等 位 的 SNP 很 少, 第 三 位 或 第 四 位 突 变 碱 基 的 频 率 也 很 低, 一 般 突 变 碱 基 数 只 有 一 个, 当 然 也 有 少 数 是 2 的

312 各 类 型 SNP 的 统 计 结 果 见 表 1, 表 2 和 图 1: 表 1. 各 等 位 SNP 的 统 计 二 等 位 三 等 位 四 等 位 五 等 位 总 和 num 2387 607 77 4 3075 % 77.63% 19.74% 2.50% 0.13% 100% 在 本 文 中, 总 共 检 测 到 3075 个 SNP, 参 考 scaffold 序 列 总 长 达 到 6Mb, 平 均 全 基 因 组 的 SNP 密 度 为 0.511/kb 其 中 二 等 位 SNP 占 了 绝 大 多 数, 达 77.63%; 三 等 位 SNP 也 有 19.74%, 其 他 等 位 的 SNP 很 少, 几 乎 可 以 忽 略 表 2. 转 换 与 颠 换 SNP 的 分 布 个 数 及 平 均 突 变 频 率 转 换 Transitions 颠 换 Transversion C/T G/A C/G A/T C/A T/G 总 和 或 平 均 snp_num 258 334 65 54 1348 1016 3075 平 均 突 变 频 率 Frequencies 10.98% 9.43% 14.53% 12.08% 6.46% 6.95% 7.56% 表 2 的 统 计 不 考 虑 SNP 的 第 三 位 及 第 四 位 突 变 ( 因 为 其 突 变 碱 基 一 般 只 有 一 个, 有 可 能 是 错 误 测 序 所 致 ) 从 表 中 可 知,SNP 在 全 基 因 组 的 平 均 发 生 频 率 为 7.56% 在 突 变 频 率 上, 转 换 的 C/T 与 G/A 是 相 近 的, 颠 换 的 C/G 与 A/T C/A 与 T/G 也 是 相 近 的, 符 合 DNA 双 链 的 碱 基 对 应 关 系

313 图 1 上 的 比 例 是 各 SNP 类 型 所 占 的 百 分 比 图 1. JK2 全 基 因 组 SNP 的 分 布 由 统 计 数 据 可 知, 转 换 类 型 的 C/T G/A 所 占 比 例 不 大, 分 别 为 8.39% 10.86%; 颠 换 的 四 种 类 型 C/G A/T C/A 和 G/T 中,C/A 和 G/T 两 者 总 共 约 占 了 全 部 SNP 的 76% JK2 菌 种 整 体 的 转 换 与 颠 换 比 为 1..4.19, 颠 换 的 SNP 数 远 远 大 于 转 换, 即 颠 换 的 发 生 频 率 比 较 大 3.2 基 因 中 SNP 数 的 统 计 利 用 shell 命 令 分 析 菌 种 JK2 中 每 个 基 因 分 布 的 SNP, 得 到 结 果 文 件 :JK2.snp.in.gene.txt, 如 下 所 示 :

314 用 星 号 线 *** 隔 开 每 一 个 基 因 检 测 到 的 SNP 第 一 行 是 基 因 信 息, 包 括 以 下 几 个 方 面 : 所 在 scaffold 序 列, 基 因 起 始 终 止 位 点 长 度 名 称 和 正 负 链, 最 后 一 列 是 指 在 这 个 基 因 中 检 测 到 的 SNP 数 ; 接 下 来, 直 到 *** 之 前 的 所 有 行, 是 分 布 的 SNP 的 具 体 信 息 菌 种 JK2 检 测 到 的 SNP 数 较 少, 密 度 只 有 0.511/kb, 从 上 面 的 信 息 可 以 看 出, 基 因 中 分 布 的 SNP 也 很 少, 主 要 集 中 在 0~4 个, 有 很 多 基 因 没 有 发 现 SNP 但 也 有 一 些 突 出 的 情 况, 如 图 2 所 示, 在 基 因 wls237_1769 中 的 SNP 有 12 个, 而 wls237_4280 分 布 的 SNP 数 多 达 18 个 菌 种 JK2 全 基 因 组 的 所 有 基 因 分 布 的 SNP 数 情 况 见 图 2:

315 图 2. JK2 每 一 个 基 因 中 分 布 的 snp 数 的 变 化 横 坐 标 是 基 因 编 号, 按 基 因 在 scaffold 序 列 的 顺 序 排 列 ; 纵 坐 标 是 SNP 个 数 在 基 因 组 内, 虽 然 在 基 因 中 的 SNP 数 不 多, 但 还 是 有 少 数 基 因 其 编 码 SNP (coding SNP,cSNP) 数 5, 提 取 出 这 些 基 因 的 信 息, 如 下 : 菌 种 JK2 有 39 个 : scaffold9 313518 329087 15569 wls237_0332 Forward 5 scaffold16 85055 85897 842 wls237_1157 Forward 5 scaffold16 140929 144039 3110 wls237_1201 Forward 5 scaffold16 150915 152606 1691 wls237_1208 Forward 5 scaffold16 230711 235753 5042 wls237_1277 Reverse 6 scaffold16 246399 248747 2348 wls237_1285 Forward 5 scaffold16 300734 303412 2678 wls237_1328 Forward 5 scaffold5 30927 40676 9749 wls237_1657 Forward 5 scaffold5 48618 64358 15740 wls237_1659 Forward 5 scaffold5 103821 118136 14315 wls237_1669 Forward 9 scaffold5 223703 245146 21443 wls237_1769 Forward 12 scaffold8 215625 221597 5972 wls237_2339 Reverse 5

316 scaffold3 35933 37927 1994 wls237_2432 Reverse 7 scaffold3 53560 54261 701 wls237_2445 Reverse 5 scaffold3 141398 143746 2348 wls237_2517 Reverse 7 scaffold3 184335 185111 776 wls237_2552 Reverse 5 scaffold20 38364 42284 3920 wls237_2602 Forward 7 scaffold20 65580 68831 3251 wls237_2624 Forward 5 scaffold47 80822 82153 1331 wls237_3135 Reverse 7 scaffold47 98655 100472 1817 wls237_3157 Forward 5 scaffold11 121376 122980 1604 wls237_3616 Reverse 6 scaffold6 54232 55131 899 wls237_3798 Forward 5 scaffold28 35969 37276 1307 wls237_4025 Forward 5 scaffold28 38558 39709 1151 wls237_4028 Forward 5 scaffold28 80949 84497 3548 wls237_4082 Forward 7 scaffold28 101660 103087 1427 wls237_4098 Forward 5 scaffold28 108807 109772 965 wls237_4104 Forward 5 scaffold14 64033 69816 5783 wls237_4280 Forward 18 scaffold27 24738 25940 1202 wls237_4335 Reverse 5 scaffold53 75114 76133 1019 wls237_4555 Forward 5 scaffold49 18933 20402 1469 wls237_4579 Reverse 5 scaffold55 55102 56469 1367 wls237_4961 Reverse 5 scaffold43 14078 16033 1955 wls237_5202 Forward 5 scaffold31 20454 27008 6554 wls237_5296 Reverse 8 C4811 9341 10834 1493 wls237_5322 Reverse 5 C4811 18278 19936 1658 wls237_5330 Reverse 5 scaffold41 13502 18985 5483 wls237_5430 Reverse 5 C4719 6283 8385 2102 wls237_5547 Reverse 5 scaffold15 319 5742 5423 wls237_5616 Reverse 5 每 一 行 的 最 后 一 列 数 字 指 的 是 基 因 中 分 布 的 SNP 数, 这 些 SNP 密 度 相 对 较 高 的 基 因 可 能 对 菌 种 有 重 要 影 响, 不 过 还 是 要 进 一 步 确 定 这 些 SNP 是 同 义 csnp 还 是 非 同 义 csnp, 有 待 进 一 步 考 究

317 4. 试 验 讨 论 根 据 对 一 些 常 见 物 种 的 分 析, 发 现 基 因 组 的 SNP 密 度 主 要 在 1.0/kb ~ 2.0/kb 之 间, 如 本 人 硕 士 论 文 分 析 的 物 种 日 本 晴 水 稻, 全 基 因 组 的 平 均 SNP 密 度 为 1.41/kb, 另 一 物 种 拟 南 芥 的 SNP 密 度 为 1.6/kb 又 如, 人 类 基 因 组 中 平 均 每 500~1000 个 碱 基 对 中 就 有 1 个 SNP, 其 密 度 也 介 于 1.0/kb ~ 2.0/kb 当 然, 这 主 要 是 在 真 核 生 物 的 情 况, 有 可 能 分 析 物 种 的 不 同, 密 度 会 有 一 定 的 不 同, 如 之 前 分 析 的 青 枯 雷 尔 氏 菌 RS91 平 均 全 基 因 组 的 SNP 密 度 为 3.96/kb,RS98 的 SNP 密 度 为 3.34/kb, 都 非 常 高, 而 本 文 分 析 的 短 短 芽 孢 杆 菌 JK2 的 SNP 数 明 显 少 很 多, 密 度 只 有 0.511/kb, 看 来 JK2 是 比 较 保 守 的 一 个 菌 种 一 般 来 说, 转 换 的 发 生 更 容 易, 因 为 它 是 同 型 碱 基 之 间 的 替 换, 大 量 研 究 ( 仪 军 玲 等,2008; 杨 永 强 等,2009) 也 表 明, 转 换 的 发 生 频 率 更 大 Wang 等 在 1998 年 对 人 类 基 因 组 进 行 大 规 模 SNP 检 测 时 得 出, 转 换 与 颠 换 的 比 约 为 2..1, 本 人 硕 士 分 析 的 日 本 晴 水 稻 转 换 与 颠 换 比 值 为 2.89..1 但 是, 在 细 菌 中 情 况 却 有 些 不 同, 如 青 枯 雷 尔 氏 菌 RS91 转 换 与 颠 换 的 比 为 1..5.81,RS98 的 转 换 与 颠 换 比 为 1..5.64, 颠 换 的 SNP 数 远 远 大 于 转 换 在 本 文 中, 菌 种 JK2 的 其 中 两 种 颠 换 C/G 与 A/T 突 变 数 确 实 比 转 换 少, 但 另 外 两 种 颠 换 C/A 与 T/G 远 多 于 转 换, 占 了 SNP 的 绝 大 多 数, 总 的 转 换 与 颠 换 比 为 1..4.19, 颠 换 的 发 生 频 率 还 是 比 较 大 这 可 能 是 由 于 分 析 对 象 的 不 同, 原 核 与 真 核 生 物 真 的 有 差 别 5.. 参 考 文 献 Wang D G, Fan J B, Siao C J, et al. Large-scale identification, mapping and genotyping of single nucleotide polymorphisms in the human genome [J]. Science, 1998, 280: 1077 1082. 杨 永 强, 王 巍 杰, 徐 长 波, 等. 单 核 苷 酸 多 态 性 研 究 进 展 [J]. 化 学 与 生 物 工 程,2009,26(8):16 19. 仪 军 玲, 李 彩 霞, 胡 兰, 等. 单 核 苷 酸 多 态 性 及 其 检 测 方 法 [J]. 证 据 科 学,2008,16(6 ):74 75. 邱 孙 全, 杨 红, 赵 春 安, 李 海 燕. 一 株 内 生 短 短 芽 胞 杆 菌 的 鉴 定 及 其 抗 菌 活 性 研 究 [J]. 天 然 产 物 研 究 与 开 发,2009,21:30 33. 郑 雪 芳, 葛 慈 斌, 林 营 志, 刘 建, 刘 波. 瓜 类 作 物 枯 萎 病 生 防 菌 BS-2000 和 JK-2 的 分 子 鉴 定 [J]. 福 建 农 业 学 报,2006,21(2):154 157. 葛 慈 斌, 刘 波, 蓝 江 林, 黄 素 芳, 朱 育 菁. 生 防 菌 JK-2 对 尖 孢 镰 刀 菌 抑 制 特 性 的 研 究. 福 建 农 业 学 报,2009,24(1):29 34. 试 验 负 责 试 验 人 员 林 爱 婷

318 2011-08-25 承 担 单 位 : 福 建 省 农 科 院 农 业 生 物 资 源 研 究 所 试 验 设 计 : 试 验 项 目 : 苯 酚 硫 酸 法 测 定 胞 外 多 糖 标 准 曲 线 的 测 定 试 验 人 员 : 张 文 州 郑 雪 芳 试 验 负 责 : 郑 雪 芳 报 告 日 期 :2011-08-25 计 数 月 份 :2011 年 8 月 研 究 资 格 系 数 (0.5-1.0) 实 验 设 计 系 数 (0.9-1.0 0.9-1.0) 报 告 得 分 总 分 实 验 设 计 实 验 记 载 实 验 分 析 实 验 简 报 实 验 文 章 1-20% 21-40% 41-60% 61-80% 81-100% 1%-5% 设 计 不 足, 实 施 错 误 6%-10% 设 计 不 全, 实 验 无 果 11%-15% 设 计 可 以, 实 施 不 全 16%-20% 设 计 完 整, 分 布 实 施 21%-25% 实 验 不 全, 记 载 无 果 26%-30% 实 验 不 足, 记 载 不 全 31%-35% 独 立 实 验, 记 载 不 全 36%-40% 分 布 实 验, 记 载 完 整 41%-45% 目 的 明 确, 实 验 完 成 46%-50% 实 验 完 整, 记 载 清 晰 51%-55% 实 验 系 统, 结 果 可 信 56%-60% 实 验 创 新, 分 析 清 晰 61%-65% 实 验 创 新, 结 论 清 晰 66%-70% 实 验 完 整, 统 计 清 晰 71%-75% 实 验 系 统, 数 据 可 靠 76%-80% 报 告 完 整, 文 章 雏 形 81%-85% 结 构 合 理, 分 析 有 据 86%-90% 逻 辑 清 晰, 统 计 合 理 91%-95% 图 表 完 整, 写 作 流 畅 96%-100% 文 献 完 整, 发 表 水 平 福 建 省 农 业 科 学 院 农 业 生 物 资 源 研 究 所 农 业 微 生 物 研 究 中 心 电 话 : 0591-87882571, 传 真 : 0591-87882571 fjat.yzxz.com

319 1. 试 验 目 的 青 枯 菌 胞 外 多 糖 是 决 定 青 枯 菌 侵 染 力 的 主 要 因 素 之 一 青 枯 菌 存 在 致 病 力 强 弱 菌 株 的 分 化, 强 弱 致 病 力 菌 株 在 分 泌 胞 外 多 糖 上 是 否 存 在 区 别 本 试 验 通 过 用 乙 醇 沉 淀 方 法, 从 青 枯 菌 强 弱 菌 株 发 酵 液 中 提 取 胞 外 多 糖, 然 后 用 苯 酚 - 硫 酸 比 色 法 测 定 胞 外 多 糖 的 量, 以 分 析 不 同 青 枯 雷 尔 氏 菌 菌 株 在 分 泌 胞 外 多 糖 的 量 上 是 否 存 在 差 异 [1] 青 枯 雷 尔 氏 菌 (Ralstonia solanacearum), 属 于 革 兰 氏 阴 性 b 蛋 白 类 细 菌 雷 尔 氏 菌 引 起 的 植 物 细 菌 性 青 枯 病 害 (Bacterial wilt), 简 称 青 枯 病, 是 一 种 世 界 范 围 的 细 菌 性 土 传 病 害 该 菌 寄 主 广 泛, 能 够 侵 染 热 带 和 温 带 地 区 多 达 450 种 以 上 的 植 物 种 类, 严 重 影 响 了 很 多 重 要 经 济 作 物, 比 如 番 茄 [2] [3] 烟 草 辣 椒 等 的 产 量 青 枯 病 的 防 治 目 前 还 没 有 有 效 的 化 学 农 药 防 治 且 易 造 成 环 境 污 染 和 残 留 利 用 无 致 病 力 青 枯 雷 尔 氏 菌 对 作 物 青 枯 病 进 行 生 物 防 治, 是 一 个 有 益 的 尝 试, 并 已 有 过 许 多 成 功 的 例 子 本 试 验 通 过 标 准 曲 线 的 制 作 为 下 一 步 研 究 不 同 青 枯 雷 尔 氏 菌 胞 外 多 糖 的 差 异 比 较 提 供 了 条 件 2. 试 验 方 法 2.1 材 料 浓 硫 酸 : 分 析 纯,95.5%,5% 苯 酚, 分 析 纯 葡 萄 糖,UV2550-SHIMADZU 紫 外 - 可 见 光 谱 仪 2.2 试 验 方 法 (1) 苯 酚 - 硫 酸 法 标 准 曲 线 的 制 定 : a 原 理 : 糖 类 物 质 与 硫 酸 作 用 脱 水, 生 成 糠 醛 或 糠 醛 的 衍 生 物, 此 衍 生 物 遇 芳 香 族 酚 类 或 胺 类 化 合 物, 能 缩 合 生 成 有 色 物 质 b 标 准 曲 线 制 定 的 方 法 : 取 6 支 试 管 (18 180), 分 别 加 入 0.1,0.2,0.4,0.6,0.8,1.0ml(100Ug/ml) 标 准 葡 萄 糖 溶 液, 依 次 加 水, 使 最 终 体 积 均 为 1ml 另 取 1ml 水 作 为 空 白 每 一 试 管 再 加 入 1ml 5% 的 苯 酚 水 溶 液, 摇 匀 用 吸 量 管 向 每 个 试 管 中 加 入 5ml 浓 硫 酸, 将 试 管 摇 匀 10min 后, 放 入 25 水 浴 中 20min 显 色 后 的 橙 黄 色 溶 液 可 稳 定 几 小 时, 将 各 溶 液 在 490nm 下 比 色 测 定 每 个 测 得 的 光 密 度 减 去 空 白 的 光 密 度 后, 以 糖 的 微 克 数 为 横 坐 标, 以 光 密 度 为 纵 坐 标, 绘 制 标 准 曲 线 或 求 出 糖 的 微 克 数 --- 光 密 度 之 间 的 函 数 关 系 式 (2) 胞 外 多 糖 含 量 测 定 : 准 确 吸 取 各 胞 外 多 糖 溶 液 1.0ml, 加 入 到 试 管 中, 各 试 管 再 加 入 1ml 5% 的 苯 酚 水 溶 液 和 5ml 浓 硫 酸, 将 试 管 摇 匀 10min 后, 放 入 25 水 浴 中 20min, 将 各 显 色 后 的 橙 黄 色 溶 液 在 490nm 下 比 色 测 定 根 据 测 得 的 光 密 度 值 从 标 准 曲 线 上 查 得 相 应 含 量 或 从 标 准 关 系 式 中 算 出 相 应 含 量, 计 算 各 青 枯 菌 发 酵 液 的 胞 外 多 糖 含 量

320 3. 试 验 结 果 (1) 苯 酚 - 硫 酸 法 的 标 准 曲 线 : 对 于 不 同 体 积 的 标 准 葡 萄 糖 溶 液, 用 苯 酚 - 硫 酸 法 测 得 的 光 密 度 如 下 表 所 示 : 表 1: 不 同 体 积 标 准 糖 溶 液 的 光 密 度 标 准 糖 溶 液 的 体 积 (ml) 光 密 度 (λ=490nm) 0.1 0.065 0.2 0.147 0.4 0.324 0.6 0.475 0.8 0.611 1.0 0.770 用 标 准 曲 线 回 归 分 析, 其 回 归 方 程 :Y=0.1533X+0.0055, 相 关 系 数 r=0.9981 吸 光 度 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 y = 0.1533x + 0.0055 R 2 = 0.9981 0.2 0.4 0.6 0.8 1 系 列 1 线 性 ( 系 列 1) 标 准 糖 溶 液 的 体 积 (ml) 图 1 苯 酚 - 硫 酸 法 的 标 准 曲 线

321 图 2 苯 酚 - 硫 酸 法 显 色 后 的 不 同 菌 株 多 糖 溶 液 ( 图 中 最 左 一 只 试 管 内 为 CK) 4. 试 验 讨 论 通 过 对 不 同 体 积 的 标 准 葡 萄 糖 溶 液 生 长 曲 线 的 测 定, 建 立 菌 体 生 物 量 的 直 观 测 定 方 法, 从 而 为 更 加 深 入 地 研 究 青 枯 雷 尔 氏 菌 胞 外 多 糖 提 供 依 据, 同 时 为 进 一 步 研 究 青 枯 雷 尔 氏 菌 胞 外 多 糖 的 差 异 提 供 依 据 5.. 参 考 文 献 [1] 沈 向 红.2001. 保 健 食 品 中 粗 多 糖 测 定 方 法 研 究. 实 用 预 防 医 学,8(6):461-462 袁 晓 华 等. 植 物 生 理 生 化 实 验. 北 京 : 高 等 教 育 出 版 社,9-11 [2] 姚 占 芳 等.1995. 香 菇 多 糖 提 取 工 艺 条 件 和 测 定 方 法 的 研 究. 河 南 农 业 大 学 学 报,29(2):180-183 [3] 何 学 友. 我 国 林 木 青 枯 病 研 究 概 况 [J]. 森 林 病 虫 通 讯,1997 (1):43-46. [4]Opina N L,Valdez R B,Opina O S.Effect of rice-tomato cropping patterns and flooding on the survival of Pseudomonas solanacearum E.F.Smith[J]. Philippine-Phytopathology.1994,30(2):93~99. [5] 姚 革, 张 帆, 李 舟. 土 壤 添 加 剂 防 治 细 菌 性 青 枯 病 初 报. 生 物 防 治 通 报,1994,10(3):106~109. [6] 随 学 超, 卜 崇 兴, 郭 世 荣, 等. 基 质 中 添 加 有 机 缓 释 肥 对 番 茄 青 枯 病 防 效 的 影 响. 江 苏 农 业 科 学,2007 (4):85-88. [7] 黄 乃 秀. 几 种 不 同 抗 菌 素 对 培 养 桉 树 青 枯 病 菌 的 影 响 [J]. 广 西 林 业 科 学,1998,27(1):25-17. [8] 陈 勇, 唐 春 生, 刘 爱 中, 等. 4 种 药 剂 对 烟 草 青 枯 病 的 防 治 效 果 研 究 [J]. 湖 南 农 业 科 学,2008,(4):93~95. [9] 尹 贤 贵, 张 赟, 潘 光 辉, 等. 番 茄 抗 青 枯 病 材 料 筛 选 [J]. 长 江 蔬 菜,2004(1):42-44. 试 验 负 责 郑 雪 芳 试 验 人 员 张 文 州 郑 雪 芳

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323 2011-09-21 承 担 单 位 : 福 建 省 农 科 院 农 业 生 物 资 源 研 究 所 试 验 设 计 : 试 验 项 目 : 苗 立 鲜 对 金 石 王 1 号 番 茄 种 苗 保 鲜 效 果 试 验 人 员 : 张 文 州 试 验 负 责 : 郑 雪 芳 报 告 日 期 :2011-09-21 计 数 月 份 :2011 年 08 月 研 究 资 格 系 数 (0.5-1.0) 实 验 设 计 系 数 (0.9-1.0 0.9-1.0) 报 告 得 分 总 分 实 验 设 计 实 验 记 载 实 验 分 析 实 验 简 报 实 验 文 章 1-20% 21-40% 41-60% 61-80% 81-100% 1%-5% 设 计 不 足, 实 施 错 误 6%-10% 设 计 不 全, 实 验 无 果 11%-15% 设 计 可 以, 实 施 不 全 16%-20% 设 计 完 整, 分 布 实 施 21%-25% 实 验 不 全, 记 载 无 果 26%-30% 实 验 不 足, 记 载 不 全 31%-35% 独 立 实 验, 记 载 不 全 36%-40% 分 布 实 验, 记 载 完 整 41%-45% 目 的 明 确, 实 验 完 成 46%-50% 实 验 完 整, 记 载 清 晰 51%-55% 实 验 系 统, 结 果 可 信 56%-60% 实 验 创 新, 分 析 清 晰 61%-65% 实 验 创 新, 结 论 清 晰 66%-70% 实 验 完 整, 统 计 清 晰 71%-75% 实 验 系 统, 数 据 可 靠 76%-80% 报 告 完 整, 文 章 雏 形 81%-85% 结 构 合 理, 分 析 有 据 86%-90% 逻 辑 清 晰, 统 计 合 理 91%-95% 图 表 完 整, 写 作 流 畅 96%-100% 文 献 完 整, 发 表 水 平 福 建 省 农 业 科 学 院 农 业 生 物 资 源 研 究 所 农 业 微 生 物 研 究 中 心 电 话 : 0591-87882571, 传 真 : 0591-87882571 fjat.yzxz.com

324 1. 试 验 目 的 随 着 科 技 水 平 日 益 提 高, 种 苗 培 育 以 逐 步 成 为 了 育 苗 的 重 要 手 段 之 一 而 种 苗 运 输 中 出 现 的 烂 苗 和 徒 长 现 象 成 了 限 制 种 苗 发 展 的 一 个 重 要 因 素 因 此, 找 出 一 种 有 效 防 治 运 输 过 程 中 出 现 烂 苗 和 徒 长 的 方 法 是 当 前 种 苗 发 展 急 需 解 决 的 问 题 本 试 验 采 用 农 科 院 生 产 的 苗 立 鲜, 模 拟 运 输 条 件 观 察 苗 立 鲜 对 金 石 王 1 号 番 茄 实 生 苗 保 鲜 及 徒 长 现 象 的 作 用 2. 试 验 方 法 2.1 试 验 材 料 (1) 保 鲜 品 种 : 金 石 王 1 号 番 茄, 由 厦 门 如 意 集 团 有 限 公 司 购 买 (2) 微 生 物 保 鲜 材 料 : 苗 立 鲜, 由 本 研 究 室 自 行 研 制, 稀 释 2000 倍 使 用 2.2 试 验 方 法 2.1 微 生 物 保 鲜 菌 使 用 方 法 喷 施 实 生 苗 为 金 石 王 1 号 番 茄 14 天 苗 ( 苗 外 运 时 间 ), 实 验 组 采 用 稀 释 2000 倍 苗 立 鲜 喷 施, 使 植 株 茎 杆 和 叶 片 充 分 淋 湿, 对 照 组 用 清 水 做 相 同 处 理 处 理 结 束 后, 将 苗 放 至 阴 凉 处 待 苗 晾 干, 装 箱 每 个 处 理 300 株 苗 2.2 检 测 指 标 1) 观 察 植 株 是 否 徒 长 2) 选 取 实 验 和 对 照 组 各 30 株 分 析 : 叶 片 数 株 高 弯 曲 度 差 异 3. 试 验 结 果 随 机 选 取 试 验 组 和 对 照 组 好 苗 各 30 株 统 计 结 果 如 表 1, 苗 立 鲜 处 理 茄 子 植 株 平 均 株 高 为 19.45cm 而 清 水 对 照 植 株 平 均 株 高 为 18.72cm 苗 立 鲜 处 理 茄 子 植 株 平 均 曲 度 为 147.13, 清 水 对 照 平 均 曲 度 为 108.33 叶 片 数 分 别 为 4.13 和 4.14, 二 者 相 差 较 小 表 1 随 机 选 取 试 验 组 和 对 照 组 好 苗 各 30 株 统 计 结 果 ck 处 理 株 高 叶 片 数 曲 度 株 高 叶 片 数 曲 度 1 18 4 95 19 4 140 2 19.5 4 102 17.8 4 145 3 19.8 3 105 20 4 170 4 18.6 4 110 19.2 4 130 5 18.2 4 96 19.8 5 145 6 18 4 100 17.7 5 143 7 17.6 4 98 19.5 4 138 8 19.5 4 111 19.7 4 168 9 18.3 4 113 18.5 4 170 10 19 4 104 19.5 4 140 11 17.4 4 111 19.6 4 152 12 20.5 5 115 18.3 3 141 13 20.3 4 121 16.4 4 158 14 20.5 4 126 19.2 4 156 15 20 4 118 18.8 4 139 16 19.8 4 109 18.3 4 168

325 17 20.5 4 112 19.7 5 162 18 18.6 4 106 19.2 161 19 16.7 5 123 20.5 4 168 20 18.3 4 109 18.5 4 126 21 20.2 5 118 17 4 137 22 19.6 4 93 20.2 4 125 23 21.5 5 85 18.5 4 128 24 19.5 4 89 17.3 4 142 25 22 4 126 19.8 4 153 26 21 4 131 20.1 5 148 27 22.5 5 118 10.2 5 143 28 18.7 4 122 20.5 4 139 29 20.7 4 88 20.3 4 136 30 18.8 4 96 18.6 4 143 平 均 值 19.45 4.13 108.33 18.72 4.14 147.13

326 图 1 处 理 96 h 后 番 茄 苗 处 理 96h 后 试 验 组 图 2 开 箱 后 番 茄 苗 处 理 96h 后 对 照 组

327 图 4 处 理 96h 后 试 验 组 对 照 组 的 比 较 图 5 试 验 田

328 图 6 苗 立 鲜 产 品 图 片 4. 试 验 结 论 由 表 1 可 知 试 验 组 和 对 照 组 株 高 和 曲 度 差 别 较 大, 叶 片 数 差 别 较 小 综 合 以 上 因 素 可 知 苗 立 鲜 对 抑 制 种 苗 的 徒 长 具 有 显 著 作 用 通 过 图 片 可 明 显 的 发 现 对 照 组 番 茄 苗 弯 曲 度 很 大, 这 对 植 株 田 间 的 生 长 有 一 定 的 影 响, 而 苗 立 鲜 处 理 番 茄 植 株 会 比 较 健 壮 下 一 步, 将 对 试 验 苗 进 行 田 间 观 察, 以 便 进 一 步 比 较 苗 立 鲜 对 番 茄 后 续 生 长 的 影 响 5. 参 考 文 献 1) 孔 凡 真. 国 外 食 品 保 鲜 十 项 新 技 术 [J]. 肉 品 卫 生,2003,(9):38-39 2) 李 京 晶, 籍 保 平, 周 峰, 李 博. 丁 香 和 肉 桂 挥 发 油 的 提 取 主 要 成 分 测 定 及 其 抗 菌 活 性 研 究 [J]. 食 品 科 学,2006,27(8):64-68 3) 王 海 宏, 周 慧 娟, 乔 勇 进, 张 绍 铃, 陈 召 亮, 王 希 英. 桃 贮 藏 保 鲜 技 术 研 究 现 状 与 发 展 趋 势 [J]. 保 鲜 与 加 工,2009,9(2):10-14 4) 王 曙 文, 代 永 刚, 牛 红 红, 南 喜 平. 国 内 外 果 蔬 生 物 保 鲜 技 术 的 研 究 进 展 [J]. 农 产 品 加 工,2008,(12):110-113 5) Roller S.The quest for natural antimicrobials as novel means of food preservation; status report on a European research project [J].International Biodeterioration and Biodegradation,1995,36 (3-4):333 345. 6) Scannell A G,Ross R P,Hill C,et al. An efective lacticin biopreservative in fresh pork sausage [J].J Food Port,2000,63 (3):370-375. 7) 张 福 星, 蒋 炳 生. 生 物 保 鲜 液 膜 对 草 莓 常 温 保 鲜 效 果 的 研 究 [J]. 安 徽 农 业 科 学,2000, 28(5):691-693. 8) 周 静 亚, 徐 忠 传, 马 春 朋. 壳 聚 糖 在 鲜 切 果 蔬 保 鲜 中 的 应 用 [J]. 食 品 研 究 与 开 发. 2009, (10):130-134 9) 李 雯, 邵 远 志, 符 青 苗, 谢 江 辉. 壳 聚 糖 在 香 蕉 果 实 贮 藏 保 鲜 上 的 应 用 效 果 [J]. 天 然 产 物 研 究 与 开 发,2008,20(6):1099-1103 10) 李 凤 梅, 周 庆 新, 李 文 香, 王 成 荣, 吕 建 华. 丁 香 提 取 液 与 壳 聚 糖 复 合 对 草 莓 保 鲜 效 果 的 影 响 [J]. 青 岛 农 业 大 学 学 报,2008,25(4):298-300,306 11) 张 举 印, 饶 景 萍, 董 晓 庆, 田 改 妮. 壳 聚 糖 复 合 涂 膜 对 红 富 士 苹 果 保 鲜 研 究 [J]. 西 北 农

329 业 学 报,2009,(5):354-358 12) 曾 荣, 李 平, 陈 金 印. 天 然 保 鲜 剂 涂 膜 处 理 对 猕 猴 桃 果 实 活 性 氧 代 谢 的 影 响 [J]. 保 鲜 与 加 工,2005,5(5):29-31 13) 万 惠 萍, 叶 淑 红, 陈 丽, 曹 方, 于 榕, 穆 野, 钟 耀 广. 壳 聚 糖 膜 在 黄 瓜 保 鲜 中 的 应 用 [J]. 大 连 工 业 大 学 学 报,2008,27(2):110-112 14) 邓 冬 梅, 孙 宇 飞, 肖 恒 春. 不 同 放 置 方 式 对 壳 聚 糖 常 温 保 鲜 黄 瓜 的 影 响 [J]. 广 西 工 学 院 学 报,2008,19(1):67-70 15) 高 兆 银, 胡 美 姣, 李 敏, 杨 凤 珍. 壳 聚 糖 涂 膜 对 台 农 1 号 丰 亡 果 保 鲜 效 果 研 究 [J]. 中 国 南 方 果 树,2007,36(2):37-39 试 验 负 责 郑 雪 芳 试 验 人 员 张 文 州

330 2011-09-20 承 担 单 位 : 福 建 省 农 科 院 农 业 生 物 资 源 研 究 所 试 验 设 计 : 试 验 项 目 : 苗 立 鲜 对 农 友 长 茄 种 苗 保 鲜 效 果 试 验 人 员 : 张 文 州 试 验 负 责 : 郑 雪 芳 报 告 日 期 :2011-09-20 计 数 月 份 :2011 年 08 月 研 究 资 格 系 数 (0.5-1.0) 实 验 设 计 系 数 (0.9-1.0 0.9-1.0) 报 告 得 分 总 分 实 验 设 计 实 验 记 载 实 验 分 析 实 验 简 报 实 验 文 章 1-20% 21-40% 41-60% 61-80% 81-100% 1%-5% 设 计 不 足, 实 施 错 误 6%-10% 设 计 不 全, 实 验 无 果 11%-15% 设 计 可 以, 实 施 不 全 16%-20% 设 计 完 整, 分 布 实 施 21%-25% 实 验 不 全, 记 载 无 果 26%-30% 实 验 不 足, 记 载 不 全 31%-35% 独 立 实 验, 记 载 不 全 36%-40% 分 布 实 验, 记 载 完 整 41%-45% 目 的 明 确, 实 验 完 成 46%-50% 实 验 完 整, 记 载 清 晰 51%-55% 实 验 系 统, 结 果 可 信 56%-60% 实 验 创 新, 分 析 清 晰 61%-65% 实 验 创 新, 结 论 清 晰 66%-70% 实 验 完 整, 统 计 清 晰 71%-75% 实 验 系 统, 数 据 可 靠 76%-80% 报 告 完 整, 文 章 雏 形 81%-85% 结 构 合 理, 分 析 有 据 86%-90% 逻 辑 清 晰, 统 计 合 理 91%-95% 图 表 完 整, 写 作 流 畅 96%-100% 文 献 完 整, 发 表 水 平 福 建 省 农 业 科 学 院 农 业 生 物 资 源 研 究 所 农 业 微 生 物 研 究 中 心 电 话 : 0591-87882571, 传 真 : 0591-87882571 fjat.yzxz.com

331 1 试 验 目 的 随 着 科 技 水 平 日 益 提 高, 种 苗 培 育 以 逐 步 成 为 了 育 苗 的 重 要 手 段 之 一 而 种 苗 运 输 中 出 现 的 烂 苗 和 徒 长 现 象 成 了 限 制 种 苗 发 展 的 一 个 重 要 因 素 因 此, 找 出 一 种 有 效 防 治 运 输 过 程 中 出 现 烂 苗 和 徒 长 的 方 法 是 当 前 种 苗 发 展 急 需 解 决 的 问 题 本 试 验 采 用 农 科 院 生 产 的 苗 立 鲜, 模 拟 运 输 条 件 观 察 苗 立 鲜 对 农 友 长 茄 实 生 苗 保 鲜 及 徒 长 现 象 的 作 用 2. 试 验 方 法 2.1 试 验 材 料 (1) 保 鲜 品 种 : 农 友 长 茄 实 生 苗, 由 厦 门 如 意 集 团 有 限 公 司 购 买 (2) 微 生 物 保 鲜 材 料 : 苗 立 鲜, 由 本 研 究 室 自 行 研 制, 稀 释 800 倍 使 用 2.2 试 验 方 法 2.1 微 生 物 保 鲜 菌 使 用 方 法 喷 施 实 生 苗 为 农 友 长 茄 14 天 苗 ( 苗 外 运 时 间 ), 实 验 组 采 用 稀 释 800 倍 苗 立 鲜 喷 施, 使 植 株 茎 杆 和 叶 片 充 分 淋 湿, 对 照 组 用 清 水 做 相 同 处 理 处 理 结 束 后, 将 苗 放 至 阴 凉 处 待 苗 晾 干, 装 箱 每 个 处 理 300 株 苗 2.2 检 测 指 标 3) 观 察 植 株 是 否 徒 长 4) 选 取 实 验 和 对 照 组 各 30 株 分 析 : 叶 片 数 株 高 弯 曲 度 第 三 叶 的 长 和 宽 差 异 3. 试 验 结 果 随 机 选 取 试 验 组 和 对 照 组 好 苗 各 30 株 统 计 结 果 如 表 1, 苗 立 鲜 处 理 茄 子 植 株 平 均 株 高 为 15.5cm 而 清 水 对 照 植 株 平 均 株 高 为 17.8cm 苗 立 鲜 处 理 茄 子 植 株 平 均 曲 度 为 118.97, 清 水 对 照 平 均 曲 度 为 90.8 表 1 随 机 选 取 试 验 组 和 对 照 组 好 苗 各 30 株 统 计 结 果 处 理 ck 株 高 叶 片 数 曲 度 第 二 片 第 二 片 第 二 片 第 二 片 株 高 叶 片 数 曲 度 叶 长 叶 宽 叶 长 叶 宽 1 14.1 3 95 5.6 3.7 19.2 3 95 5.8 4.1 2 14.5 3 106 5 3.8 16.1 3 75 6.5 4.6 3 18.3 4 155 4.9 3.8 16.7 4 57 6.8 4.6 4 15.4 3 106 6.7 3.8 15.4 4 75 5.4 3.5 5 15.3 3 140 6.3 3.8 17.1 3 65 6.5 5.2 6 16.8 4 126 6 3.8 16.1 3 75 5.1 3.3 7 15.5 3 92 7 3.8 15.1 3 45 4.9 3.8 8 15.6 3 98 6.9 3.8 17.5 4 46 6.9 4.8 9 13.9 3 135 6.1 3.8 17.5 3 40 4.9 3.7 10 16.2 3 138 6.6 3.8 17 3 40 5.8 4.1 11 14.2 3 115 6.2 3.8 19.5 3 35 5.6 4.2 12 15.8 3 152 5.4 3.8 19.9 3 80 5.1 4.7 13 15.6 3 148 6.1 3.8 16.5 3 86 6.7 4.6 14 17.2 4 108 7.1 3.8 19.2 3 80 6.7 5.3 15 14.9 3 132 4.8 3.8 20.5 3 130 6.7 4.7

332 16 13.8 3 105 5 3.8 19 3 60 6.6 5 17 17 4 91 7 3.8 20 4 82 5.6 3.7 18 19.9 3 115 5.5 3.8 20.8 3 81 6.8 4.6 19 13 3 120 5.9 3.8 18.2 3 130 5.3 3.6 20 17.3 3 125 6.7 3.8 17.9 3 160 5.9 4.2 21 14.9 4 115 5.3 3.8 16 3 140 5.9 3.8 22 14.3 4 121 5.8 3.8 17.8 4 140 6.2 4 23 15.2 3 136 6.5 3.8 17 4 120 6.8 5 24 18 3 108 5.7 3.8 17.2 3 120 6.4 4.6 25 16.2 4 123 6.7 3.8 15.3 3 150 5.8 3.7 26 15.8 3 98 6.9 3.8 16.3 3 75 5.9 4.3 27 14.7 3 93 7.2 3.8 17.1 3 110 5.9 3.9 28 15.4 3 112 4.8 3.8 19.5 3 100 6.9 4.6 29 11.5 3 110 6.7 3.8 18.4 3 120 6.7 4.9 30 14.6 4 151 5.1 3.8 19.2 3 109 6.2 4.4 平 均 值 15.50 3.27 118.97 6.05 3.80 17.77 3.20 90.70 6.08 4.32

333 图 1 处 理 96 h 后 茄 子 苗 处 理 96h 后 试 验 组 图 2 开 箱 后 茄 子 苗 处 理 96h 后 对 照 组

334 图 4 处 理 96h 后 试 验 组 对 照 组 的 比 较 图 5 试 验 田

335 图 6 苗 立 鲜 产 品 图 片 4. 试 验 结 论 由 表 1 可 知 试 验 组 和 对 照 组 株 高 和 曲 度 差 别 较 大, 叶 片 数 及 叶 长 叶 宽 差 别 较 小 综 合 以 上 因 素 可 知 苗 立 鲜 对 抑 制 种 苗 的 徒 长 具 有 显 著 作 用 下 一 步, 将 对 试 验 苗 进 行 田 间 观 察, 以 便 进 一 步 比 较 苗 立 鲜 对 茄 子 后 续 生 长 的 影 响 5. 参 考 文 献 16) 孔 凡 真. 国 外 食 品 保 鲜 十 项 新 技 术 [J]. 肉 品 卫 生,2003,(9):38-39 17) 李 京 晶, 籍 保 平, 周 峰, 李 博. 丁 香 和 肉 桂 挥 发 油 的 提 取 主 要 成 分 测 定 及 其 抗 菌 活 性 研 究 [J]. 食 品 科 学,2006,27(8):64-68 18) 王 海 宏, 周 慧 娟, 乔 勇 进, 张 绍 铃, 陈 召 亮, 王 希 英. 桃 贮 藏 保 鲜 技 术 研 究 现 状 与 发 展 趋 势 [J]. 保 鲜 与 加 工,2009,9(2):10-14 19) 王 曙 文, 代 永 刚, 牛 红 红, 南 喜 平. 国 内 外 果 蔬 生 物 保 鲜 技 术 的 研 究 进 展 [J]. 农 产 品 加 工,2008,(12):110-113 20) Roller S.The quest for natural antimicrobials as novel means of food preservation; status report on a European research project [J].International Biodeterioration and Biodegradation,1995,36 (3-4):333 345. 21) Scannell A G,Ross R P,Hill C,et al. An efective lacticin biopreservative in fresh pork sausage [J].J Food Port,2000,63 (3):370-375. 22) 张 福 星, 蒋 炳 生. 生 物 保 鲜 液 膜 对 草 莓 常 温 保 鲜 效 果 的 研 究 [J]. 安 徽 农 业 科 学,2000, 28(5):691-693. 23) 周 静 亚, 徐 忠 传, 马 春 朋. 壳 聚 糖 在 鲜 切 果 蔬 保 鲜 中 的 应 用 [J]. 食 品 研 究 与 开 发. 2009, (10):130-134 24) 李 雯, 邵 远 志, 符 青 苗, 谢 江 辉. 壳 聚 糖 在 香 蕉 果 实 贮 藏 保 鲜 上 的 应 用 效 果 [J]. 天 然 产 物 研 究 与 开 发,2008,20(6):1099-1103 25) 李 凤 梅, 周 庆 新, 李 文 香, 王 成 荣, 吕 建 华. 丁 香 提 取 液 与 壳 聚 糖 复 合 对 草 莓 保 鲜 效 果 的 影 响 [J]. 青 岛 农 业 大 学 学 报,2008,25(4):298-300,306 26) 张 举 印, 饶 景 萍, 董 晓 庆, 田 改 妮. 壳 聚 糖 复 合 涂 膜 对 红 富 士 苹 果 保 鲜 研 究 [J]. 西 北 农 业 学 报,2009,(5):354-358 27) 曾 荣, 李 平, 陈 金 印. 天 然 保 鲜 剂 涂 膜 处 理 对 猕 猴 桃 果 实 活 性 氧 代 谢 的 影 响 [J]. 保 鲜 与 加 工,2005,5(5):29-31

336 28) 万 惠 萍, 叶 淑 红, 陈 丽, 曹 方, 于 榕, 穆 野, 钟 耀 广. 壳 聚 糖 膜 在 黄 瓜 保 鲜 中 的 应 用 [J]. 大 连 工 业 大 学 学 报,2008,27(2):110-112 29) 邓 冬 梅, 孙 宇 飞, 肖 恒 春. 不 同 放 置 方 式 对 壳 聚 糖 常 温 保 鲜 黄 瓜 的 影 响 [J]. 广 西 工 学 院 学 报,2008,19(1):67-70 30) 高 兆 银, 胡 美 姣, 李 敏, 杨 凤 珍. 壳 聚 糖 涂 膜 对 台 农 1 号 丰 亡 果 保 鲜 效 果 研 究 [J]. 中 国 南 方 果 树,2007,36(2):37-39 试 验 负 责 郑 雪 芳 试 验 人 员 张 文 州

337 2011-08-13 承 担 单 位 : 福 建 省 农 科 院 农 业 生 物 资 源 研 究 所 试 验 设 计 : 试 验 项 目 : 平 潭 花 生 4 级 病 株 青 枯 雷 尔 氏 菌 的 分 离 检 测 试 验 人 员 : 张 文 州 郑 雪 芳 林 抗 美 试 验 负 责 : 郑 雪 芳 报 告 日 期 :2011-08-13 计 数 月 份 :2011 年 8 月 研 究 资 格 系 数 (0.5-1.0) 实 验 设 计 系 数 (0.9-1.0 0.9-1.0) 报 告 得 分 总 分 实 验 设 计 实 验 记 载 实 验 分 析 实 验 简 报 实 验 文 章 1-20% 21-40% 41-60% 61-80% 81-100% 1%-5% 设 计 不 足, 实 施 错 误 6%-10% 设 计 不 全, 实 验 无 果 11%-15% 设 计 可 以, 实 施 不 全 16%-20% 设 计 完 整, 分 布 实 施 21%-25% 实 验 不 全, 记 载 无 果 26%-30% 实 验 不 足, 记 载 不 全 31%-35% 独 立 实 验, 记 载 不 全 36%-40% 分 布 实 验, 记 载 完 整 41%-45% 目 的 明 确, 实 验 完 成 46%-50% 实 验 完 整, 记 载 清 晰 51%-55% 实 验 系 统, 结 果 可 信 56%-60% 实 验 创 新, 分 析 清 晰 61%-65% 实 验 创 新, 结 论 清 晰 66%-70% 实 验 完 整, 统 计 清 晰 71%-75% 实 验 系 统, 数 据 可 靠 76%-80% 报 告 完 整, 文 章 雏 形 81%-85% 结 构 合 理, 分 析 有 据 86%-90% 逻 辑 清 晰, 统 计 合 理 91%-95% 图 表 完 整, 写 作 流 畅 96%-100% 文 献 完 整, 发 表 水 平 福 建 省 农 业 科 学 院 农 业 生 物 资 源 研 究 所 农 业 微 生 物 研 究 中 心 电 话 : 0591-87882571, 传 真 : 0591-87882571 fjat.yzxz.com

338 1. 试 验 目 的 青 枯 雷 尔 氏 菌 (Ralstonia solanacearum), 属 于 革 兰 氏 阴 性 b 蛋 白 类 细 菌 [1] 雷 尔 氏 菌 引 起 的 植 物 细 菌 性 青 枯 病 害 (Bacterial wilt), 简 称 青 枯 病, 是 一 种 世 界 范 围 的 细 菌 性 土 传 病 害 该 菌 寄 主 广 泛, 能 够 侵 染 热 带 和 温 带 地 区 多 达 450 种 以 上 的 植 物 种 类, 严 重 影 响 了 很 多 重 要 经 济 作 物, 比 如 番 茄 烟 草 花 生 等 的 产 量 [2] 青 枯 病 的 防 治 目 前 还 没 有 有 效 的 化 学 农 药 防 治 且 易 造 成 环 境 污 染 和 残 留 [3] 利 用 无 致 病 力 青 枯 雷 尔 氏 菌 对 茄 科 作 物 进 行 免 疫 接 种, 使 植 株 产 生 类 似 于 动 物 的 免 疫 系 统 以 抵 制 病 害 本 试 验 通 过 分 离 从 平 潭 病 区 采 集 回 来 的 病 株, 检 测 该 病 区 是 否 由 青 枯 病 引 起, 以 便 我 们 更 有 针 对 性 的 防 治 作 物 病 害 的 发 生 2. 试 验 方 法 2.1 试 验 材 料 2.1.1 供 试 植 株 试 验 植 株 为 平 潭 采 集 回 来 的 花 生 病 株 2.1.2 培 养 基 配 制 TTC 培 养 基 :10g 蛋 白 胨,1g 水 解 酪 蛋 白,5g 葡 萄 糖,17g 琼 脂,1000mL 蒸 馏 水,pH 值 调 节 到 约 7.4 左 右, 分 装,121 灭 菌 20min 灭 菌 后 当 冷 却 至 55 左 右 加 入 已 灭 菌 的 1% 的 TTC(2,3,5 氯 化 三 苯 基 四 氮 唑 ) 水 溶 液 其 终 浓 度 为 0.005%, 最 终 ph 值 为 7.2 左 右 2.2 试 验 方 法 2.2.1 溢 菌 实 验 溢 菌 实 验 : 用 无 菌 刀 切 下 发 病 部 位 纵 切 面 切 片 置 于 载 波 片 上, 盖 上 盖 玻 片 从 盖 玻 片 的 一 边 滴 加 无 菌 水, 置 于 水 平 台 面 上 5min, 观 察 是 否 有 菌 脓 溢 出, 以 便 初 步 判 断 该 病 害 是 否 为 细 菌 性 病 害 2.2.2 植 株 目 标 菌 的 分 离 植 株 预 处 理 : 植 株 先 用 清 水 清 洗, 用 报 纸 将 植 株 水 分 吸 干 称 样 及 样 品 处 理 : 称 取 根 部 果 实 各 1 g, 先 用 75 酒 精 消 毒 30s 再 用 10 的 NACLO 消 毒 5min, 然 后 用 无 菌 水 清 洗 3 遍, 再 用 灭 菌 滤 纸 将 样 品 吸 干, 放 至 装 有 10 ml 无 菌 水 的 研 钵, 充 分 研 磨, 即 配 成 10-1 浓 度 ; 10-3 稀 释 样 品 原 液 : 吸 取 1 ml 原 液 至 装 有 9 ml 无 菌 水 的 试 管, 即 配 成 10-2 浓 度, 依 次 稀 释 配 置 成 平 板 涂 布 : 超 净 台 上 无 菌 操 作, 溶 液 在 振 荡 器 上 振 荡 10-20 s, 吸 取 200 μl 至 相 应 标 记 浓 度 的 平 板 上, 溶 液 滴 至 平 板 中 央, 用 涂 布 棒 涂 匀 涂 好 的 平 板 正 放 静 置 一 会, 使 溶 液 渗 透 进 平 板 中 每 个 梯 度 重 复 3 次 ; 培 养 :: 将 涂 好 的 平 板 用 袋 子 装 好 倒 置 于 30 恒 温 箱 中 培 养 60h; 划 线 分 离 纯 化 : 观 察 分 离 培 养 的 菌 落, 将 要 纯 化 的 菌 落 标 上 标 记, 无 菌 操 作 用 接 种 环 直 接 取 平 板 上 要 分 离 纯 化 的 菌 落 至 相 应 标 记 的 平 板 上, 划 线 完 后 放 在 30 温 箱 中 培 养.; 结 果 计 算 : 每 克 土 样 中 微 生 物 的 数 量 = 同 一 稀 释 度 的 3 个 平 板 上 菌 落 平 均 数 稀 释 倍 数 / 含 菌 样 品 2.2.3 疑 似 青 枯 雷 尔 氏 菌 的 分 子 检 测 挑 取 2 环 纯 化 好 的 疑 似 青 枯 雷 尔 氏 菌 于 1.5ml 离 心 管 中, 加 入 200μl 无 菌 水, 水 浴 10min,8000r 离 心 1min, 吸 取 上 清 液 于 -20 保 存 把 纯 化 保 存 的 似 青 枯 雷 尔 氏 菌 落 形 态 的 单 菌 落 的 DNA 用 特 异 性 引 物 peha#3 和 peha#6 进 行 鉴

339 定, 引 物 序 列 为,pehA#3: 5'-CAG CAG AAC CCG CGC CTG ATC CAG-3' 和 peha#6: 5'-ATC GGA CTT GAT GCG CAG GCC GTT-3' 扩 增 得 到 的 片 断 大 小 为 504bp 25μl 的 反 应 体 系 为 :DNA 模 板 10-20ng, Taq(5U/μl) 0.3μl,10 PCR 缓 冲 液 2.5μl,dNTP(10mM) 0.5μl, 引 物 peha#3 和 peha#6(10μm) 各 1μl 加 无 菌 水 至 25μl 反 应 程 序 : 首 先 96 1min, 然 后 按 96 30s 70 30s 72 1min 程 序 2 个 循 环, 再 按 94 30s 70 30s 72 1min 程 序 33 个 循 环, 最 后 72 下 延 伸 5min 3. 试 验 结 果 3.1 溢 菌 实 验 由 图 1 可 知 花 生 病 株 无 溢 菌 现 象, 表 明 花 生 病 株 可 能 不 是 由 于 细 菌 性 病 害 引 起 的 需 通 过 进 一 步 分 离 以 验 证 该 病 害 是 否 由 青 枯 雷 尔 氏 菌 引 起 图 1 花 生 根 部 溢 菌 实 验 图 由 图 2 植 株 分 离 图 片, 通 过 菌 落 形 态 可 初 步 判 断 该 病 株 无 青 枯 雷 尔 氏 菌 存 在 对 筛 选 出 的 几 株 菌 株 利 用 青 枯 雷 尔 氏 菌 特 异 性 引 起 检 测 均 无 目 标 条 带 出 现, 表 明 花 生 植 株 发 病 不 是 由 青 枯 病 引 起 3.2 部 分 试 验 图 片 图 2 平 潭 花 生 4 级 病 株

340 图 3 花 生 病 株 株 部 分 分 离 图 片 4. 试 验 讨 论 本 试 验 从 采 集 回 来 的 花 生 病 株, 通 过 溢 菌 试 验 可 初 步 判 断 该 病 害 不 是 细 菌 性 病 害, 即 不 是 青 枯 病 引 起 的 发 病 现 象 通 过 对 植 株 各 部 位 的 分 离, 通 过 形 态 和 分 子 手 段 进 行 验 证 表 明 花 生 病 株 无 青 枯 雷 尔 氏 菌 存 在, 这 对 我 们 进 一 步 防 治 该 地 区 花 生 病 害 具 有 重 要 的 指 导 意 义 根 据 试 验 结 果 可 以 判 断 平 潭 花 生 病 株 不 是 青 枯 病, 可 能 由 于 枯 萎 病 或 其 他 真 菌 性 病 害 引 起 的, 这 将 更 有 利 于 我 们 有 效 防 病 害 的 发 生

341 5.. 参 考 文 献 [1] Hayward, A.C. 1994. The hosts of Pseudomonas solanacearum. In Bacterial Wilt: the disease and its Causative Agent, Pseudomonas solanacearum. Hayward, A.C., and Hartman, G.L.(eds).Walingford: CAB International, pp. 9-25. [2] M.Gillings, P.Fahy&C.Davies.Pestriction analysis of an amplified polygalacturonase gene fragment differentiates strains of Microbiology.1993,17,44-48. the phytopathogenic bacterium Pseudomonas solanacearum.letters in Applied [3] 何 学 友. 我 国 林 木 青 枯 病 研 究 概 况 [J]. 森 林 病 虫 通 讯,1997 (1):43-46. [2]Opina N L,Valdez R B,Opina O S.Effect of rice-tomato cropping patterns and flooding on the survival of Pseudomonas solanacearum E.F.Smith[J]. Philippine-Phytopathology.1994,30(2):93~99. [4] 姚 革, 张 帆, 李 舟. 土 壤 添 加 剂 防 治 细 菌 性 青 枯 病 初 报. 生 物 防 治 通 报,1994,10(3):106~109. [5] 随 学 超, 卜 崇 兴, 郭 世 荣, 等. 基 质 中 添 加 有 机 缓 释 肥 对 番 茄 青 枯 病 防 效 的 影 响. 江 苏 农 业 科 学,2007 (4):85-88. [6] 黄 乃 秀. 几 种 不 同 抗 菌 素 对 培 养 桉 树 青 枯 病 菌 的 影 响 [J]. 广 西 林 业 科 学,1998,27(1):25-17. [7] 陈 勇, 唐 春 生, 刘 爱 中, 等. 4 种 药 剂 对 烟 草 青 枯 病 的 防 治 效 果 研 究 [J]. 湖 南 农 业 科 学,2008,(4):93~95. [8] 尹 贤 贵, 张 赟, 潘 光 辉, 等. 番 茄 抗 青 枯 病 材 料 筛 选 [J]. 长 江 蔬 菜,2004(1):42-44. [9] 杨 宇 红, 刘 俊 平, 等. 植 物 保 护 学 报 [J],2008,38(5):433-437 [10] 杨 威, 刘 苏 闵, 等. 中 国 生 物 防 治 [J],2010,26( 增 刊 )90-94 [11] 吕 建 林, 刘 二 明, 等. 中 国 生 物 防 治 [J],2010,26(2)200-205 [12] 祝 明 亮, 夏 振 远, 等. 中 国 烟 草 学 报 [J],2004, 10(1)25-27 试 验 负 责 郑 雪 芳 试 验 人 员 张 文 州 郑 雪 芳 林 抗 美

342 2011-08-13 承 担 单 位 : 福 建 省 农 科 院 农 业 生 物 资 源 研 究 所 试 验 设 计 : 试 验 项 目 : 莆 田 辣 椒 4 级 病 株 青 枯 雷 尔 氏 菌 的 分 离 检 测 试 验 人 员 : 张 文 州 郑 雪 芳 林 抗 美 试 验 负 责 : 郑 雪 芳 报 告 日 期 :2011-08-13 计 数 月 份 :2011 年 8 月 研 究 资 格 系 数 (0.5-1.0) 实 验 设 计 系 数 (0.9-1.0 0.9-1.0) 报 告 得 分 总 分 实 验 设 计 实 验 记 载 实 验 分 析 实 验 简 报 实 验 文 章 1-20% 21-40% 41-60% 61-80% 81-100% 1%-5% 设 计 不 足, 实 施 错 误 6%-10% 设 计 不 全, 实 验 无 果 11%-15% 设 计 可 以, 实 施 不 全 16%-20% 设 计 完 整, 分 布 实 施 21%-25% 实 验 不 全, 记 载 无 果 26%-30% 实 验 不 足, 记 载 不 全 31%-35% 独 立 实 验, 记 载 不 全 36%-40% 分 布 实 验, 记 载 完 整 41%-45% 目 的 明 确, 实 验 完 成 46%-50% 实 验 完 整, 记 载 清 晰 51%-55% 实 验 系 统, 结 果 可 信 56%-60% 实 验 创 新, 分 析 清 晰 61%-65% 实 验 创 新, 结 论 清 晰 66%-70% 实 验 完 整, 统 计 清 晰 71%-75% 实 验 系 统, 数 据 可 靠 76%-80% 报 告 完 整, 文 章 雏 形 81%-85% 结 构 合 理, 分 析 有 据 86%-90% 逻 辑 清 晰, 统 计 合 理 91%-95% 图 表 完 整, 写 作 流 畅 96%-100% 文 献 完 整, 发 表 水 平 福 建 省 农 业 科 学 院 农 业 生 物 资 源 研 究 所 农 业 微 生 物 研 究 中 心 电 话 : 0591-87882571, 传 真 : 0591-87882571 fjat.yzxz.com

343 1. 试 验 目 的 青 枯 雷 尔 氏 菌 (Ralstonia solanacearum), 属 于 革 兰 氏 阴 性 b 蛋 白 类 细 菌 [1] 雷 尔 氏 菌 引 起 的 植 物 细 菌 性 青 枯 病 害 (Bacterial wilt), 简 称 青 枯 病, 是 一 种 世 界 范 围 的 细 菌 性 土 传 病 害 该 菌 寄 主 广 泛, 能 够 侵 染 热 带 和 温 带 地 区 多 达 450 种 以 上 的 植 物 种 类, 严 重 影 响 了 很 多 重 要 经 济 作 物, 比 如 番 茄 烟 草 辣 椒 等 的 产 量 [2] 青 枯 病 的 防 治 目 前 还 没 有 有 效 的 化 学 农 药 防 治 且 易 造 成 环 境 污 染 和 残 留 [3] 无 致 病 力 青 枯 雷 尔 氏 菌 对 茄 科 作 物 进 行 免 疫 接 种, 使 植 株 产 生 类 似 于 动 物 的 免 疫 系 统 以 抵 制 病 害 本 试 验 通 过 分 离 从 莆 田 病 区 采 集 回 来 的 病 株, 检 测 该 病 区 是 否 由 青 枯 病 引 起, 以 便 我 们 更 有 针 对 性 的 防 治 作 物 病 害 的 发 生 2. 试 验 方 法 2.1 试 验 材 料 2.1.1 供 试 植 株 试 验 植 株 为 莆 田 采 集 回 来 的 辣 椒 病 株 2.1.2 培 养 基 配 制 TTC 培 养 基 :10g 蛋 白 胨,1g 水 解 酪 蛋 白,5g 葡 萄 糖,17g 琼 脂,1000mL 蒸 馏 水,pH 值 调 节 到 约 7.4 左 右, 分 装,121 灭 菌 20min 灭 菌 后 当 冷 却 至 55 左 右 加 入 已 灭 菌 的 1% 的 TTC(2,3,5 氯 化 三 苯 基 四 氮 唑 ) 水 溶 液 其 终 浓 度 为 0.005%, 最 终 ph 值 为 7.2 左 右 2.2 试 验 方 法 2.2.1 溢 菌 实 验 溢 菌 实 验 : 用 无 菌 刀 切 下 发 病 部 位 纵 切 面 切 片 置 于 载 波 片 上, 盖 上 盖 玻 片 从 盖 玻 片 的 一 边 滴 加 无 菌 水, 置 于 水 平 台 面 上 5min, 观 察 是 否 有 菌 脓 溢 出, 以 便 初 步 判 断 该 病 害 是 否 为 细 菌 性 病 害 2.2.2 植 株 目 标 菌 的 分 离 植 株 预 处 理 : 植 株 先 用 清 水 清 洗, 用 报 纸 将 植 株 水 分 吸 干 称 样 及 样 品 处 理 : 称 取 根 茎 基 部 茎 中 部 茎 顶 部 叶 各 1 g, 先 用 75 酒 精 消 毒 30s 再 用 10 的 NACLO 消 毒 5min, 然 后 用 无 菌 水 清 洗 3 遍, 再 用 灭 菌 滤 纸 将 样 品 吸 干, 放 至 装 有 10 ml 无 菌 水 的 研 钵, 充 分 研 磨, 即 配 成 10-1 浓 度 ; 稀 释 样 品 原 液 : 吸 取 1 ml 原 液 至 装 有 9 ml 无 菌 水 的 试 管, 即 配 成 10-2 浓 度, 依 次 稀 释 配 置 成 10-3 平 板 涂 布 : 超 净 台 上 无 菌 操 作, 溶 液 在 振 荡 器 上 振 荡 10-20 s, 吸 取 200 μl 至 相 应 标 记 浓 度 的 平 板 上, 溶 液 滴 至 平 板 中 央, 用 涂 布 棒 涂 匀 涂 好 的 平 板 正 放 静 置 一 会, 使 溶 液 渗 透 进 平 板 中 每 个 梯 度 重 复 3 次 ; 培 养 :: 将 涂 好 的 平 板 用 袋 子 装 好 倒 置 于 30 恒 温 箱 中 培 养 60h; 划 线 分 离 纯 化 : 观 察 分 离 培 养 的 菌 落, 将 要 纯 化 的 菌 落 标 上 标 记, 无 菌 操 作 用 接 种 环 直 接 取 平 板 上 要 分 离 纯 化 的 菌 落 至 相 应 标 记 的 平 板 上, 划 线 完 后 放 在 30 温 箱 中 培 养.; 结 果 计 算 : 每 克 土 样 中 微 生 物 的 数 量 = 同 一 稀 释 度 的 3 个 平 板 上 菌 落 平 均 数 稀 释 倍 数 / 含 菌 样 品 2.2.3 疑 似 青 枯 雷 尔 氏 菌 的 分 子 检 测 挑 取 2 环 纯 化 好 的 疑 似 青 枯 雷 尔 氏 菌 于 1.5ml 离 心 管 中, 加 入 200μl 无 菌 水, 水 浴 10min,8000r 离 心 1min, 吸 取 上 清 液 于 -20 保 存 把 纯 化 保 存 的 似 青 枯 雷 尔 氏 菌 落 形 态 的 单 菌 落 的 DNA 用 特 异 性 引 物 peha#3 和 peha#6 进 行 鉴 定, 引 物 序 列 为,pehA#3: 5'-CAG CAG AAC CCG CGC CTG ATC CAG-3' 和 peha#6: 5'-ATC GGA CTT 利 用

344 GAT GCG CAG GCC GTT-3' 扩 增 得 到 的 片 断 大 小 为 504bp 25μl 的 反 应 体 系 为 :DNA 模 板 10-20ng, Taq(5U/μl) 0.3μl,10 PCR 缓 冲 液 2.5μl,dNTP(10mM) 0.5μl, 引 物 peha#3 和 peha#6(10μm) 各 1μl 加 无 菌 水 至 25μl 反 应 程 序 : 首 先 96 1min, 然 后 按 96 30s 70 30s 72 1min 程 序 2 个 循 环, 再 按 94 30s 70 30s 72 1min 程 序 33 个 循 环, 最 后 72 下 延 伸 5min 3. 试 验 结 果 3.1 溢 菌 实 验 由 图 1 可 知 辣 椒 病 株 无 溢 菌 现 象, 表 明 辣 椒 病 株 可 能 不 是 由 于 细 菌 性 病 害 引 起 的 需 通 过 进 一 步 分 离 以 验 证 该 病 害 是 否 由 青 枯 雷 尔 氏 菌 引 起 图 1 辣 椒 根 部 溢 菌 实 验 图 3.2 疑 似 青 枯 雷 尔 氏 菌 检 测 由 图 2 植 株 分 离 图 片, 通 过 菌 落 形 态 可 初 步 判 断 该 病 株 无 青 枯 雷 尔 氏 菌 存 在 对 筛 选 出 的 几 株 菌 株 利 用 青 枯 雷 尔 氏 菌 特 异 性 引 起 检 测 均 无 目 标 条 带 出 现, 表 明 辣 椒 植 株 发 病 不 是 由 青 枯 病 引 起 图 2 疑 似 青 枯 雷 尔 氏 菌 检 测 (6,7 泳 道 为 + 对 照 ) 3.3 部 分 试 验 图 片

345 图 3 辣 椒 病 株 株 部 分 分 离 图 片 4. 试 验 讨 论 本 试 验 从 采 集 回 来 的 辣 椒 病 株, 通 过 溢 菌 试 验 可 初 步 判 断 该 病 害 不 是 细 菌 性 病 害, 即 不 是 青 枯 病 引 起 的 发 病 现 象 通 过 对 植 株 各 部 位 的 分 离, 通 过 形 态 和 分 子 手 段 进 行 验 证 表 明 辣 椒 病 株 无 青 枯 雷 尔 氏 菌 存 在, 这 对 我 们 进 一 步 防 治 该 地 区 辣 椒 病 害 具 有 重 要 的 指 导 意 义 根 据 试 验 结 果 可 以 判 断 平 潭 辣 椒 病 株 不 是 青 枯 病, 可 能 由 于 枯 萎 病 或 其 他 真 菌 性 病 害 引 起 的, 这 将 更 有 利 于 我 们 有 效 防 病 害 的 发 生

346 5.. 参 考 文 献 [1] Hayward, A.C. 1994. The hosts of Pseudomonas solanacearum. In Bacterial Wilt: the disease and its Causative Agent, Pseudomonas solanacearum. Hayward, A.C., and Hartman, G.L.(eds).Walingford: CAB International, pp. 9-25. [2] M.Gillings, P.Fahy&C.Davies.Pestriction analysis of an amplified polygalacturonase gene fragment differentiates strains of Microbiology.1993,17,44-48. the phytopathogenic bacterium Pseudomonas solanacearum.letters in Applied [3] 何 学 友. 我 国 林 木 青 枯 病 研 究 概 况 [J]. 森 林 病 虫 通 讯,1997 (1):43-46. [2]Opina N L,Valdez R B,Opina O S.Effect of rice-tomato cropping patterns and flooding on the survival of Pseudomonas solanacearum E.F.Smith[J]. Philippine-Phytopathology.1994,30(2):93~99. [4] 姚 革, 张 帆, 李 舟. 土 壤 添 加 剂 防 治 细 菌 性 青 枯 病 初 报. 生 物 防 治 通 报,1994,10(3):106~109. [5] 随 学 超, 卜 崇 兴, 郭 世 荣, 等. 基 质 中 添 加 有 机 缓 释 肥 对 番 茄 青 枯 病 防 效 的 影 响. 江 苏 农 业 科 学,2007 (4):85-88. [6] 黄 乃 秀. 几 种 不 同 抗 菌 素 对 培 养 桉 树 青 枯 病 菌 的 影 响 [J]. 广 西 林 业 科 学,1998,27(1):25-17. [7] 陈 勇, 唐 春 生, 刘 爱 中, 等. 4 种 药 剂 对 烟 草 青 枯 病 的 防 治 效 果 研 究 [J]. 湖 南 农 业 科 学,2008,(4):93~95. [8] 尹 贤 贵, 张 赟, 潘 光 辉, 等. 番 茄 抗 青 枯 病 材 料 筛 选 [J]. 长 江 蔬 菜,2004(1):42-44. [9] 杨 宇 红, 刘 俊 平, 等. 植 物 保 护 学 报 [J],2008,38(5):433-437 [10] 杨 威, 刘 苏 闵, 等. 中 国 生 物 防 治 [J],2010,26( 增 刊 )90-94 [11] 吕 建 林, 刘 二 明, 等. 中 国 生 物 防 治 [J],2010,26(2)200-205 [12] 祝 明 亮, 夏 振 远, 等. 中 国 烟 草 学 报 [J],2004, 10(1)25-27 试 验 负 责 郑 雪 芳 试 验 人 员 张 文 州 郑 雪 芳 林 抗 美

347 编 号 : 农 业 微 生 物 研 究 中 心 [ 菌 种 -110802], 共 7 页 承 担 单 位 : 福 建 省 农 科 院 农 业 生 物 资 源 研 究 所 试 验 设 计 : 刘 国 红 试 验 项 目 : 土 壤 芽 胞 杆 菌 的 分 离 纯 化 及 保 种 (14132-14199) 试 验 人 员 : 田 潇 娜 试 验 负 责 : 林 营 志 报 告 日 期 :2011-08-02 计 数 月 份 :2011 年 07 月 研 究 资 格 系 数 (0.5-1.0) 实 验 设 计 系 数 (0.9-1.0 0.9-1.0) 报 告 得 分 总 分 实 验 设 计 实 验 记 载 实 验 分 析 实 验 简 报 实 验 文 章 1-20% 21-40% 41-60% 61-80% 81-100% 1%-5% 设 计 不 足, 实 施 错 误 6%-10% 设 计 不 全, 实 验 无 果 11%-15% 设 计 可 以, 实 施 不 全 16%-20% 设 计 完 整, 分 布 实 施 21%-25% 实 验 不 全, 记 载 无 果 26%-30% 实 验 不 足, 记 载 不 全 31%-35% 独 立 实 验, 记 载 不 全 36%-40% 分 布 实 验, 记 载 完 整 41%-45% 目 的 明 确, 实 验 完 成 46%-50% 实 验 完 整, 记 载 清 晰 51%-55% 实 验 系 统, 结 果 可 信 56%-60% 实 验 创 新, 分 析 清 晰 61%-65% 实 验 创 新, 结 论 清 晰 66%-70% 实 验 完 整, 统 计 清 晰 71%-75% 实 验 系 统, 数 据 可 靠 76%-80% 报 告 完 整, 文 章 雏 形 81%-85% 结 构 合 理, 分 析 有 据 86%-90% 逻 辑 清 晰, 统 计 合 理 91%-95% 图 表 完 整, 写 作 流 畅 96%-100% 文 献 完 整, 发 表 水 平 福 建 省 农 业 科 学 院 农 业 生 物 资 源 研 究 所 农 业 微 生 物 研 究 中 心 电 话 :0591-87882571, 传 真 :0591-87882571 fjat.yzxz.com

348 1. 试 验 目 的 目 前 在 各 种 农 作 物 及 果 树 等 经 济 作 物 中 发 现 的 植 物 内 生 细 菌 已 超 过 745 种 ( 隶 属 于 9 个 属 ), 这 些 内 生 细 菌 大 多 为 土 壤 微 生 物 种 类 [1] 其 中 芽 胞 杆 菌 (Bacillaceae), 包 括 芽 胞 杆 菌 属 芽 胞 乳 杆 菌 属 梭 菌 属 脱 硫 肠 状 菌 属 和 芽 胞 八 叠 球 菌 属 等, 它 们 繁 殖 快 速, 生 命 力 强, 耐 强 酸 耐 强 碱 抗 菌 消 毒 耐 高 氧 ( 嗜 氧 繁 殖 ) 耐 低 氧 ( 厌 氧 繁 殖 ), 为 土 壤 微 生 物 的 主 要 类 群, 由 于 芽 胞 杆 菌 具 有 重 要 的 生 态 和 生 理 作 用, 研 究 它 就 有 重 要 的 意 义 为 了 分 离 得 到 新 的 芽 胞 杆 菌, 本 实 验 对 辽 宁 和 江 苏 省 某 些 地 区 的 土 壤 标 本 进 行 了 分 离, 采 用 稀 释 平 板 法 从 土 壤 中 分 离 芽 胞 杆 菌 并 进 行 了 纯 化, 统 计 了 几 种 不 同 土 壤 中 各 种 芽 胞 杆 菌 2. 试 验 方 法 2.1 材 料 表 1 采 集 土 样 的 信 息 编 号 采 集 地 点 生 境 类 型 2983 辽 宁 沈 阳 天 柱 山 草 地 2984 辽 宁 沈 阳 天 柱 山 草 地 2985 辽 宁 沈 阳 天 柱 山 草 地 2971 江 苏 浙 江 草 地 2.2 培 养 基 牛 肉 膏 蛋 白 胨 培 养 基 (NA): 牛 肉 膏 3 g NaCl 5 g 蛋 白 胨 10 g 琼 脂 15-20 g 水 1000 ml ph7.2-7.5 2.3 仪 器 试 管 锥 形 瓶 150 ml, 移 液 枪, 涂 布 棒, 培 养 皿, 振 荡 器, 培 养 箱 2.4 试 验 方 法 2.4.1 土 样 处 理 取 五 种 土 样, 加 入 编 号 的 锥 形 瓶 内 (150 ml), 瓶 内 装 有 90 ml 无 菌 水, 加 土 样 各 10 g 震 荡 20 min( 摇 床 ) 后 水 浴 10 min(80 ) 10-15 min 均 可, 中 间 震 荡 2-3 次 2.4.2 土 壤 原 液 的 配 置 吸 取 1 ml 原 液 至 装 有 9 ml 无 菌 水 的 试 管, 即 配 成 10-2 浓 度, 依 次 稀 释 配 置 成 10-3,10-4 ; 2.4.3 平 板 涂 布 超 净 台 上 无 菌 操 作, 每 个 梯 度 重 复 2 次 ; 涂 布 梯 度 为 10-3 10-4 2.4.4 培 养 用 袋 子 装 好,30 恒 温 箱 培 养 1-2 d 2.5 计 数 统 计 平 板 上 的 菌 落 数, 描 述 菌 落 形 态 大 小 等, 算 出 每 一 稀 释 度 菌 落 的 平 均 数 菌 落 数 计 算 公 式 : 每 克 土 样 中 微 生 物 的 数 量 = 同 一 稀 释 度 的 菌 落 平 均 数 稀 释 倍 数 / 含 菌 样 品 克 数 2.6 纯 化 菌 株 用 平 板 划 线 法, 用 接 种 环 在 NA 平 板 上 挑 取 单 菌 落 在 新 的 平 板 上 划 线, 划 线 后 盖 上 培 养 皿 盖, 倒 置 温 室 培 养, 培 养 后 重 复 多 次 直 到 认 为 菌 落 完 全 被 纯 化 2.7 菌 种 保 藏

349 对 纯 化 菌 种 编 号 后 拍 照, 保 种 3. 试 验 结 果 从 芽 孢 杆 菌 中 分 离 的 菌 株 的 形 态 特 征 描 述 和 数 量 及 照 片 见 表 2 和 纯 化 菌 落 图 表 2 从 土 样 标 本 中 分 离 的 芽 胞 杆 菌 形 态 描 述 编 号 及 数 量 菌 株 编 号 大 小 表 面 颜 色 14351 小 光 滑 14352 小 光 滑 14353 小 光 滑 14354 小 光 滑 淡 黄 色, 四 周 包 色 白 色, 四 周 透 明 中 间 灰 白, 四 周 透 明 淡 黄, 中 间 半 透 明 干 湿 形 状 高 度 边 缘 菌 落 数 ( 10 2 cfu/g 湿 圆 形 扁 平 不 整 齐 90 湿 圆 形 扁 平 不 整 齐 70 湿 圆 形 隆 起 整 齐 300 湿 圆 形 中 凹 整 齐 20 14355 小 光 滑 灰 色 湿 圆 形 扁 平 整 齐 200 14356 小 粗 糙 白 色 湿 圆 形 中 凸 不 整 齐 550 14357 小 光 滑 灰 色 湿 圆 形 扁 平 整 齐 200 14358 小 光 滑 透 明 湿 不 规 则 裂 叶 状 不 整 齐 100 14359 小 光 滑 灰 色, 有 透 明 圈 湿 圆 形 扁 平 整 齐 200 14360 大 粗 糙 白 色 湿 圆 形 扁 平 不 整 齐 200 14361 大 光 滑 灰 白 湿 圆 形 隆 起 整 齐 20 14362 小 不 光 滑 灰 色, 有 透 明 圈 湿 圆 形 扁 平 不 整 齐 100 14363 小 光 滑 淡 黄 湿 圆 形 扁 平 整 齐 600 14364 小 粗 糙 淡 黄 湿 圆 形 褶 皱 不 整 齐 100 14365 小 粗 糙 透 明 湿 不 规 则 点 状 不 整 齐 290 14366 大 粗 糙 灰 白 湿 圆 形 扁 平 不 整 齐 700 14367 大 粗 糙 灰 色 湿 圆 形 褶 皱 整 齐 10 14368 大 粗 糙 白 色 湿 圆 形 扁 平 不 整 齐 30 14369 大 粗 糙 灰 白 湿 圆 形 隆 起 整 齐 100 14370 小 粗 糙 灰 白 湿 圆 形 隆 起 不 整 齐 1000 14371 小 光 滑 透 明 湿 圆 形 隆 起 整 齐 800 14372 大 粗 糙 白 色 干 丝 状 扁 平 不 整 齐 110 14373 大 粗 糙 白 色 湿 圆 形 褶 皱 不 整 齐 20 14374 大 粗 糙 灰 白 湿 圆 形 隆 起 整 齐 10 14375 小 光 滑 灰 色, 四 周 透 明 湿 圆 形 扁 平 整 齐 200 14376 大 粗 糙 灰 色 湿 不 规 则 裂 叶 状 不 整 齐 100 14377 小 光 滑 白 色 湿 圆 形 扁 平 整 齐 170

350 图 1 FJAT- 土 样 4322( 正 面 ) 图 2 FJAT- 土 样 4322( 反 面 ) 图 3 FJAT- 土 样 4320( 正 面 ) 图 4 FJAT- 土 样 4320( 反 面 ) 图 5 FJAT- 土 样 4224( 正 面 ) 图 6 FJAT- 土 样 4224( 反 面 ) 图 7 FJAT- 土 样 4224( 正 面 ) 图 8 FJAT- 土 样 4224( 反 面 ) 图 9 FJAT- 土 样 4230( 正 面 ) 图 10 FJAT- 土 样 4230( 反 面 ) 图 11FJAT- 土 样 4243( 正 面 ) 图 12 FJAT- 土 样 4243( 反 面 ) 图 为 土 壤 中 分 离 的 菌 落 形 态

351 图 13 菌 株 14365( 正 面 ) 图 14 菌 株 14365( 反 面 ) 图 15 菌 株 14356( 正 面 ) 图 16 菌 株 14356( 反 面 ) 图 17 菌 株 14377( 正 面 ) 图 18 菌 株 14377( 反 面 ) 图 19 菌 株 14362( 正 面 ) 图 20 菌 株 14362( 反 面 ) 图 21 菌 株 14351( 正 面 ) 图 22 菌 株 14351( 反 面 ) 图 23 菌 株 14361( 正 面 ) 图 24 菌 株 14361( 反 面 )

352 图 25 菌 株 14374( 正 面 ) 图 26 菌 株 14374( 反 面 ) 图 27 菌 株 14363( 正 面 ) 图 28 菌 株 14363( 反 面 ) 图 29 菌 株 14369( 正 面 ) 图 30 菌 株 14369( 反 面 ) 图 31 菌 株 14366( 正 面 ) 图 32 菌 株 14366( 反 面 ) 图 33 菌 株 14367( 正 面 ) 图 34 菌 株 14367( 反 面 ) 图 35 菌 株 14370( 正 面 ) 图 36 菌 株 14370( 反 面 ) 图 为 纯 化 的 菌 落 形 态

353 4. 试 验 讨 论 1. 土 壤 中 有 些 芽 胞 杆 菌 在 各 土 样 中 普 遍 存 在, 但 在 各 土 样 中 的 种 类 和 含 量 很 有 差 异, 可 能 是 由 于 生 境 不 同 造 成 的 2. 通 过 形 态 可 见 某 些 芽 胞 杆 菌 的 生 长 速 率 和 状 态 等 与 其 他 相 比 差 异 比 较 大 5. 参 考 文 献 [1] 宋 培 勇, 李 凤 华, 马 莉 莉. 珙 桐 内 生 细 菌 的 分 离 鉴 定 及 系 统 发 育 分 析 [J]. 微 生 物 学 通 报, (MicrobiologyChina), 2011, 38(1):8 13. 试 验 负 责 刘 国 红 试 验 人 员 田 潇 娜

354 编 号 : 农 业 微 生 物 研 究 中 心 [ 菌 种 -110806], 共 4 页 承 担 单 位 : 福 建 省 农 科 院 农 业 生 物 资 源 研 究 所 试 验 设 计 : 刘 国 红 试 验 项 目 : 土 壤 中 芽 胞 杆 菌 的 脂 肪 酸 测 定 试 验 人 员 : 田 潇 娜 试 验 负 责 : 林 营 志 报 告 日 期 :2011-08-06 计 数 月 份 :2011 年 07 月 研 究 资 格 系 数 (0.5-1.0) 实 验 设 计 系 数 (0.9-1.0 0.9-1.0) 报 告 得 分 总 分 实 验 设 计 实 验 记 载 实 验 分 析 实 验 简 报 实 验 文 章 1-20% 21-40% 41-60% 61-80% 81-100% 1%-5% 设 计 不 足, 实 施 错 误 6%-10% 设 计 不 全, 实 验 无 果 11%-15% 设 计 可 以, 实 施 不 全 16%-20% 设 计 完 整, 分 布 实 施 21%-25% 实 验 不 全, 记 载 无 果 26%-30% 实 验 不 足, 记 载 不 全 31%-35% 独 立 实 验, 记 载 不 全 36%-40% 分 布 实 验, 记 载 完 整 41%-45% 目 的 明 确, 实 验 完 成 46%-50% 实 验 完 整, 记 载 清 晰 51%-55% 实 验 系 统, 结 果 可 信 56%-60% 实 验 创 新, 分 析 清 晰 61%-65% 实 验 创 新, 结 论 清 晰 66%-70% 实 验 完 整, 统 计 清 晰 71%-75% 实 验 系 统, 数 据 可 靠 76%-80% 报 告 完 整, 文 章 雏 形 81%-85% 结 构 合 理, 分 析 有 据 86%-90% 逻 辑 清 晰, 统 计 合 理 91%-95% 图 表 完 整, 写 作 流 畅 96%-100% 文 献 完 整, 发 表 水 平 福 建 省 农 业 科 学 院 农 业 生 物 资 源 研 究 所 农 业 微 生 物 研 究 中 心 电 话 :0591-87882571, 传 真 :0591-87882571 fjat.yzxz.com

355 1. 试 验 目 的 脂 肪 酸 是 生 物 体 内 一 种 重 要 的 生 物 大 分 子, 它 不 仅 是 生 物 体 的 基 本 结 构 成 分, 还 具 有 重 要 的 生 理 作 用 [1], 藻 类 真 菌 和 细 菌 中 多 不 饱 和 脂 肪 酸 含 量 丰 富, 是 因 为 微 生 物 中 具 有 一 系 列 脱 氢 酶 和 延 长 酶 等 活 性 物 质, 能 够 从 头 合 成 多 不 饱 和 脂 肪 酸, 也 就 是 说 不 同 的 生 物 由 于 自 身 生 理 功 能 等 的 不 同 会 产 生 不 同 的 脂 肪 酸, 因 此 通 过 鉴 定 脂 肪 酸 来 鉴 定 生 物 种 类, 无 疑 成 为 一 种 很 有 效 的 分 类 途 径 尤 其 通 过 脂 肪 酸 鉴 定 芽 胞 杆 菌 更 是 一 种 很 有 效 的 方 法 本 实 验 就 是 通 过 提 取 脂 肪 酸, 通 过 气 相 色 谱 检 测 系 统 来 鉴 定 芽 胞 杆 菌 2. 试 验 方 法 2.1 检 测 仪 器 全 自 动 微 生 物 检 测 系 统 (sherlockmidi) 2.2 脂 肪 酸 提 取 前 试 剂 处 理 试 剂 I:NaOH45 g+ 甲 醇 150 ml+ 去 离 子 水 150 ml, 水 和 甲 醇 混 合 后 再 加 入 NaOH, 同 时 搅 拌 至 完 全 溶 解 试 剂 II:6.00 N 盐 酸 325 ml+ 甲 醇 275 ml, 把 盐 酸 加 入 到 甲 醇 中, 并 不 断 搅 拌 试 剂 III: 正 己 烷 200 ml+mtbe 200 ml, 把 MTBE 加 入 到 正 己 烷 中, 并 不 断 搅 拌 试 剂 IV:NaOH 10.8 g + 去 离 子 蒸 馏 水 900 ml 2.3 提 取 步 骤 2.3.1 菌 株 的 培 养 将 菌 株 接 种 到 TSB 平 板 上, 置 于 30 培 养 箱 中 培 养 24 h 2.3.2 获 菌 用 接 种 环 挑 取 20 mg 芽 胞 杆 菌 置 于 耐 酸 耐 碱 管 底 部 2.3.3 皂 化 ( 强 烈 的 甲 醇 随 着 加 热 杀 菌 及 溶 解 细 菌 ) 在 装 有 菌 体 的 管 中 加 入 1.0 ml 的 [ 试 剂 I], 锁 紧 盖 子, 震 荡 试 管 5-10 min; 放 入 95-100 的 沸 水 中 水 浴 5 min; 从 沸 水 中 移 开 试 管 并 轻 微 的 冷 却 不 要 打 开 盖 子 ; 震 荡 每 支 试 管 5-10 min; 再 水 浴 25 min; 移 开 和 放 置 试 管 架 室 温 冷 却 2.3.4 甲 基 化 ( 甲 基 化 转 换 脂 肪 酸 成 甲 基 脂 脂 肪 酸 以 增 加 脂 肪 酸 的 挥 发 性 以 供 GC 分 析 ) 加 入 2.0 ml[ 试 剂 II]; 栓 紧 盖 子 震 荡 5-10 min; 水 浴 加 热 试 管 80 10 min; 移 开 且 快 速 用 龙 头 水 冷 却 至 室 温 2.3.5 萃 取 ( 甲 基 脂 脂 肪 酸 移 出 从 酸 性 水 相 转 移 到 一 个 有 机 相 液 相 的 萃 取 过 程 ) 加 入 1.25 ml[ 试 剂 III] 萃 取 溶 剂 在 每 个 试 管 中 ; 盖 紧 盖 子, 放 此 批 的 试 管 在 一 个 旋 转 器 温 和 混 合 旋 转 10 min; 打 开 管 盖, 利 用 干 净 的 移 液 管 取 出 每 个 样 本 的 下 层 似 水 部 位, 弃 去 2.3.6 基 本 洗 涤 ( 从 有 机 相 中 移 去 自 由 的 脂 肪 酸 ) 加 入 3.0 ml[ 试 剂 IV]; 栓 紧 盖 子 和 温 和 震 荡 试 管 旋 转 约 5 min; 打 开 盖 子, 利 用 干 净 的 移 液 管 移 出 约 2/3 体 积 的 上 层 有 机 体 到 干 净 的 GC 检 体 小 瓶 2.4 上 样 脂 肪 酸 检 测 2.5 数 据 库 比 对

356 3. 试 验 结 果 共 测 试 34 株 菌 株, 测 试 结 果 如 下 : 菌 株 编 号 SimIndex 菌 种 名 14134 0.701 Bacillus simplex 14135 0.547 Bacillus pumilus GC subgroup B 14136 0.790 Bacillus megaterium GC subgroup B 14139 0.684 Brevibacillus choshinensis 14142 0.252 Bacillus alcalophilus 14143 0.516 Bacillus cereus GC subgroup B 14144 无 匹 配 14145 0.238 Bacillus cereus 14146 0.529 Bacillus cereus GC subgroup B 14149 0.138 Bacillus GC group 22 14150 0.638 Brevibacillus choshinensis 14151 0.628 Bacillus megaterium GC subgroup B 14152 0.800 Bacillus atrophaeus 14155 0.139 Bacillus GC group 22 14156 0.470 Bacillus lentus 14161 无 匹 配 14162 0.266 Bacillus halmapalus 14164 0.631 Bacillus sphaericus GC subgroup E 14166 0.638 Paenibacillus polymyxa (Bacillus) 14169 0.620 Bacillus licheniformis (Bacillus subtilis group) 14175 0.687 Paenibacillus macquariensis 14178 0.691 Bacillus pumilus GC subgroup A 14180 0.753 Bacillus atrophaeus 14181 0.498 Bacillus licheniformis 14182 0.276 Bacillus GC group 22 14183 0.773 Bacillu GC group 22 14188 0.503 Cedecea davisae 14189 0.647 Kurthia gibsonii 14190 0.370 Sporosarcina ureae 14196 0.909 Bacillus sphaericus GC subgroup E 14197 0.704 Cedecea davisae 14198 0.183 Bacillus clausii

357 14199 0.259 Virgibacillus pantothenticus (Bacillus) 4. 试 验 讨 论 1. 通 过 各 项 指 标 可 以 看 出 通 过 这 种 方 法 鉴 定 的 脂 肪 酸 精 确 度 是 很 高 的 2. 检 测 结 果 的 峰 值 显 示 某 些 脂 肪 酸 中 可 能 含 有 杂 质, 应 注 意 确 保 提 取 脂 肪 酸 的 纯 度 5. 参 考 文 献 [1] 刘 梦 坛, 李 超 伦, 孙 松. 脂 肪 酸 对 中 华 哲 水 蚤 摄 食 两 种 海 洋 微 藻 的 指 示 作 用 [J]. 生 态 学 报, 2011, 31(4):0933 0942. 试 验 负 责 刘 国 红 试 验 人 员 田 潇 娜

358 编 号 : 农 业 微 生 物 研 究 中 心 [ 菌 种 -110810], 共 8 页 承 担 单 位 : 福 建 省 农 科 院 农 业 生 物 资 源 研 究 所 试 验 设 计 : 刘 国 红 试 验 项 目 : 土 壤 芽 胞 杆 菌 的 分 离 纯 化 及 保 存 (14378-14423) 试 验 人 员 : 田 潇 娜 试 验 负 责 : 林 营 志 报 告 日 期 :2011-08-10 计 数 月 份 :2011 年 08 月 研 究 资 格 系 数 (0.5-1.0) 实 验 设 计 系 数 (0.9-1.0 0.9-1.0) 报 告 得 分 总 分 实 验 设 计 实 验 记 载 实 验 分 析 实 验 简 报 实 验 文 章 1-20% 21-40% 41-60% 61-80% 81-100% 1%-5% 设 计 不 足, 实 施 错 误 6%-10% 设 计 不 全, 实 验 无 果 11%-15% 设 计 可 以, 实 施 不 全 16%-20% 设 计 完 整, 分 布 实 施 21%-25% 实 验 不 全, 记 载 无 果 26%-30% 实 验 不 足, 记 载 不 全 31%-35% 独 立 实 验, 记 载 不 全 36%-40% 分 布 实 验, 记 载 完 整 41%-45% 目 的 明 确, 实 验 完 成 46%-50% 实 验 完 整, 记 载 清 晰 51%-55% 实 验 系 统, 结 果 可 信 56%-60% 实 验 创 新, 分 析 清 晰 61%-65% 实 验 创 新, 结 论 清 晰 66%-70% 实 验 完 整, 统 计 清 晰 71%-75% 实 验 系 统, 数 据 可 靠 76%-80% 报 告 完 整, 文 章 雏 形 81%-85% 结 构 合 理, 分 析 有 据 86%-90% 逻 辑 清 晰, 统 计 合 理 91%-95% 图 表 完 整, 写 作 流 畅 96%-100% 文 献 完 整, 发 表 水 平 福 建 省 农 业 科 学 院 农 业 生 物 资 源 研 究 所 农 业 微 生 物 研 究 中 心 电 话 :0591-87882571, 传 真 :0591-87882571

359 fjat.yzxz.com 1. 试 验 目 的 芽 胞 杆 菌 是 土 壤 和 植 物 微 生 态 的 优 势 微 生 物 种 群, 是 植 物 病 害 生 防 微 生 物 的 重 要 组 成 部 分, 由 于 其 能 产 生 抗 逆 性 强 的 芽 孢, 对 菌 体 的 生 存 剂 型 加 工 及 其 在 环 境 中 的 存 活 和 定 殖 都 十 分 有 利, 因 [1] 此 它 是 一 种 理 想 的 生 防 微 生 物, 许 多 性 状 优 良 的 拮 抗 菌 株 已 成 功 地 应 用 于 植 物 病 害 生 物 防 治 中, 而 土 壤 又 是 芽 胞 杆 菌 主 要 的 来 源, 因 此, 分 离 筛 选 各 种 不 同 的 芽 胞 杆 菌 为 生 物 农 药 的 开 发 等 提 供 [2] 了 基 础 资 源, 具 有 重 要 意 义 为 了 分 离 得 到 新 的 芽 胞 杆 菌, 本 实 验 对 几 个 不 同 地 区 的 土 壤 标 本 进 行 了 分 离, 采 用 稀 释 平 板 计 数 法 统 计 了 几 种 不 同 土 壤 中 各 种 芽 胞 杆 菌 2. 试 验 方 法 2.1 材 料 表 1 采 集 土 样 的 信 息 编 号 采 集 地 点 生 境 类 型 采 集 时 间 4160 河 北 野 狐 岭 2010-08-28 4161 河 北 张 家 口 草 地 2010-08-29 4157 河 北 野 狐 岭 树 林 2010-08-28 2384 北 京 颐 和 园 2008-08-15 2982 河 北 衡 水 花 地 2.2 培 养 基 牛 肉 膏 蛋 白 胨 培 养 基 (NA): 牛 肉 膏 3 g NaCl 5 g 蛋 白 胨 10 g 琼 脂 15-20 g 水 1000 ml ph7.2-7.5 2.3 仪 器 试 管 锥 形 瓶 150 ml, 移 液 枪, 涂 布 棒, 培 养 皿, 振 荡 器, 培 养 箱 2.4 试 验 方 法 2.4.1 土 样 处 理 取 五 种 土 样, 加 入 编 号 的 锥 形 瓶 内 (150 ml), 瓶 内 装 有 90 ml 无 菌 水, 加 土 样 各 10 g 震 荡 20 min( 摇 床 ) 后 水 浴 10 min(80 ) 10-15 min 均 可, 中 间 震 荡 2-3 次 2.4.2 土 壤 原 液 的 配 置 吸 取 1 ml 原 液 至 装 有 9 ml 无 菌 水 的 试 管, 即 配 成 10-2 浓 度, 依 次 稀 释 配 置 成 10-3,10-4 ; 2.4.3 平 板 涂 布 超 净 台 上 无 菌 操 作, 每 个 梯 度 重 复 2 次 ; 涂 布 梯 度 为 10-3 10-4 2.4.4 培 养 用 袋 子 装 好,30 恒 温 箱 培 养 1-2 d 2.5 计 数 统 计 平 板 上 的 菌 落 数, 描 述 菌 落 形 态 大 小 等, 算 出 每 一 稀 释 度 菌 落 的 平 均 数 菌 落 数 计 算 公 式 : 每 克 土 样 中 微 生 物 的 数 量 = 同 一 稀 释 度 的 菌 落 平 均 数 稀 释 倍 数 / 含 菌 样 品 克 数 2.6 纯 化 菌 株 用 平 板 划 线 法, 用 接 种 环 在 NA 平 板 上 挑 取 单 菌 落 在 新 的 平 板 上 划 线, 划 线 后 盖 上 培 养 皿 盖,

360 倒 置 温 室 培 养, 培 养 后 重 复 多 次 直 到 认 为 菌 落 完 全 被 纯 化 2.7 菌 种 保 藏 对 纯 化 菌 种 编 号 后 拍 照, 保 存 3. 试 验 结 果 从 芽 孢 杆 菌 中 分 离 的 菌 株 的 形 态 特 征 描 述 和 数 量 及 照 片 见 表 2 和 图 表 2 从 土 样 标 本 中 分 离 的 芽 胞 杆 菌 形 态 描 述 编 号 及 数 量 菌 株 编 号 大 小 表 面 颜 色 干 湿 形 状 高 度 边 缘 菌 落 数 ( 10 4 cfu/g) 14378 大 粗 糙 白 色 湿 不 规 则 褶 皱 不 整 齐 9 14379 小 粗 糙 白 色 湿 不 规 则 褶 皱 不 整 齐 9 14380 小 粗 糙 白 色 湿 不 规 则 褶 皱, 有 白 色 圈 不 整 齐 5 14381 小 光 滑 黄 色, 透 明 湿 圆 形 扁 平 不 整 齐 0.2 14382 小 光 滑 白 色 湿 圆 形 扁 平 整 齐 8 14383 小 光 滑 中 间 灰 白, 四 周 透 明 湿 圆 形 扁 平 不 整 齐 3 14384 小 粗 糙 白 色 湿 圆 形 中 间 有 褶 皱 整 齐 5 14385 小 光 滑 灰 色 湿 圆 形 扁 平, 中 间 有 白 圈 整 齐 0.2 14386 小 粗 糙 淡 黄 湿 不 规 则 扁 平 不 整 齐 0.2 14387 小 光 滑 灰 白 湿 圆 形 扁 平 整 齐 6 14388 小 粗 糙 粉 色 湿 不 规 则 褶 皱 不 整 齐 0.2 14389 大 粗 糙 灰 色 湿 不 规 则 白 色 褶 皱 不 整 齐 7 14390 大 粗 糙 灰 白 湿 不 规 则 扁 平 不 整 齐 3 14391 小 光 滑 透 明 湿 不 规 则 有 白 色 褶 皱 不 整 齐 2 14392 小 光 滑 白 色 湿 不 规 则 扁 平 裂 叶 状 0.2 14393 小 光 滑 淡 黄 色, 有 透 明 圈 湿 圆 形 扁 平 整 齐 3 14394 小 光 滑 淡 粉 湿 圆 形 中 凸 整 齐 2 14395 小 光 滑 透 明 湿 圆 形 扁 平 整 齐 0.2 14396 小 光 滑 白 色 湿 不 规 则 扁 平 不 整 齐 0.2 14397 小 光 滑 白 色 湿 圆 形 扁 平 整 齐 2 14398 小 光 滑 灰 色 湿 圆 形 扁 平 整 齐 3 14399 大 粗 糙 白 色 湿 不 规 则 扁 平 不 整 齐 1 14400 大 光 滑 灰 白 湿 不 规 则 扁 平 不 整 齐 3 14401 大 粗 糙 白 色 湿 圆 形 中 凸 不 整 齐 1 14402 小 粗 糙 白 色 湿 圆 形 隆 起 整 齐 7 14403 小 光 滑 淡 黄 湿 不 规 则 扁 平 不 整 齐 1 14404 小 光 滑 白 色 湿 圆 形 中 间 有 波 纹 状 整 齐 6

361 14405 小 光 滑 中 间 淡 黄, 四 周 透 明 湿 圆 形 扁 平 不 整 齐 5 14406 小 光 滑 淡 黄 湿 圆 形 扁 平 整 齐 6 14407 小 光 滑 透 明 湿 圆 形 扁 平 不 整 齐 2 14408 小 光 滑 淡 粉 湿 圆 形 扁 平 整 齐 7 14409 小 光 滑 淡 黄 湿 不 规 则 扁 平 不 整 齐 1 14410 大 光 滑 灰 色 湿 不 规 则 扁 平, 有 白 色 褶 皱 不 整 齐 16 14411 小 光 滑 白 色 湿 圆 形 扁 平, 中 间 白 色, 有 圈 状 凸 不 整 齐 3 起 14412 小 光 滑 灰 白, 有 透 明 圈 湿 圆 形 扁 平 整 齐 10 14413 小 粗 糙 灰 色 湿 圆 形 扁 平, 有 白 色 褶 皱 整 齐 25 14414 小 光 滑 灰 色 湿 圆 形 扁 平, 有 白 色 褶 皱 整 齐 7 14415 大 粗 糙 灰 色 湿 不 规 则 褶 皱 不 整 齐 13 14416 小 光 滑 黄 色 湿 圆 形 中 凸 整 齐 1 14417 小 光 滑 中 间 黄 色, 四 周 透 明 湿 圆 形 中 凸 整 齐 1 14418 小 光 滑 灰 色, 半 透 明 湿 圆 形 扁 平 整 齐 27 14419 大 粗 糙 白 色 湿 不 规 则 扁 平 不 整 齐 4 14420 小 光 滑 灰 色 湿 圆 形 扁 平 整 齐 10 14421 小 光 滑 白 色 湿 不 规 则 扁 平 裂 叶 状 1 14422 小 光 滑 淡 黄 湿 圆 形 褶 皱 不 整 齐 1 14423 小 光 滑 中 间 透 明, 四 周 白 色 湿 圆 形 扁 平 不 整 齐 1 图 1 FJAT- 土 样 4157( 正 面 ) 图 2 FJAT- 土 样 4157( 反 面 ) 图 3 FJAT- 土 样 4157( 正 面 )

362 图 4 FJAT- 土 样 4157( 反 面 ) 图 5 FJAT- 土 样 4161( 正 面 ) 图 6 FJAT- 土 样 4161( 反 面 ) 图 7 FJAT- 土 样 2384( 正 面 ) 图 8 FJAT- 土 样 2384( 反 面 ) 图 9 FJAT- 土 样 4160( 正 面 ) 图 10 FJAT- 土 样 4160( 反 面 ) 图 11 FJAT- 土 样 2982( 正 面 ) 图 12 FJAT- 土 样 2982( 反 面 ) 图 为 土 壤 中 分 离 的 菌 落 形 态 图 13 菌 株 14408 08( 正 面 ) 图 14 菌 株 14408( 反 面 ) 图 15 菌 株 14409 09( 正 面 )

363 图 16 菌 株 14409( 反 面 ) 图 17 菌 株 14411 11( 正 面 ) 图 18 菌 株 14411( 反 面 ) 图 19 菌 株 14379 379( 正 面 ) 图 20 菌 株 14379( 反 面 ) 图 21 菌 株 14404 04( 正 面 ) 图 22 菌 株 14404( 反 面 ) 图 23 菌 株 14400 00( 正 面 ) 图 24 菌 株 14400( 反 面 ) 图 25 菌 株 14494 494( 正 面 ) 图 26 菌 株 14394( 反 面 ) 图 27 菌 株 14410 10( 正 面 )

364 图 28 菌 株 14410( 反 面 ) 图 29 菌 株 14388 388( 正 面 ) 图 30 菌 株 14388( 反 面 ) 图 31 菌 株 14422( 正 面 ) 图 32 菌 株 14422( 反 面 ) 图 33 菌 株 14385( 正 面 ) 图 34 菌 株 14385( 反 面 ) 图 35 菌 株 14386( 正 面 ) 图 36 菌 株 14386( 反 面 ) 图 为 纯 化 菌 株 形 态 4. 试 验 讨 论 1. 实 验 结 果 表 明 不 同 土 壤 中 含 菌 的 种 类 和 数 量 不 同, 也 就 是 说 不 同 地 区 菌 的 生 长 受 环 境 条 件 各 方 面 的 影 响 2. 不 同 土 壤 中 含 有 一 些 相 同 的 菌, 但 各 土 壤 中 也 有 许 多 不 同 的 芽 胞 杆 菌, 不 同 平 板 上 也 会 因 微 环 境 的 不 同 长 不 同 的 菌 5. 参 考 文 献 [1] 陈 中 义, 张 杰, 黄 大 昉. 植 物 病 害 生 防 芽 孢 杆 菌 抗 菌 机 制 与 遗 传 改 良 研 究 [J]. 植 物 病 理 学 报, 2003, 33(2):97-103.

365 [2] 任 士 伟, 邢 小 霞, 董 向 丽 生 防 芽 孢 杆 菌 的 分 离 筛 选 与 初 步 鉴 定 [J]. 现 代 农 药, 2011, 10 (1):44-47. 试 验 负 责 刘 国 红 试 验 人 员 田 潇 娜

366 编 号 : 农 业 微 生 物 研 究 中 心 [ 菌 种 -110806], 共 5 页 承 担 单 位 : 福 建 省 农 科 院 农 业 生 物 资 源 研 究 所 试 验 设 计 : 刘 国 红 试 验 项 目 : 土 壤 中 芽 胞 杆 菌 的 脂 肪 酸 测 定 试 验 人 员 : 田 潇 娜 试 验 负 责 : 林 营 志 报 告 日 期 :2011-08-06 计 数 月 份 :2011 年 07 月 研 究 资 格 系 数 (0.5-1.0) 实 验 设 计 系 数 (0.9-1.0 0.9-1.0) 报 告 得 分 总 分 实 验 设 计 实 验 记 载 实 验 分 析 实 验 简 报 实 验 文 章 1-20% 21-40% 41-60% 61-80% 81-100% 1%-5% 设 计 不 足, 实 施 错 误 6%-10% 设 计 不 全, 实 验 无 果 11%-15% 设 计 可 以, 实 施 不 全 16%-20% 设 计 完 整, 分 布 实 施 21%-25% 实 验 不 全, 记 载 无 果 26%-30% 实 验 不 足, 记 载 不 全 31%-35% 独 立 实 验, 记 载 不 全 36%-40% 分 布 实 验, 记 载 完 整 41%-45% 目 的 明 确, 实 验 完 成 46%-50% 实 验 完 整, 记 载 清 晰 51%-55% 实 验 系 统, 结 果 可 信 56%-60% 实 验 创 新, 分 析 清 晰 61%-65% 实 验 创 新, 结 论 清 晰 66%-70% 实 验 完 整, 统 计 清 晰 71%-75% 实 验 系 统, 数 据 可 靠 76%-80% 报 告 完 整, 文 章 雏 形 81%-85% 结 构 合 理, 分 析 有 据 86%-90% 逻 辑 清 晰, 统 计 合 理 91%-95% 图 表 完 整, 写 作 流 畅 96%-100% 文 献 完 整, 发 表 水 平 福 建 省 农 业 科 学 院 农 业 生 物 资 源 研 究 所 农 业 微 生 物 研 究 中 心 电 话 :0591-87882571, 传 真 :0591-87882571 fjat.yzxz.com

367 1. 试 验 目 的 芽 胞 杆 菌 中 含 有 多 种 不 同 的 脂 肪 酸, 因 脂 肪 酸 是 生 物 体 内 一 种 重 要 的 生 物 大 分 子, 它 不 仅 是 生 物 体 的 基 本 结 构 成 分, 还 具 有 重 要 的 生 理 作 用 [1], 藻 类 真 菌 和 细 菌 中 多 不 饱 和 脂 肪 酸 含 量 丰 富, 是 因 为 微 生 物 中 具 有 一 系 列 脱 氢 酶 和 延 长 酶 等 活 性 物 质, 能 够 从 头 合 成 多 不 饱 和 脂 肪 酸, 也 就 是 说 不 同 的 生 物 由 于 自 身 生 理 功 能 等 的 不 同 会 产 生 不 同 的 脂 肪 酸, 因 此 通 过 鉴 定 脂 肪 酸 来 鉴 定 生 物 种 类, 无 疑 成 为 一 种 很 有 效 的 分 类 途 径 尤 其 通 过 脂 肪 酸 鉴 定 芽 胞 杆 菌 更 是 一 种 很 有 效 的 方 法 本 实 验 就 是 通 过 提 取 脂 肪 酸, 用 气 相 色 谱 检 测 系 统 来 鉴 定 芽 胞 杆 菌 2. 试 验 方 法 2.1 检 测 仪 器 全 自 动 微 生 物 检 测 系 统 (sherlockmidi) 2.2 脂 肪 酸 提 取 前 试 剂 处 理 试 剂 I:NaOH45 g+ 甲 醇 150 ml+ 去 离 子 水 150 ml, 水 和 甲 醇 混 合 后 再 加 入 NaOH, 同 时 搅 拌 至 完 全 溶 解 试 剂 II:6.00 N 盐 酸 325 ml+ 甲 醇 275 ml, 把 盐 酸 加 入 到 甲 醇 中, 并 不 断 搅 拌 试 剂 III: 正 己 烷 200 ml+mtbe 200 ml, 把 MTBE 加 入 到 正 己 烷 中, 并 不 断 搅 拌 试 剂 IV:NaOH 10.8 g + 去 离 子 蒸 馏 水 900 ml 2.3 提 取 步 骤 2.3.1 菌 株 的 培 养 将 菌 株 接 种 到 TSB 平 板 上, 置 于 30 培 养 箱 中 培 养 24 h 2.3.2 获 菌 用 接 种 环 挑 取 20 mg 芽 胞 杆 菌 置 于 耐 酸 耐 碱 管 底 部 2.3.3 皂 化 ( 强 烈 的 甲 醇 随 着 加 热 杀 菌 及 溶 解 细 菌 ) 在 装 有 菌 体 的 管 中 加 入 1.0 ml 的 [ 试 剂 I], 锁 紧 盖 子, 震 荡 试 管 5-10 min; 放 入 95-100 的 沸 水 中 水 浴 5 min; 从 沸 水 中 移 开 试 管 并 轻 微 的 冷 却 不 要 打 开 盖 子 ; 震 荡 每 支 试 管 5-10 min; 再 水 浴 25 min; 移 开 和 放 置 试 管 架 室 温 冷 却 2.3.4 甲 基 化 ( 甲 基 化 转 换 脂 肪 酸 成 甲 基 脂 脂 肪 酸 以 增 加 脂 肪 酸 的 挥 发 性 以 供 GC 分 析 ) 加 入 2.0 ml[ 试 剂 II]; 栓 紧 盖 子 震 荡 5-10 min; 水 浴 加 热 试 管 80 10 min; 移 开 且 快 速 用 龙 头 水 冷 却 至 室 温 2.3.5 萃 取 ( 甲 基 脂 脂 肪 酸 移 出 从 酸 性 水 相 转 移 到 一 个 有 机 相 液 相 的 萃 取 过 程 ) 加 入 1.25 ml[ 试 剂 III] 萃 取 溶 剂 在 每 个 试 管 中 ; 盖 紧 盖 子, 放 此 批 的 试 管 在 一 个 旋 转 器 温 和 混 合 旋 转 10 min; 打 开 管 盖, 利 用 干 净 的 移 液 管 取 出 每 个 样 本 的 下 层 似 水 部 位, 弃 去 2.3.6 基 本 洗 涤 ( 从 有 机 相 中 移 去 自 由 的 脂 肪 酸 ) 加 入 3.0 ml[ 试 剂 IV]; 栓 紧 盖 子 和 温 和 震 荡 试 管 旋 转 约 5 min; 打 开 盖 子, 利 用 干 净 的 移 液 管 移 出 约 2/3 体 积 的 上 层 有 机 体 到 干 净 的 GC 检 体 小 瓶 2.4 上 样 脂 肪 酸 检 测 2.5 数 据 库 比 对

368 3. 试 验 结 果 共 测 试 48 株 菌 株, 测 试 结 果 如 下 : 菌 株 编 号 SimIndex 菌 种 名 14299 0.845 Bacillus cereus GC subgroup B 14300 0.498 Paenibacillus azotofixans (Bacillus azotofixans) 14302 0.573 Bacillus megaterium GC subgroup A 14304 0.279 Paenibacillus lentimorbus 14309 0.362 Bacillus lentus 14312 0.461 Bacillus GC group 22 14315 0.710 Paenibacillus polymyxa (Bacillus) 14316 0.673 Bacillus oleronius 14317 0.301 Bacillus sphaericus GC subgroup D 14318 0.580 Bacillus sphaericus GC subgroup B 14319 0.384 Bacillus lentus 14320 0.327 Bacillus cereus GC subgroup B 14321 0.622 Bacillus subtilis 14322 0.630 Bacillus pumilus GC subgroup B 14323 0.286 Virgibacillus pantothenticus (Bacillus) 14324 0.528 Bacillus cereus GC subgroup B 14325 0.141 Stenotrophomonas maltophilia (Xanthomonas, Pseudomonas) 14326 0.390 Bacillus circulans GC subgroup A 14327 0.417 Bacillus viscosus(was Arthrobacter) 14328 0.372 Bacillus circulans GC subgroup A 14329 0.424 Bacillus megaterium GC subgroup A 14331 0.245 Bacillus clausii 14332 0.469 Bacillus clausii 14334 0.180 Bacillus alcalophilus 14335 0.633 Bacillus alcalophilus 14351 0.687 Bacillus megaterium GC subgroup A 14352 0.732 Bacillus pumilus GC subgroup B 14353 0.534 Virgibacillus-pantothenticus (Bacillus)

369 14354 0.503 Paenibacillus lentimorbus 14355 0.565 Bacillus oleronius 14356 0.532 Bacillus cereus GC subgroup A 14359 0.315 Bacillus sphaericus GC subgroup B 14360 0.585 Bacillus cereus GC subgroup B 14361 0.503 Paenibacillus-polymyxa (Bacillus) 14362 0.641 Bacillus pumilus GC subgroup B 14363 0.491 14364 0.660 14365 0.524 Bacillus megaterium GC subgroup A Bacillus megaterium GC subgroup A Microbacterium laevaniformans (Corynebacterium laevaniformans 14366 0.786 Bacillus cereus GC subgroup B 14367 0.204 Paenibacillus lautus 14369 0.529 Paenibacillus polymyxa (Bacillus) 14370 0.536 Bacillus cereus GC subgroup B 14371 0.698 Paenibacillus poymyxa (Bacillus) 14372 0.125 Bacillu cereus GC subgroup B 14373 0.585 Bacillus cereus GC subgroup B 14374 无 匹 配 14376 0.361 Bacillus sphaericus GC subgroup D 14377 0.509 Bacillus pumilus GC subgroup B 4. 试 验 讨 论 1. 检 测 结 果 的 峰 值 显 示 某 些 脂 肪 酸 中 可 能 含 有 杂 质, 应 注 意 确 保 提 取 脂 肪 酸 的 纯 度 2. 通 过 各 项 指 标 可 以 看 出 通 过 这 种 方 法 鉴 定 的 脂 肪 酸 精 确 度 是 很 高 的 5. 参 考 文 献 [1] 刘 梦 坛, 李 超 伦, 孙 松. 脂 肪 酸 对 中 华 哲 水 蚤 摄 食 两 种 海 洋 微 藻 的 指 示 作 用 [J]. 生 态 学 报, 2011, 31(4):0933 0942. 试 验 负 责 刘 国 红 试 验 人 员 田 潇 娜

370 编 号 : 农 业 微 生 物 研 究 中 心 [ 菌 种 -100515], 共 4 页 承 担 单 位 : 福 建 省 农 科 院 农 业 生 物 资 源 研 究 所 试 验 设 计 : 刘 国 红 试 验 项 目 : 土 壤 中 芽 胞 杆 菌 的 脂 肪 酸 鉴 定 试 验 人 员 : 余 谦 试 验 负 责 : 林 营 志 报 告 日 期 :2011-08-26 计 数 月 份 :2011 年 08 月 研 究 资 格 系 数 (0.5-1.0) 实 验 设 计 系 数 (0.9-1.0 0.9-1.0) 报 告 得 分 总 分 实 验 设 计 实 验 记 载 实 验 分 析 实 验 简 报 实 验 文 章 1-20% 21-40% 41-60% 61-80% 81-100% 1%-5% 设 计 不 足, 实 施 错 误 6%-10% 设 计 不 全, 实 验 无 果 11%-15% 设 计 可 以, 实 施 不 全 16%-20% 设 计 完 整, 分 布 实 施 21%-25% 实 验 不 全, 记 载 无 果 26%-30% 实 验 不 足, 记 载 不 全 31%-35% 独 立 实 验, 记 载 不 全 36%-40% 分 布 实 验, 记 载 完 整 41%-45% 目 的 明 确, 实 验 完 成 46%-50% 实 验 完 整, 记 载 清 晰 51%-55% 实 验 系 统, 结 果 可 信 56%-60% 实 验 创 新, 分 析 清 晰 61%-65% 实 验 创 新, 结 论 清 晰 66%-70% 实 验 完 整, 统 计 清 晰 71%-75% 实 验 系 统, 数 据 可 靠 76%-80% 报 告 完 整, 文 章 雏 形 81%-85% 结 构 合 理, 分 析 有 据 86%-90% 逻 辑 清 晰, 统 计 合 理 91%-95% 图 表 完 整, 写 作 流 畅 96%-100% 文 献 完 整, 发 表 水 平 福 建 省 农 业 科 学 院 农 业 生 物 资 源 研 究 所 农 业 微 生 物 研 究 中 心 电 话 :0591-87882571, 传 真 :0591-87882571 fjat.yzxz.com

371 1. 试 验 目 的 脂 肪 酸 是 生 物 体 内 一 种 重 要 的 生 物 大 分 子, 它 不 仅 是 生 物 体 的 基 本 结 构 成 分, 还 具 有 重 要 的 生 理 作 用 [1], 藻 类 真 菌 和 细 菌 中 多 不 饱 和 脂 肪 酸 含 量 丰 富, 是 因 为 微 生 物 中 具 有 一 系 列 脱 氢 酶 和 延 长 酶 等 活 性 物 质, 能 够 从 头 合 成 多 不 饱 和 脂 肪 酸, 也 就 是 说 不 同 的 生 物 由 于 自 身 生 理 功 能 等 的 不 同 会 产 生 不 同 的 脂 肪 酸, 因 此 通 过 鉴 定 脂 肪 酸 来 鉴 定 生 物 种 类, 无 疑 成 为 一 种 很 有 效 的 分 类 途 径 尤 其 通 过 脂 肪 酸 鉴 定 芽 胞 杆 菌 更 是 一 种 很 有 效 的 方 法 本 实 验 就 是 通 过 提 取 脂 肪 酸, 通 过 气 相 色 谱 检 测 系 统 来 鉴 定 芽 胞 杆 菌 的 种 类 2. 试 验 方 法 2.1 检 测 仪 器 全 自 动 微 生 物 检 测 系 统 (sherlockmidi) 2.2 脂 肪 酸 提 取 前 试 剂 处 理 试 剂 I:NaOH45 g+ 甲 醇 150 ml+ 去 离 子 水 150 ml, 水 和 甲 醇 混 合 后 再 加 入 NaOH, 同 时 搅 拌 至 完 全 溶 解 试 剂 II:6.00 N 盐 酸 325 ml+ 甲 醇 275 ml, 把 盐 酸 加 入 到 甲 醇 中, 并 不 断 搅 拌 试 剂 III: 正 己 烷 200 ml+mtbe200 ml, 把 MTBE 加 入 到 正 己 烷 中, 并 不 断 搅 拌 试 剂 IV:NaOH10.8 g+ 去 离 子 蒸 馏 水 900 ml 2.3 提 取 步 骤 2.3.1 菌 株 的 培 养 将 菌 株 接 种 到 TSB 平 板 上, 置 于 30 培 养 箱 中 培 养 24 h 2.3.2 获 菌 用 接 种 环 挑 取 20 mg 芽 胞 杆 菌 置 于 耐 酸 耐 碱 管 底 部 2.3.3 皂 化 ( 强 烈 的 甲 醇 随 着 加 热 杀 菌 及 溶 解 细 菌 ) 在 装 有 菌 体 的 管 中 加 入 1.0 ml 的 [ 试 剂 I], 锁 紧 盖 子, 震 荡 试 管 5-10 min; 放 入 95-100 的 沸 水 中 水 浴 5 min; 从 沸 水 中 移 开 试 管 并 轻 微 的 冷 却 不 要 打 开 盖 子 ; 震 荡 每 支 试 管 5-10 min; 再 水 浴 25 min; 移 开 和 放 置 试 管 架 室 温 冷 却 2.3.4 甲 基 化 ( 甲 基 化 转 换 脂 肪 酸 成 甲 基 脂 脂 肪 酸 以 增 加 脂 肪 酸 的 挥 发 性 以 供 GC 分 析 ) 加 入 2.0 ml[ 试 剂 II]; 栓 紧 盖 子 震 荡 5-10 min; 水 浴 加 热 试 管 80 10 min; 移 开 且 快 速 用 龙 头 水 冷 却 至 室 温 2.3.5 萃 取 ( 甲 基 脂 脂 肪 酸 移 出 从 酸 性 水 相 转 移 到 一 个 有 机 相 液 相 的 萃 取 过 程 ) 加 入 1.25 ml[ 试 剂 III] 萃 取 溶 剂 在 每 个 试 管 中 ; 盖 紧 盖 子, 放 此 批 的 试 管 在 一 个 旋 转 器 温 和 混 合 旋 转 10 min; 打 开 管 盖, 利 用 干 净 的 移 液 管 取 出 每 个 样 本 的 下 层 似 水 部 位, 弃 去 2.3.6 基 本 洗 涤 ( 从 有 机 相 中 移 去 自 由 的 脂 肪 酸 ) 加 入 3.0 ml[ 试 剂 IV]; 栓 紧 盖 子 和 温 和 震 荡 试 管 旋 转 约 5 min; 打 开 盖 子, 利 用 干 净 的 移 液 管 移

372 出 约 2/3 体 积 的 上 层 有 机 体 到 干 净 的 GC 检 体 小 瓶 2.4 上 样 脂 肪 酸 检 测 2.5 数 据 库 比 对 3. 试 验 结 果 共 测 试 17 株 菌 株, 测 试 结 果 如 下 : 菌 株 编 号 SimIndex 菌 种 名 14280 0.279 Bacillus-GC group 22 (No 16S match to known species) 14281 0.730 Virgibacillus-pantothenticus (Bacillus) 14293 无 匹 配 14282 0.787 Brevibacillus-reuszeri 14294 0.701 Bacillus-viscosus" (was Arthrobacter) 14290 0.755 Bacillus-sphaericus-GC subgroup E 14296 0.796 Brevibacillus-reuszeri 14277 0.178 Bacillus-cereus-GC subgroup B 14279 0.536 Brevibacillus-reuszeri 14292 无 匹 配 14278 0.825 Bacillus-cereus-GC subgroup A 14284 0.668 Bacillus-mycoides-GC subgroup B (Bacillus cereus group) 14287 0.571 Virgibacillus-pantothenticus (Bacillus) 14291 0.888 Bacillus-cereus-GC subgroup A 14277 无 匹 配 14289 0.771 Bacillus-cereus-GC subgroup A 14279 无 匹 配 4. 试 验 讨 论 检 测 结 果 的 峰 值 显 示 某 些 脂 肪 酸 中 可 能 含 有 杂 质, 也 就 是 可 能 在 提 取 取 过 程 中 操 作 可 能 有 问 题, 应 注 意 确 保 提 取 脂 肪 酸 的 纯 度 另 外, 在 提 取 的 过 程 中 可 能 也 有 操 作 不 规 范 的 地 方, 比 如, 在 水 浴 加 热 试 管 80 10 min 这 一 步 可 能 存 在 时 间 以 及 温 度 控 制 不 当 的 问 题, 特 别 是 温 度 不 在 80 上, 从 而 对 实 验 的 结 果 会 造 成 一 定 的 误 差, 这 些 都 是 在 以 后 的 实 验 中 应 该 注 意 的, 尽 量 避 免 因 操 作 而 造 成 的 误 差 在 本 次 实 验 中 出 现 了 2 个 匹 配 值 很 低 的 菌 株,14277 和 14280 这 几 株 菌 的 匹 配 值 均 在 0.3 以 下, 其 原 因 很 可 能 是 在 提 取 的 时 候, 挑 菌 后, 接 种 环 灭 菌 不 够, 没 完 全 灭 活, 从 而 带 入 其 他 菌, 使 其 匹 配 值 很 低

373 5. 参 考 文 献 [1] 刘 梦 坛, 李 超 伦, 孙 松. 脂 肪 酸 对 中 华 哲 水 蚤 摄 食 两 种 海 洋 微 藻 的 指 示 作 用 [J]. 生 态 学 报, 2011, 31(4):933 942. [2] MIDI 微 生 物 鉴 定 系 统. 试 验 负 责 刘 国 红 试 验 人 员 余 谦

374 2011-09-27 承 担 单 位 : 福 建 省 农 科 院 农 业 生 物 资 源 研 究 所 试 验 设 计 : 试 验 项 目 : 耐 高 温 芽 孢 杆 菌 的 分 离 试 验 人 员 : 余 谦 试 验 负 责 : 刘 国 红 报 告 日 期 :2011-08-17 计 数 月 份 :2011 年 08 研 究 资 格 系 数 (0.5-1.0) 实 验 设 计 系 数 (0.9-1.0 0.9-1.0) 报 告 得 分 总 分 实 验 设 计 实 验 记 载 实 验 分 析 实 验 简 报 实 验 文 章 1-20% 21-40% 41-60% 61-80% 81-100% 1%-5% 设 计 不 足, 实 施 错 误 6%-10% 设 计 不 全, 实 验 无 果 11%-15% 设 计 可 以, 实 施 不 全 16%-20% 设 计 完 整, 分 布 实 施 21%-25% 实 验 不 全, 记 载 无 果 26%-30% 实 验 不 足, 记 载 不 全 31%-35% 独 立 实 验, 记 载 不 全 36%-40% 分 布 实 验, 记 载 完 整 41%-45% 目 的 明 确, 实 验 完 成 46%-50% 实 验 完 整, 记 载 清 晰 51%-55% 实 验 系 统, 结 果 可 信 56%-60% 实 验 创 新, 分 析 清 晰 61%-65% 实 验 创 新, 结 论 清 晰 66%-70% 实 验 完 整, 统 计 清 晰 71%-75% 实 验 系 统, 数 据 可 靠 76%-80% 报 告 完 整, 文 章 雏 形 81%-85% 结 构 合 理, 分 析 有 据 86%-90% 逻 辑 清 晰, 统 计 合 理 91%-95% 图 表 完 整, 写 作 流 畅 96%-100% 文 献 完 整, 发 表 水 平 福 建 省 农 业 科 学 院 农 业 生 物 资 源 研 究 所 农 业 微 生 物 研 究 中 心 电 话 : 0591-87882571, 传 真 : 0591-87882571 fjat.yzxz.com

375 1 试 验 目 的 土 壤 是 微 生 物 生 活 的 大 本 营, 是 寻 找 和 发 现 有 重 要 应 用 潜 力 的 微 生 物 的 主 要 菌 源 不 同 土 壤 微 生 物 [1] [1] 的 含 量 不 同, 土 壤 是 芽 孢 杆 菌 最 丰 富 的 来 源 另 外, 在 水 中 也 可 以 筛 选 出 少 量 的 芽 孢 杆 菌 芽 孢 杆 菌 多 样 性 的 研 究 在 科 学 领 域 研 究 的 和 很 少, 采 用 现 代 分 类 手 段 对 其 中 芽 孢 杆 菌 资 源 进 行 调 查 和 分 类 研 究 可 望 获 得 芽 孢 杆 菌 的 一 些 生 产 年 应 用 或 者 潜 在 应 用 价 值 的 菌 株, 具 有 重 要 的 科 学 意 义 和 经 济 价 值, 对 建 立 相 应 的 芽 孢 杆 菌 资 源 库 和 数 据 库 有 重 要 意 义 所 以 芽 孢 杆 菌 的 研 究 蕴 涵 着 巨 大 的 经 济 效 益 和 科 学 价 值, 而 开 发 和 应 用 这 种 效 益 与 价 值 的 前 提 就 是 资 源 的 获 得 和 资 源 的 探 入 研 究, 因 此 芽 孢 杆 菌 的 资 源 分 类 是 有 着 重 要 意 义 的 科 研 项 目 本 实 验 从 温 泉 附 近 采 集 土 壤 及 水 样, 从 中 筛 选 出 耐 高 温 的 芽 孢 杆 菌 [1,2,3] 本 实 验 主 要 是 采 用 稀 释 平 板 法 从 土 壤 中 分 离 耐 高 温 的 芽 孢 杆 菌, 将 类 似 芽 孢 杆 菌 的 菌 落 挑 出 进 行 培 养, 纯 化 培 养 得 到 的 菌 落 斜 面 保 存, 作 为 下 一 步 实 验 的 菌 种 材 料 2. 试 验 方 法 2.1 材 料 与 仪 器 2.1. 样 品 本 实 验 所 用 的 实 验 材 料 均 采 集 于 温 泉 附 近 的 土 壤 及 水 中 2.1.2 仪 器 振 荡 器 摇 床 2.2 试 验 方 法 称 样 : 称 取 5 g 土 壤 至 装 有 45 ml 无 菌 水 的 三 角 瓶, 摇 床 振 荡 15 min, 使 之 充 分 溶 解, 即 配 成 10-1 浓 度 ; 稀 释 土 壤 原 液 : 吸 取 1 ml 原 液 至 装 有 9 ml 无 菌 水 的 试 管, 即 配 成 10-2 ; 水 浴 : 将 稀 释 好 的 土 样 溶 液 放 在 80 水 浴 锅 水 浴 10 min, 期 间 振 荡 2-3 次 ; 平 板 涂 布 : 超 净 台 上 无 菌 操 作, 溶 液 在 振 荡 器 上 振 荡 10-20 s, 吸 取 200 μl 至 相 应 标 记 浓 度 的 平 板 上, 溶 液 滴 至 平 板 中 央, 用 涂 布 棒 涂 匀 涂 好 的 平 板 正 放 静 置 一 会, 使 溶 液 渗 透 进 平 板 中 每 个 梯 度 重 复 3 次 ; 培 养 :: 将 涂 好 的 平 板 用 报 纸 包 好, 分 成 两 份, 分 别 倒 置 于 30 和 75 恒 温 箱 中 培 养 2 d; 划 线 分 离 : 观 察 分 离 培 养 的 菌 落, 将 要 纯 化 的 菌 落 标 上 标 记, 无 菌 操 作 用 接 种 环 直 接 取 平 板 上 要 分 离 纯 化 的 菌 落 至 相 应 标 记 的 平 板 上, 划 线 完 后 放 在 30 和 75 温 箱 中 培 养.; 结 果 计 算 : 每 克 土 样 中 微 生 物 的 数 量 = 同 一 稀 释 度 的 3 个 平 板 上 菌 落 平 均 数 稀 释 倍 数 / 含 菌 样 品 克 数

376 3. 试 验 结 果 本 试 验 的 土 样 分 离 结 果 如 表 2. 土 样 5.0 中 芽 孢 杆 菌 的 含 量 最 高, 土 样 5.0 和 5.2 的 芽 孢 杆 菌 含 量 基 本 一 致,5.1 的 含 量 最 少,5.0 样 本 中 菌 的 种 类 数 最 少. 其 它 四 个 样 的 芽 孢 杆 菌 的 种 类 数 差 不 多 一 样. 根 据 菌 落 特 征 观 察 3 个 土 样 芽 孢 杆 菌 分 离 的 结 果 见 表 2 表 2 不 同 土 样 分 离 芽 孢 杆 菌 数 量 土 样 编 号 土 样 原 始 编 号 肉 眼 观 察 重 复 总 含 量 均 值 Ⅰ 1.00 10 3 1 5.0 1 种 菌 Ⅱ 0 3.33 10 2 Ⅲ 0 Ⅰ 3.00 10 3 2 5.1 2 种 菌 Ⅱ 3.60 10 3 3.53 10 3 Ⅲ 0 Ⅰ 0 3 5.2 2 种 菌 Ⅱ 2.00 10 3 6.67 10 2 Ⅲ 0 4 4 种 菌 Ⅰ 1.36 10 3 Ⅰ 4.80 10 3 3.35 10 3 Ⅲ 4.00 10 3 5 2 种 菌 Ⅰ 2.00 10 2 2.00 10 2 Ⅰ 4.00 10 2 Ⅲ 0 表 3 菌 落 特 征 菌 株 正 面 颜 色 表 面 特 征 边 缘 形 状 菌 落 形 状 光 学 特 征 14340 乳 白 色 粗 糙 整 齐 近 圆 形, 湿 润, 不 透 明, 有 光 泽 突 起 14341 乳 白 色 光 滑 整 齐 圆 形, 湿 润, 隆 不 透 明, 有 光 泽 突 14342 白 色 粗 糙 整 齐 近 圆 形, 扁 平, 半 透 明, 无 光 泽 湿 润 14343 乳 白 色 粗 糙 整 齐 圆 形, 干 燥, 突 不 透 明, 有 光 泽 起 14344 乳 白 色 粗 糙 整 齐 圆 形, 干 燥, 突 不 透 明, 有 光 泽 起 14338 灰 白 光 滑 齿 状 近 圆 形, 扁 平, 半 透 明, 无 光 泽 干 燥 14339 乳 白 色 光 滑 整 齐 圆 形, 隆 起, 湿 不 透 明, 无 光 泽 润 14345 米 黄 色 粗 糙 丝 状 圆 形, 隆 起, 湿 不 透 明, 有 光 泽 润 14346 乳 白 色 不 光 滑 整 齐 近 圆 形, 扁 平, 半 透 明, 有 光 泽 湿 润 14347 乳 白 色 光 滑 整 齐 圆 形, 扁 平, 干 不 透 明, 无 光 泽 燥 14348 乳 白 色 光 滑 整 齐 圆 形, 扁 平, 湿 润 不 透 明, 有 光 泽

377 14349 乳 白 色 光 滑 整 齐 隆 突, 圆 形, 湿 润 14350 浅 黄 色 光 滑 整 齐 圆 形, 湿 润, 隆 突 不 透 明, 有 光 泽 不 透 明, 有 光 泽 表 3 70 下 筛 选 菌 落 数 量 土 样 编 号 肉 眼 观 察 编 号 总 含 量 均 值 3 1 种 菌 14344 50 4 1 种 菌 14343 40 3.33 10 2 以 下 是 几 种 代 表 性 菌 株 菌 落 图 : 图 1 菌 株 14340( 反 面 ) 图 2 菌 株 14340( 正 面 ) 图 3 菌 株 14338( 反 面 ) 图 4 菌 株 14338( 正 面 ) 图 5 菌 株 14342( 反 面 ) 图 6 菌 株 14342( 正 面 ) 图 7 菌 株 14341( 反 面 ) 图 8 菌 株 14281( 正 面 ) 图 9 菌 株 14344( 反 面 ) 图 10 菌 株 14344( 正 面 ) 图 11 菌 株 14343( 反 面 ) 图 12 菌 株 14343( 正 面 ) 4. 试 验 结 论 土 壤 是 芽 孢 杆 菌 的 主 要 来 源 本 试 验 选 择 的 3 个 土 样 和 2 个 水 样 中 的 芽 孢 杆 菌 的 含 量 均 很 少 分 析 其 原 因 很 可 能 是 在 高 温 下 菌 的 蛋 白 质 和 酶 发 生 凝 固 或 变 性 而 导 致 其 死 亡 芽 孢 杆 菌 的 总 数 量 与 土 壤 悬 液 是 否 加 热 有 关, 文 献 中 有 提 到 过 热 处 理 后 测 定 的 数 量 显 著 低 于 非 热 处 理 的 菌 的 总 量 和 菌 的 种 类 的 多 少 也 和 土

378 壤 的 营 养 状 况 温 度 和 ph 有 一 定 的 关 系, 另 外, 采 样 的 时 间 也 可 能 对 其 有 一 定 的 影 响 本 次 实 验 中 1 3 和 5 号 样 均 采 自 80 的 环 境 中, 菌 的 数 量 很 少, 只 有 10 2 数 量 级, 而 2 和 4 号 样 采 集 的 温 度 是 50 的 环 境, 菌 的 数 量 相 对 就 要 多, 达 到 10 3 一 般 来 说, 土 壤 中 芽 孢 杆 菌 的 的 数 量 差 异 是 很 大 的, 大 概 在 10 3 到 10 6 之 间, 本 实 验 测 得 的 结 果 是 与 理 论 不 相 符 合 的, 不 在 此 范 围 之 内, 其 主 要 原 因 是 大 部 分 菌 都 不 耐 高 温, 在 高 温 下 不 能 生 长 本 次 筛 选 到 2 株 菌 均 能 在 75 的 高 温 下 生 长, 但 是 其 数 量 相 当 的 少 5 参 考 文 献 [1] 钱 存 柔, 黄 仪 秀. 微 生 物 学 实 验 教 程. 北 京 大 学 出 版 社. 1997 年. [2] 魏 雪 生, 陈 颖, 牛 静 怡. 天 津 地 区 土 壤 中 苏 云 金 芽 孢 杆 菌 调 查. 天 津 农 学 院 学 报. 2006 年, 13(3):30-3 [3] 李 峰, 郭 瑞 雪, 张 林 普. 芽 孢 杆 菌 属 一 新 种 的 鉴 定. 淮 北 煤 炭 师 范 学 院 学 报. 2005, 26(2):45-48. 试 验 设 计 : 余 谦 试 验 负 责 : 刘 国 红 试 验 人 员 : 余 谦 刘 国 红

379 2010-08-04 承 担 单 位 : 福 建 省 农 科 院 农 业 生 物 资 源 研 究 所 试 验 设 计 : 试 验 项 目 : 垫 料 堆 肥 实 验 总 微 生 物 量 的 测 定 ( 二 ) 试 验 人 员 : 王 洁 试 验 负 责 : 朱 育 菁 报 告 日 期 :2011-08-04 计 数 月 份 :2011 年 08 月 研 究 资 格 系 数 (0.5-1.0) 实 验 设 计 系 数 (0.9-1.0 0.9-1.0) 报 告 得 分 总 分 实 验 设 计 实 验 记 载 实 验 分 析 实 验 简 报 实 验 文 章 1-20% 21-40% 41-60% 61-80% 81-100% 1%-5% 设 计 不 足, 实 施 错 误 6%-10% 设 计 不 全, 实 验 无 果 11%-15% 设 计 可 以, 实 施 不 全 16%-20% 设 计 完 整, 分 布 实 施 21%-25% 实 验 不 全, 记 载 无 果 26%-30% 实 验 不 足, 记 载 不 全 31%-35% 独 立 实 验, 记 载 不 全 36%-40% 分 布 实 验, 记 载 完 整 41%-45% 目 的 明 确, 实 验 完 成 46%-50% 实 验 完 整, 记 载 清 晰 51%-55% 实 验 系 统, 结 果 可 信 56%-60% 实 验 创 新, 分 析 清 晰 61%-65% 实 验 创 新, 结 论 清 晰 66%-70% 实 验 完 整, 统 计 清 晰 71%-75% 实 验 系 统, 数 据 可 靠 76%-80% 报 告 完 整, 文 章 雏 形 81%-85% 结 构 合 理, 分 析 有 据 86%-90% 逻 辑 清 晰, 统 计 合 理 91%-95% 图 表 完 整, 写 作 流 畅 96%-100% 文 献 完 整, 发 表 水 平 福 建 省 农 业 科 学 院 农 业 生 物 资 源 研 究 所 农 业 微 生 物 研 究 中 心 电 话 : 0591-87882571, 传 真 : 0591-87882571 fjat.yzxz.com

380 1. 试 验 目 的 传 统 养 猪 模 式 产 生 的 大 量 粪 便 给 环 境 带 来 极 大 的 负 担, 造 成 严 重 的 污 染 而 目 前, 发 酵 床 养 猪 是 一 个 非 常 热 门 的 话 题, 又 称 零 污 染 养 猪, 即 从 样 品 中 分 离 筛 选 出 一 种 功 能 微 生 物 菌 种, 然 后 通 过 特 定 的 营 养 剂 的 培 养 形 成 土 著 微 生 物 原 种, 将 原 种 按 一 定 比 例 掺 拌 锯 末 谷 壳 泥 土, 然 后 控 制 一 定 的 条 件 让 其 发 酵 成 优 势 群 落, 最 后 制 成 猪 舍 的 垫 料 把 垫 料 在 猪 舍 铺 设 成 一 定 厚 度 的 垫 料 层 利 用 生 猪 拱 翻 的 生 活 习 性, 使 垫 料 和 猪 粪 尿 充 分 混 合, 通 过 样 品 微 生 物 菌 落 的 分 解 发 酵, 使 猪 粪 尿 中 的 有 机 物 质 得 到 充 分 的 分 解 和 转 化 [1] 并 且 同 时 对 猪 配 合 以 专 一 性 的 益 生 菌, 最 终 达 到 降 解 消 化 猪 粪 便, 除 去 异 味 和 无 害 化 的 目 的, 是 一 种 无 污 染 零 排 放 的 新 型 环 保 养 猪 技 术 发 酵 床 养 猪 模 式 中 垫 料 的 原 材 料 由 谷 壳 和 木 屑 组 成, 由 于 目 前 生 产 上 该 原 材 料 紧 缺, 价 格 较 高, 急 需 寻 找 其 他 廉 价 的 农 产 品 废 弃 物 作 为 新 原 材 料 本 实 验 用 菌 渣 和 椰 子 壳 替 代 垫 料 原 材 料 进 行 发 酵, 并 模 拟 猪 场 零 排 放 模 式 将 猪 粪 直 接 加 入 垫 料 中 进 行 堆 肥 实 验, 采 用 稀 释 涂 布 平 板 法 研 究 堆 肥 发 酵 过 程 中 微 生 物 的 变 化 2. 试 验 方 法 2.1 供 试 材 料 福 清 渔 溪 农 场 的 堆 肥 实 验 样 品 组 成 如 下 表 2-1: 表 2-1 垫 料 样 品 配 方 组 合 设 计 编 号 组 合 1 菌 渣 + 椰 子 壳 (1;2) 2 谷 壳 + 锯 末 (1:1) 3 菌 渣 4 菌 渣 + 椰 子 壳 (1:1) 5 椰 子 壳 2011 年 07 月 18 日 在 不 同 配 比 的 垫 料 中 各 加 入 50 公 斤 新 鲜 猪 粪, 堆 积 发 酵 采 样 批 次 及 信 息 见 表 2-2: 表 2-2 采 样 批 次 信 息 批 次 时 间 备 注 第 一 批 2011-07-18 无 第 二 批 2011-07-23 无 第 三 批 2011-07-29 采 样 后 翻 堆 2.2 实 验 器 材 2.2.1 培 养 基 牛 肉 膏 蛋 白 胨 培 养 基 (NA): 牛 肉 浸 膏 3g 蛋 白 胨 5g 葡 萄 糖 10g 琼 脂 15-20g 水 定 容 1000ml ph 7.2-7.6 马 铃 薯 葡 萄 糖 培 养 基 (PDA): 马 铃 薯 200g 葡 萄 糖 20g 琼 脂 15-20g, 配 制 时 将 土 豆 切 块 煮 沸 后 过 滤, 加 葡 萄 糖, 蒸 馏 水 定 容 1000ml 2.2.2 溶 液 或 试 剂 盛 有 9ml 无 菌 水 的 18 18 试 管 盛 90ml 无 菌 水 并 带 有 玻 璃 珠 的 250ml 三 角 瓶

381 2.2.3 仪 器 或 其 他 用 具 采 样 袋 无 菌 涂 布 棒 灭 菌 试 管 1ml 移 液 枪 无 菌 1ml 移 液 枪 头 200 μl 移 液 枪 无 菌 200 μl 移 液 枪 头 接 种 环 无 菌 培 养 皿 酒 精 灯 超 净 工 作 台 振 荡 器 等 2.3 实 验 方 法 2.3.1 制 备 样 品 稀 释 液 称 取 样 品 10g, 无 菌 条 件 下 操 作, 放 入 盛 有 90ml 无 菌 水 ( 带 玻 璃 珠 ) 的 三 角 烧 瓶 中, 振 荡 约 20min, 使 样 品 与 水 充 分 混 合, 配 成 10-1 的 稀 释 度, 再 从 10-1 液 中 吸 取 1ml 悬 液 加 入 盛 有 9ml 无 菌 水 的 试 管 中 充 分 混 匀, 配 制 成 10-2 稀 释 度 样 品 溶 液, 以 此 类 推 配 制 10-3 10-4 10-5 10-6 不 同 稀 释 度 的 样 品 溶 液 2.3.2 涂 布 平 板 培 养 超 净 台 上 无 菌 操 作, 取 10-5 10-6 两 个 稀 释 度 溶 液, 振 荡 器 上 振 荡 10-20s 后 分 别 吸 取 100μL 至 NA 和 PDA 平 板 中 央, 用 涂 布 棒 涂 匀 后 室 温 静 置 会, 使 菌 液 充 分 吸 附 到 培 养 基 里 而 后 平 板 倒 置,NA 平 板 于 30 恒 温 培 养 箱 中 培 养 1 天, 观 察 计 数 ;PDA 平 板 于 28 恒 温 培 养 箱 中 培 养 2 天 后, 观 察 计 数 每 个 梯 度 重 复 2 次 2.3.3 结 果 计 数 肉 眼 观 察 计 数, 算 出 同 一 稀 释 度 的 平 均 菌 落 数, 按 公 式 计 算 : 每 克 菌 落 形 成 单 位 = 同 一 稀 释 度 平 均 菌 落 数 10 稀 释 倍 数 ( 单 位 cfu/g) 3. 试 验 结 果 3.1 垫 料 堆 肥 实 验 细 菌 分 离 结 果 以 第 一 批 堆 肥 垫 料 为 对 照, 共 分 离 出 9 株 细 菌, 其 菌 落 特 征 如 下 表 3.1.1 表 3.1.1 样 品 分 离 的 细 菌 菌 株 特 征 菌 株 编 号 菌 落 形 态 特 征 1 大, 白 色, 圆 形, 扁 平, 表 面 蜡 状, 湿 润, 无 光 泽 2 大, 白 色, 形 状 不 规 则, 表 面 凹 陷, 湿 润, 无 光 泽 3 大, 半 透 明, 圆 滑, 湿 润, 粘 稠, 有 光 泽 4 小, 乳 白, 圆 滑, 湿 润, 隆 起, 有 光 泽 5 小, 透 明, 圆 滑, 湿 润, 隆 起, 有 光 泽 6 小, 白 色, 不 规 则, 表 面 不 平, 湿 润, 无 光 泽 7 中, 白 色, 圆 形, 凸 起, 表 面 褶 皱, 湿 润, 无 光 泽 8 大, 白 色, 边 缘 齿 状, 湿 润, 扁 平, 无 光 泽 9 小, 白 色, 半 透 明, 圆 滑, 湿 润, 扁 平, 无 光 泽 样 品 一 中 细 菌 的 变 化 如 下 表 3.1.2 和 图 3.1.1, 经 过 一 周 发 酵 后 细 菌 种 类 剧 减, 仅 剩 1 号 和 2 号 两 种 菌, 但 总 含 菌 量 并 未 明 显 减 少 ; 两 周 后, 细 菌 种 类 仍 未 增 加, 但 总 含 菌 量 明 显 下 降 表 3.1.2 样 品 1 中 细 菌 含 量 变 化 ( 单 位 : 10 cfu/g) 样 品 1 2 3 4 5 6 7 8 9 总 含 量 1-1 1.75 0.6 0.25 4.9 1.75 0.3 0.15 \ \ 9.7 2-1 4.25 4.9 0.1 \ \ \ \ \ \ 9.25 3-1 4.15 2.0 \ \ 0.8 \ \ \ \ 6.95

382 1-1 细 菌 菌 落 图 (10-5 ) 2-1 细 菌 菌 落 图 (10-5 ) 3-1 细 菌 菌 落 图 (10-5 ) 图 3.1.1 样 品 1 细 菌 含 量 变 化 对 比 图 样 品 二 中 细 菌 的 变 化 如 下 表 3.1.3 和 图 3.1.2 样 品 二 经 过 一 周 发 酵 后 细 菌 种 类 剧 减, 仅 剩 1 号 和 2 号 两 种 菌, 且 总 含 菌 量 也 随 之 急 剧 下 降 ; 发 酵 两 周 后, 细 菌 种 类 仍 未 增 加, 总 含 菌 量 明 显 下 降 至 0.1 10 7 cfu/g 表 3.1.2 样 品 1 中 细 菌 含 量 变 化 ( 单 位 : 10 cfu/g) 样 品 1 2 3 4 5 6 7 8 9 总 含 量 1-2 0.5 0.05 \ 6.5 \ \ \ 1.0 0.5 8.55 2-2 0.3 0.55 \ \ \ \ \ \ \ 0.85 3-2 0.05 0.05 \ \ \ \ \ \ \ 0.1 1-2 细 菌 菌 落 图 (10-5 ) 2-2 细 菌 菌 落 图 (10-4 ) 3-2 细 菌 菌 落 图 (10-4 ) 图 3.1.2 样 品 2 细 菌 含 量 变 化 对 比 图 样 品 三 中 细 菌 的 变 化 如 下 表 3.1.4 和 图 3.1.3, 样 品 三 发 酵 起 始 含 菌 种 类 和 总 含 菌 量 都 较 低, 前 期 发 酵 过 程 中 变 化 不 明 显 表 3.1.4 样 品 3 中 细 菌 含 量 变 化 ( 单 位 : 10 cfu/g) 样 品 1 2 3 4 5 6 7 8 9 总 含 量 1-3 0.95 0.15 \ 0.55 \ \ \ \ \ 1.65 2-3 0.35 0.65 0.15 \ \ \ \ \ \ 1.15 3-3 0.85 1.1 \ \ 0.15 \ \ \ \ 2.1

383 1-3 细 菌 菌 落 图 (10-5 ) 2-3 细 菌 菌 落 图 (10-5 ) 3-3 细 菌 菌 落 图 (10-5 ) 图 3.1.3 样 品 3 细 菌 含 量 变 化 对 比 图 样 品 四 中 细 菌 的 变 化 如 下 表 3.1.5 和 图 3.1.4, 经 过 一 周 发 酵 后 细 菌 种 类 剧 减, 只 有 1 号 和 2 号 两 种 菌 含 量 较 高, 总 含 菌 量 明 显 减 少 ; 两 周 后, 细 菌 种 类 仍 未 增 加, 总 含 菌 量 下 降 已 不 明 显 表 3.1.2 样 品 4 中 细 菌 含 量 变 化 ( 单 位 : 10 cfu/g) 样 品 1 2 3 4 5 6 7 8 9 总 含 量 1-4 1.25 0.3 \ 1.65 1.05 \ 0.15 0.25 \ 4.65 2-4 0.95 1.05 0.1 0.05 \ \ \ \ \ 2.15 3-4 0.8 1.0 \ \ 0.25 \ \ \ \ 2.05 1-4 细 菌 菌 落 图 (10-5 ) 2-4 细 菌 菌 落 图 (10-5 ) 3-4 细 菌 菌 落 图 (10-5 ) 图 3.1.4 样 品 4 细 菌 含 量 变 化 对 比 图 样 品 五 中 细 菌 的 变 化 如 下 表 3.1.6 和 图 3.1.5, 经 过 一 周 发 酵 后 细 菌 种 类 剧 减, 仅 剩 1 号 和 2 号 两 种 菌, 且 这 两 种 菌 含 量 大 幅 增 加 ; 两 周 后, 细 菌 种 类 仍 未 增 加, 但 总 含 菌 量 明 显 下 降 表 3.1.6 样 品 5 中 细 菌 含 量 变 化 ( 单 位 : 10 cfu/g) 样 品 1 2 3 4 5 6 7 8 9 总 含 量 1-5 1.65 0.55 0.25 0.1 1.7 \ \ \ \ 4.25 2-5 3.95 2.35 \ \ \ \ \ \ \ 6.3 3-5 0.8 1.85 \ \ 0.55 \ \ \ \ 3.2

384 1-5 细 菌 菌 落 图 (10-5 ) 2-5 细 菌 菌 落 图 (10-5 ) 3-5 细 菌 菌 落 图 (10-5 ) 图 3.1.6 样 品 5 细 菌 含 量 变 化 对 比 图 3.2 垫 料 堆 肥 实 验 真 菌 分 离 结 果 以 第 一 批 堆 肥 垫 料 为 对 照, 共 分 离 出 9 株 真 菌, 其 菌 落 特 征 如 下 表 3.2.1 表 3.2.1 样 品 分 离 的 细 菌 菌 株 特 征 菌 株 编 号 菌 落 形 态 特 征 1 大, 青 色, 圆 形, 扁 平 2 中, 白 色, 圆 形, 菌 丝 长, 竖 起 3 大, 绿 色, 菌 丝 短, 松 散 呈 点 状, 扁 平 4 大, 白 色 带 黑 色 点 状, 短, 松 散 5 小, 白 色, 圆 形, 紧 密, 凸 起 6 中, 白 色 圆 形, 菌 丝 短, 絮 状 7 小, 圆 形, 反 面 黄 色, 正 面 绿 色, 紧 密, 凸 起 8 中, 反 面 白 色, 正 面 带 点 黄 色, 菌 丝 短, 松 散 9 大, 白 色, 菌 丝 短, 松 散 呈 点 状, 扁 平 样 品 一 中 真 菌 的 变 化 如 下 表 3.2.2 和 图 3.2.1, 经 过 一 周 发 酵 后 真 菌 种 类 剧 减, 仅 剩 1 号 真 菌, 总 含 菌 量 也 明 显 减 少 ; 两 周 后, 总 含 菌 量 已 持 续 下 降 至 0.2 10 6 cfu/g 表 3.2.2 样 品 1 中 真 菌 含 量 变 化 ( 单 位 : 10 cfu/g) 样 品 1 2 3 4 5 6 7 8 9 总 含 量 1-1 16 1.5 0.5 0.5 \ \ \ \ \ 18.5 2-1 1.65 \ \ \ \ \ \ \ \ 1.65 3-1 0.2 \ \ \ \ \ \ \ \ 0.2

385 1-1 真 菌 分 离 图 (10-5 ) 2-1 真 菌 分 离 图 (10-4 ) 3-1 真 菌 分 离 图 (10-4 ) 图 3.2.1 样 品 1 真 菌 含 量 变 化 对 比 图 样 品 二 中 真 菌 的 变 化 如 下 表 3.2.3 和 图 3.2.2, 经 过 一 周 发 酵 后 真 菌 种 类 明 显 减 少, 总 含 菌 量 也 明 显 减 少 ; 两 周 后, 总 含 菌 量 已 持 续 下 降 至 0.35 10 6 cfu/g 表 3.2.2 样 品 1 中 真 菌 含 量 变 化 ( 单 位 : 10 cfu/g) 样 品 1 2 3 4 5 6 7 8 9 总 含 量 1-2 1.5 \ \ \ 4.0 1.5 4.5 \ \ 11.5 2-2 0.55 0.75 0.2 \ \ \ \ \ \ 0.85 3-2 0.3 \ \ \ \ 0.05 \ \ \ 0.35 1-2 真 菌 分 离 图 (10-5 ) 2-2 真 菌 分 离 图 (10-4 ) 3-2 真 菌 分 离 图 (10-4 ) 图 3.2.2 样 品 2 真 菌 含 量 变 化 对 比 图 样 品 三 中 真 菌 的 变 化 如 下 表 3.2.4 和 图 3.2.3, 经 过 一 周 发 酵 后 真 菌 总 含 菌 量 也 明 显 减 少 ; 两 周 后, 仅 剩 1 号 真 菌, 总 含 菌 量 已 持 续 下 降 至 2.9 10 6 cfu/g 表 3.2.4 样 品 3 中 真 菌 含 量 变 化 ( 单 位 : 10 cfu/g) 样 品 1 2 3 4 5 6 7 8 9 总 含 量 1-3 11 1.5 \ 0.5 \ \ \ 0.5 \ 13.5 2-3 5.0 0.05 0.35 \ \ \ \ \ \ 5.4 3-3 2.9 \ \ \ \ \ \ \ \ 2.9

386 1-3 真 菌 分 离 图 (10-5 ) 2-3 真 菌 分 离 图 (10-4 ) 3-3 真 菌 分 离 图 (10-4 ) 图 3.2.3 样 品 3 真 菌 含 量 变 化 对 比 图 样 品 四 中 真 菌 的 变 化 如 下 表 3.2.5 和 图 3.2.4, 经 过 一 周 发 酵 后 真 菌 总 含 菌 量 也 明 显 减 少 ; 两 周 后, 总 含 菌 量 已 持 续 下 降 至 1.4 10 6 cfu/g 表 3.2.5 样 品 4 中 真 菌 含 量 变 化 ( 单 位 : 10 cfu/g) 样 品 1 2 3 4 5 6 7 8 9 总 含 量 1-4 24.5 1.5 \ 0.5 \ \ \ 0.5 \ 27 2-4 4.2 0.6 \ \ \ \ \ \ \ 4.8 3-4 1.3 0.05 \ \ \ 0.05 \ \ \ 1.4 1-4 真 菌 分 离 图 (10-5 ) 2-4 真 菌 分 离 图 (10-4 ) 3-4 真 菌 分 离 图 (10-4 ) 图 3.2.4 样 品 4 真 菌 含 量 变 化 对 比 图 样 品 五 中 真 菌 的 变 化 如 下 表 3.2.6 和 图 3.2.5, 五 号 样 品 中 起 始 含 菌 种 类 很 少, 发 酵 一 周 后 总 含 菌 量 明 显 减 少 ; 两 周 后, 总 含 菌 量 已 持 续 下 降 至 1.35 10 6 cfu/g 表 3.2.2 样 品 1 中 真 菌 含 量 变 化 ( 单 位 : 10 cfu/g) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 总 含 量 1-5 25 \ \ \ \ \ \ \ 0.5 26 2-5 1.6 \ \ \ \ \ \ \ \ 1.6 3-5 1.35 \ \ \ \ \ \ \ \ 1.35

387 1-5 真 菌 分 离 图 (10-5 ) 2-5 真 菌 分 离 图 (10-4 ) 3-5 真 菌 分 离 图 (10-4 ) 图 3.2.5 样 品 5 真 菌 含 量 变 化 对 比 图 4. 试 验 结 论 (1) 经 过 一 周 发 酵, 样 品 温 度 升 高, 样 品 中 含 菌 量 明 显 减 少, 虽 然 样 品 五 的 细 菌 总 含 菌 量 没 有 下 降, 但 其 含 菌 总 类 明 显 下 降 ; 经 过 一 周 发 酵 后, 样 品 中 仍 大 量 存 在 的 细 菌 为 细 菌 1 号 和 2 号, 真 菌 1 号 (2) 发 酵 第 二 周, 样 品 中 菌 含 量 仍 有 下 降, 但 随 着 温 度 的 下 降, 部 分 样 品 中 下 降 已 不 太 明 显, 甚 至 有 所 升 高 5 参 考 文 献 [1] 刘 波, 朱 昌 雄. 微 生 物 发 酵 床 零 污 染 养 猪 技 术 研 究 与 应 用 [M]. 北 京 : 中 国 农 业 科 学 技 术 出 版 社,2009, 05. 试 验 设 计 : 试 验 负 责 : 朱 育 菁 试 验 人 员 : 王 洁

388 2010-08-18 承 担 单 位 : 福 建 省 农 科 院 农 业 生 物 资 源 研 究 所 试 验 设 计 : 试 验 项 目 : 垫 料 堆 肥 实 验 总 微 生 物 量 的 测 定 ( 三 ) 试 验 人 员 : 王 洁 试 验 负 责 : 朱 育 菁 报 告 日 期 :2011-08-18 计 数 月 份 :2011 年 08 月 研 究 资 格 系 数 (0.5-1.0) 实 验 设 计 系 数 (0.9-1.0 0.9-1.0) 报 告 得 分 总 分 实 验 设 计 实 验 记 载 实 验 分 析 实 验 简 报 实 验 文 章 1-20% 21-40% 41-60% 61-80% 81-100% 1%-5% 设 计 不 足, 实 施 错 误 6%-10% 设 计 不 全, 实 验 无 果 11%-15% 设 计 可 以, 实 施 不 全 16%-20% 设 计 完 整, 分 布 实 施 21%-25% 实 验 不 全, 记 载 无 果 26%-30% 实 验 不 足, 记 载 不 全 31%-35% 独 立 实 验, 记 载 不 全 36%-40% 分 布 实 验, 记 载 完 整 41%-45% 目 的 明 确, 实 验 完 成 46%-50% 实 验 完 整, 记 载 清 晰 51%-55% 实 验 系 统, 结 果 可 信 56%-60% 实 验 创 新, 分 析 清 晰 61%-65% 实 验 创 新, 结 论 清 晰 66%-70% 实 验 完 整, 统 计 清 晰 71%-75% 实 验 系 统, 数 据 可 靠 76%-80% 报 告 完 整, 文 章 雏 形 81%-85% 结 构 合 理, 分 析 有 据 86%-90% 逻 辑 清 晰, 统 计 合 理 91%-95% 图 表 完 整, 写 作 流 畅 96%-100% 文 献 完 整, 发 表 水 平 福 建 省 农 业 科 学 院 农 业 生 物 资 源 研 究 所 农 业 微 生 物 研 究 中 心 电 话 : 0591-87882571, 传 真 : 0591-87882571 fjat.yzxz.com

389 1. 试 验 目 的 传 统 养 猪 模 式 产 生 的 大 量 粪 便 给 环 境 带 来 极 大 的 负 担, 造 成 严 重 的 污 染 而 目 前, 发 酵 床 养 猪 是 一 个 非 常 热 门 的 话 题, 又 称 零 污 染 养 猪, 即 从 样 品 中 分 离 筛 选 出 一 种 功 能 微 生 物 菌 种, 然 后 通 过 特 定 的 营 养 剂 的 培 养 形 成 土 著 微 生 物 原 种, 将 原 种 按 一 定 比 例 掺 拌 锯 末 谷 壳 泥 土, 然 后 控 制 一 定 的 条 件 让 其 发 酵 成 优 势 群 落, 最 后 制 成 猪 舍 的 垫 料 把 垫 料 在 猪 舍 铺 设 成 一 定 厚 度 的 垫 料 层 利 用 生 猪 拱 翻 的 生 活 习 性, 使 垫 料 和 猪 粪 尿 充 分 混 合, 通 过 样 品 微 生 物 菌 落 的 分 解 发 酵, 使 猪 粪 尿 中 [1] 的 有 机 物 质 得 到 充 分 的 分 解 和 转 化 并 且 同 时 对 猪 配 合 以 专 一 性 的 益 生 菌, 最 终 达 到 降 解 消 化 猪 粪 便, 除 去 异 味 和 无 害 化 的 目 的, 是 一 种 无 污 染 零 排 放 的 新 型 环 保 养 猪 技 术 发 酵 床 养 猪 模 式 中 垫 料 的 原 材 料 由 谷 壳 和 木 屑 组 成, 由 于 目 前 生 产 上 该 原 材 料 紧 缺, 价 格 较 高, 急 需 寻 找 其 他 廉 价 的 农 产 品 废 弃 物 作 为 新 原 材 料 本 实 验 用 菌 渣 和 椰 子 壳 替 代 垫 料 原 材 料 进 行 发 酵, 并 模 拟 猪 场 零 排 放 模 式 将 猪 粪 直 接 加 入 垫 料 中 进 行 堆 肥 实 验, 采 用 稀 释 涂 布 平 板 法 研 究 堆 肥 发 酵 过 程 中 微 生 物 的 变 化 2. 试 验 方 法 2.1 供 试 材 料 福 清 渔 溪 农 场 的 堆 肥 实 验 样 品 组 成 如 下 表 2-1: 表 2-1 垫 料 样 品 配 方 组 合 设 计 编 号 组 合 1 菌 渣 + 椰 子 壳 (1;2) 2 谷 壳 + 锯 末 (1:1) 3 菌 渣 4 菌 渣 + 椰 子 壳 (1:1) 5 椰 子 壳 2011 年 07 月 18 日 在 不 同 配 比 的 垫 料 中 各 加 入 50 公 斤 新 鲜 猪 粪, 堆 积 发 酵 采 样 批 次 及 信 息 见 表 2-2: 表 2-2 采 样 批 次 信 息 批 次 时 间 备 注 第 一 批 2011-07-18 无 第 二 批 2011-07-23 无 第 三 批 2011-07-29 采 样 后 翻 堆 第 四 批 2011-08-05 无 第 五 批 2011-08-12 采 样 后 翻 堆 2.2 实 验 器 材 2.2.1 培 养 基 牛 肉 膏 蛋 白 胨 培 养 基 (NA): 牛 肉 浸 膏 3g 蛋 白 胨 5g 葡 萄 糖 10g 琼 脂 15-20g 水 定 容 1000ml ph 7.2-7.6 马 铃 薯 葡 萄 糖 培 养 基 (PDA): 马 铃 薯 200g 葡 萄 糖 20g 琼 脂 15-20g, 配 制 时 将 土 豆 切 块 煮 沸 后 过 滤, 加 葡 萄 糖, 蒸 馏 水 定 容 1000ml

390 2.2.2 溶 液 或 试 剂 盛 有 9ml 无 菌 水 的 18 18 试 管 盛 90ml 无 菌 水 并 带 有 玻 璃 珠 的 250ml 三 角 瓶 2.2.3 仪 器 或 其 他 用 具 采 样 袋 无 菌 涂 布 棒 灭 菌 试 管 1ml 移 液 枪 无 菌 1ml 移 液 枪 头 200 μl 移 液 枪 无 菌 200 μl 移 液 枪 头 接 种 环 无 菌 培 养 皿 酒 精 灯 超 净 工 作 台 振 荡 器 等 2.3 实 验 方 法 2.3.1 制 备 样 品 稀 释 液 称 取 样 品 10g, 无 菌 条 件 下 操 作, 放 入 盛 有 90ml 无 菌 水 ( 带 玻 璃 珠 ) 的 三 角 烧 瓶 中, 振 荡 约 20min, 使 样 品 与 水 充 分 混 合, 配 成 10-1 的 稀 释 度, 再 从 10-1 液 中 吸 取 1ml 悬 液 加 入 盛 有 9ml 无 菌 水 的 试 管 中 充 分 混 匀, 配 制 成 10-2 稀 释 度 样 品 溶 液, 以 此 类 推 配 制 10-3 10-4 10-5 10-6 不 同 稀 释 度 的 样 品 溶 液 2.3.2 涂 布 平 板 培 养 超 净 台 上 无 菌 操 作, 取 10-5 10-6 两 个 稀 释 度 溶 液, 振 荡 器 上 振 荡 10-20s 后 分 别 吸 取 100μL 至 NA 和 PDA 平 板 中 央, 用 涂 布 棒 涂 匀 后 室 温 静 置 会, 使 菌 液 充 分 吸 附 到 培 养 基 里 而 后 平 板 倒 置,NA 平 板 于 30 恒 温 培 养 箱 中 培 养 1 天, 观 察 计 数 ;PDA 平 板 于 28 恒 温 培 养 箱 中 培 养 2 天 后, 观 察 计 数 每 个 梯 度 重 复 2 次 2.3.3 结 果 计 数 肉 眼 观 察 计 数, 算 出 同 一 稀 释 度 的 平 均 菌 落 数, 按 公 式 计 算 : 每 克 菌 落 形 成 单 位 = 同 一 稀 释 度 平 均 菌 落 数 10 稀 释 倍 数 ( 单 位 cfu/g) 3. 试 验 结 果 3.1 垫 料 堆 肥 实 验 细 菌 分 离 结 果 以 第 一 批 堆 肥 垫 料 为 对 照, 共 分 离 出 9 株 细 菌, 其 菌 落 特 征 如 下 表 3.1.1 表 3.1.1 样 品 分 离 的 细 菌 菌 株 特 征 菌 株 编 号 菌 落 形 态 特 征 1 大, 白 色, 圆 形, 扁 平, 表 面 蜡 状, 湿 润, 无 光 泽 2 大, 白 色, 形 状 不 规 则, 表 面 凹 陷, 湿 润, 无 光 泽 3 大, 半 透 明, 圆 滑, 湿 润, 粘 稠, 有 光 泽 4 小, 乳 白, 圆 滑, 湿 润, 隆 起, 有 光 泽 5 小, 透 明, 圆 滑, 湿 润, 隆 起, 有 光 泽 6 小, 白 色, 不 规 则, 表 面 不 平, 湿 润, 无 光 泽 7 中, 白 色, 圆 形, 凸 起, 表 面 褶 皱, 湿 润, 无 光 泽 8 大, 白 色, 边 缘 齿 状, 湿 润, 扁 平, 无 光 泽 9 小, 白 色, 半 透 明, 圆 滑, 湿 润, 扁 平, 无 光 泽 样 品 一 中 细 菌 的 变 化 如 下 表 3.1.2, 翻 堆 后 经 过 一 周 发 酵 细 菌 继 续 减 少, 翻 堆 两 周 后, 总 含 菌 量 开 始 上 升, 但 细 菌 种 类 并 无 变 化

391 表 3.1.2 样 品 1 中 细 菌 含 量 变 化 ( 单 位 : 10 cfu/g) 样 品 1 2 3 4 5 6 7 8 9 总 含 量 1-1 1.75 0.6 0.25 4.9 1.75 0.3 0.15 \ \ 9.7 2-1 4.25 4.9 0.1 \ \ \ \ \ \ 9.25 3-1 4.15 2.0 \ \ 0.8 \ \ \ \ 6.95 4-1 1.35 3.55 \ \ \ \ \ \ \ 4.9 5-1 4.25 1.8 \ \ \ \ \ \ \ 6.05 样 品 二 中 细 菌 的 变 化 如 下 表 3.1.3, 翻 堆 后 经 过 一 周 发 酵 细 菌 继 续 减 少, 翻 堆 两 周 后, 总 含 菌 量 开 始 上 升, 但 细 菌 种 类 并 无 变 化 表 3.1.3 样 品 2 中 细 菌 含 量 变 化 ( 单 位 : 10 cfu/g) 样 品 1 2 3 4 5 6 7 8 9 总 含 量 1-2 0.5 0.05 \ 6.5 \ \ \ 1.0 0.5 8.55 2-2 0.3 0.55 \ \ \ \ \ \ \ 0.85 3-2 0.05 0.05 \ \ \ \ \ \ \ 0.1 4-2 0.035 0.011 \ \ \ \ \ \ \ 0.046 5-2 0.014 0.085 \ \ \ \ \ \ \ 0.099 样 品 三 中 细 菌 的 变 化 如 下 表 3.1.4, 翻 堆 后 经 过 一 周 发 酵 细 菌 继 续 减 少, 翻 堆 两 周 后, 总 含 菌 量 开 始 上 升, 但 细 菌 种 类 并 无 变 化 表 3.1.4 样 品 3 中 细 菌 含 量 变 化 ( 单 位 : 10 cfu/g) 样 品 1 2 3 4 5 6 7 8 9 总 含 量 1-3 0.95 0.15 \ 0.55 \ \ \ \ \ 1.65 2-3 0.35 0.65 0.15 \ \ \ \ \ \ 1.15 3-3 0.85 1.1 \ \ 0.15 \ \ \ \ 2.1 4-3 0.3 0.5 \ \ \ \ \ \ \ 0.8 5-3 1.05 0.6 \ \ \ 0.3 \ \ \ 1.95 样 品 四 中 细 菌 的 变 化 如 下 表 3.1.5, 翻 堆 后 经 过 一 周 发 酵 细 菌 总 含 菌 量 已 经 开 始 回 升, 翻 堆 两 周 后, 总 含 菌 量 下 将, 但 细 菌 种 类 并 无 变 化 表 3.1.5 样 品 4 中 细 菌 含 量 变 化 ( 单 位 : 10 cfu/g) 样 品 1 2 3 4 5 6 7 8 9 总 含 量 1-4 1.25 0.3 \ 1.65 1.05 \ 0.15 0.25 \ 4.65 2-4 0.95 1.05 0.1 0.05 \ \ \ \ \ 2.15 3-4 0.8 1.0 \ \ 0.25 \ \ \ \ 2.05 4-4 1.4 1.25 \ \ \ \ \ \ \ 2.65 5-4 0.7 0.55 \ \ \ 0.6 \ \ \ 1.85 样 品 五 中 细 菌 的 变 化 如 下 表 3.1.6, 翻 堆 后 经 过 一 周 发 酵 细 菌 继 续 减 少, 翻 堆 两 周 后, 总 含 菌 量 继 续 下 降, 仍 未 回 升, 但 细 菌 种 类 并 无 变 化

392 表 3.1.6 样 品 5 中 细 菌 含 量 变 化 ( 单 位 : 10 cfu/g) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 总 含 量 1-5 1.65 0.55 0.25 0.1 1.7 \ \ \ \ 4.25 2-5 3.95 2.35 \ \ \ \ \ \ \ 6.3 3-5 0.8 1.85 \ \ 0.55 \ \ \ \ 3.2 4-5 0.9 1.45 \ \ \ \ \ \ \ 2.35 5-5 1.55 0.6 \ \ \ \ \ \ \ 2.15 3.2 垫 料 堆 肥 实 验 真 菌 分 离 结 果 以 第 一 批 堆 肥 垫 料 为 对 照, 共 分 离 出 9 株 真 菌, 其 菌 落 特 征 如 下 表 3.2.1 表 3.2.1 样 品 分 离 的 真 菌 菌 株 特 征 菌 株 编 号 菌 落 形 态 特 征 1 大, 青 色, 圆 形, 扁 平 2 中, 白 色, 圆 形, 菌 丝 长, 竖 起 3 大, 绿 色, 菌 丝 短, 松 散 呈 点 状, 扁 平 4 大, 白 色 带 黑 色 点 状, 短, 松 散 5 小, 白 色, 圆 形, 紧 密, 凸 起 6 中, 白 色 圆 形, 菌 丝 短, 絮 状 7 小, 圆 形, 反 面 黄 色, 正 面 绿 色, 紧 密, 凸 起 8 中, 反 面 白 色, 正 面 带 点 黄 色, 菌 丝 短, 松 散 9 大, 白 色, 菌 丝 短, 松 散 呈 点 状, 扁 平 样 品 一 中 真 菌 的 变 化 如 下 表 3.2.2, 翻 堆 后 经 过 一 周 发 酵 真 菌 总 含 量 回 升, 翻 堆 两 周 后, 真 总 含 菌 量 开 始 下 降 表 3.2.2 样 品 1 中 真 菌 含 量 变 化 ( 单 位 : 10 cfu/g) 样 品 1 2 3 4 5 6 7 8 9 总 含 量 1-1 16 1.5 0.5 0.5 \ \ \ \ \ 18.5 2-1 1.65 \ \ \ \ \ \ \ \ 1.65 3-1 0.2 \ \ \ \ \ \ \ \ 0.2 4-1 0.25 \ \ \ 0.15 \ \ \ \ 0.4 5-1 0.25 0.01 \ \ \ \ \ \ \ 0.26 样 品 二 中 真 菌 的 变 化 如 下 表 3.2.3, 翻 堆 后 经 过 一 周 发 酵 真 菌 总 含 量 回 升, 翻 堆 两 周 后, 真 总 含 菌 量 开 始 下 降 表 3.2.3 样 品 2 中 真 菌 含 量 变 化 ( 单 位 : 10 cfu/g) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 总 含 量 1-2 1.5 \ \ \ 4.0 1.5 4.5 \ \ 11.5 2-2 0.55 0.75 0.2 \ \ \ \ \ \ 0.85 3-2 0.3 \ \ \ \ 0.05 \ \ \ 0.35 4-2 0.6 0.05 \ \ 0.4 \ \ \ \ 1.05 5-2 0.55 0.1 \ \ \ \ \ \ \ 0.65

393 样 品 三 中 真 菌 的 变 化 如 下 表 3.2.4, 翻 堆 后 经 过 一 周 发 酵 真 菌 总 含 量 回 升, 翻 堆 两 周 后, 真 总 含 菌 量 开 始 下 降 表 3.2.4 样 品 3 中 真 菌 含 量 变 化 ( 单 位 : 10 cfu/g) 样 品 1 2 3 4 5 6 7 8 9 总 含 量 1-3 11 1.5 \ 0.5 \ \ \ 0.5 \ 13.5 2-3 5.0 0.05 0.35 \ \ \ \ \ \ 5.4 3-3 2.9 \ \ \ \ \ \ \ \ 2.9 4-3 5.1 \ \ \ \ \ \ \ \ 5.1 5-3 1.6 0.2 \ \ 0.1 \ \ \ \ 1.9 样 品 四 中 真 菌 的 变 化 如 下 表 3.2.5, 翻 堆 后 经 过 一 周 发 酵 真 菌 总 含 量 回 升, 翻 堆 两 周 后, 真 总 含 菌 量 开 始 下 降 表 3.2.5 样 品 4 中 真 菌 含 量 变 化 ( 单 位 : 10 cfu/g) 样 品 1 2 3 4 5 6 7 8 9 总 含 量 1-4 24.5 1.5 \ 0.5 \ \ \ 0.5 \ 27 2-4 4.2 0.6 \ \ \ \ \ \ \ 4.8 3-4 1.3 0.05 \ \ \ 0.05 \ \ \ 1.4 4-4 2.7 \ \ \ \ \ \ \ \ 2.7 5-4 2.5 0.1 \ \ \ \ \ \ \ 2.6 样 品 五 中 真 菌 的 变 化 如 下 表 3.2.6, 翻 堆 后 经 过 一 周 发 酵 真 菌 总 含 量 继 续 下 降, 翻 堆 两 周 后, 真 总 含 菌 量 回 升 并 不 明 显 表 3.2.6 样 品 5 中 真 菌 含 量 变 化 ( 单 位 : 10 cfu/g) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 总 含 量 1-5 25 \ \ \ \ \ \ \ 0.5 26 2-5 1.6 \ \ \ \ \ \ \ \ 1.6 3-5 1.35 \ \ \ \ \ \ \ \ 1.35 4-5 0.2 \ \ \ \ \ \ \ \ 0.2 5-5 0.25 \ \ \ \ \ \ \ \ 0.25 4. 试 验 结 论 (1) 翻 堆 后 经 过 一 周 发 酵, 样 品 温 度 升 高, 样 品 细 菌 总 含 菌 量 继 续 下 降, 翻 堆 两 周 后, 样 品 中 细 菌 总 含 量 开 始 回 升 (2) 翻 堆 后 经 过 一 周 发 酵, 样 品 真 菌 总 含 菌 量 有 所 回 升, 翻 堆 两 周 后, 样 品 中 真 菌 总 含 量 开 始 下 降 5 参 考 文 献 [1] 刘 波, 朱 昌 雄. 微 生 物 发 酵 床 零 污 染 养 猪 技 术 研 究 与 应 用 [M]. 北 京 : 中 国 农 业 科 学 技 术 出 版 社,2009, 05.

试 验 设 计 : 试 验 负 责 : 朱 育 菁 试 验 人 员 : 王 洁 394

395 2010-08-30 承 担 单 位 : 福 建 省 农 科 院 农 业 生 物 资 源 研 究 所 试 验 设 计 : 试 验 项 目 : 垫 料 堆 肥 实 验 总 微 生 物 量 的 测 定 ( 四 ) 试 验 人 员 : 王 洁 试 验 负 责 : 朱 育 菁 报 告 日 期 :2011-08-30 计 数 月 份 :2011 年 08 月 研 究 资 格 系 数 (0.5-1.0) 实 验 设 计 系 数 (0.9-1.0 0.9-1.0) 报 告 得 分 总 分 实 验 设 计 实 验 记 载 实 验 分 析 实 验 简 报 实 验 文 章 1-20% 21-40% 41-60% 61-80% 81-100% 1%-5% 设 计 不 足, 实 施 错 误 6%-10% 设 计 不 全, 实 验 无 果 11%-15% 设 计 可 以, 实 施 不 全 16%-20% 设 计 完 整, 分 布 实 施 21%-25% 实 验 不 全, 记 载 无 果 26%-30% 实 验 不 足, 记 载 不 全 31%-35% 独 立 实 验, 记 载 不 全 36%-40% 分 布 实 验, 记 载 完 整 41%-45% 目 的 明 确, 实 验 完 成 46%-50% 实 验 完 整, 记 载 清 晰 51%-55% 实 验 系 统, 结 果 可 信 56%-60% 实 验 创 新, 分 析 清 晰 61%-65% 实 验 创 新, 结 论 清 晰 66%-70% 实 验 完 整, 统 计 清 晰 71%-75% 实 验 系 统, 数 据 可 靠 76%-80% 报 告 完 整, 文 章 雏 形 81%-85% 结 构 合 理, 分 析 有 据 86%-90% 逻 辑 清 晰, 统 计 合 理 91%-95% 图 表 完 整, 写 作 流 畅 96%-100% 文 献 完 整, 发 表 水 平 福 建 省 农 业 科 学 院 农 业 生 物 资 源 研 究 所 农 业 微 生 物 研 究 中 心 电 话 : 0591-87882571, 传 真 : 0591-87882571 fjat.yzxz.com

396 1. 试 验 目 的 传 统 养 猪 模 式 产 生 的 大 量 粪 便 给 环 境 带 来 极 大 的 负 担, 造 成 严 重 的 污 染 而 目 前, 发 酵 床 养 猪 是 一 个 非 常 热 门 的 话 题, 又 称 零 污 染 养 猪, 即 从 样 品 中 分 离 筛 选 出 一 种 功 能 微 生 物 菌 种, 然 后 通 过 特 定 的 营 养 剂 的 培 养 形 成 土 著 微 生 物 原 种, 将 原 种 按 一 定 比 例 掺 拌 锯 末 谷 壳 泥 土, 然 后 控 制 一 定 的 条 件 让 其 发 酵 成 优 势 群 落, 最 后 制 成 猪 舍 的 垫 料 把 垫 料 在 猪 舍 铺 设 成 一 定 厚 度 的 垫 料 层 利 用 生 猪 拱 翻 的 生 活 习 性, 使 垫 料 和 猪 粪 尿 充 分 混 合, 通 过 样 品 微 生 物 菌 落 的 分 解 发 酵, 使 猪 粪 尿 中 的 有 机 物 质 得 到 充 分 的 分 解 和 转 化 [1] 并 且 同 时 对 猪 配 合 以 专 一 性 的 益 生 菌, 最 终 达 到 降 解 消 化 猪 粪 便, 除 去 异 味 和 无 害 化 的 目 的, 是 一 种 无 污 染 零 排 放 的 新 型 环 保 养 猪 技 术 发 酵 床 养 猪 模 式 中 垫 料 的 原 材 料 由 谷 壳 和 木 屑 组 成, 由 于 目 前 生 产 上 该 原 材 料 紧 缺, 价 格 较 高, 急 需 寻 找 其 他 廉 价 的 农 产 品 废 弃 物 作 为 新 原 材 料 本 实 验 用 菌 渣 和 椰 子 壳 替 代 垫 料 原 材 料 进 行 发 酵, 并 模 拟 猪 场 零 排 放 模 式 将 猪 粪 直 接 加 入 垫 料 中 进 行 堆 肥 实 验, 采 用 稀 释 涂 布 平 板 法 研 究 堆 肥 发 酵 过 程 中 微 生 物 的 变 化 2. 试 验 方 法 2.1 供 试 材 料 福 清 渔 溪 农 场 的 堆 肥 实 验 样 品 组 成 如 下 表 2-1: 表 2-1 垫 料 样 品 配 方 组 合 设 计 编 号 组 合 1 菌 渣 + 椰 子 壳 (1;2) 2 谷 壳 + 锯 末 (1:1) 3 菌 渣 4 菌 渣 + 椰 子 壳 (1:1) 5 椰 子 壳 2011 年 07 月 18 日 在 不 同 配 比 的 垫 料 中 各 加 入 50 公 斤 新 鲜 猪 粪, 堆 积 发 酵 采 样 批 次 及 信 息 见 表 2-2: 表 2-2 采 样 批 次 信 息 批 次 时 间 备 注 第 一 批 2011-07-18 无 第 二 批 2011-07-23 无 第 三 批 2011-07-29 采 样 后 翻 堆 第 四 批 2011-08-05 无 第 五 批 2011-08-12 采 样 后 翻 堆 第 六 批 2011-08-19 无 第 七 批 2011-08-26 无 2.2 实 验 器 材 2.2.1 培 养 基 牛 肉 膏 蛋 白 胨 培 养 基 (NA): 牛 肉 浸 膏 3g 蛋 白 胨 5g 葡 萄 糖 10g 琼 脂 15-20g 水 定 容 1000ml ph 7.2-7.6

397 马 铃 薯 葡 萄 糖 培 养 基 (PDA): 马 铃 薯 200g 葡 萄 糖 20g 琼 脂 15-20g, 配 制 时 将 土 豆 切 块 煮 沸 后 过 滤, 加 葡 萄 糖, 蒸 馏 水 定 容 1000ml 2.2.2 溶 液 或 试 剂 盛 有 9ml 无 菌 水 的 18 18 试 管 盛 90ml 无 菌 水 并 带 有 玻 璃 珠 的 250ml 三 角 瓶 2.2.3 仪 器 或 其 他 用 具 采 样 袋 无 菌 涂 布 棒 灭 菌 试 管 1ml 移 液 枪 无 菌 1ml 移 液 枪 头 200 μl 移 液 枪 无 菌 200 μl 移 液 枪 头 接 种 环 无 菌 培 养 皿 酒 精 灯 超 净 工 作 台 振 荡 器 等 2.3 实 验 方 法 2.3.1 制 备 样 品 稀 释 液 称 取 样 品 10g, 无 菌 条 件 下 操 作, 放 入 盛 有 90ml 无 菌 水 ( 带 玻 璃 珠 ) 的 三 角 烧 瓶 中, 振 荡 约 20min, 使 样 品 与 水 充 分 混 合, 配 成 10-1 的 稀 释 度, 再 从 10-1 液 中 吸 取 1ml 悬 液 加 入 盛 有 9ml 无 菌 水 的 试 管 中 充 分 混 匀, 配 制 成 10-2 稀 释 度 样 品 溶 液, 以 此 类 推 配 制 10-3 10-4 10-5 10-6 不 同 稀 释 度 的 样 品 溶 液 2.3.2 涂 布 平 板 培 养 超 净 台 上 无 菌 操 作, 取 10-5 10-6 两 个 稀 释 度 溶 液, 振 荡 器 上 振 荡 10-20s 后 分 别 吸 取 100μL 至 NA 和 PDA 平 板 中 央, 用 涂 布 棒 涂 匀 后 室 温 静 置 会, 使 菌 液 充 分 吸 附 到 培 养 基 里 而 后 平 板 倒 置,NA 平 板 于 30 恒 温 培 养 箱 中 培 养 1 天, 观 察 计 数 ;PDA 平 板 于 28 恒 温 培 养 箱 中 培 养 2 天 后, 观 察 计 数 每 个 梯 度 重 复 2 次 2.3.3 结 果 计 数 肉 眼 观 察 计 数, 算 出 同 一 稀 释 度 的 平 均 菌 落 数, 按 公 式 计 算 : 每 克 菌 落 形 成 单 位 = 同 一 稀 释 度 平 均 菌 落 数 10 稀 释 倍 数 ( 单 位 cfu/g) 3. 试 验 结 果 3.1 垫 料 堆 肥 实 验 细 菌 分 离 结 果 以 第 一 批 堆 肥 垫 料 为 对 照, 共 分 离 出 9 株 细 菌, 其 菌 落 特 征 如 下 表 3.1.1 表 3.1.1 样 品 分 离 的 细 菌 菌 株 特 征 菌 株 编 号 菌 落 形 态 特 征 1 大, 白 色, 圆 形, 扁 平, 表 面 蜡 状, 湿 润, 无 光 泽 2 大, 白 色, 形 状 不 规 则, 表 面 凹 陷, 湿 润, 无 光 泽 3 大, 半 透 明, 圆 滑, 湿 润, 粘 稠, 有 光 泽 4 小, 乳 白, 圆 滑, 湿 润, 隆 起, 有 光 泽 5 小, 透 明, 圆 滑, 湿 润, 隆 起, 有 光 泽 6 小, 白 色, 不 规 则, 表 面 不 平, 湿 润, 无 光 泽 7 中, 白 色, 圆 形, 凸 起, 表 面 褶 皱, 湿 润, 无 光 泽 8 大, 白 色, 边 缘 齿 状, 湿 润, 扁 平, 无 光 泽 9 小, 白 色, 半 透 明, 圆 滑, 湿 润, 扁 平, 无 光 泽 样 品 一 中 细 菌 的 变 化 如 下 表 3.1.2, 样 品 一 中 细 菌 含 量 较 高, 经 一 次 高 温 发 酵 后 细 菌 种 类 和 含 量 都 有 较 明 显 下 降, 而 后 续 发 酵 过 程 中 变 化 不 明 显

398 表 3.1.2 样 品 2 中 细 菌 含 量 变 化 ( 单 位 : 10 cfu/g) 样 品 1 2 3 4 5 6 7 8 9 总 含 量 1-1 1.75 0.6 0.25 4.9 1.75 0.3 0.15 \ \ 9.7 2-1 4.25 4.9 0.1 \ \ \ \ \ \ 9.25 3-1 4.15 2.0 \ \ 0.8 \ \ \ \ 6.95 4-1 1.35 3.55 \ \ \ \ \ \ \ 4.9 5-1 4.25 1.8 \ \ \ \ \ \ \ 6.05 6-1 4.1 1.2 \ \ \ \ \ \ \ 5.3 7-1 3.3 3.15 \ \ \ \ \ \ \ 6.45 样 品 二 中 细 菌 的 变 化 如 下 表 3.1.3, 样 品 二 初 始 细 菌 含 量 较 高, 经 一 次 高 温 发 酵 后 急 剧 下 降, 后 续 发 酵 过 程 中 细 菌 含 量 一 直 较 低, 无 明 显 回 升 表 3.1.3 样 品 3 中 细 菌 含 量 变 化 ( 单 位 : 10 cfu/g) 样 品 1 2 3 4 5 6 7 8 9 总 含 量 1-2 0.5 0.05 \ 6.5 \ \ \ 1.0 0.5 8.55 2-2 0.3 0.55 \ \ \ \ \ \ \ 0.85 3-2 0.05 0.05 \ \ \ \ \ \ \ 0.1 4-2 0.035 0.011 \ \ \ \ \ \ \ 0.046 5-2 0.014 0.085 \ \ \ \ \ \ \ 0.099 6-2 0.265 0.14 \ \ \ \ \ \ \ 0.405 7-2 0.025 0.03 \ \ \ \ \ \ \ 0.055 样 品 三 中 细 菌 的 变 化 如 下 表 3.1.4, 样 品 三 初 始 细 菌 含 量 并 不 多, 发 酵 过 程 中 变 化 缓 慢, 翻 堆 后 有 下 降, 但 回 升 快 表 3.1.4 样 品 4 中 细 菌 含 量 变 化 ( 单 位 : 10 cfu/g) 样 品 1 2 3 4 5 6 7 8 9 总 含 量 1-3 0.95 0.15 \ 0.55 \ \ \ \ \ 1.65 2-3 0.35 0.65 0.15 \ \ \ \ \ \ 1.15 3-3 0.85 1.1 \ \ 0.15 \ \ \ \ 2.1 4-3 0.3 0.5 \ \ \ \ \ \ \ 0.8 5-3 1.05 0.6 \ \ \ 0.3 \ \ \ 1.95 6-3 0.3 0.4 \ \ \ \ \ \ \ 0.7 7-3 0.45 0.45 0.45 \ \ \ \ \ \ 1.35 样 品 四 中 细 菌 的 变 化 如 下 表 3.1.5, 随 着 发 酵 升 温 其 细 菌 含 量 会 明 显 下 降, 温 度 一 旦 降 低 细 菌 含 量 也 会 随 之 升 高 表 3.1.5 样 品 4 中 细 菌 含 量 变 化 ( 单 位 : 10 cfu/g) 样 品 1 2 3 4 5 6 7 8 9 总 含 量 1-4 1.25 0.3 \ 1.65 1.05 \ 0.15 0.25 \ 4.65 2-4 0.95 1.05 0.1 0.05 \ \ \ \ \ 2.15

399 3-4 0.8 1.0 \ \ 0.25 \ \ \ \ 2.05 4-4 1.4 1.25 \ \ \ \ \ \ \ 2.65 5-4 0.7 0.55 \ \ \ 0.6 \ \ \ 1.85 6-4 0.5 0.45 \ \ 0.06 \ \ \ \ 1.01 7-4 0.75 0.4 0.45 \ \ \ \ \ \ 1.6 样 品 五 中 细 菌 的 变 化 如 下 表 3.1.6, 样 品 五 在 最 初 发 酵 过 程 中 虽 然 细 菌 种 类 有 减 少, 但 其 含 量 有 上 升 ; 随 着 发 酵 时 间 的 延 续, 其 细 菌 含 量 下 降 表 3.1.6 样 品 5 中 细 菌 含 量 变 化 ( 单 位 : 10 cfu/g) 样 品 1 2 3 4 5 6 7 8 9 总 含 量 1-5 1.65 0.55 0.25 0.1 1.7 \ \ \ \ 4.25 2-5 3.95 2.35 \ \ \ \ \ \ \ 6.3 3-5 0.8 1.85 \ \ 0.55 \ \ \ \ 3.2 4-5 0.9 1.45 \ \ \ \ \ \ \ 2.35 5-5 1.55 0.6 \ \ \ \ \ \ \ 2.15 6-5 2.4 0.5 \ \ \ \ \ \ \ 2.9 7-5 1.1 0.35 0.2 \ \ \ \ \ \ 1.65 12 10 细 菌 总 含 量 (10 7 cfu.g -1 ) 8 6 4 2 样 品 1 样 品 2 样 品 3 样 品 4 样 品 5 0 1 2 3 4 5 6 7 样 品 批 次 图 1 垫 料 堆 肥 实 验 细 菌 总 含 量 变 化 图 从 图 1 中 可 以 看 出, 不 同 配 比 的 垫 料 在 对 猪 粪 进 行 发 酵 的 过 程 中, 细 菌 含 量 变 化 差 异 较 大, 相 对 于 传 统 材 料 的 2 号 样 品, 其 它 材 料 在 发 酵 前 期 下 降 不 够 明 显, 且 后 期 波 动 较 大, 回 升 快 3.2 垫 料 堆 肥 实 验 真 菌 分 离 结 果 以 第 一 批 堆 肥 垫 料 为 对 照, 共 分 离 出 9 株 真 菌, 其 菌 落 特 征 如 下 表 3.2.1

400 表 3.2.1 样 品 分 离 的 真 菌 菌 株 特 征 菌 株 编 号 菌 落 形 态 特 征 1 大, 青 色, 圆 形, 扁 平 2 中, 白 色, 圆 形, 菌 丝 长, 竖 起 3 大, 绿 色, 菌 丝 短, 松 散 呈 点 状, 扁 平 4 大, 白 色 带 黑 色 点 状, 短, 松 散 5 小, 白 色, 圆 形, 紧 密, 凸 起 6 中, 白 色 圆 形, 菌 丝 短, 絮 状 7 小, 圆 形, 反 面 黄 色, 正 面 绿 色, 紧 密, 凸 起 8 中, 反 面 白 色, 正 面 带 点 黄 色, 菌 丝 短, 松 散 9 大, 白 色, 菌 丝 短, 松 散 呈 点 状, 扁 平 样 品 一 中 真 菌 的 变 化 如 下 表 3.2.2, 在 前 期 发 酵 过 程 中, 真 菌 种 类 和 总 含 量 都 急 剧 下 降, 后 期 真 菌 种 类 和 总 含 量 都 有 所 回 升 表 3.2.2 样 品 1 中 真 菌 含 量 变 化 ( 单 位 : 10 cfu/g) 样 品 1 2 3 4 5 6 7 8 9 总 含 量 1-1 16 1.5 0.5 0.5 \ \ \ \ \ 18.5 2-1 1.65 \ \ \ \ \ \ \ \ 1.65 3-1 0.2 \ \ \ \ \ \ \ \ 0.2 4-1 0.25 \ \ \ 0.15 \ \ \ \ 0.4 5-1 0.25 0.01 \ \ \ \ \ \ \ 0.26 6-1 0.7 0.05 \ \ 0.1 \ \ \ \ 0.85 7-1 0.45 0.05 \ \ \ \ 0.15 \ \ 0.65 样 品 二 中 真 菌 的 变 化 如 下 表 3.2.3, 在 前 期 发 酵 过 程 中, 真 菌 种 类 和 总 含 量 都 急 剧 下 降, 后 期 真 菌 种 类 和 总 含 量 都 有 所 回 升 表 3.2.3 样 品 2 中 真 菌 含 量 变 化 ( 单 位 : 10 cfu/g) 样 品 1 2 3 4 5 6 7 8 9 总 含 量 1-2 1.5 \ \ \ 4.0 1.5 4.5 \ \ 11.5 2-2 0.55 0.75 0.2 \ \ \ \ \ \ 0.85 3-2 0.3 \ \ \ \ 0.05 \ \ \ 0.35 4-2 0.6 0.05 \ \ 0.4 \ \ \ \ 1.05 5-2 0.55 0.1 \ \ \ \ \ \ \ 0.65 6-2 3.0 \ \ \ 0.2 \ \ \ \ 3.2 7-2 0.85 0.1 0.05 0.1 \ \ 0.1 \ \ 1.2 样 品 三 中 真 菌 的 变 化 如 下 表 3.2.4, 在 前 期 发 酵 过 程 中, 真 菌 种 类 和 总 含 量 都 急 剧 下 降, 后 期 真 菌 种 类 和 总 含 量 都 有 所 回 升

401 表 3.2.4 样 品 3 中 真 菌 含 量 变 化 ( 单 位 : 10 cfu/g) 样 品 1 2 3 4 5 6 7 8 9 总 含 量 1-3 11 1.5 \ 0.5 \ \ \ 0.5 \ 13.5 2-3 5.0 0.05 0.35 \ \ \ \ \ \ 5.4 3-3 2.9 \ \ \ \ \ \ \ \ 2.9 4-3 5.1 \ \ \ \ \ \ \ \ 5.1 5-3 1.6 0.2 \ \ 0.1 \ \ \ \ 1.9 6-3 2.35 0.05 \ \ 0.05 \ \ \ \ 2.45 7-3 3.35 0.05 0.05 0.05 \ \ 0.15 \ \ 3.65 样 品 四 中 真 菌 的 变 化 如 下 表 3.2.5, 在 前 期 发 酵 过 程 中, 真 菌 种 类 和 总 含 量 都 急 剧 下 降, 后 期 真 菌 种 类 和 总 含 量 都 有 所 回 升 表 3.2.5 样 品 4 中 真 菌 含 量 变 化 ( 单 位 : 10 cfu/g) 样 品 1 2 3 4 5 6 7 8 9 总 含 量 1-4 24.5 1.5 \ 0.5 \ \ \ 0.5 \ 27 2-4 4.2 0.6 \ \ \ \ \ \ \ 4.8 3-4 1.3 0.05 \ \ \ 0.05 \ \ \ 1.4 4-4 2.7 \ \ \ \ \ \ \ \ 2.7 5-4 2.5 0.1 \ \ \ \ \ \ \ 2.6 6-4 1.7 \ \ \ \ \ \ \ \ 1.7 7-4 1.65 0.05 0.1 \ \ 0.05 \ \ \ 1.85 样 品 一 中 真 菌 的 变 化 如 下 表 3.2.6, 在 前 期 发 酵 过 程 中, 真 菌 种 类 和 总 含 量 都 急 剧 下 降, 后 期 真 菌 种 类 和 总 含 量 都 有 所 回 升 表 3.2.6 样 品 5 中 真 菌 含 量 变 化 ( 单 位 : 10 cfu/g) 样 品 1 2 3 4 5 6 7 8 9 总 含 量 1-5 25 \ \ \ \ \ \ \ 0.5 26 2-5 1.6 \ \ \ \ \ \ \ \ 1.6 3-5 1.35 \ \ \ \ \ \ \ \ 1.35 4-5 0.2 \ \ \ \ \ \ \ \ 0.2 5-5 0.25 \ \ \ \ \ \ \ \ 0.25 6-5 0.9 0.05 \ \ \ \ \ \ \ 0.95 7-5 0.55 \ \ \ \ 0.1 \ \ \ 0.65

402 30 25 真 菌 总 含 量 (10 6 cfu.g -1 ) 20 15 10 5 样 品 1 样 品 2 样 品 3 样 品 4 样 品 5 0 1 2 3 4 5 6 7 样 品 批 次 图 2 垫 料 堆 肥 实 验 中 真 菌 总 含 量 变 化 图 从 图 2 中 可 以 看 出, 不 同 配 比 的 垫 料 在 对 猪 粪 进 行 发 酵 的 过 程 中, 真 菌 含 量 变 化 大 体 相 似, 发 酵 前 期 真 菌 含 量 迅 速 下 降, 后 期 回 升 较 小 4. 试 验 结 论 利 用 菌 渣 和 椰 子 壳 代 替 传 统 的 垫 料 材 料, 在 对 猪 粪 进 行 发 酵 的 过 程 中, 细 菌 总 含 量 变 化 有 明 显 差 别, 在 发 酵 后 期 前 者 细 菌 含 量 回 升 较 快 ; 真 菌 总 含 量 大 体 一 致 本 实 验 监 测 了 不 同 配 方 垫 料 对 猪 粪 堆 肥 过 程 中 的 微 生 物 变 化 情 况, 还 需 结 合 其 他 实 验 做 进 一 步 比 较, 进 一 步 判 断 各 种 配 比 的 垫 料 的 性 能 5 参 考 文 献 [1] 刘 波, 朱 昌 雄. 微 生 物 发 酵 床 零 污 染 养 猪 技 术 研 究 与 应 用 [M]. 北 京 : 中 国 农 业 科 学 技 术 出 版 社,2009, 05. 试 验 设 计 : 试 验 负 责 : 朱 育 菁 试 验 人 员 : 王 洁

403 2011-08-20 承 担 单 位 : 福 建 省 农 科 院 农 业 生 物 资 源 研 究 所 试 验 设 计 : 蓝 江 林 试 验 项 目 : 不 同 施 肥 方 式 和 施 肥 量 对 葡 萄 叶 绿 素 的 影 响 试 验 人 员 : 王 洁 试 验 负 责 : 蓝 江 林 报 告 日 期 :2011-08-02 计 数 月 份 :2011 年 08 月 研 究 资 格 系 数 (0.5-1.0) 实 验 设 计 系 数 (0.9-1.0 0.9-1.0) 报 告 得 分 总 分 实 验 设 计 实 验 记 载 实 验 分 析 实 验 简 报 实 验 文 章 1-20% 21-40% 41-60% 61-80% 81-100% 1%-5% 设 计 不 足, 实 施 错 误 6%-10% 设 计 不 全, 实 验 无 果 11%-15% 设 计 可 以, 实 施 不 全 16%-20% 设 计 完 整, 分 布 实 施 21%-25% 实 验 不 全, 记 载 无 果 26%-30% 实 验 不 足, 记 载 不 全 31%-35% 独 立 实 验, 记 载 不 全 36%-40% 分 布 实 验, 记 载 完 整 41%-45% 目 的 明 确, 实 验 完 成 46%-50% 实 验 完 整, 记 载 清 晰 51%-55% 实 验 系 统, 结 果 可 信 56%-60% 实 验 创 新, 分 析 清 晰 61%-65% 实 验 创 新, 结 论 清 晰 66%-70% 实 验 完 整, 统 计 清 晰 71%-75% 实 验 系 统, 数 据 可 靠 76%-80% 报 告 完 整, 文 章 雏 形 81%-85% 结 构 合 理, 分 析 有 据 86%-90% 逻 辑 清 晰, 统 计 合 理 91%-95% 图 表 完 整, 写 作 流 畅 96%-100% 文 献 完 整, 发 表 水 平 福 建 省 农 业 科 学 院 农 业 生 物 资 源 研 究 所 农 业 微 生 物 研 究 中 心 电 话 : 0591-87882571, 传 真 : 0591-87882571 fjat.yzxz.com

404 1. 试 验 目 的 叶 绿 素 含 量 是 反 映 作 物 光 合 能 力 的 一 个 重 要 指 标, 与 作 物 产 量 形 成 有 着 极 其 密 切 的 关 系 叶 绿 素 是 叶 绿 体 中 最 重 要 的 色 素, 是 叶 绿 酸 的 酯, 主 要 含 有 叶 绿 素 a 和 叶 绿 素 b, 它 们 不 溶 于 水, 但 能 溶 于 酒 精 丙 酮 等 有 机 溶 剂, 因 此 可 以 通 过 实 验 用 丙 酮 液 提 取 叶 绿 素 并 对 其 进 行 含 量 测 定 同 一 种 植 物 生 长 的 环 境 对 其 叶 绿 素 的 合 成 有 不 同 程 度 的 影 响, 采 集 不 同 生 境 下 的 植 物 进 行 实 验, 测 定 [1] 其 叶 绿 素 的 含 量, 从 而 验 证 不 同 生 境 对 叶 绿 素 的 影 响 本 文 对 不 同 施 肥 方 式 不 同 施 肥 量 下 葡 萄 的 叶 片 叶 绿 素 含 量 进 行 测 定 比 较, 探 讨 施 肥 方 式 和 施 肥 量 对 葡 萄 叶 片 叶 绿 素 含 量 的 影 响 2. 试 验 方 法 2.1 供 试 材 料 2011 年 7 月 26 采 集 自 福 安 的 新 鲜 葡 萄 叶 片, 具 体 信 息 见 表 1 表 1 葡 萄 叶 片 样 品 信 息 编 号 施 肥 量 (kg/ 株 ) 施 肥 方 式 叶 片 形 态 1 号 对 照 老 叶 2 号 对 照 嫩 叶 3 号 3 沟 施 老 叶 4 号 3 沟 施 嫩 叶 5 号 3 撒 施 老 叶 6 号 3 撒 施 嫩 叶 7 号 4 沟 施 老 叶 8 号 4 沟 施 嫩 叶 9 号 4 撒 施 老 叶 10 号 4 撒 施 嫩 叶 11 号 5 沟 施 老 叶 12 号 5 沟 施 嫩 叶 13 号 5 撒 施 老 叶 14 号 5 撒 施 嫩 叶 15 号 丰 产 树 老 叶 16 号 丰 产 树 嫩 叶 2.2. 仪 器 和 试 剂 分 光 光 度 计, 电 子 天 平 ( 感 量 0.01g), 研 钵,25ml 棕 色 容 量 瓶, 小 漏 斗, 定 量 滤 纸 (9cm), 擦 镜 纸, 滴 管,95% 乙 醇 2.3 葡 萄 叶 片 叶 绿 素 的 提 取 取 正 常 的 葡 萄 叶 片, 擦 净 组 织 表 面 污 物, 剪 碎 ( 去 掉 中 脉 ), 分 别 混 匀 称 取 剪 碎 的 样 品 0.2 g, 放 入 研 钵 中, 加 少 量 95% 乙 醇 研 成 匀 浆, 再 加 95% 乙 醇 10 ml, 继 续 研 磨 至 组 织 变 白, 静 置 3~5 min 取 滤 纸 1 张, 置 漏 斗 中, 用 95% 乙 醇 湿 润, 沿 玻 棒 把 提 取 液 倒 入 漏 斗 中, 过 滤 到 25 ml 棕 色 容 量 瓶 中, 用 少 量 乙 醇 冲 洗 研 钵 研 棒 及 残 渣 数 次, 最 后 连 同 残 渣 一 起 倒 入 漏 斗 中 用 滴 管 吸 取 95% 乙 醇, 将 滤 纸 上 的 叶 绿 体 色 素 全 部 洗 入 容 量 瓶 中 直 至 滤 纸 和 残 渣 中 无 绿 色 为 止 最 后 用 95% 乙 醇 定 容 至

405 25 ml, 摇 匀 把 叶 绿 体 色 素 提 取 液 倒 入 比 色 杯 内 以 95% 乙 醇 为 空 白, 在 波 长 665nm 649nm 和 下 测 定 吸 光 度 2.4 葡 萄 叶 片 叶 绿 素 含 量 的 计 算 叶 绿 素 a 的 含 量 (Ca):Ca=13.95A665-6.88A649( 单 位 mg/l) 叶 绿 素 b 的 含 量 (Cb):Cb=24.96A649-7.32A665( 单 位 mg/l) 总 叶 绿 素 含 量 (C 总 ):C 总 = C a +C b ( 单 位 mg/l) 3. 试 验 结 果 不 同 施 肥 方 式 和 施 肥 量 下 的 葡 萄 叶 片 叶 绿 素 含 量 见 表 2 表 2 葡 萄 叶 片 叶 绿 素 含 量 样 品 A649 A665 Ca(mg/L) Cb(mg/L) C 总 (mg/l) C 总 (mg/g) 1 0.560 1.236 13.250 5.423 18.673 2.334 2 0.593 1.268 13.604 5.522 19.126 2.391 3 0.508 1.048 11.122 5.002 16.125 2.016 4 0.348 0.792 8.652 2.897 11.549 1.444 13 0.664 1.419 15.234 6.176 21.409 2.676 14 0.540 0.946 9.484 6.560 16.043 2.005 9 0.595 1.273 13.667 5.539 19.206 2.401 10 0.315 0.642 6.786 3.171 9.958 1.245 11 0.564 1.187 12.671 5.399 18.071 2.259 12 0.393 0.856 9.235 3.552 12.787 1.598 7 0.349 0.752 8.082 3.217 11.300 1.413 8 0.565 1.199 12.843 5.323 18.167 2.271 5 0.567 1.147 12.102 5.762 17.864 2.233 6 0.426 0.929 10.026 3.841 13.867 1.733 15 0.545 1.177 12.676 4.977 17.653 2.207 16 0.302 0.615 6.495 3.047 9.541 1.193 不 同 施 肥 量 和 施 肥 方 式 对 老 叶 和 嫩 叶 叶 绿 素 影 响 见 图 1 和 图 2, 在 所 有 老 叶 中, 叶 绿 素 含 量 最 高 的 是 3kg/ 亩 撒 施 的 样 品, 为 2.676mg/g, 相 对 应 最 低 的 是 5kg/ 亩 沟 施 的 样 品, 含 量 为 1.444mg/g; 在 嫩 叶 中 叶 绿 素 含 量 最 高 的 是 5kg/ 亩 沟 施 的 2.259 mg/g, 最 低 的 是 4kg/ 亩 沟 施 的 1.245mg/g; 在 施 肥 方 式 方 面 撒 施 总 体 上 高 于 沟 施

406 3 3kg 撒 施 叶 绿 素 含 量 ( mg.g -1 ) 2.5 2 1.5 1 对 照 3kg 沟 施 4kg 沟 施 4kg 撒 施 5kg 沟 施 5kg 撒 施 丰 产 株 0.5 0 1 2 3 4 5 6 7 8 样 品 图 1 不 同 施 肥 量 和 施 肥 方 式 对 老 叶 叶 绿 素 影 响 3 2.5 对 照 5kg 沟 施 叶 绿 素 含 量 ( mg.g -1) 2 1.5 1 3kg 沟 施 3kg 撒 施 4kg 沟 施 4kg 撒 施 5kg 撒 施 丰 产 株 0.5 0 1 2 3 4 5 6 7 8 样 品 图 2 不 同 施 肥 量 和 施 肥 方 式 对 嫩 叶 叶 绿 素 影 响 4. 试 验 结 论 本 实 验 研 究 发 现 在 施 肥 方 式 上, 撒 施 效 果 明 显 比 沟 施 效 果 好 ; 且 叶 绿 素 含 量 并 不 随 着 施 肥 量 的 增 加 而 有 规 律 的 上 升 与 对 照 相 比, 不 论 是 施 肥 方 式 还 是 施 肥 量 的 变 化 都 不 能 提 高 叶 绿 素 的 含 量, 需 结 合 其 它 实 验 对 其 进 行 进 一 步 分 析 5 参 考 文 献 [1] 李 建 锋, 张 荣, 董 莹 莹 等. 施 用 尿 素 对 冬 萝 卜 产 量 形 成 及 叶 绿 素 含 量 的 影 响 [J]. 安 徽 农 业 科 学, 2010, 38(4):1786-1787,1806. 5 试 验 设 计 : 蓝 江 林 试 验 负 责 : 蓝 江 林 试 验 人 员 : 王 洁

407 2011-08-23 承 担 单 位 : 福 建 省 农 科 院 农 业 生 物 资 源 研 究 所 试 验 设 计 : 试 验 项 目 : 微 波 诱 变 后 强 致 病 力 青 枯 雷 尔 氏 菌 的 弱 化 指 数 的 测 定 试 验 人 员 : 周 游 试 验 负 责 : 郑 雪 芳 报 告 日 期 :2011-08-23 计 数 月 份 :2011-08 研 究 资 格 系 数 (0.5-1.0) 实 验 设 计 系 数 (0.9-1.0 0.9-1.0) 报 告 得 分 总 分 实 验 设 计 实 验 记 载 实 验 分 析 实 验 简 报 实 验 文 章 1-20% 21-40% 41-60% 61-80% 81-100% 1%-5% 设 计 不 足, 实 施 错 误 6%-10% 设 计 不 全, 实 验 无 果 11%-15% 设 计 可 以, 实 施 不 全 16%-20% 设 计 完 整, 分 布 实 施 21%-25% 实 验 不 全, 记 载 无 果 26%-30% 实 验 不 足, 记 载 不 全 31%-35% 独 立 实 验, 记 载 不 全 36%-40% 分 布 实 验, 记 载 完 整 41%-45% 目 的 明 确, 实 验 完 成 46%-50% 实 验 完 整, 记 载 清 晰 51%-55% 实 验 系 统, 结 果 可 信 56%-60% 实 验 创 新, 分 析 清 晰 61%-65% 实 验 创 新, 结 论 清 晰 66%-70% 实 验 完 整, 统 计 清 晰 71%-75% 实 验 系 统, 数 据 可 靠 76%-80% 报 告 完 整, 文 章 雏 形 81%-85% 结 构 合 理, 分 析 有 据 86%-90% 逻 辑 清 晰, 统 计 合 理 91%-95% 图 表 完 整, 写 作 流 畅 96%-100% 文 献 完 整, 发 表 水 平 福 建 省 农 业 科 学 院 农 业 生 物 资 源 研 究 所 农 业 微 生 物 研 究 中 心 电 话 : 0591-87882571, 传 真 : 0591-87882571 fjat.yzxz.com

408 1. 试 验 目 的 青 枯 雷 尔 氏 菌 ( Ralstonia solanacearum) 引 起 植 物 青 枯 病, 是 一 种 毁 灭 性 土 传 病, 可 造 成 作 物 严 重 减 产 甚 至 绝 产, 是 严 重 威 胁 农 业 生 产 的 主 要 病 害 之 一 青 枯 雷 尔 氏 菌 寄 主 广 泛, 可 侵 染 4 4 个 科 数 百 种 植 物 大 量 研 究 和 试 验 表 明 青 枯 雷 尔 氏 菌 无 致 病 力 突 变 株 在 植 物 青 枯 病 防 治 中 具 有 重 要 的 生 防 应 用 潜 力, 揭 示 其 生 防 机 理 对 其 实 际 生 产 应 用 及 提 高 植 物 青 枯 病 防 治 水 平 具 有 重 要 意 义 致 病 性 强 弱 不 同 的 青 枯 菌 其 形 态 上 和 弱 化 指 数 是 有 所 差 异, 其 中 强 致 病 性 的 青 枯 雷 尔 氏 菌 菌 落 形 态 表 现 为 : 流 动 性 强, 中 间 为 粉 红 色, 并 且 白 边 比 较 宽, 表 面 比 较 湿 润 弱 致 病 性 或 无 致 病 性 的 青 枯 雷 尔 氏 菌 菌 落 形 态 表 现 为 : 无 流 动 性, 中 间 为 暗 红 色, 并 且 白 边 比 较 窄, 表 面 比 较 干 燥 ( 刘 波, 2005) 本 试 验 从 弱 化 指 数 来 识 别 不 同 致 病 性 的 青 枯 菌, 为 今 后 的 试 验 提 供 依 据 2. 试 验 方 法 2.1 试 验 材 料 2.1.1 供 试 病 原 菌 供 试 病 原 菌 由 福 建 省 农 科 院 农 业 生 物 资 源 所 微 生 物 研 究 中 心 提 供, 为 FJAT-1458 2.1.2 培 养 基 1)TTC 培 养 基 : 蛋 白 胨 10.0 g; 水 解 酪 蛋 白 1.0 g; 葡 萄 糖 5.0 g;ttc(2,3,5 氯 化 三 苯 基 四 氮 唑 ) 0.05 g;ph 7.0~7.2 ( 注 :TTC 用 蒸 馏 水 配 成 1% 溶 液 并 用 细 菌 过 滤 器 过 滤 灭 菌, 在 培 养 基 倒 平 板 前 ( 冷 却 至 约 50 ) 每 100. ml 培 养 基 加 入 0.5 ml ) 2)SPA 培 养 基 :5g 蛋 白 胨,20g 蔗 糖,0.5g KH2PO4,0.25g MgSO4,1000mL 蒸 馏 水,pH 值 调 节 到 约 7.4 左 右, 分 装,121 灭 菌 20min, 最 终 ph 值 为 7.2 左 右 2.1.3 仪 器 设 备 微 波 炉 ;HPG-280 人 工 气 候 培 养 箱 ;Leica M165FC 高 级 电 动 荧 光 体 视 显 微 镜 ; 2.2 试 验 方 法 2.2.1 悬 液 的 制 备 出 发 菌 株 FJAT-1458 在 新 鲜 TTC 平 板 培 养 基 上 活 化,30 培 养 3d; 将 活 化 后 的 菌 株 接 种 于 SPA 液 体 培 养 基,30 150rpm 振 荡 培 养 过 夜 ( 约 16h); 取 4ml 培 养 液 与 5ml 离 心 管 中,10000rpm 离 心 3~5min, 弃 去 上 清 液, 加 4ml 无 菌 0.85% 生 理 盐 水, 重 新 悬 浮 菌 体, 再 离 心, 弃 去 上 清, 重 复 上 述 步 骤 用 生 理 盐 水 恢 复 成 菌 悬 液 ; 将 上 述 菌 悬 液 倒 入 装 有 小 玻 璃 珠 的 无 菌 三 角 瓶 内, 振 荡 20~30min, 以 打 散 细 胞 ; 取 诱 变 前 的 0.5ml 菌 悬 液 进 行 适 当 稀 释 分 离, 取 三 个 合 适 的 稀 释 度 倾 注 肉 汤 平 板, 每 一 梯 度 倾 注 两 皿, 每 皿 加 1ml 菌 液,37 倒 置 培 养 24~36h, 进 行 平 板 菌 落 计 数 2.2.2 微 波 诱 变 将 原 始 菌 株 扩 大 培 养 后, 把 菌 悬 液 放 在 灭 过 菌 的 平 板 上, 用 封 口 膜 将 平 板 封 住, 将 平 板 放 在 冰 上, 直 接 放 入 微 波 炉 中 分 别 以 中 高 强 度 微 波 处 理 60s,120s,180s,240s,300s 五 个 时 间 梯 度, 每 隔 120s 换 冰 冷 却 以 消 除 热 效 应 处 理 后 的 菌 液 稀 释 不 同 梯 度 涂 于 固 体 培 养 基 平 板 上, 并 以 没 有 经 过 微 波 处 理 的 菌 液 涂 板 进 行 对 照, 放 置 于 30 C 培 养 箱 中 培 养,48h 后 计 算 其 弱 化 指 数

409 2.2.3 弱 化 指 数 的 测 定 将 要 检 测 的 菌 株 的 平 板 放 在 电 动 荧 光 体 视 显 微 镜 下, 以 此 测 出 其 白 边 的 直 径 和 红 边 的 直 径 2.2.4 青 枯 雷 尔 氏 菌 的 菌 株 分 离 纯 化 根 据 菌 落 的 形 态 特 征, 我 们 将 致 病 力 弱 的 菌 株 挑 选 出 来, 放 在 TTC 培 养 基 上, 放 在 30 C 的 培 养 箱 中 培 养 48 小 时 2.2.5 DNA 制 备 挑 取 2 环 纯 化 好 的 疑 似 弱 致 病 力 青 枯 雷 尔 氏 菌 于 1.5ml 离 心 管 中, 加 入 200μl 无 菌 水, 水 浴 10min,8000r 离 心 1min, 吸 取 上 清 液 于 -20 保 存 2.2.6 青 枯 雷 尔 氏 菌 的 分 子 检 测 把 纯 化 保 存 的 似 青 枯 雷 尔 氏 菌 落 形 态 的 单 菌 落 的 DNA 用 特 异 性 引 物 peha#3 和 peha#6 进 行 鉴 定, 引 物 序 列 为,pehA#3: 5'-CAG CAG AAC CCG CGC CTG ATC CAG-3' 和 peha#6: 5'-ATC GGA CTT GAT GCG CAG GCC GTT-3' 扩 增 得 到 的 片 断 大 小 为 504bp 25μl 的 反 应 体 系 为 :DNA 模 板 10-20ng, Taq(5U/μl) 0.3μl,10 PCR 缓 冲 液 2.5μl,dNTP(10mM) 0.5μl, 引 物 peha#3 和 peha#6(10μm) 各 1μl 加 无 菌 水 至 25μl 反 应 程 序 : 首 先 96 1min, 然 后 按 96 30s 70 30s 72 1min 程 序 2 个 循 环, 再 按 94 30s 70 30s 72 1min 程 序 33 个 循 环, 最 后 72 下 延 伸 5min 2.2.4 通 过 DPS 软 件 分 析 不 同 菌 落 的 差 异 性 3. 试 验 结 果 3.1 微 波 诱 变 处 理 后 弱 致 病 力 青 枯 雷 尔 氏 菌 的 情 况 图 1 微 波 120s 后 青 枯 雷 尔 氏 菌 菌 株 FJAT-1458 的 菌 落 形 态

410 图 2 微 波 180s 后 青 枯 雷 尔 氏 菌 菌 株 FJAT-1458 的 菌 落 形 态 图 3 微 波 240s 后 青 枯 雷 尔 氏 菌 菌 株 FJAT-1458 的 菌 落 形 态 图 4 微 波 300s 后 青 枯 雷 尔 氏 菌 菌 株 FJAT-1458 的 菌 落 形 态 弱 菌 株 在 微 波 辐 射 下 的 都 是 致 病 力 弱 的 菌 株 形 态 上 并 没 有 太 大 的 变 化 3.2 微 波 诱 变 处 理 后 的 弱 致 病 力 青 枯 雷 尔 氏 菌 的 弱 化 指 数 3.2.1 不 同 微 波 辐 射 处 理 青 枯 菌 体 视 显 微 镜 下 镜 局 部 照 片

411 图 5 青 枯 雷 尔 氏 菌 FJAT-1458 微 波 辐 射 60s 后 弱 化 指 数 图 6 青 枯 雷 尔 氏 菌 FJAT-1458 微 波 辐 射 120s 后 弱 化 指 数 图 7 青 枯 雷 尔 氏 菌 FJAT-145 微 波 辐 射 180s 后 弱 化 指 数

412 图 8 青 枯 雷 尔 氏 菌 FJAT-1458 微 波 辐 射 240s 后 弱 化 指 数 图 9 青 枯 雷 尔 氏 菌 FJAT-1458 微 波 辐 射 300s 后 弱 化 指 数 3.2.2 微 波 处 理 后 的 青 枯 雷 尔 氏 菌 弱 化 指 数 结 果 通 过 测 量 各 个 菌 株 的 红 边 直 径 以 及 白 边 直 径, 根 据 弱 化 指 数 公 式, 即 : 红 边 直 径 弱 化 指 数 = ( 刘 波,2005) 白 边 直 径 试 验 结 果 见 表 1 由 表 可 知, 微 波 60s 后 平 均 弱 化 指 数 为 0.810, 微 波 120s 后 平 均 弱 化 指 数 为 0.843, 微 波 180s 后 平 均 弱 化 指 数 为 0.855, 微 波,240s 后 平 均 弱 化 指 数 为 0.755, 微 波 300s 后 平 均 弱 化 指 数 为 0.842 微 波 处 理 时 间 (s) 60 120 180 平 行 测 量 表 1 微 波 处 理 后 的 青 枯 雷 尔 氏 菌 FJAT-1458 的 弱 化 指 数 红 边 直 径 /μm (D1) 白 边 直 径 /μm (D2) 弱 化 指 数 (D1/D2) 1 150.004 183.004 0.820 2 123.345 151.845 0.812 3 61.366 76.911 0.798 1 174.501 200.513 0.870 2 132.466 162.218 0.817 3 154.133 182.914 0.843 1 202.040 258.824 0.781 2 164.124 185.072 0.887 3 168.406 187.822 0.897 平 均 值 0.810 0.843 0.855

413 240 300 1 101.863 130.949 0.778 2 85.738 119.863 0.715 3 74.245 96.225 0.772 1 129.918 151.926 0.855 2 139.140 165.911 0.839 3 127.991 153.584 0.833 0.755 0.842 3.2.3 通 过 DPS 软 件 分 析 不 同 菌 落 的 差 异 性 的 情 况

414 表 2 DPS 分 析 的 结 果 当 前 日 期 计 算 结 果 2011-9- 30 16:14:43 处 理 样 本 数 均 值 标 准 差 标 准 误 95% 置 信 区 间 0.82 2 0.805 0.0099 0.007 0.7161 0.8939 0.87 2 0.83 0.0184 0.013 0.6648 0.9952 0.781 2 0.892 0.0071 0.005 0.8285 0.9555 0.778 2 0.7435 0.0403 0.0285 0.3814 1.1056 0.855 2 0.836 0.0042 0.003 0.7979 0.8741 方 差 分 析 表 变 异 来 源 平 方 和 自 由 度 均 方 F 值 p 值 处 理 间 0.0232 4 0.0058 13.635 0.0067 处 理 内 0.0021 5 0.0004 总 变 异 0.0253 9 Tukey 法 多 重 比 较 ( 下 三 角 为 均 值 差, 上 三 角 为 显 著 水 平 ) No. 均 值 3 5 2 1 4 3 0.892 0.1821 0.1348 0.0414 0.0043 5 0.836 0.056 0.9979 0.6013 0.0326 2 0.83 0.062 0.006 0.7477 0.0423 1 0.805 0.087 0.031 0.025 0.1382 4 0.7435 0.1485 0.0925 0.0865 0.0615 字 母 标 记 表 示 结 果 处 理 均 值 5% 显 著 水 平 0.781 0.892 a A 0.855 0.836 ab AB 0.87 0.83 ab AB 0.82 0.805 bc AB 0.778 0.7435 c B 1% 极 显 著 水 平 从 表 2 中 我 们 可 以 得 出, 微 波 辐 射 60s 时, 形 态 发 生 变 化 微 波 辐 射 60s 到 120s 之 间, 他 们 的 形 态 并 没 有 存 在 很 明 显 的 差 异 但 是 微 波 辐 射 120s 后 各 个 菌 株 形 态 上 存 在 差 异 微 波 对 菌 株 的 形 态 有 诱 变 作 用

415 4. 试 验 讨 论 弱 化 结 果 表 明, 菌 株 在 不 同 时 间 的 微 波 辐 射 下, 通 过 方 差 分 析 可 知, 不 同 辐 射 时 间 的 青 枯 雷 尔 氏 菌 弱 化 指 数 是 有 显 著 性 差 异, 表 明 即 使 均 为 强 致 病 性 青 枯 雷 尔 氏 菌 在 形 态 学 上 还 是 有 显 著 性 差 异, 而 这 一 点 与 青 枯 雷 尔 氏 菌 菌 株 本 身 复 杂 性 是 相 关 的 5. 参 考 文 献 [1] 石 元 春. 20 世 纪 中 国 学 术 大 典 农 业 科 学 [M]. 福 州 : 福 建 教 育 出 版 社, 2002: 277. [2] 刘 波, 林 志 营,, 等. 青 枯 雷 尔 氏 菌 多 态 性 研 究 [M]. 福 州 : 福 建 科 技 出 版 社,2005,6. 试 验 负 责 周 游 试 验 人 员 周 游 郑 雪 芳

416 2011-08-19 承 担 单 位 : 福 建 省 农 科 院 农 业 生 物 资 源 研 究 所 试 验 设 计 : 郑 雪 芳 试 验 项 目 : 苗 立 鲜 对 农 友 长 茄 种 苗 保 鲜 效 果 试 验 人 员 : 周 游 郑 雪 芳 试 验 负 责 : 郑 雪 芳 报 告 日 期 :2011-08-19 计 数 月 份 :2011 年 8 月 研 究 资 格 系 数 (0.5-1.0) 实 验 设 计 系 数 (0.9-1.0 0.9-1.0) 报 告 得 分 总 分 实 验 设 计 实 验 记 载 实 验 分 析 实 验 简 报 实 验 文 章 1-20% 21-40% 41-60% 61-80% 81-100% 1%-5% 设 计 不 足, 实 施 错 误 6%-10% 设 计 不 全, 实 验 无 果 11%-15% 设 计 可 以, 实 施 不 全 16%-20% 设 计 完 整, 分 布 实 施 21%-25% 实 验 不 全, 记 载 无 果 26%-30% 实 验 不 足, 记 载 不 全 31%-35% 独 立 实 验, 记 载 不 全 36%-40% 分 布 实 验, 记 载 完 整 41%-45% 目 的 明 确, 实 验 完 成 46%-50% 实 验 完 整, 记 载 清 晰 51%-55% 实 验 系 统, 结 果 可 信 56%-60% 实 验 创 新, 分 析 清 晰 61%-65% 实 验 创 新, 结 论 清 晰 66%-70% 实 验 完 整, 统 计 清 晰 71%-75% 实 验 系 统, 数 据 可 靠 76%-80% 报 告 完 整, 文 章 雏 形 81%-85% 结 构 合 理, 分 析 有 据 86%-90% 逻 辑 清 晰, 统 计 合 理 91%-95% 图 表 完 整, 写 作 流 畅 96%-100% 文 献 完 整, 发 表 水 平 福 建 省 农 业 科 学 院 农 业 生 物 资 源 研 究 所 农 业 微 生 物 研 究 中 心 电 话 : 0591-87882571, 传 真 : 0591-87882571 fjat.yzxz.com

417 1. 试 验 目 的 随 着 科 技 水 平 日 益 提 高, 种 苗 培 育 以 逐 步 成 为 了 育 苗 的 重 要 手 段 之 一 而 种 苗 运 输 中 出 现 的 烂 苗 和 徒 长 现 象 成 了 限 制 种 苗 发 展 的 一 个 重 要 因 素 因 此, 找 出 一 种 有 效 防 治 运 输 过 程 中 出 现 烂 苗 和 徒 长 的 方 法 是 当 前 种 苗 发 展 急 需 解 决 的 问 题 本 试 验 采 用 农 科 院 生 产 的 苗 立 鲜, 模 拟 运 输 条 件 观 察 苗 立 鲜 对 农 友 长 茄 实 生 苗 保 鲜 及 徒 长 现 象 的 作 用 2. 试 验 方 法 2.1 试 验 材 料 (1) 保 鲜 品 种 : 农 友 长 茄 嫁 接 苗, 由 厦 门 如 意 集 团 有 限 公 司 购 买 (2) 微 生 物 保 鲜 材 料 : 苗 立 鲜, 由 本 研 究 室 自 行 研 制, 稀 释 800 倍 使 用 2.2 试 验 方 法 2.2.1 微 生 物 保 鲜 菌 使 用 方 法 喷 施 嫁 接 苗 为 农 友 长 茄 14 天 苗 ( 苗 外 运 时 间 ), 实 验 组 采 用 稀 释 800 倍 苗 立 鲜 喷 施, 使 植 株 茎 杆 和 叶 片 充 分 淋 湿, 对 照 组 用 清 水 做 相 同 处 理 处 理 结 束 后, 将 苗 放 至 阴 凉 处 待 苗 晾 干, 装 箱 每 个 处 理 300 株 苗 2.2.2 检 测 指 标 (1) 观 察 植 株 是 否 徒 长 (2) 选 取 实 验 和 对 照 组 各 30 株 分 析 : 叶 片 数 株 高 弯 曲 度 第 二 叶 的 长 和 宽 差 异 3. 试 验 结 果 随 机 选 取 试 验 组 和 对 照 组 好 苗 各 30 株 统 计 结 果 如 表 1, 苗 立 鲜 处 理 茄 子 植 株 平 均 株 高 为 23.6cm 而 清 水 对 照 植 株 平 均 株 高 为 23.9cm 苗 立 鲜 处 理 茄 子 植 株 平 均 曲 度 为 128.3, 清 水 对 照 平 均 80.8. 表 1 随 机 选 取 试 验 组 和 对 照 组 好 苗 各 30 株 统 计 结 果 处 理 CK 株 高 嫁 接 口 到 顶 端 距 离 叶 片 数 曲 度 第 二 叶 片 长 第 二 叶 片 宽 1 22.2 16.0 3 130 5.5 4.0 21.5 16.5 3 85 6.0 3.4 2 26.5 20.0 2 140 5.8 3.8 22.5 15.0 3 110 5.6 3.8 3 26.5 20.5 2 140 7.3 5.0 23.5 19.0 4 110 6.6 4.5 4 25.0 20.0 4 140 7.2 4.8 24.0 15.5 4 70 5.0 3.3 5 21.0 16.0 3 110 6.1 3.8 23.0 14.0 3 85 5.9 4.0 6 27.5 21.0 3 100 7.2 4.5 24.0 18.5 4 90 4.9 3.4 7 24.5 19.0 4 100 6.8 4.7 18.0 16.0 2 75 6.6 4.7 8 23.5 17.5 3 160 6.9 4.6 30.5 24.0 4 85 6.8 4.2 9 23.0 17.8 2 120 6.3 3.8 27.0 21.0 2 70 5.7 4.1 10 24.5 18.0 3 160 6.0 3.9 21.0 15.5 3 65 5.6 3.3 11 22.0 14.0 3 120 5.2 3.7 26.0 19.5 3 85 4.9 3.9 12 22.0 14.5 2 100 6.6 4.3 26.5 21.5 4 80 5.8 3.8 13 22.5 16.0 4 140 6.3 2.9 26.0 20.5 3 86 5.8 4.2 株 高 嫁 接 口 到 顶 端 距 离 叶 片 数 曲 度 第 二 叶 片 长 第 二 叶 片 宽

418 14 23.5 19.5 2 140 6.5 4.6 21.5 15.0 4 86 5.1 3.2 15 21.5 15.5 4 90 5.4 4, 2 21.5 15.5 3 70 5.8 3.2 16 26.0 20.0 3 90 7.3 4.9 22.5 16.0 3 95 6.5 4.2 17 22.5 18.5 3 160 6.8 4.1 22.5 16.0 4 95 5.8 4.2 18 22.0 19.5 3 160 6.3 4.4 22.0 15.8 3 65 6.0 4.2 19 25.0 17.0 4 90 6.0 4.1 22.5 15.2 3 70 5.8 3.9 20 22.0 16.5 4 110 5.5 3.2 23.0 17.0 3 86 7.6 4.9 21 22.5 16.0 3 120 6.5 4.3 25.0 17.5 4 85 6.4 4.2 22 26.5 20.0 3 160 5.9 3.8 24.8 17.5 3 75 5.7 3.8 23 22.0 16.5 4 150 6.0 4.1 22.6 17.4 3 95 6.0 4.1 24 20.5 16.0 3 130 7.2 5.3 25.6 17.6 4 90 6.1 4.4 25 25.5 17.5 3 90 5.8 4.3 25.5 19.3 3 87 6.7 4.6 26 24.5 16.5 3 140 6.2 4.2 23.5 16.5 3 95 6.1 4.0 27 21.5 15.0 3 130 5.2 3.3 26.0 19.2 4 70 5.9 4.1 28 21.5 16.0 3 160 6.7 5.1 24.7 17.6 4 55 6.6 4.3 29 24.0 17.5 2 140 5.5 3.4 24.6 17.5 4 50 5.9 4.1 30 26.5 20.0 3 130 5.3 3.0 26.5 20.0 2 60 5.3 3.8 平 均 值 23.6 17.6 3 128.3 6.2 4.1 23.9 17.6 3 80.8 6.0 4.0 图 一 茄 子 处 理 的 环 境 苗 立 鲜 处 理 的 茄 子 苗 图 二 处 理 96h 后 嫁 接 茄 子 苗 清 水 处 理 的 茄 子 苗

419 处 理 96h 后 实 验 组 图 三 开 箱 后 茄 子 苗 处 理 96h 后 对 照 组 图 四 96h 后 实 验 组 和 对 照 组 的 对 比 图 五 试 验 田

420 4. 试 验 讨 论 由 表 1 可 知 试 验 组 和 对 照 组 曲 度 差 别 较 大, 株 高, 叶 片 数 及 叶 长 叶 宽 差 别 较 小 综 合 以 上 因 素 可 知 苗 立 鲜 对 抑 制 种 苗 的 弯 曲 具 有 显 著 作 用 下 一 步, 将 对 试 验 苗 进 行 田 间 观 察, 以 便 进 一 步 比 较 苗 立 鲜 对 茄 子 后 续 生 长 的 影 响 5. 参 考 文 献 试 验 负 责 郑 雪 芳 试 验 人 员 周 游

421 2011-08-13 承 担 单 位 : 福 建 省 农 科 院 农 业 生 物 资 源 研 究 所 试 验 设 计 : 试 验 项 目 : 莆 田 辣 椒 1 级 病 株 青 枯 雷 尔 氏 菌 的 分 离 检 测 试 验 人 员 : 周 游 郑 雪 芳 林 抗 美 试 验 负 责 : 郑 雪 芳 报 告 日 期 :2011-08-13 计 数 月 份 :2011 年 8 月 研 究 资 格 系 数 (0.5-1.0) 实 验 设 计 系 数 (0.9-1.0 0.9-1.0) 报 告 得 分 总 分 实 验 设 计 实 验 记 载 实 验 分 析 实 验 简 报 实 验 文 章 1-20% 21-40% 41-60% 61-80% 81-100% 1%-5% 设 计 不 足, 实 施 错 误 6%-10% 设 计 不 全, 实 验 无 果 11%-15% 设 计 可 以, 实 施 不 全 16%-20% 设 计 完 整, 分 布 实 施 21%-25% 实 验 不 全, 记 载 无 果 26%-30% 实 验 不 足, 记 载 不 全 31%-35% 独 立 实 验, 记 载 不 全 36%-40% 分 布 实 验, 记 载 完 整 41%-45% 目 的 明 确, 实 验 完 成 46%-50% 实 验 完 整, 记 载 清 晰 51%-55% 实 验 系 统, 结 果 可 信 56%-60% 实 验 创 新, 分 析 清 晰 61%-65% 实 验 创 新, 结 论 清 晰 66%-70% 实 验 完 整, 统 计 清 晰 71%-75% 实 验 系 统, 数 据 可 靠 76%-80% 报 告 完 整, 文 章 雏 形 81%-85% 结 构 合 理, 分 析 有 据 86%-90% 逻 辑 清 晰, 统 计 合 理 91%-95% 图 表 完 整, 写 作 流 畅 96%-100% 文 献 完 整, 发 表 水 平 福 建 省 农 业 科 学 院 农 业 生 物 资 源 研 究 所 农 业 微 生 物 研 究 中 心 电 话 : 0591-87882571, 传 真 : 0591-87882571 fjat.yzxz.com

422 1. 试 验 目 的 [1] 青 枯 雷 尔 氏 菌 (Ralstonia solanacearum), 属 于 革 兰 氏 阴 性 b 蛋 白 类 细 菌 雷 尔 氏 菌 引 起 的 植 物 细 菌 性 青 枯 病 害 (Bacterial wilt), 简 称 青 枯 病, 是 一 种 世 界 范 围 的 细 菌 性 土 传 病 害 该 菌 寄 主 广 泛, 能 够 侵 染 热 带 和 温 带 地 区 多 达 450 种 以 上 的 植 物 种 类, 严 重 影 响 了 很 多 重 要 经 济 作 物, 比 如 番 茄 [2] [3] 烟 草 辣 椒 等 的 产 量 青 枯 病 的 防 治 目 前 还 没 有 有 效 的 化 学 农 药 防 治 且 易 造 成 环 境 污 染 和 残 留 利 用 无 致 病 力 青 枯 雷 尔 氏 菌 对 茄 科 作 物 进 行 免 疫 接 种, 使 植 株 产 生 类 似 于 动 物 的 免 疫 系 统 以 抵 制 病 害 本 试 验 通 过 分 离 从 莆 田 病 区 采 集 回 来 的 病 株, 检 测 该 病 区 是 否 由 青 枯 病 引 起, 以 便 我 们 更 有 针 对 性 的 防 治 作 物 病 害 的 发 生 2. 试 验 方 法 2.1 试 验 材 料 2.1.1 供 试 植 株 试 验 植 株 为 莆 田 采 集 回 来 的 辣 椒 病 株 ( 一 级 病 株 ) 2.1.2 培 养 基 配 制 TTC 培 养 基 :10g 蛋 白 胨,1g 水 解 酪 蛋 白,5g 葡 萄 糖,17g 琼 脂,1000mL 蒸 馏 水,pH 值 调 节 到 约 7.4 左 右, 分 装,121 灭 菌 20min 灭 菌 后 当 冷 却 至 55 左 右 加 入 已 灭 菌 的 1% 的 TTC(2,3, 5 氯 化 三 苯 基 四 氮 唑 ) 水 溶 液 其 终 浓 度 为 0.005%, 最 终 ph 值 为 7.2 左 右 2.2 试 验 方 法 2.2.1 溢 菌 实 验 溢 菌 实 验 : 用 无 菌 刀 切 下 发 病 部 位 纵 切 面 切 片 置 于 载 波 片 上, 盖 上 盖 玻 片 从 盖 玻 片 的 一 边 滴 加 无 菌 水, 置 于 水 平 台 面 上 5min, 观 察 是 否 有 菌 脓 溢 出, 以 便 初 步 判 断 该 病 害 是 否 为 细 菌 性 病 害 2.2.2 植 株 目 标 菌 的 分 离 植 株 预 处 理 : 植 株 先 用 清 水 清 洗, 用 报 纸 将 植 株 水 分 吸 干 称 样 及 样 品 处 理 : 称 取 根 茎 基 部 茎 中 部 茎 顶 部 叶 各 1 g, 先 用 75 酒 精 消 毒 30s 再 用 10 的 NACLO 消 毒 5min, 然 后 用 无 菌 水 清 洗 3 遍, 再 用 灭 菌 滤 纸 将 样 品 吸 干, 放 至 装 有 10 ml 无 菌 水 的 研 钵, 充 分 研 磨, 即 配 成 10-1 浓 度 ; 稀 释 样 品 原 液 : 吸 取 1 ml 原 液 至 装 有 9 ml 无 菌 水 的 试 管, 即 配 成 10-2 浓 度, 依 次 稀 释 配 置 成 10-3 平 板 涂 布 : 超 净 台 上 无 菌 操 作, 溶 液 在 振 荡 器 上 振 荡 10-20 s, 吸 取 200 μl 至 相 应 标 记 浓 度 的 平 板 上, 溶 液 滴 至 平 板 中 央, 用 涂 布 棒 涂 匀 涂 好 的 平 板 正 放 静 置 一 会, 使 溶 液 渗 透 进 平 板 中 每 个 梯 度 重 复 3 次 ; 培 养 :: 将 涂 好 的 平 板 用 袋 子 装 好 倒 置 于 30 恒 温 箱 中 培 养 60h; 划 线 分 离 纯 化 : 观 察 分 离 培 养 的 菌 落, 将 要 纯 化 的 菌 落 标 上 标 记, 无 菌 操 作 用 接 种 环 直 接 取 平 板 上 要 分 离 纯 化 的 菌 落 至 相 应 标 记 的 平 板 上, 划 线 完 后 放 在 30 温 箱 中 培 养.; 结 果 计 算 : 每 克 土 样 中 微 生 物 的 数 量 = 同 一 稀 释 度 的 3 个 平 板 上 菌 落 平 均 数 稀 释 倍 数 / 含 菌 样 品 2.2.3 疑 似 青 枯 雷 尔 氏 菌 的 分 子 检 测 挑 取 2 环 纯 化 好 的 疑 似 青 枯 雷 尔 氏 菌 于 1.5ml 离 心 管 中, 加 入 200μl 无 菌 水, 水 浴 10min,8000r 离 心 1min, 吸 取 上 清 液 于 -20 保 存

423 把 纯 化 保 存 的 似 青 枯 雷 尔 氏 菌 落 形 态 的 单 菌 落 的 DNA 用 特 异 性 引 物 peha#3 和 peha#6 进 行 鉴 定, 引 物 序 列 为,pehA#3: 5'-CAG CAG AAC CCG CGC CTG ATC CAG-3' 和 peha#6: 5'-ATC GGA CTT GAT GCG CAG GCC GTT-3' 扩 增 得 到 的 片 断 大 小 为 504bp 25μl 的 反 应 体 系 为 :DNA 模 板 10-20ng, Taq(5U/μl) 0.3μl,10 PCR 缓 冲 液 2.5μl,dNTP(10mM) 0.5μl, 引 物 peha#3 和 peha#6(10μm) 各 1μl 加 无 菌 水 至 25μl 反 应 程 序 : 首 先 96 1min, 然 后 按 96 30s 70 30s 72 1min 程 序 2 个 循 环, 再 按 94 30s 70 30s 72 1min 程 序 33 个 循 环, 最 后 72 下 延 伸 5min 3. 试 验 结 果 3.1 溢 菌 实 验 由 图 1 可 知 辣 椒 病 株 无 溢 菌 现 象, 表 明 辣 椒 病 株 可 能 不 是 由 于 细 菌 性 病 害 引 起 的 需 通 过 进 一 步 分 离 以 验 证 该 病 害 是 否 由 青 枯 雷 尔 氏 菌 引 起 图 1 辣 椒 根 部 溢 菌 实 验 图 3.2 疑 似 青 枯 雷 尔 氏 菌 检 测 由 图 2 植 株 分 离 图 片, 通 过 菌 落 形 态 可 初 步 判 断 该 病 株 无 青 枯 雷 尔 氏 菌 存 在 对 筛 选 出 的 几 株 菌 株 利 用 青 枯 雷 尔 氏 菌 特 异 性 引 起 检 测 均 无 目 标 条 带 出 现, 表 明 辣 椒 植 株 发 病 不 是 由 青 枯 病 引 起 图 2 疑 似 青 枯 雷 尔 氏 菌 检 测 (5,6 泳 道 为 + 对 照 ) 3.3 部 分 试 验 图 片

424 图 3 辣 椒 病 株 根 部 分 离 图 4 辣 椒 病 株 叶 部 分 离 4. 试 验 讨 论 本 试 验 从 采 集 回 来 的 辣 椒 病 株, 通 过 溢 菌 试 验 可 初 步 判 断 该 病 害 不 是 细 菌 性 病 害, 即 不 是 青 枯 病 引 起 的 发 病 现 象 通 过 对 植 株 各 部 位 的 分 离, 通 过 形 态 和 分 子 手 段 进 行 验 证 表 明 辣 椒 病 株 无 青 枯 雷 尔 氏 菌 存 在, 这 对 我 们 进 一 步 防 治 该 地 区 辣 椒 病 害 具 有 重 要 的 指 导 意 义 根 据 试 验 结 果 可 以 判 断 莆 田 辣 椒 病 株 不 是 青 枯 病, 可 能 由 于 枯 萎 病 或 其 他 真 菌 性 病 害 引 起 的, 这 将 更 有 利 于 我 们 有 效 防 病 害 的 发 生 另 外, 通 过 试 验 可 知, 为 分 离 到 青 枯 雷 尔 氏 菌 无 致 病 力 菌 株 可 从 其 他 地 区 寻 找 发 病 植 株 进 一 步 分 离 检 测

425 5. 参 考 文 献 [1] Hayward, A.C. 1994. The hosts of Pseudomonas solanacearum. In Bacterial Wilt: the disease and its Causative Agent, Pseudomonas solanacearum. Hayward, A.C., and Hartman, G.L.(eds).Walingford: CAB International, pp. 9-25. [2] M.Gillings, P.Fahy&C.Davies.Pestriction analysis of an amplified polygalacturonase gene fragment differentiates strains of the phytopathogenic bacterium Pseudomonas solanacearum.letters in Applied Microbiology.1993,17,44-48. [3] 何 学 友. 我 国 林 木 青 枯 病 研 究 概 况 [J]. 森 林 病 虫 通 讯,1997 (1):43-46. [2]Opina N L,Valdez R B,Opina O S.Effect of rice-tomato cropping patterns and flooding on the survival of Pseudomonas solanacearum E.F.Smith[J]. Philippine-Phytopathology.1994,30(2):93~99. [4] 姚 革, 张 帆, 李 舟. 土 壤 添 加 剂 防 治 细 菌 性 青 枯 病 初 报. 生 物 防 治 通 报,1994,10(3):106~109. [5] 随 学 超, 卜 崇 兴, 郭 世 荣, 等. 基 质 中 添 加 有 机 缓 释 肥 对 番 茄 青 枯 病 防 效 的 影 响. 江 苏 农 业 科 学,2007 (4):85-88. [6] 黄 乃 秀. 几 种 不 同 抗 菌 素 对 培 养 桉 树 青 枯 病 菌 的 影 响 [J]. 广 西 林 业 科 学,1998,27(1):25-17. [7] 陈 勇, 唐 春 生, 刘 爱 中, 等. 4 种 药 剂 对 烟 草 青 枯 病 的 防 治 效 果 研 究 [J]. 湖 南 农 业 科 学,2008,(4):93~95. [8] 尹 贤 贵, 张 赟, 潘 光 辉, 等. 番 茄 抗 青 枯 病 材 料 筛 选 [J]. 长 江 蔬 菜,2004(1):42-44. [9] 杨 宇 红, 刘 俊 平, 等. 植 物 保 护 学 报 [J],2008,38(5):433-437 [10] 杨 威, 刘 苏 闵, 等. 中 国 生 物 防 治 [J],2010,26( 增 刊 )90-94 [11] 吕 建 林, 刘 二 明, 等. 中 国 生 物 防 治 [J],2010,26(2)200-205 [12] 祝 明 亮, 夏 振 远, 等. 中 国 烟 草 学 报 [J],2004, 10(1)25-27 试 验 负 责 郑 雪 芳 试 验 人 员 周 游 郑 雪 芳 林 抗 美

426 2011-08-18 承 担 单 位 : 福 建 省 农 科 院 农 业 生 物 资 源 研 究 所 试 验 设 计 : 郑 雪 芳 试 验 项 目 : 青 枯 雷 尔 氏 菌 FJAT-91 微 波 诱 变 条 件 摸 索 试 验 人 员 : 周 游 郑 雪 芳 试 验 负 责 : 郑 雪 芳 报 告 日 期 :2011-08-18 计 数 月 份 :2011 年 8 月 研 究 资 格 系 数 (0.5-1.0) 实 验 设 计 系 数 (0.9-1.0 0.9-1.0) 报 告 得 分 总 分 实 验 设 计 实 验 记 载 实 验 分 析 实 验 简 报 实 验 文 章 1-20% 21-40% 41-60% 61-80% 81-100% 1%-5% 设 计 不 足, 实 施 错 误 6%-10% 设 计 不 全, 实 验 无 果 11%-15% 设 计 可 以, 实 施 不 全 16%-20% 设 计 完 整, 分 布 实 施 21%-25% 实 验 不 全, 记 载 无 果 26%-30% 实 验 不 足, 记 载 不 全 31%-35% 独 立 实 验, 记 载 不 全 36%-40% 分 布 实 验, 记 载 完 整 41%-45% 目 的 明 确, 实 验 完 成 46%-50% 实 验 完 整, 记 载 清 晰 51%-55% 实 验 系 统, 结 果 可 信 56%-60% 实 验 创 新, 分 析 清 晰 61%-65% 实 验 创 新, 结 论 清 晰 66%-70% 实 验 完 整, 统 计 清 晰 71%-75% 实 验 系 统, 数 据 可 靠 76%-80% 报 告 完 整, 文 章 雏 形 81%-85% 结 构 合 理, 分 析 有 据 86%-90% 逻 辑 清 晰, 统 计 合 理 91%-95% 图 表 完 整, 写 作 流 畅 96%-100% 文 献 完 整, 发 表 水 平 福 建 省 农 业 科 学 院 农 业 生 物 资 源 研 究 所 农 业 微 生 物 研 究 中 心 电 话 : 0591-87882571, 传 真 : 0591-87882571 fjat.yzxz.com

427 1. 试 验 目 的 青 枯 雷 尔 氏 菌 ( Ralstonia solanacearum) 引 起 植 物 青 枯 病, 是 一 种 毁 灭 性 土 传 病, 可 造 成 作 物 严 重 减 产 甚 至 绝 产, 是 严 重 威 胁 农 业 生 产 的 主 要 病 害 之 一 青 枯 雷 尔 氏 菌 寄 主 广 泛, 可 侵 染 4 4 个 科 数 百 种 植 物 大 量 研 究 和 试 验 表 明 青 枯 雷 尔 氏 菌 无 致 病 力 突 变 株 在 植 物 青 枯 病 防 治 中 具 有 重 要 的 生 防 应 用 潜 力, 揭 示 其 生 防 机 理 对 其 实 际 生 产 应 用 及 提 高 植 物 青 枯 病 防 治 水 平 具 有 重 要 意 义 微 生 物 的 诱 变 方 式 有 很 多, 采 用 较 多 的 是 化 学 诱 变 和 紫 外 线 诱 变, 但 这 些 方 法 对 操 作 人 员 都 有 很 大 的 危 险 性, 操 作 不 慎 会 对 人 体 造 成 伤 害 微 波 是 高 频 交 变 的 电 磁 波, 具 有 传 导 作 用 和 极 强 的 穿 透 力, 能 够 造 成 极 性 分 子 的 迅 速 震 动, 这 种 震 动 能 引 起 菌 体 DNA 分 子 间 强 烈 的 摩 擦, 使 DNA 分 子 氢 键 和 碱 基 堆 积 化 学 力 受 损, 使 得 DNA 结 构 发 生 变 化, 从 而 发 生 遗 传 变 异 微 波 诱 变 已 在 植 物, 禽 畜, 微 生 物 育 种 等 多 方 面 得 到 应 用 利 用 微 波 诱 变 菌 株 提 高 菌 体 代 谢 产 物 的 量 已 被 证 明 是 很 好 的 诱 变 方 法 本 试 验 通 过 对 青 枯 雷 尔 氏 菌 进 行 微 波 诱 变, 找 到 致 病 力 弱 的 菌 株, 进 一 步 研 究 无 致 病 力 菌 株 对 青 枯 雷 尔 氏 菌 的 植 物 防 治 有 一 定 的 实 践 意 义 本 试 验 通 过 对 青 枯 雷 尔 氏 菌 进 行 微 波 诱 变, 对 进 一 步 研 究 植 物 疫 苗 有 一 定 的 指 导 意 义 2. 试 验 方 法 2.1 试 验 材 料 2.1.1 供 试 病 原 菌 供 试 病 原 菌 由 福 建 省 农 科 院 农 业 生 物 资 源 所 微 生 物 研 究 中 心 提 供, 为 FJAT-91 2.1.2 培 养 基 1)TTC 培 养 基 : 蛋 白 胨 10.0 g; 水 解 酪 蛋 白 1.0 g; 葡 萄 糖 5.0 g;ttc(2,3,5 氯 化 三 苯 基 四 氮 唑 ) 0.05 g;ph 7.0~7.2 ( 注 :TTC 用 蒸 馏 水 配 成 1% 溶 液 并 用 细 菌 过 滤 器 过 滤 灭 菌, 在 培 养 基 倒 平 板 前 ( 冷 却 至 约 50 ) 每 100. ml 培 养 基 加 入 0.5 ml ) 2)SPA 培 养 基 :5g 蛋 白 胨,20g 蔗 糖,0.5g KH2PO4,0.25g MgSO4,1000mL 蒸 馏 水,pH 值 调 节 到 约 7.4 左 右, 分 装,121 灭 菌 20min, 最 终 ph 值 为 7.2 左 右 2.1.3 仪 器 设 备 微 波 炉 2.2 试 验 方 法 2.2.1 悬 液 的 制 备 出 发 菌 株 FJAT-91 在 新 鲜 TTC 平 板 培 养 基 上 活 化,30 培 养 3d; 将 活 化 后 的 菌 株 接 种 于 SPA 液 体 培 养 基,30 150rpm 振 荡 培 养 过 夜 ( 约 16h); 取 4ml 培 养 液 与 5ml 离 心 管 中,10000rpm 离 心 3~5min, 弃 去 上 清 液, 加 4ml 无 菌 0.85% 生 理 盐 水, 重 新 悬 浮 菌 体, 再 离 心, 弃 去 上 清, 重 复 上 述 步 骤 用 生 理 盐 水 恢 复 成 菌 悬 液 ; 将 上 述 菌 悬 液 倒 入 装 有 小 玻 璃 珠 的 无 菌 三 角 瓶 内, 振 荡 20~30min, 以 打 散 细 胞 ; 取 诱 变 前 的 0.5ml 菌 悬 液 进 行 适 当 稀 释 分 离, 取 三 个 合 适 的 稀 释 度 倾 注 肉 汤 平 板, 每 一 梯 度 倾 注 两 皿, 每 皿 加 1ml 菌 液,37 倒 置 培 养 24~36h, 进 行 平 板 菌 落 计 数

428 2.2.2 微 波 诱 变 将 原 始 菌 株 扩 大 培 养 后, 把 菌 悬 液 放 在 灭 过 菌 的 平 板 上, 用 封 口 膜 将 平 板 封 住, 将 平 板 放 在 冰 上, 直 接 放 入 微 波 炉 中 分 别 以 中 高 强 度 微 波 处 理 60s,120s,180s,240s,300s 五 个 时 间 梯 度, 每 隔 120s 换 冰 冷 却 以 消 除 热 效 应 处 理 后 的 菌 液 稀 释 不 同 梯 度 涂 于 固 体 培 养 基 平 板 上, 并 以 没 有 经 过 微 波 处 理 的 菌 液 涂 板 进 行 对 照, 放 置 于 30 C 培 养 箱 中 培 养,48h 后 菌 落 计 数 2.2.3 致 死 率 的 测 定 将 培 养 后 的 平 板 单 菌 落 计 数, 以 没 有 经 过 微 波 处 理 的 平 板 菌 落 数 作 对 照, 计 算 五 个 时 间 梯 度 的 致 死 率 2.2.4 疑 似 弱 致 病 力 青 枯 雷 尔 氏 菌 的 菌 株 分 离 纯 化 根 据 菌 落 的 形 态 特 征, 我 们 将 致 病 力 弱 的 菌 株 挑 选 出 来, 放 在 TTC 培 养 基 上, 放 在 30 C 的 培 养 箱 中 培 养 48 小 时 2.2.5 DNA 制 备 挑 取 2 环 纯 化 好 的 疑 似 弱 致 病 力 青 枯 雷 尔 氏 菌 于 1.5ml 离 心 管 中, 加 入 200μl 无 菌 水, 水 浴 10min,8000r 离 心 1min, 吸 取 上 清 液 于 -20 保 存 2.2.6 青 枯 雷 尔 氏 菌 的 分 子 检 测 把 纯 化 保 存 的 似 青 枯 雷 尔 氏 菌 落 形 态 的 单 菌 落 的 DNA 用 特 异 性 引 物 peha#3 和 peha#6 进 行 鉴 定, 引 物 序 列 为,pehA#3: 5'-CAG CAG AAC CCG CGC CTG ATC CAG-3' 和 peha#6: 5'-ATC GGA CTT GAT GCG CAG GCC GTT-3' 扩 增 得 到 的 片 断 大 小 为 504bp 25μl 的 反 应 体 系 为 :DNA 模 板 10-20ng, Taq(5U/μl) 0.3μl,10 PCR 缓 冲 液 2.5μl,dNTP(10mM) 0.5μl, 引 物 peha#3 和 peha#6(10μm) 各 1μl 加 无 菌 水 至 25μl 反 应 程 序 : 首 先 96 1min, 然 后 按 96 30s 70 30s 72 1min 程 序 2 个 循 环, 再 按 94 30s 70 30s 72 1min 程 序 33 个 循 环, 最 后 72 下 延 伸 5min 3. 试 验 结 果 3.1 微 波 诱 变 处 理 后 的 致 病 力 强 的 青 枯 雷 尔 氏 菌 的 情 况 致 死 率 (%) 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 1 2 3 4 5 微 波 辐 射 时 间 (min)

429 图 1 微 波 辐 射 时 间 与 致 死 率 之 间 的 关 系 不 同 微 波 辐 射 时 间 对 青 枯 雷 尔 氏 菌 致 死 率 的 影 响 不 同 不 同 紫 外 照 射 时 间 处 理 后,TTC 平 板 上 出 现 的 菌 落 数 随 着 微 波 时 间 的 增 长, 菌 株 的 致 死 率 也 在 增 高 在 紫 外 照 射 时 间 为 240s 时, 其 致 死 率 为 94.6% 图 2 无 微 波 辐 射 青 枯 雷 尔 氏 菌 生 长 情 况 图 3 微 波 辐 射 240s 青 枯 雷 尔 氏 菌 生 长 情 况 图 4 微 波 辐 射 180s 青 枯 雷 尔 氏 菌 生 长 情 况 图 5 微 波 辐 射 120s 青 枯 雷 尔 氏 菌 生 长 情 况

430 3.2 微 波 诱 变 处 理 后 的 致 病 力 强 的 青 枯 雷 尔 氏 菌 纯 化 情 况 图 6 纯 化 后 的 青 枯 雷 尔 氏 菌 生 长 情 况 图 7 纯 化 后 的 青 枯 雷 尔 氏 菌 生 长 情 况 从 图 6, 图 7 中 可 以 得 到, 当 用 微 波 诱 变 强 致 病 菌 株 时, 几 乎 不 产 生 弱 致 病 的 菌 株, 也 就 是 突 变 率 很 低, 几 乎 为 零 3.3 微 波 诱 变 处 理 后 的 致 病 力 强 的 青 枯 雷 尔 氏 菌 的 分 子 鉴 定 的 结 果 图 7 诱 变 后 的 菌 株 的 分 子 鉴 定 结 果 从 图 8 中 我 们 可 以 得 到, 我 们 纯 化 后 在 平 板 上 分 离 的 菌 株, 全 部 都 是 青 枯 雷 尔 氏 菌

431 4. 试 验 讨 论 (1) 具 有 强 致 病 力 的 青 枯 雷 尔 氏 菌, 在 微 波 辐 射 的 诱 变 下, 很 难 突 变 成 弱 致 病 力 的 菌 株, 突 变 率 极 低, 几 乎 为 零 (2) 微 波 对 菌 株 的 致 死 率 在 120s 之 后, 随 着 时 间 的 增 加 而 增 大, 在 300s 时 致 死 率 达 到 100% 5. 参 考 文 献 [1] 姚 革, 张 帆, 李 舟. 土 壤 添 加 剂 防 治 细 菌 性 青 枯 病 初 报. 生 物 防 治 通 报,1994,10(3):106~109. [2] 随 学 超, 卜 崇 兴, 郭 世 荣, 等. 基 质 中 添 加 有 机 缓 释 肥 对 番 茄 青 枯 病 防 效 的 影 响. 江 苏 农 业 科 学,2007 (4):85-88. [3] 黄 乃 秀. 几 种 不 同 抗 菌 素 对 培 养 桉 树 青 枯 病 菌 的 影 响 [J]. 广 西 林 业 科 学,1998,27(1):25-17. [4] 陈 勇, 唐 春 生, 刘 爱 中, 等. 4 种 药 剂 对 烟 草 青 枯 病 的 防 治 效 果 研 究 [J]. 湖 南 农 业 科 学,2008,(4):93~95. [5] 尹 贤 贵, 张 赟, 潘 光 辉, 等. 番 茄 抗 青 枯 病 材 料 筛 选 [J]. 长 江 蔬 菜,2004(1):42-44. 试 验 负 责 郑 雪 芳 试 验 人 员 周 游

432 2011-8-15 承 担 单 位 : 福 建 省 农 科 院 农 业 生 物 资 源 研 究 所 试 验 设 计 : 试 验 项 目 : 青 枯 雷 尔 氏 菌 无 致 病 力 突 变 体 的 PCR 检 测 试 验 人 员 : 马 桂 美 试 验 负 责 : 车 建 美 林 海 云 刘 波 报 告 日 期 :2011-8-15 计 数 月 份 :2011 年 7 月 (3) 研 究 资 格 系 数 (0.5-1.0) 实 验 设 计 系 数 (0.9-1.0 0.9-1.0) 报 告 得 分 总 分 实 验 设 计 实 验 记 载 实 验 分 析 实 验 简 报 实 验 文 章 1-20% 21-40% 41-60% 61-80% 81-100% 1%-5% 设 计 不 足, 实 施 错 误 6%-10% 设 计 不 全, 实 验 无 果 11%-15% 设 计 可 以, 实 施 不 全 16%-20% 设 计 完 整, 分 布 实 施 21%-25% 实 验 不 全, 记 载 无 果 26%-30% 实 验 不 足, 记 载 不 全 31%-35% 独 立 实 验, 记 载 不 全 36%-40% 分 布 实 验, 记 载 完 整 41%-45% 目 的 明 确, 实 验 完 成 46%-50% 实 验 完 整, 记 载 清 晰 51%-55% 实 验 系 统, 结 果 可 信 56%-60% 实 验 创 新, 分 析 清 晰 61%-65% 实 验 创 新, 结 论 清 晰 66%-70% 实 验 完 整, 统 计 清 晰 71%-75% 实 验 系 统, 数 据 可 靠 76%-80% 报 告 完 整, 文 章 雏 形 81%-85% 结 构 合 理, 分 析 有 据 86%-90% 逻 辑 清 晰, 统 计 合 理 91%-95% 图 表 完 整, 写 作 流 畅 96%-100% 文 献 完 整, 发 表 水 平 福 建 省 农 业 科 学 院 农 业 生 物 资 源 研 究 所 农 业 微 生 物 研 究 中 心 电 话 : 0591-87882571, 传 真 : 0591-87882571 fjat.yzxz.com

433 1. 试 验 目 的 细 菌 性 青 枯 病 是 一 种 的 重 要 土 传 植 物 病 害, 分 布 广 泛, 在 热 带 和 亚 热 带 地 区 都 有 发 现, 并 且 其 侵 染 寄 主 的 范 围 也 很 广, 包 括 单 子 叶 和 双 子 叶 植 物 (Remenant B. et al, 2010), 其 在 农 业 上 造 成 的 损 失 是 惨 重, 在 历 史 上 就 出 现 过 此 类 病 害 的 灾 难, 因 此 青 枯 菌 致 病 机 理 的 研 究 至 关 重 要 前 期 已 经 对 mini-tn5 插 入 突 变 体 的 菌 落 形 态 进 行 了 研 究, 对 其 致 病 力 进 行 了 初 步 的 判 断, 并 采 用 SDS 和 CTAB 法 提 取 菌 体 总 DNA mini-tn5 中 含 有 抗 卡 那 霉 素 基 因, 本 次 试 验 利 用 抗 卡 那 霉 素 基 因 的 引 物 进 行 PCR 扩 增, 检 测 突 变 体 是 否 有 插 入 mini-tn5 并 以 青 枯 雷 尔 氏 菌 特 异 性 引 物 flic 引 物 和 phca 引 物 进 行 PCR 扩 增, 进 一 步 对 无 致 病 力 菌 株 进 行 检 测, 确 认 其 是 否 为 青 枯 雷 尔 氏 菌 2. 试 验 方 法 2.1 试 验 材 料 2.1.1 供 试 菌 株 菌 株 来 源 于 FJAT-91 青 枯 雷 尔 氏 菌 Tn5 插 入 突 变 体 库, 菌 株 编 号 :FJAT-FJAT-t770 FJAT-t65 FJAT-t158 FJAT-t134 FJAT-t168 FJAT-t186 FJAT-t200 FJAT-t212 FJAT-t334 FJAT-t616 FJAT-t617 FJAT-t636 FJAT-t644 FJAT-t618 FJAT-t601 FJAT-t297 FJAT-t162 其 中 FJAT-t618 FJAT-t601 FJAT-t297 FJAT-t162 是 强 致 病 力 菌 株, 而 FJAT-t618 是 产 色 素 的 强 致 病 力 菌 株 ; 其 他 均 为 无 致 病 力 菌 株 2.1.2 供 试 DNA 试 验 中 所 使 用 的 基 因 组 DNA, 来 自 上 一 试 验 中 用 SDS 和 CTAB 法 提 取 的 基 因 组 总 DNA 2.2 试 剂 与 仪 器 (1) 试 剂 : 无 菌 水 dntp 购 自 福 州 博 海 生 物 技 术 有 限 公 司 ;Buffer,Taq 酶 购 自 北 京 天 根 生 化 科 技 有 限 公 司 ; 特 异 性 基 因 引 物 flic 基 因 引 物 抗 卡 那 霉 素 基 因 引 物 和 phca 基 因 引 物,1500 bp Maker 购 自 上 海 英 竣 生 物 技 术 公 司 (2) 仪 器 :Biometra 梯 度 PCR 仪 ;BIO-RAD 电 泳 仪 ;UVP 凝 胶 成 像 仪 2.3 试 验 方 法 2.3.1 扩 增 体 系 ddw:18.7 μl ; Buffer:2.5 μl; dntp:0.5 μl; 上 游 引 物 :1 μl; 下 游 引 物 :1 μl; Taq:0.3 μl; DNA:1 μl 2.3.2 扩 增 程 序 (1) 青 枯 雷 尔 氏 菌 的 特 异 性 引 物 的 PCR 扩 增 程 序 96 C, 预 变 性 1min; 96 C 变 性 30 s, 70 C 退 火 30 s, 72 C 延 伸 1min, 进 行 2 个 循 环 ; 之 后 94 C 变 性 30 s, 70 C 退 火 30 s, 72 C 延 伸 1min, 再 进 行 33 个 循 环 ; 最 后 72 C 5min (2) 青 枯 雷 尔 氏 菌 的 flic 基 因 引 物 的 PCR 扩 增 程 序 94 C, 预 变 性 5min; 然 后 94 C 变 性 30s, 63 C 退 火 30s, 72 C 延 伸 1min, 进 行 25 个 循 环 ; 最 后 72 C 10min

434 (3) 抗 卡 那 霉 素 基 因 引 物 的 PCR 扩 增 程 序 94 C, 预 变 性 3 min; 然 后 94 C 变 性 30 s, 57 C 退 火 30 s, 72 C 延 伸 1 min, 进 行 35 个 循 环 ; 最 后 72 C 10 min (4)phcA 基 因 引 物 的 PCR 扩 增 程 序 : 95 C, 预 变 性 5 min; 然 后 95 C 变 性 30 s, 61 C 退 火 30 s, 72 C 延 伸 1 min, 进 行 30 个 循 环 ; 最 后 72 C 5 min 2.3.3 电 泳 采 用 的 1.5% 胶 浓 度, 上 样 量 为 6 μl, 电 压 为 100 V; 凝 胶 成 像 观 测 PCR 结 果 3. 试 验 结 果 3.1 青 枯 雷 尔 氏 菌 特 异 性 引 物 PCR 扩 增 结 果 青 枯 雷 尔 氏 菌 特 异 性 基 因 引 物 的 PCR 扩 增 结 果 见 图 1 由 图 可 见, 大 部 分 菌 株 都 扩 增 出 500 bp 条 带, 如 FJAT-t65 FJAT-t158 FJAT-t134 FJAT-t168 FJAT-t186 FJAT-t200 FJAT-t212 FJAT-t334 FJAT-t616 FJAT-t644 FJAT-t601 FJAT-t297 和 FJAT-t162 只 有 FJAT-t770 FJAT-t617 FJAT-t618 没 有 扩 增 出 条 带, FJAT-t636 的 条 带 特 别 模 糊 ; 而 FJAT-t158 FJAT-t168 FJAT-t186 FJAT-t297 FJAT-t162 扩 增 出 了 2 条 带 图 1 注 : M maker, + 阳 性 对 照, - 阴 性 对 照 青 枯 雷 尔 氏 菌 特 异 性 引 物 的 PCR 扩 增 结 果 3.2 青 枯 雷 尔 氏 菌 flic 引 物 PCR 扩 增 结 果 扩 增 结 果 见 图 2 由 图 可 见, 大 部 分 菌 株 均 扩 增 出 了 400 bp 的 片 段, 如 FJAT-t65 FJAT-t158 FJAT-t134 FJAT-t168 FJAT-t186 FJAT-t200 FJAT-t212 FJAT-t334 FJAT-t616 FJAT-t617 FJAT-t644 FJAT-t 618 FJAT-t601 FJAT-t297 和 FJAT-t162 但 也 有 部 分 菌 株 未 扩 增 出 条 带, 如 FJAT-t770 FJAT-t636 未 扩 增 出 条 带, 但 FJAT-t616 FJAT-t617 FJAT-t644 FJAT-t601 的 条 带 很 模 糊, 而 FJAT-t158 FJAT-t186 也 扩 增 出 了 2 条 带 图 2 注 : M maker, + 阳 性 对 照, - 阴 性 对 照 青 枯 雷 尔 氏 菌 flic 引 物 PCR 扩 增 结 果

435 3.3 青 枯 雷 尔 氏 菌 抗 卡 那 霉 素 引 物 PCR 扩 增 结 果 扩 增 结 果 见 图 3 由 图 可 见, 虽 然 有 些 条 带 模 糊, 但 所 有 菌 株 都 扩 增 出 了 700 bp 的 片 段, 表 明 这 些 菌 株 有 卡 那 霉 素 抗 性 基 因 的 的 片 段 同 样 此 次 扩 增 也 有 出 现 2 条 带 的 菌 株, 如 FJAT-t186 FJAT-t200 FJAT-t162. 注 : M maker, - 阴 性 对 照 图 3 青 枯 雷 尔 氏 菌 抗 卡 那 霉 素 引 物 PCR 扩 增 结 果 3.4 青 枯 雷 尔 氏 菌 PhcA 引 物 PCR 扩 增 结 果 由 图 4 可 知, 只 有 部 分 菌 株 扩 增 出 了 约 1300 bp 的 片 段, 如 FJAT-t65 FJAT-t158 FJAT-t334 FJAT-t618 FJAT-t601 FJAT-t162 图 4 注 : M maker, + 阳 性 对 照, - 阴 性 对 照 青 枯 雷 尔 氏 菌 phca 引 物 PCR 扩 增 结 果 4. 试 验 讨 论 (1) 由 图 1 的 结 果 可 以 初 步 推 断 FJAT-t770 FJAT-t617 FJAT-t618 不 是 青 枯 雷 尔 氏 菌 (2) 而 FJAT-t158 FJAT-t168 FJAT-t186 FJAT-t297 FJAT-t162 扩 增 出 了 两 条 带, 可 能 是 基 因 组 DNA 浓 度 高, 扩 增 不 完 全, 有 基 因 组 DNA 残 留 (2) 卡 那 霉 素 抗 性 基 因 引 物 的 扩 增 结 果 显 示, 所 以 mini-tn5 插 入 突 变 体 菌 株 都 有 卡 那 霉 素 的 抗 性 基 因 片 段 (3)phcA 是 毒 力 调 节 的 关 键 基 因 (Poussier S. et al,2003),phca 引 物 的 扩 增 结 果 表 面,mini-Tn5 插 入 突 变 体 中 的 无 致 病 力 菌 株 缺 失 phca 基 因, 以 至 于 其 表 现 出 无 致 病 力 的 菌 落 形 态 ; 而 部 分 无 致 病 力 菌 株 保 留 了 phca 基 因, 却 表 现 出 无 致 病 力 的 菌 落 形 态, 其 具 体 原 因 有 待 进 一 步 的 研 究 (4) 扩 增 条 带 模 糊, 可 能 是 DNA 浓 度 太 低, 也 可 能 是 DNA 提 取 时 残 留 的 离 子 影 响 其 扩 增 和 电 泳, 具 体 原 因 有 待 下 个 试 验 的 验 证

436 5.. 参 考 文 献 (1) Renmenant B, Coupat-Goutaland B, Guidot A, et al. Genomes of three tomato pathogens within the Ralstonia solanacearum species complex reveal significant evolutionary divergence[j]. BMC Genomics 2010, 11:379-395. (2) Poussier S.,Thoquet P.,Denny D.,Barthet S.,Meyer D.,Arlat M.,Trlgalet A..Host plant-dependent phenotypic reversion of Ralstonia solanacearum from non-pathogenic to pathogenic forms via alterations in the phca gene[j]. Molecular Microbiology,2003, 49(4): 991-1003. 试 验 负 责 车 建 美 林 海 云 刘 波 试 验 人 员 马 桂 美

437 2011-8-16 承 担 单 位 : 福 建 省 农 科 院 农 业 生 物 资 源 研 究 所 试 验 设 计 : 试 验 项 目 : 短 短 芽 孢 杆 菌 FJAT-0809-GLX 抗 生 素 敏 感 性 检 测 试 验 人 员 : 马 桂 美 试 验 负 责 : 车 建 美 林 海 云 刘 波 报 告 日 期 :2011-8-16 计 数 月 份 :2011 年 7 月 (2) 研 究 资 格 系 数 (0.5-1.0) 实 验 设 计 系 数 (0.9-1.0 0.9-1.0) 报 告 得 分 总 分 实 验 设 计 实 验 记 载 实 验 分 析 实 验 简 报 实 验 文 章 1-20% 21-40% 41-60% 61-80% 81-100% 1%-5% 设 计 不 足, 实 施 错 误 6%-10% 设 计 不 全, 实 验 无 果 11%-15% 设 计 可 以, 实 施 不 全 16%-20% 设 计 完 整, 分 布 实 施 21%-25% 实 验 不 全, 记 载 无 果 26%-30% 实 验 不 足, 记 载 不 全 31%-35% 独 立 实 验, 记 载 不 全 36%-40% 分 布 实 验, 记 载 完 整 41%-45% 目 的 明 确, 实 验 完 成 46%-50% 实 验 完 整, 记 载 清 晰 51%-55% 实 验 系 统, 结 果 可 信 56%-60% 实 验 创 新, 分 析 清 晰 61%-65% 实 验 创 新, 结 论 清 晰 66%-70% 实 验 完 整, 统 计 清 晰 71%-75% 实 验 系 统, 数 据 可 靠 76%-80% 报 告 完 整, 文 章 雏 形 81%-85% 结 构 合 理, 分 析 有 据 86%-90% 逻 辑 清 晰, 统 计 合 理 91%-95% 图 表 完 整, 写 作 流 畅 96%-100% 文 献 完 整, 发 表 水 平 福 建 省 农 业 科 学 院 农 业 生 物 资 源 研 究 所 农 业 微 生 物 研 究 中 心 电 话 : 0591-87882571, 传 真 : 0591-87882571 fjat.yzxz.com

438 1. 试 验 目 的 短 短 芽 孢 杆 菌 是 革 兰 氏 阳 性 菌, 在 逆 境 中 能 形 成 芽 孢, 以 适 应 恶 劣 环 境 其 细 胞 壁 不 含 内 毒, [1-2] [3] [4] 绝 大 多 数 对 人 畜 无 毒, 并 且 在 自 然 界 分 布 比 较 广 泛, 可 以 产 生 抗 生 素 细 菌 素 抗 菌 蛋 白 及 挥 [5] 发 性 抗 菌 物 质 短 短 芽 孢 杆 菌 的 抗 菌 谱 较 广, 在 离 体 的 条 件 下 可 以 对 多 种 病 原 真 菌 和 病 原 细 菌 表 现 拮 抗 活 性, 具 有 潜 在 的 开 发 前 景 和 研 究 价 值 本 实 验 室 从 土 壤 中 分 离 到 的 短 短 芽 孢 杆 菌 FJAT-0809-GLX, 对 番 茄 枯 萎 病 有 抑 制 作 用, 其 抑 菌 机 理 是 产 生 短 杆 菌 酪 肽 和 几 丁 质 酶 等 活 性 物 质 并 且 短 短 芽 孢 杆 菌 FJAT-0809-GLX 胞 外 物 质 较 稳 定, 对 蛋 白 酶 不 敏 感 耐 强 酸 强 碱 紫 外 线 和 反 复 冻 融 对 其 活 性 无 显 著 影 响 前 期 试 验 中, 已 经 对 短 短 芽 孢 杆 菌 FJAT-0809-GLX 的 基 因 组 进 行 了 测 序, 但 是 其 基 因 功 能 还 有 待 研 究 为 了 研 究 基 因 的 功 能, 首 先 要 找 出 该 菌 株 的 标 记 基 因, 本 次 试 验 研 究 短 短 芽 孢 杆 菌 对 抗 生 素 敏 感 性, 采 用 本 实 验 室 现 有 的 新 霉 素 和 卡 那 霉 素 进 行 抑 菌 圈 试 验, 观 察 两 种 抗 生 素 对 短 短 芽 孢 杆 菌 的 抑 制 能 力, 为 该 菌 株 标 记 基 因 的 寻 找 奠 定 基 础 2. 试 验 方 法 2.1 试 验 材 料 2.1.1 试 验 菌 株 短 短 芽 孢 杆 菌 FJAT-0809-GLX 是 本 实 验 室 自 土 壤 中 分 离 得 到 的 2.1.2 试 验 器 材 与 试 剂 (1) 试 验 器 材 : 滤 纸 片 镊 子 涂 布 棒 (2) 试 剂 (A)NA 培 养 基 :NA 固 体 培 养 基 : 每 升 含 牛 肉 膏 3.0 g, 蛋 白 胨 5.0 g, 葡 萄 糖 10.0 g, 琼 脂 1.7%, ph7.2-7.4; NA 半 固 体 培 养 基 : 每 升 含 牛 肉 膏 3.0 g, 蛋 白 胨 5.0 g, 葡 萄 糖 10.0 g, 琼 脂 0.7%,pH7.2-7.4; NA 液 体 培 养 基 : 每 升 含 牛 肉 膏 3.0 g, 蛋 白 胨 5.0 g, 葡 萄 糖 10.0 g, ph7.2-7.4 (B) 抗 生 素 : 抗 生 素 及 其 浓 度 见 表 1 表 1 抗 生 素 及 其 浓 度 抗 生 素 浓 度 (μg/ml) 10 20 50 新 霉 素 100 150 200 10 20 50 卡 那 霉 素 100 150 200 2.2 试 验 内 容 与 方 法 (1) 短 短 芽 孢 杆 菌 FJAT-0809-GLX 菌 株 的 活 化 : 将 从 冰 箱 中 取 出 的 短 短 芽 孢 杆 菌 FJAT-0809-GLX 划 线 于 NA 培 养 基 上,30 培 养 48 h 后, 挑 取 单 菌 落 于 NA 液 体 培 养 基 中 振 荡 培 养 48 h, 菌 液 备 用

439 (2) 抗 生 素 敏 感 性 试 验 (A) 滤 纸 贴 片 法 : 向 含 有 0.7% 琼 脂 的 培 养 基 中 加 入 1 ml 菌 液, 混 匀, 倒 在 含 有 1.7% 的 NA 固 体 培 养 基 上, 制 备 双 层 培 养 基 将 含 有 不 同 浓 度 抗 生 素 的 滤 纸 片 置 于 平 板 上,30 培 养 48 h, 进 行 抑 菌 圈 大 小 的 测 量 和 统 计, 试 验 重 复 3 次 (B) 划 线 法 : 在 含 有 不 同 浓 度 抗 生 素 的 培 养 基 上 划 线 (C) 平 板 涂 布 法 : 取 梯 度 稀 释 的 短 短 芽 孢 杆 菌 FJAT-0809-GLX 加 入 含 有 不 同 浓 度 抗 生 素 的 培 养 基 上, 涂 板,30 倒 置 培 养 48 h 进 行 菌 落 计 数, 计 算 抑 菌 率 试 验 重 复 2 次 3. 试 验 结 果 3.1 滤 纸 贴 片 法 测 短 短 芽 孢 杆 菌 FJAT-0809-GLX 对 抗 生 素 的 敏 感 性 滤 纸 贴 片 法 试 验 结 果 见 表 2 和 图 1-4 滤 纸 片 法 的 结 果 显 示, 新 霉 素 和 卡 那 霉 素 都 不 能 抑 制 短 短 芽 孢 杆 菌 FJAT-0809-GLX 的 生 长 抗 生 素 新 霉 素 卡 那 霉 素 注 : +++ +++ 生 长 正 常 表 2 滤 纸 片 法 检 测 抗 生 素 敏 感 性 结 果 浓 度 (μg/ml g/ml) 敏 感 性 CK +++ 10 +++ 20 +++ 50 +++ 100 +++ 150 +++ 200 +++ 10 +++ 20 +++ 50 +++ 100 +++ 150 +++ 200 +++ A B 图 1 新 霉 素 敏 感 性 检 测 (A: 反 面,B; 正 面 )

440 A 图 2 新 霉 素 敏 感 性 检 测 (A: 反 面,B: 正 面 ) B A B 图 3 卡 那 霉 素 敏 感 性 检 测 (A: 反 面,B: 正 面 ) A B 图 4 卡 那 霉 素 敏 感 性 检 测 (A: 反 面,B: 正 面 ) 3.2 划 线 法 检 测 短 短 芽 孢 杆 菌 FJAT-0809-GLX 对 抗 生 素 的 敏 感 性 划 线 法 试 验 结 果 见 表 3 和 图 5-11 划 线 法 试 验 结 果 显 示, 新 霉 素 浓 度 为 100 μg/ml 以 上 时, 对 短 短 芽 孢 杆 菌 FJAT-0809-GLX 的 生 长 有 抑 制 作 用

441 抗 生 素 新 霉 素 表 3 划 线 法 检 测 敏 感 性 试 验 的 结 果 浓 度 (μg/ml g/ml) 注 : +++ 生 长 正 常, ++ 长 势 稍 弱, + 长 势 较 弱, - 完 全 抑 制 敏 感 性 CK +++ 10 ++ 20 ++ 50 + 100-150 - 200 - A B 图 5 无 新 霉 素 菌 落 生 长 情 况 (A: 反 面,B: 正 面 ) A B 图 6 含 有 10 μg/ml 新 霉 素 的 菌 落 生 长 状 况 (A: 反 面,B: 正 面 )

442 A B 图 7 含 有 20 μg/ml 新 霉 素 的 菌 落 生 长 状 况 (A: 反 面,B: 正 面 ) A B 图 8 含 有 50 μg/ml 新 霉 素 的 菌 落 生 长 状 况 (A: 反 面,B: 正 面 ) A B 图 9 含 有 100 μg/ml 新 霉 素 的 菌 落 生 长 状 况 (A: 反 面,B: 正 面 )

443 A B 图 10 含 有 150μg/mL 新 霉 素 菌 落 生 长 状 况 (A: 反 面,B: 正 面 ) A B 图 11 含 有 200 μg/ml 新 霉 素 的 菌 落 生 长 状 况 (A: 反 面,B: 正 面 ) 3.3 涂 板 法 检 测 短 短 芽 孢 杆 菌 FJAT-0809-GLX 对 抗 生 素 的 敏 感 性 由 前 面 2 种 方 法 的 结 果 显 示, 新 霉 素 对 短 短 芽 孢 杆 菌 FJAT-0809-GLX 的 生 长 有 抑 制 作 用, 但 是 菌 体 的 浓 度 直 接 影 响 其 抑 制 效 果, 因 此 采 用 稀 释 菌 液, 进 行 涂 板, 观 察 其 抑 制 率 涂 布 平 板 法 检 测 敏 感 性 的 试 验 结 果 见 表 4 和 图 12-21 涂 布 平 板 法 的 试 验 结 果 显 示, 短 短 芽 孢 杆 菌 FJAT-0809-GLX 在 50 μg/ml 的 新 霉 素 平 板 上 不 生 长, 同 样 在 100 μg/ml 150 μg/ml 和 200 μg/ml 上 也 不 能 生 长 表 4 涂 布 平 板 法 的 敏 感 性 检 测 试 验 结 果 抗 生 素 抗 生 素 浓 度 (μg/ml g/ml) 菌 体 稀 释 倍 数 敏 感 性 对 照 10 +++ 10 +++ 50 10-10 - 新 霉 素 100 10-10 - 150 10-10 - 200 10-10 - 注 : +++ +++ 正 常 生 长, - 生 长 被 抑 制

444 A B 图 12 对 照 组 菌 体 的 生 长 状 况 (A: 反 面,B: 正 面 ) A B 图 13 对 照 组 菌 体 的 生 长 状 况 (A: 反 面,B: 正 面 ) A 图 14 新 霉 素 浓 度 50 μg/ml 为 菌 体 的 生 长 状 况 (A: 反 面,B: 正 面 ) B

445 A B 图 15 新 霉 素 浓 度 为 50 μg/ml 菌 体 的 生 长 状 况 (A: 反 面,B: 正 面 ) A B 图 16 新 霉 素 浓 度 100 μg/ml 为 菌 体 的 生 长 状 况 (A: 反 面,B: 正 面 ) A 图 17 新 霉 素 浓 度 100 μg/ml 为 菌 体 的 生 长 状 况 (A: 反 面,B: 正 面 ) B

446 A B 图 18 新 霉 素 浓 度 150 μg/ml 为 菌 体 的 生 长 状 况 (A: 反 面,B: 正 面 ) A B 图 19 新 霉 素 浓 度 150 μg/ml 为 菌 体 的 生 长 状 况 (A: 反 面,B: 正 面 ) A B 图 20 新 霉 素 浓 度 200 μg/ml 为 菌 体 的 生 长 状 况 (A: 反 面,B: 正 面 )

447 A B 图 21 新 霉 素 浓 度 200 μg/ml 为 菌 体 的 生 长 状 况 (A: 反 面,B: 正 面 ) 4. 试 验 讨 论 (1) 滤 纸 贴 片 法 的 试 验 结 果 显 示, 新 霉 素 与 卡 那 霉 素 对 短 短 芽 孢 杆 菌 FJAT-0809-GLX 的 生 长 没 有 抑 制 作 用 初 步 推 断 是 菌 液 浓 度 太 高, 以 至 于 其 敏 感 性 未 有 所 表 现 (2) 划 线 法 的 试 验 结 果 显 示, 新 霉 素 浓 度 为 100 μg/ml 时, 短 短 芽 孢 杆 菌 FJAT-0809-GLX 的 生 长 被 抑 制, 初 步 论 证 了, 短 短 芽 孢 杆 菌 FJAT-0809-GLX 新 霉 素 敏 感 性 与 菌 液 浓 度 有 关, 菌 液 浓 度 过 高 时, 其 敏 感 性 未 能 表 现 (3) 为 了 进 步 研 究 其 菌 液 浓 度 与 其 敏 感 性 的 关 系, 将 菌 液 稀 释 后 涂 于 含 有 不 同 浓 度 新 霉 素 的 培 养 基 上, 观 察 其 生 长 状 况, 试 验 结 果 显 示, 短 短 芽 孢 杆 菌 FJAT-0809-GLX 在 新 霉 素 浓 度 为 50 μg/ml 100 μg/ml 150 μg/ml 和 200 μg/ml 的 平 板 上 不 能 生 长 (4) 综 合 3 个 试 验 的 结 果, 短 短 芽 孢 杆 菌 FJAT-0809-GLX 在 新 霉 素 浓 度 为 100 μg/ml 时 不 能 生 长, 即 短 短 芽 孢 杆 菌 FJAT-0809-GLX 的 新 霉 素 敏 感 浓 度 为 100 μg/ml 5.. 参 考 文 献 1) Asaka O, Shoda M. Biocontrol of Rhizoctonia solani damping off of tomato with Bacillus subtilis RB14[J]. Appl Environ Microbiol,1996, 62(11):4081-4085. 2) Kleinkauf H, Dohren H Nonribosomal biosynthesis of peptide antibiotics[j]. Eur J Biochem,1990, 192(1):1-l5. 3) Zheng G, Slavik M Isolation, partial purification and characterization of a bacteriocin produced by a newly isolated Bacillus subtilis strain[j]. Lett App1 Bacterio1,1999, 28(5):363-367. 4) Axe1 G, Stoverand A D. Regulation of synthesis of the Bacillus subtilis transition phase, spore associated antibacterial protenin TasA[J]. J Bacterio1,1999, 181(17):5476-5481. 试 验 负 责 车 建 美 林 海 云 刘 波 试 验 人 员 马 桂 美

448 2011-8-17 承 担 单 位 : 福 建 省 农 科 院 农 业 生 物 资 源 研 究 所 试 验 设 计 : 试 验 项 目 : 青 枯 雷 尔 氏 菌 的 无 致 病 力 突 变 株 的 形 态 和 分 子 检 测 试 验 人 员 : 马 桂 美 试 验 负 责 : 车 建 美 林 海 云 刘 波 报 告 日 期 :2011-8-17 计 数 月 份 :2011 年 7 月 (1) 研 究 资 格 系 数 (0.5-1.0) 实 验 设 计 系 数 (0.9-1.0 0.9-1.0) 报 告 得 分 总 分 实 验 设 计 实 验 记 载 实 验 分 析 实 验 简 报 实 验 文 章 1-20% 21-40% 41-60% 61-80% 81-100% 1%-5% 设 计 不 足, 实 施 错 误 6%-10% 设 计 不 全, 实 验 无 果 11%-15% 设 计 可 以, 实 施 不 全 16%-20% 设 计 完 整, 分 布 实 施 21%-25% 实 验 不 全, 记 载 无 果 26%-30% 实 验 不 足, 记 载 不 全 31%-35% 独 立 实 验, 记 载 不 全 36%-40% 分 布 实 验, 记 载 完 整 41%-45% 目 的 明 确, 实 验 完 成 46%-50% 实 验 完 整, 记 载 清 晰 51%-55% 实 验 系 统, 结 果 可 信 56%-60% 实 验 创 新, 分 析 清 晰 61%-65% 实 验 创 新, 结 论 清 晰 66%-70% 实 验 完 整, 统 计 清 晰 71%-75% 实 验 系 统, 数 据 可 靠 76%-80% 报 告 完 整, 文 章 雏 形 81%-85% 结 构 合 理, 分 析 有 据 86%-90% 逻 辑 清 晰, 统 计 合 理 91%-95% 图 表 完 整, 写 作 流 畅 96%-100% 文 献 完 整, 发 表 水 平 福 建 省 农 业 科 学 院 农 业 生 物 资 源 研 究 所 农 业 微 生 物 研 究 中 心 电 话 : 0591-87882571, 传 真 : 0591-87882571 fjat.yzxz.com

449 1. 试 验 目 的 青 枯 雷 尔 氏 菌 是 一 种 土 传 性 病 害, 在 很 多 植 物 中 都 有 所 发 现, 寄 主 范 围 很 广, 是 常 见 的 农 作 物 病 害, 其 致 病 机 理 的 研 究 至 关 重 要 我 们 实 验 室 通 过 插 入 mini-tn5 构 建 突 变 体 库, 为 其 致 病 机 理 的 研 究 提 供 材 料 此 次 试 验 主 要 研 究 mini-tn5 插 入 突 变 体 中 的 无 致 病 力 菌 株, 前 期 试 验 从 菌 体 形 态 对 突 变 体 库 中 的 部 分 菌 株 进 行 了 鉴 别, 但 分 子 检 测 的 结 果 不 是 很 理 想, 因 此 需 要 再 次 验 证 此 次 试 验 分 别 从 菌 体 的 形 态 和 分 子 方 面 进 行 验 证 这 些 菌 株 为 无 致 病 力 菌 株, 此 次 试 验 涂 板 后, 测 其 弱 化 指 数 并 采 用 试 剂 盒 法 提 取 基 因 组 DNA, 避 免 蛋 白 和 离 子 残 留, 影 响 PCR 结 果 分 别 用 特 异 性 引 物 和 flic 引 物 检 测 进 行 PCR 扩 增, 检 测 其 是 否 为 无 致 病 力 菌 株 2. 试 验 方 法 2.1 试 验 材 料 2.1.1 供 试 菌 株 菌 株 来 源 于 FJAT-91 青 枯 雷 尔 氏 菌 mini-tn5 插 入 突 变 体 库, 菌 株 编 号 :FJAT-FJAT-t770 FJAT-t65 FJAT-t158 FJAT-t134 FJAT-t168 FJAT-t186 FJAT-t200 FJAT-t212 FJAT-t334 FJAT-t616 FJAT-t617 FJAT-t636 FJAT-t644 FJAT-t618 FJAT-t601 FJAT-t297 FJAT-t162 其 中 FJAT-t618 FJAT-t601 FJAT-t297 FJAT-t162 是 强 致 病 力 菌 株, 作 为 阳 性 对 照 2.1.2 试 剂 与 仪 器 (1) 试 剂 :TTC 培 养 基 : 每 升 含 葡 萄 糖 5 g, 蛋 白 胨 10 g, 水 解 酪 蛋 白 1 g, 琼 脂 17 g, 每 200 ml 培 养 基 中 加 入 1 ml 1%TTC 和 200 μl 50 mg/ml 卡 那 霉 素,pH7.0-7.2 SPA 培 养 基 : 每 升 含 蔗 糖 20 g, 蛋 白 胨 5 g,kh2po40.5 g,mgso40.025 g,ph7.0-7.2 无 菌 水 dntp 购 自 福 州 博 海 生 物 技 术 有 限 公 司 ;Buffer,Taq 酶 购 自 北 京 天 根 生 化 科 技 有 限 公 司 ; 特 异 性 基 因 引 物 flic 基 因 引 物 1500 bpmaker 购 自 上 海 英 竣 生 物 技 术 公 司 (2) 仪 器 : 超 净 工 作 台 恒 温 培 养 箱 水 浴 锅 离 心 机 分 光 光 度 计 Biometra 梯 度 PCR 仪 ; BIO-RAD 电 泳 仪 ;UVP 凝 胶 成 像 仪 2.2 试 验 方 法 2.2.1 菌 株 活 化 于 -80 冰 箱 中 取 出 菌 株, 在 TTC( 含 有 50 μg/ml 卡 那 霉 素 ) 平 板 上 划 线 置 于 30 恒 温 培 养 箱 中 培 养 72 h ( 注 意 : 从 冰 箱 中 取 出 的 菌 株 要 放 在 冰 盒 中, 防 止 细 菌 细 胞 破 裂 而 死 亡 ) 2.2.2 摇 瓶 培 养 挑 取 纯 化 后 的 单 菌 落 于 SPA 培 养 基 中 (20 ml, 卡 那 霉 素 浓 度 为 50 μg/ml) 于 30 摇 床 培 养 14-16 h, 转 速 170 r/min 2.2.3 DNA 提 取 ( 采 用 试 剂 盒 法 ) 和 DNA 浓 度 的 测 定 (1) 取 2 ml 菌 液 于 离 心 管 中,12000 rpm 离 心 10 min, 弃 去 上 清 液, 收 集 菌 体 (2) 向 菌 体 中 加 入 600 μl Nuclei Lysis Solution 溶 液, 用 移 液 枪 轻 轻 吹 打, 使 菌 体 重 新 悬 浮, 置 于 80 水 浴 锅 内, 温 育 5min( 期 间 拿 出 反 复 颠 倒, 使 其 受 热 均 匀 ), 放 室 外 冷 却 至 室 温 ( 一 定 要 充 分 冷 却 ) (3) 加 入 3 μl RNase Solution, 反 复 颠 倒 2-5 次, 使 其 混 合 均 匀 (4) 置 于 37 水 浴 锅 中 1 h,( 期 间 每 20min 拿 出 反 复 颠 倒 2-5 次 ) (5) 充 分 冷 却 至 室 温, 加 入 200 μl Protein Previption solution 高 速 振 荡,20 s, 使 蛋 白 质 完 全

450 沉 淀, 冰 浴 5 min( 期 间 可 拿 出 反 复 颠 倒 ), 离 心 (14000 r/min,3 min, 时 间 可 以 更 长, 使 蛋 白 质 完 全 沉 淀 (6) 转 移 上 清 液 于 600 μl 异 丙 醇 中, 水 平 翻 转, 直 至 出 现 白 色 絮 状, 离 心 (14000 r/min,2-3min) (7) 小 心 弃 去 上 清 液, 加 入 600 μl 乙 醇, 并 垂 直 翻 转, 再 次 置 于 14000 r/min 离 心 2-3min (8) 小 心 弃 去 上 清 液, 在 纸 上 扣 干 (9) 至 离 心 管 上 的 液 体 风 干 后, 加 入 100 μl 无 菌 水, 并 65 温 育 1 h( 期 间 20 min 取 出 颠 倒 2-5 次 ) (10) 室 内 过 夜,-20 保 存 2.2.4 PCR 扩 增 (1) 扩 增 体 系 ddw:18.7 μl ; Buffer:2.5 μl; dntp:0.5 μl; 上 游 引 物 :1 μl; 下 游 引 物 :1 μl; Taq:0.3 μl; DNA:1 μl (2) 扩 增 程 序 A 青 枯 雷 尔 氏 菌 的 特 异 性 引 物 的 PCR 扩 增 程 序 96 C, 预 变 性 1min; 96 C 变 性 30 s, 70 C 退 火 30 s, 72 C 延 伸 1min, 进 行 2 个 循 环 ; 之 后 94 C 变 性 30 s,70 C 退 火 30 s,72 C 延 伸 1min, 再 进 行 33 个 循 环 ; 最 后 72 C 5min B 青 枯 雷 尔 氏 菌 的 flic 基 因 引 物 的 PCR 扩 增 程 序 94 C, 预 变 性 5min; 然 后 94 C 变 性 30s, 63 C 退 火 30s, 72 C 延 伸 1min, 进 行 25 个 循 环 ; 最 后 72 C 10min

451 3. 试 验 结 果 3.1 不 同 青 枯 雷 尔 氏 菌 突 变 体 菌 株 的 菌 落 形 态 及 致 病 性 试 验 结 果 见 表 1 和 图 1-6 根 据 青 枯 雷 尔 氏 菌 的 菌 落 形 态 初 步 判 断 其 致 病 性 强 弱 强 致 病 性 的 青 枯 雷 尔 氏 菌 的 菌 落 形 态 表 现 为 : 菌 落 表 面 较 湿 润, 且 流 动 性 强, 菌 落 中 间 为 粉 红 色, 白 边 较 宽 弱 致 病 性 的 青 枯 雷 尔 氏 菌 菌 落 形 态 表 现 为 : 表 面 较 干 燥, 无 流 动 性, 中 间 为 暗 红 色, 并 且 白 边 较 窄 ( 刘 波,2005) 在 第 一 次 试 验 中 鉴 别 出 的 无 致 病 力 菌 株, 此 次 试 验 活 化 后, 出 现 部 分 强 致 病 力 菌 株, 如 FJAT-t770 FJAT-t617 FJAT-t644 FJAT-t87 FJAT-t186, 还 出 现 青 枯 雷 尔 氏 菌 的 类 似 菌 株, 如 FJAT-t334 表 1 青 枯 雷 尔 氏 菌 突 变 体 致 病 力 强 弱 判 断 菌 体 编 号 致 病 性 菌 体 编 号 致 病 性 菌 体 编 号 致 病 性 FJAT-t770 V FJAT-t168 A FJAT-t618 A FJAT-t65 A FJAT-t186 V FJAT-t616 A FJAT-t87 V FJAT-t200 A FJAT-t617 V FJAT-t158 A FJAT-t212 A FJAT-t636 A FJAT-t134 A FJAT-t334 A FJAT-t644 V 注 : V 表 示 强 致 病 力 菌 株, A 表 示 无 致 病 力 菌 株 A B 图 1 青 枯 雷 尔 氏 菌 突 变 体 FJAT-t87 菌 落 形 态 (A: 反 面 ;B: 正 面 ) A B 图 2 青 枯 雷 尔 氏 菌 突 变 体 FJAT-t186 菌 落 形 态 (A: 反 面 ;B: 正 面 )

452 A 图 3 青 枯 雷 尔 氏 菌 突 变 体 FJAT-t200 菌 落 形 态 (A: 反 面 ;B: 正 面 ) B A B 图 4 青 枯 雷 尔 氏 菌 突 变 体 FJAT-t212 菌 落 形 态 (A: 反 面 ;B: 正 面 ) A B 图 5 青 枯 雷 尔 氏 菌 突 变 体 FJAT-t334 菌 落 形 态 (A: 反 面 ;B: 正 面 )

453 A B 图 6 青 枯 雷 尔 氏 菌 突 变 体 FJAT-t626 菌 落 形 态 (A: 反 面 ;B: 正 面 ) 3.2 青 枯 雷 尔 氏 菌 基 因 组 DNA 浓 度 的 测 定 使 用 试 剂 盒 法 提 取 基 因 组 DNA, 采 用 分 光 光 度 计 测 定 所 提 取 的 DNA 浓 度 一 般 用 260/280 来 检 验 DNA 和 RNA 的 纯 度, 纯 DNA 的 比 值 约 为 1.8, 一 般 认 为 比 值 在 1.8-2.0 之 间, 其 DNA 纯 度 较 好 比 值 低 于 1.8, 表 示 有 蛋 白 质 和 酚 类 物 质 的 影 响 使 用 试 剂 盒 提 取 的 DNA 效 果 不 是 很 好,260/280 的 比 值 都 不 高 于 1.8, 蛋 白 质 污 染 比 较 严 重 具 体 结 果 见 表 2 表 2 DNA 浓 度 测 定 结 果 菌 株 编 号 OD(ng/ ng/μl) 260/280 260/230 FJAT-t134a 30.2 2.32 1.14 FJAT-t134b 106.5 1.66 1.46 FJAT-t87a 217.2 1.28 0.99 FJAT-t87b 428.3 1.3 0.98 FJAT-t626a 41.2 1.57 1.08 FJAT-t626b 932.3 1.39 0.9 FJAT-t186a 332.2 1.44 1.06 FJAT-t186b 494.5 1.38 1.05 FJAT-t212a 382.8 1.44 0.94 FJAT-t212b 83.6 1.37 1.27 FJAT-t158a 36.6 1.3 1.11 FJAT-t158b 363.5 1.2 0.84 FJAT-t334 375 1.35 1.12 FJAT-t200 43.3 1.65 1.16 注 : a b 是 第 一 个 和 第 二 个 重 复 3.3 青 枯 雷 尔 氏 菌 PCR 检 测 3.3.1 特 异 性 引 物 PCR 检 测 特 异 性 引 物 PCR 检 测 结 果 如 图 7 PCR 结 果 显 示 均 具 有 500 bp 清 晰 的 条 带, 只 有 FJAT-t87a 未 跑 出 条 带, 可 能 是 DNA 浓 度 过 低, 而 FJAT-t626 FJAT-t186 FJAT-t212 都 扩 增 出 2 条 带, 可 能 是 DNA 残 留

454 注 : M maker 图 7 特 异 性 引 物 PCR 扩 增 结 果 3.3.2 flic 引 物 PCR 检 测 结 果 检 测 结 果 见 图 8 特 异 性 引 物 的 结 果 显 示,FJAT-t87a 可 能 是 DNA 浓 度 过 低, 未 扩 增 出 相 应 的 片 段, 在 此 次 检 测 中 就 直 接 用 FJAT-t87b 进 行 检 测 而 FJAT-t626a FJAT-t626b FJAT-t186a FJAT-t186b 都 有 2 条 扩 增 片 段, 所 以 此 次 检 测 就 选 其 中 之 一 进 行 扩 增 扩 增 结 果 表 明, 都 扩 增 得 到 400 bp 的 片 段 其 中 FJAT-t87b FJAT-t134b FJAT-t158b 分 别 扩 增 出 400 bp 和 1000 bp 的 片 段,FJAT-t186a 扩 增 出 了 400 bp 和 3000 bp 以 上 的 片 段 ; 而 FJAT-t626a FJAT-t212a FJAT-t334 FJAT-t200 扩 增 出 来 3 条 带, 因 此 FJAT-t87 FJAT-t134 FJAT-t158 FJAT-t626 FJAT-t186 FJAT-t212 FJAT-t334 FJAT-t200 这 些 可 能 都 不 是 青 枯 雷 尔 氏 菌 注 : M maker, + 阳 性 对 照, - 阴 性 对 照 图 8 flic 引 物 PCR 扩 增 结 果 4. 试 验 讨 论 (1) 第 一 次 试 验 中 得 到 的 青 枯 雷 尔 氏 菌 无 致 病 力 突 变 体, 在 第 二 次 活 化 时 出 现 强 致 病 力 菌 株, 可 能 是 菌 种 保 存 的 时 候 被 污 染 了, 也 可 能 在 是 保 存 前 没 有 完 全 纯 化, 强 致 病 力 菌 株 和 无 致 病 力 菌 株 共 同 存 在 ; 或 者 菌 株 因 生 境 的 改 变 而 改 变 具 体 原 因 还 有 待 进 一 步 研 究

455 (2) 特 异 性 引 物 PCR 的 结 果 表 明,FJAT-t626 FJAT-t186 FJAT-t212 可 能 不 是 青 枯 雷 尔 氏 菌 再 次 使 用 flic 引 物 进 行 验 证 (3)fliC 引 物 的 PCR 结 果 表 明, 都 扩 增 出 了 400 bp 的 片 段, 但 FJAT-t87b FJAT-t134b FJAT-t158b 分 别 扩 增 出 400 bp 和 1000 bp 的 片 段,FJAT-t186a 扩 增 出 了 400 bp 和 3000 bp 以 上 的 片 段 ; 而 且 FJAT-t626a FJAT-t212a FJAT-t334 FJAT-t200 扩 增 出 来 3 条 带, 因 此 初 步 推 断 FJAT-t87 FJAT-t626 FJAT-t186 FJAT-t334 FJAT-t200 不 是 青 枯 雷 尔 氏 菌 FJAT-t134 FJAT-t158 FJAT-t212 是 否 为 青 枯 雷 尔 氏 菌, 还 有 待 进 一 步 验 证 5.. 参 考 文 献 [1] 刘 波, 林 志 营 等. 青 枯 雷 尔 氏 菌 多 态 性 研 究 [M]. 福 州 : 福 建 科 技 出 版 社,2005,6. 试 验 负 责 车 建 美 林 海 云 刘 波 试 验 人 员 马 桂 美