1. 前 言 抗 体 药 物 中 使 用 的 单 克 隆 抗 体, 在 生 产 贮 藏 或 运 输 过 程 中 可 能 会 形 成 二 聚 体 等 凝 聚 物, 存 在 引 发 不 良 反 应 的 风 险 因 素, 故 在 质 量 控 制 中 采 用 体 积 排 阻 色 谱 法 (SEC) 对 单

高 性 能 SEC 色 谱 柱 TSKgel UP-SW3000 页 码 1. 前 言 1 2.TSKgel UP-SW3000 色 谱 柱 的 基 本 特 性 1 2-1. 填 料 的 特 点 1 2-2. 标 准 曲 线 和 分 离 性 能 1 2-3. 洗 脱 液 盐 浓 度 对 蛋 白 质 出 峰 结 果 的 影 响 3 2-4. 测 定 流 速 的 影 响 5 2-5. 样 品 载 量 及 样 品 进 样 量 的 影 响 7 2-6. 色 谱 柱 外 ( 管 路 中 ) 扩 散 作 用 的 影 响 8 2-7. 色 谱 柱 的 耐 用 性 10 2-8. 填 料 的 批 间 差 异 11 2-9. 与 TSKgel G3000SW XL 的 对 比 12 2-10. 与 市 售 UHPLC 用 SEC 色 谱 柱 的 对 比 13 3. 分 离 实 例 15 3-1. 抗 体 类 药 物 的 精 密 分 析 15 3-2. 抗 体 木 瓜 蛋 白 酶 消 化 物 的 分 离 实 例 16 4. 总 结 16

1. 前 言 抗 体 药 物 中 使 用 的 单 克 隆 抗 体, 在 生 产 贮 藏 或 运 输 过 程 中 可 能 会 形 成 二 聚 体 等 凝 聚 物, 存 在 引 发 不 良 反 应 的 风 险 因 素, 故 在 质 量 控 制 中 采 用 体 积 排 阻 色 谱 法 (SEC) 对 单 克 隆 抗 体 进 行 分 离 分 析 现 有 的 TSKgel G3000SW XL 色 谱 柱 常 用 于 此 用 途, 但 仍 需 要 更 高 分 离 度 以 及 更 短 分 析 时 间 的 SEC 分 析 技 术 现 在 2μm 粒 径 的 高 性 能 SEC 色 谱 柱 TSKgel UP-SW3000 已 实 现 了 商 品 化 在 本 报 告 中, 介 绍 了 TSKgel UP-SW3000 色 谱 柱 的 基 本 特 性 及 其 分 离 实 例 2.TSKgel UP-SW3000 色 谱 柱 的 基 本 特 性 2-1. 填 料 的 特 性 表 1 所 示 为 TSKgel UP-SW3000 色 谱 柱 的 填 料 特 性 色 谱 柱 规 格, 以 及 与 常 用 于 抗 体 分 离 的 现 有 SW 型 色 谱 柱 的 性 能 对 比 TSKgel UP-SW3000 色 谱 柱 是 以 25nm 孔 径 硅 胶 表 面 导 入 二 醇 基 后 形 成 的 2μm 微 粒 为 填 料 的 色 谱 柱 与 现 有 SW 型 色 谱 柱 相 比, 具 有 更 高 的 分 离 性 能, 适 用 于 抗 体 二 聚 体 及 单 体 的 分 离 表 1: 填 料 特 性 色 谱 柱 规 格 色 谱 柱 尺 寸 4.6 mm I.D. 30 cm 本 色 谱 柱 TSKgel UP-SW3000 4.6 mm I.D. 15 cm TSKgel UltraSW Aggregate 7.8 mm I.D. 30 cm 现 有 色 谱 柱 TSKgel SuperSW mab HR 7.8 mm I.D. 30 cm TSKgel G3000SW XL 7.8 mm I.D. 30 cm 基 可 质 硅 胶 硅 胶 硅 胶 硅 胶 官 能 团 二 醇 基 二 醇 基 二 醇 基 二 醇 基 粒 径 2 μm 3 μm 4 μm 5 μm 孔 径 25 nm 30 nm 25 nm 25 nm 分 子 量 排 阻 界 限 800 kda 2,500 kda( 推 算 值 ) 800 kda 800 kda 分 子 量 测 定 范 围 10 ~500 kda 10 ~2,000 kda 10 ~500 kda 10 ~500 kda 用 途 抗 体 ( 二 聚 体 / 单 体 / 片 段 ) 的 高 效 分 离 分 析 抗 体 ( 二 聚 体 / 单 体 ) 的 快 速 分 析 抗 体 ( 多 聚 体 ) 的 高 效 分 离 分 析 抗 体 ( 二 聚 体 / 单 体 ) 的 高 效 分 离 分 析 一 般 蛋 白 质 抗 体 ( 二 聚 体 / 单 体 ) 的 高 效 分 离 分 析 2-2. 标 准 曲 线 和 分 离 性 能 使 用 TSKgel UP-SW3000 TSKgel SuperSW3000(4 μm) 及 TSKgel G3000SW XL(5 μm) 测 定 标 准 蛋 白 质 的 色 谱 图 对 比 如 图 1 所 示, 采 用 标 准 蛋 白 质 制 成 的 校 正 曲 线 对 比 如 图 2 所 示 具 有 相 同 孔 径 特 性 的 TSKgel UP-SW3000 TSKgel SuperSW3000 及 TSKgel G3000SW XL 中, 甲 状 腺 球 蛋 白 的 二 聚 体 及 多 聚 体 不 会 渗 入 小 孔 内 而 排 出, 进 入 间 隙 所 示 为 样 品 的 理 论 塔 板 数 粒 径 较 小 的 TSKgel UP-SW3000 比 其 他 色 谱 柱 的 理 论 塔 板 数 更 高 图 3 所 示 为 使 用 TSKgel UP-SW3000 TSKgel SuperSW3000 及 TSKgel G3000SW XL 分 离 单 克 隆 抗 体 的 色 谱 图 对 比, 表 3 所 示 为 各 溶 出 峰 分 离 度 (R) 的 对 比 粒 径 较 小 的 TSKgel UP-SW3000 比 其 他 色 谱 柱 的 分 离 度 更 高 体 积 (V 0)( 图 1), 校 正 曲 线 的 斜 率 相 同 ( 图 2) 表 2-1 -

图 1 标 准 蛋 白 质 的 色 谱 图 对 比 色 谱 柱 : A)TSKgel UP-SW3000 (2 μm,4.6 mm I.D. 30 cm) B)TSKgel SuperSW3000 (4 μm,4.6 mm I.D. 30 cm) C)TSKgel G3000SW XL, (5 μm,7.8 mm I.D. 30 cm) 流 速 : A,B)0.35 ml/min,c)1.0 ml/min 检 测 波 长 : UV 280 nm A,B) 微 型 比 色 皿,C) 标 准 比 色 皿 温 度 : 25 进 样 量 : 10 μl 样 品 : 1. 甲 状 腺 球 蛋 白,640,000 Da (1' 甲 状 腺 球 蛋 白 的 二 聚 体 ) 2.γ - 球 蛋 白,155,000 Da (2'γ - 球 蛋 白 的 二 聚 体 ) 3. 卵 白 蛋 白,47,000 Da 4.,13,700 Da 5.,137 Da 表 2 色 谱 柱 性 能 对 比 ( 理 论 塔 板 数 ) 色 谱 柱 粒 径 理 论 塔 板 数 ( ) A)TSKgel UP-SW3000 2 μm 45,625 B)TSKgel SuperSW3000 4 μm 24,419 C)TSKgel G3000SW XL 5 μm 18,325 洗 脱 体 积 [ml] 色 谱 柱 : TSKgel UP-SW3000 (2 μm,4.6 mm I.D. 30 cm) TSKgel SuperSW3000 (4 μm,4.6 mm I.D. 30 cm) TSKgel G3000SW XL, (5 μm,7.8 mm I.D. 30 cm) 流 速 : A,B)0.35 ml/min,c)1.0 ml/min 检 测 波 长 : UV 280 nm A,B) 微 型 比 色 皿,C) 标 准 比 色 皿 进 样 量 : 10 μl 样 品 : 1. 甲 状 腺 球 蛋 白,640,000 Da (1' 甲 状 腺 球 蛋 白 的 二 聚 体 ) 2.γ- 球 蛋 白,155,000 Da (2'γ- 球 蛋 白 的 二 聚 体 ) 3. 卵 清 蛋 白,47,000 Da 4.,13,700 Da 5.,137 Da 图 2 采 用 标 准 蛋 白 质 制 成 的 校 正 曲 线 对 比 - 2 -

图 3 单 克 隆 抗 体 的 色 谱 图 对 比 色 谱 柱 : A)TSKgel UP-SW3000 (2 μm,4.6 mm I.D. 30 cm) B)TSKgel SuperSW3000 (4 μm,4.6 mm I.D. 30 cm) C)TSKgel G3000SW XL (5 μm,7.8 mm I.D. 30 cm) 流 速 : A,B)0.35 ml/min,c)1.0 ml/min 检 测 波 长 : UV 280 nm A,B) 微 型 比 色 皿,C) 标 准 比 色 皿 进 样 量 : 10 μl 样 品 : IgG 人 鼠 嵌 合 单 克 隆 抗 体 1. 三 聚 体,2. 二 聚 体,3. 单 体 4. 片 段 表 3 单 克 隆 抗 体 峰 的 分 离 度 (R) 对 比 色 谱 柱 粒 径 R( 峰 1/2) R( 峰 2/3) R( 峰 3/4) A)TSKgel UP-SW3000 2 μm 5.02 3.50 2.70 B)TSKgel SuperSW3000 4 μm 2.16 1.53 1.19 C)TSKgel G3000SW XL 5 μm 2.56 1.73-2-3. 洗 脱 液 盐 浓 度 对 蛋 白 质 出 峰 结 果 的 影 响 采 用 合 理 的 SEC 进 行 测 定 时, 必 须 抑 制 填 料 与 测 定 物 质 之 间 的 相 互 作 用 ( 静 电 相 互 作 用 疏 水 相 互 作 用 等 ) 以 硅 胶 为 基 质 的 TSKgel UP-SW3000 色 谱 柱, 填 料 表 面 残 留 的 硅 烷 醇 基 和 蛋 白 质 之 间 发 生 静 电 相 互 作 用 ( 离 子 排 斥 离 子 吸 附 ), 因 此 采 用 合 适 盐 浓 度 的 洗 脱 液 抑 制 该 作 用 非 常 重 要 图 4 所 示 为 通 过 改 变 磷 酸 缓 冲 液 (ph6.7) 的 浓 度 后, 标 准 蛋 白 质 的 洗 脱 效 果 等 电 点 (pi) 低 于 洗 脱 液 ph 的 甲 状 腺 蛋 白 (pi 4.5) γ - 球 蛋 白 (pi 5.1) 及 卵 黄 蛋 白 (pi 4.6), 由 于 在 洗 脱 液 中 会 带 有 负 电 荷, 因 此 在 较 低 的 盐 浓 度 中, 会 由 于 与 残 留 的 硅 烷 醇 基 之 间 的 离 子 排 斥 而 快 速 洗 脱 一 般 情 况 下, 盐 浓 度 越 高 粒 子 排 斥 效 果 越 受 到 抑 制, 随 着 磷 酸 缓 冲 液 浓 度 的 升 高, 洗 脱 时 间 减 缓, 当 洗 脱 液 中 盐 浓 度 高 于 100 mmol/l 时, 洗 脱 时 间 即 可 保 持 稳 定 DNP-L- 丙 氨 酸 等 具 有 疏 水 部 的 化 合 物, 随 着 磷 酸 缓 冲 液 浓 度 的 升 高, 疏 水 吸 附 作 用 导 致 洗 脱 时 间 减 缓 另 外, 等 电 点 (pl) 高 于 洗 脱 液 ph 的 细 胞 色 素 C(pl 10.1) 和 溶 菌 酶 (pl 11.2) 在 洗 脱 液 中 带 有 正 电 荷, 由 于 与 残 留 硅 烷 醇 基 产 生 静 电 相 互 作 用, 会 吸 附 于 填 料 图 5 所 示 为 磷 酸 缓 冲 液 浓 度 与 碱 性 蛋 白 质 峰 面 积 的 相 关 性 碱 性 蛋 白 质 细 胞 色 素 C 和 溶 菌 酶, 在 盐 浓 度 较 低 的 情 况 下 会 吸 附 于 填 料, 因 此 峰 面 积 下 降 随 着 磷 酸 缓 冲 液 浓 度 的 升 高, 峰 面 积 增 大, 当 磷 酸 缓 冲 液 浓 度 高 于 150mmol/L 时, 峰 面 积 几 乎 可 以 保 持 稳 定 磷 酸 缓 冲 液 的 浓 度 越 高, 越 抑 制 静 电 吸 附 作 用, 因 此 可 以 改 善 吸 收 峰 拖 尾 现 象, 显 示 良 好 的 吸 收 峰 形 故 在 检 测 碱 性 蛋 白 质 时, 必 须 使 用 恒 定 离 子 强 度 的 洗 脱 液 图 6 所 示 为, 通 过 采 用 磷 酸 缓 冲 液 和 在 磷 酸 缓 冲 液 中 添 加 硫 酸 钠 的 洗 脱 液, 按 照 上 述 内 容 调 节 洗 脱 液 的 盐 浓 度 使 溶 液 的 离 子 强 度 维 持 恒 定, 从 而 抑 制 静 电 吸 收 相 互 作 用, 可 以 得 到 恒 定 的 峰 面 积 200mmol/L 磷 酸 缓 冲 液 即 可 得 到 恒 定 的 峰 面 积, 在 磷 酸 缓 冲 液 中 添 加 硫 酸 钠 的 洗 脱 液, 由 于 磷 酸 缓 冲 液 浓 度 不 一 致, 一 般 添 加 100 mmol/l~150 mmol/l 的 硫 酸 钠 后 可 得 到 恒 定 的 峰 面 积 磷 酸 缓 冲 液 浓 度 越 高, 越 能 在 低 浓 度 硫 酸 钠 的 洗 脱 条 件 下, 获 得 恒 定 的 峰 面 积 - 3 -

峰 面 积 (mv 秒 ) 峰 面 积 (mv 秒 ) 峰 面 积 (mv 秒 ) 洗 脱 时 间 [min] 甲 状 腺 球 蛋 白 γ - 球 蛋 白 牛 血 清 白 蛋 白 β- 乳 球 蛋 白 细 胞 色 素 C 溶 菌 酶 DNA-L- 丙 氨 酸 色 谱 柱 : TSKgel UP-SW3000 (4.6 mm I.D. 30 cm) 洗 脱 液 : X mmol/l 磷 酸 缓 冲 液 (ph 6.7) 进 样 量 : 10 μl(rheodyne 公 司 8125 型 ) 样 品 : 按 表 中 记 录 磷 酸 缓 冲 液 浓 度 (mmol/l) 图 4 磷 酸 缓 冲 液 浓 度 对 洗 脱 时 间 的 影 响 细 胞 色 素 C 溶 菌 酶 色 谱 柱 : TSKgel UP-SW3000 (4.6 mm I.D. 30 cm) 洗 脱 液 : X mmol/l 磷 酸 缓 冲 液 (ph 6.7) 检 测 波 长 : UV 280 nm( 微 型 比 色 皿 ) 进 样 量 : 10 μl(rheodyne 公 司 8125 型 ) 样 品 : 按 表 中 记 录 磷 酸 缓 冲 液 浓 度 (mmol/l) 图 5 磷 酸 缓 冲 液 浓 度 对 峰 面 积 的 影 响 xmmol/l 磷 酸 缓 冲 液 (ph 6.7) xmmol/l 磷 酸 缓 冲 液 (ph 6.7) 20mmol/L 磷 酸 缓 冲 液 (ph 6.7)+ x mmol/l Na 2SO 4 100mmol/L 磷 酸 缓 冲 液 (ph 6.7)+ x mmol/l Na 2SO 4 20mmol/L 磷 酸 缓 冲 液 (ph 6.7)+ x mmol/l Na 2SO 4 100mmol/L 磷 酸 缓 冲 液 (ph 6.7)+ x mmol/l Na 2SO 4 盐 浓 度 (mmol/l) 盐 浓 度 (mmol/l) 图 6 洗 脱 液 盐 浓 度 对 峰 面 积 的 影 响 色 谱 柱 : TSKgel UP-SW3000 (4.6 mm I.D. 30 cm) 洗 脱 液 : X mmol/l 磷 酸 缓 冲 液 (ph 6.7) + X mmol/l Na 2SO 4 进 样 量 : 10 μl(rheodyne 公 司 8125 型 ) 样 品 : A) 细 胞 色 素 C B) 溶 菌 酶 - 4 -

理 论 塔 板 数 2-4. 测 定 流 速 的 影 响 通 过 采 用 不 同 分 子 量 的 两 种 蛋 白 质 ( 牛 血 清 白 蛋 白 ; :Mw 66,500 :Mw 13,700) 及 低 分 子 化 合 物 (Mw 137), 确 认 了 测 定 时 流 速 对 理 论 塔 板 数 的 影 响 ( 图 7) 测 定 时 流 速 越 高, 理 论 塔 板 数 也 越 高 扩 散 系 数 较 高, 测 定 时 流 速 减 缓 后 因 扩 散 导 致 理 论 塔 板 数 减 小 但 是, 分 子 量 较 大 的 蛋 白 质 则 随 着 流 速 减 缓 而 呈 现 理 论 塔 板 数 增 大 的 趋 势, 分 子 量 越 大, 越 可 以 通 过 较 低 流 速 取 得 较 高 的 理 论 塔 板 数 因 此, 在 分 离 蛋 白 质 时, 通 过 减 缓 测 定 时 流 速, 可 以 提 高 色 谱 柱 的 柱 效, 得 到 更 好 的 分 离 效 果 图 8 所 示 为 流 速 减 缓 后 γ- 球 蛋 白 二 聚 体 和 单 体 的 分 离 效 果 也 得 以 提 升 图 9 所 示 为 TSKgel UP-SW3000( 粒 径 2 μm) 和 TSKgel SuperSW mab( 粒 径 4 μm) 的 流 速 与 HETP(Height equivalent to a theoretical plate: 理 论 塔 板 高 度 ) 的 相 关 性 对 氨 基 苯 甲 酸 的 任 何 粒 径 均 随 测 定 时 流 速 加 快, 而 呈 现 HETP 减 小, 色 谱 柱 的 柱 效 也 随 之 提 高 相 反, 蛋 白 质 随 着 测 定 流 速 加 快 而 呈 现 HETP 增 大 的 趋 势, 分 子 量 越 大 ( 分 子 尺 寸 较 大 ) 的 蛋 白 质, 色 谱 柱 的 柱 效 降 低 越 明 显 在 填 充 了 小 粒 径 填 料 的 TSKgel UP-SW3000 色 谱 柱 中, 测 定 时 流 速 对 HEPT 的 影 响 较 小, 提 升 测 定 时 流 速 后 可 以 抑 制 柱 效 降 低, 与 填 充 大 粒 径 的 填 料 相 比, 可 以 说 填 充 了 小 粒 径 填 料 TSKgel UP-SW3000 色 谱 柱 对 高 速 分 析 非 常 有 利 图 10 所 示 为 提 高 流 速 后 测 定 标 准 蛋 白 质 的 色 谱 图 通 过 将 测 定 时 流 速 调 整 为 0.50 ml/min, 可 在 5min 的 分 析 时 间 内 获 得 良 好 的 分 离 效 果 而 且, 图 11 还 揭 示 了 流 速 与 压 力 之 间 的 相 关 性 TSKgel UP-SW3000(30 cm 色 谱 柱 ) 可 在 标 准 流 速 (0.35 ml/min) 35 MPa 以 下 的 较 低 操 作 压 强 下 使 用 (66,500 Da) (13,700 Da) (137 Da) 色 谱 柱 : TSKgel UP-SW3000 (4.6 mm I.D. 30 cm) 流 速 : 0.02~0.38 ml/min 进 样 量 : 10 μl(rheodyne 公 司 8125 型 ) 样 品 :,66,500 Da,13,700 Da,137 Da 流 速 [ml/min] 图 7 流 速 对 理 论 塔 板 数 的 影 响 - 5 -

R( 二 聚 体 / 单 体 ) 色 谱 柱 : TSKgel UP-SW3000 (2 μm,4.6 mm I.D. 30 cm) + 0.05% 叠 氮 化 钠 流 速 : 0.02~0.38 ml/min 进 样 量 : 10 μl(rheodyne 公 司 8125 型 ) 样 品 :, 人 γ- 球 蛋 白 ( 多 克 隆 ) γ - 球 蛋 白 流 速 [ml/min] 图 8 流 速 与 分 离 度 R( 二 聚 体 / 单 体 ) 的 相 关 性 流 速 [ml/min] 流 速 [ml/min] 图 9 不 同 粒 径 的 SEC 色 谱 柱 流 速 与 HETP 的 相 关 性 色 谱 柱 : TSKgel UP-SW3000(4.6 mm I.D. 15 cm) 流 速 : A)0.35 ml/min,b)0.50 ml/min 进 样 量 : 5 μl(rheodyne 公 司 8125 型 ) 样 品 : 1. 甲 状 腺 球 蛋 白,640,000 Da (1' 甲 状 腺 球 蛋 白 的 二 聚 体 ) 2.γ- 球 蛋 白,155,000 Da (2'γ- 球 蛋 白 的 二 聚 体 ) 3. 卵 白 蛋 白,47,000 Da 4.,13,700 Da 5.,137 Da 图 10 高 流 速 条 件 下 标 准 蛋 白 质 的 分 离 - 6 -

理 论 塔 板 数 理 论 塔 板 数 压 力 损 失 [MPa] 色 谱 柱 :TSKgel UP-SW3000 (4.6 mm I.D. 30 cm,4.6 mm I.D. 15 cm) 洗 脱 液 :100 mmol/l 磷 酸 缓 冲 液 (ph 6.7) 流 速 :0.025 0.59 ml/min 温 度 :25 流 速 [ml/min] 图 11 流 速 与 压 力 的 相 关 性 2-5. 样 品 载 量 及 样 品 进 样 量 的 影 响 采 用 牛 血 清 白 蛋 白 (), 和 对 氨 基 苯 甲 酸, 确 认 了 4.6 mm I.D. 15 cm 色 谱 柱 及 4.6 mm I.D. 30 cm 色 谱 柱 的 样 品 载 量 测 定 15 cm 色 谱 柱 的 样 品 进 样 量 为 5 μl,30 cm 色 谱 柱 的 样 品 进 样 量 为 10 μl, 图 12 所 示 为 各 色 谱 柱 的 样 品 载 量 与 理 论 塔 板 数 的 相 关 性 如 为 15 cm 色 谱 柱, 载 量 为 50 μg 以 上, 载 量 为 37.5 μg 以 上 时, 观 察 到 理 论 塔 板 数 下 降 如 为 30 cm 色 谱 柱, 载 量 为 100 μg 以 上, 载 量 为 70 μg 以 上 时, 观 察 到 理 论 塔 板 数 严 重 下 降 据 此 认 为, 标 准 蛋 白 质 的 载 量 为 色 谱 柱 每 15cm 负 载 35~50 μg,(30 cm 色 谱 柱 则 负 载 70~100 μg) 分 别 制 备 及 样 品, 使 其 上 样 量 分 别 达 到 2 μg 1.5 μg 及 0.01 μg, 并 确 认 进 样 量 对 理 论 塔 板 数 的 影 响 图 13 所 示 为 各 色 谱 柱 的 进 样 量 与 理 论 塔 板 数 的 相 关 性 15cm 色 谱 柱 30cm 色 谱 柱 在 2μL 进 样 量 内 未 见 理 论 塔 板 数 下 降, 但 在 2μL 以 上 进 样 量 时, 随 着 进 样 量 增 加 理 论 塔 板 数 不 断 下 降 而 且,15cm 色 谱 柱 在 5μL 进 样 量,30cm 色 谱 柱 在 10 μl 进 样 量 下, 理 论 塔 板 数 下 降 10~15 % 左 右 建 议 TSKgel UP-SW3000 的 15cm 色 谱 柱 采 用 5μL 以 下 的 进 样 量,30cm 色 谱 柱 采 用 10μL 以 下 的 进 样 量 载 量 (μg) 载 量 (μg) 图 12 样 品 载 量 与 理 论 塔 板 数 的 相 关 性 色 谱 柱 : A)TSKgel UP-SW3000( 4.6 mm I.D. 15 cm) B)TSKgel UP-SW3000( 4.6 mm I.D. 30 cm) 检 测 :UV 280 nm( 微 型 比 色 皿 ) 温 度 :25 进 样 量 : A)5 μl,b)10 μl(rheodyne 公 司 8125 型 ) - 7 -

理 论 塔 板 数 理 论 塔 板 数 进 样 量 (μl) 进 样 量 (μl) 图 13 样 品 上 样 量 的 影 响 色 谱 柱 : A)TSKgel UP-SW3000(4.6 mm I.D. 15 cm) B)TSKgel UP-SW3000(4.6 mm I.D. 30 cm) 检 测 波 长 :UV 280 nm( 微 型 比 色 皿 ) 2-6. 色 谱 柱 外 ( 管 路 ) 扩 散 的 影 响 TSKgel UP-SW3000 色 谱 柱 由 于 填 料 粒 径 变 小, 管 路 等 色 谱 柱 外 扩 散 作 用 可 能 导 致 色 谱 柱 原 来 的 性 能 无 法 充 分 发 挥 我 们 确 认 了 进 样 阀 色 谱 柱 之 间 以 及 色 谱 柱 UV 比 色 皿 之 间 的 管 路 中 样 品 扩 散 对 理 论 塔 板 数 的 影 响 将 进 样 阀 色 谱 柱 之 间 或 色 谱 柱 UV 比 色 皿 之 间 的 管 路, 分 别 改 为 内 径 0.13mm 及 内 径 0.25mm 的 PEEK 管 路 长 度, 测 定 了 蛋 白 质 低 分 子 化 合 物 的 理 论 塔 板 数 图 14 所 示 为 进 样 阀 色 谱 柱 之 间 的 管 路 长 度 对 理 论 塔 板 数 的 影 响 图 15 所 示 为 色 谱 柱 UV 比 色 皿 之 间 的 管 路 长 度 对 理 论 塔 板 数 的 影 响 进 样 阀 色 谱 柱 之 间 采 用 内 径 0.13mm 的 管 路 时 ( 图 14 15 的,, ), 随 着 管 路 的 长 度 增 加, 理 论 塔 板 数 逐 渐 下 降, 使 用 25cm 长 度 ( 约 3.32 μl) 的 管 路 时, 理 论 塔 板 数 下 降 约 10% 更 改 色 谱 柱 UV 比 色 皿 之 间 的 管 路 长 度 时, 随 着 管 路 的 长 度 增 加, 理 论 塔 板 数 逐 渐 下 降, 使 用 40 cm 长 度 ( 约 5.31 μl) 的 管 路 时, 理 论 塔 板 数 下 降 约 10% 另 一 方 面, 使 用 内 径 0.25 mm 的 管 路 时 ( 图 14 15 的,, ), 随 着 管 路 的 长 度 增 加, 与 内 径 0.13 mm 管 路 均 显 示 出 理 论 塔 板 数 下 降 的 趋 势 与 使 用 内 径 0.13 mm 管 路 相 比, 进 样 阀 色 谱 柱 之 间 的 管 路 直 径 不 同 导 致 理 论 塔 板 数 下 降 约 5 10%, 色 谱 柱 UV 比 色 皿 之 间 的 管 路 直 径 不 同 导 致 理 论 塔 板 数 下 降 约 15 ~ 20% 为 获 得 TSKgel UP-SW3000 色 谱 柱 的 良 好 性 能, 建 议 仪 器 的 管 路 直 径 低 于 0.13 mm, 进 样 阀 色 谱 柱 之 间 的 管 路 长 度 小 于 20 cm, 色 谱 柱 -UV 比 色 皿 之 间 的 管 路 长 度 小 于 30 cm - 8 -

理 论 塔 板 数 理 论 塔 板 数 理 论 塔 板 数 理 论 塔 板 数 15 cm 色 谱 柱 30 cm 色 谱 柱 管 路 长 度 (cm) 管 路 长 度 (cm) 图 14 色 谱 柱 外 死 体 积 的 影 响 ( 色 谱 柱 入 口 侧 管 路 ) 色 谱 柱 : A)TSKgel UP-SW3000(4.6 mm I.D. 15 cm) B)TSKgel UP-SW3000(4.6 mm I.D. 30 cm) 进 样 量 : A)5 μl B)10 μl 色 谱 柱 出 口 侧 管 路 :0.13 mm I.D. 30 cm 15 cm 色 谱 柱 30 cm 色 谱 柱 管 路 长 度 (cm) 管 路 长 度 (cm) 图 15 色 谱 柱 外 死 体 积 的 影 响 ( 色 谱 柱 出 口 侧 管 路 ) 色 谱 柱 : A)TSKgel UP-SW3000(4.6 mm I.D. 15 cm) B)TSKgel UP-SW3000(4.6 mm I.D. 30 cm) 进 样 量 : A)5 μl B)10 μl 色 谱 柱 入 口 侧 管 路 :0.13 mm I.D. 15 cm - 9 -

洗 脱 时 间 维 持 率 (%) 理 论 塔 板 数 维 持 率 (%) 2-7. 色 谱 柱 的 耐 用 性 我 们 实 施 了 一 项 在 TSKgel UP-SW3000(4.6 mm I.D. 15 cm, 4.6 mmi.d. 30 cm) 上 连 续 进 样 时 的 色 谱 柱 耐 用 性 试 验 经 过 标 准 蛋 白 质 混 合 样 品 连 续 100 次 进 样 后, 中 止 进 样, 每 次 中 止 6 小 时 以 上, 反 复 实 验 5 次, 使 用 对 氨 基 苯 甲 酸 确 认 了 色 谱 柱 性 能 ( 洗 脱 时 间 理 论 塔 板 数 ) 采 用 各 色 谱 柱 的 最 大 使 用 流 速 (15 cm 色 谱 柱 为 0.50 ml/min,30 cm 色 谱 柱 为 0.35 ml/min) 实 施 本 试 验 结 果 如 图 16 17 所 示 通 过 各 色 谱 柱 尺 寸 确 认 了 3 批 次 的 填 料, 结 果 显 示, 在 任 一 情 况 下, 经 过 500 次 进 样 后 均 未 见 色 谱 柱 性 能 有 显 著 变 化 TSKgel UP-SW3000 比 原 有 色 谱 柱 填 料 的 粒 径 小, 因 此 洗 脱 液 中 含 有 的 不 溶 性 物 质 以 及 样 品 中 的 夹 杂 物 易 在 色 谱 柱 入 口 蓄 积, 可 能 导 致 色 谱 柱 性 能 下 降 通 过 在 分 析 柱 的 入 口 侧 安 装 保 护 柱, 适 时 进 行 更 换, 可 以 防 止 分 析 柱 老 化, 长 时 间 稳 定 地 进 行 测 定 进 样 次 数 进 样 次 数 图 16 色 谱 柱 的 连 续 进 样 试 验 (15cm 色 谱 柱 ) 色 谱 柱 : TSKgel UP-SW3000(4.6 mm I.D. 15 cm) 洗 脱 液 : 200 mmol/l 磷 酸 缓 冲 液 (ph 6.7) 流 速 : 0.50 ml/min 温 度 : 25 进 样 量 : 5 μl 进 样 间 隔 时 间 : 10 min( 样 品 1 2 3 4)(100 次 进 样 后, 中 止 进 样 6 小 时 以 上 ) 进 样 次 数 : 500 次 (100 次 连 续 进 样, 共 进 样 5 次 ) 样 品 : 1 甲 状 腺 球 蛋 白 (1.5 g/l),γ - 球 蛋 白 (1.5 g/l), 卵 清 蛋 白 (1.5 g/l), (1.5 g/l), (10 mg/l) 2 甲 状 腺 球 蛋 白 (1.5 g/l),β - 乳 球 蛋 白 (1.5 g/l),dnp-l- 丙 氨 酸 (20 mg/l) 3γ- 球 蛋 白 (1.5 g/l), 细 胞 色 素 C(1.5 g/l),dnp-l- 丙 氨 酸 (20 mg/l) 4 牛 血 清 白 蛋 白 (1.5 g/l), 溶 菌 酶 (1.5 g/l),dnp-l- 丙 氨 酸 (20 mg/l) - 10 -

洗 脱 时 间 维 持 率 (%) 理 论 塔 板 数 维 持 率 (%) 进 样 次 数 进 样 次 数 图 17 色 谱 柱 的 连 续 进 样 试 验 (30cm 色 谱 柱 ) 色 谱 柱 : TSKgel UP-SW3000(4.6 mm I.D. 30 cm) 洗 脱 液 : 200 mmol/l 磷 酸 缓 冲 液 (ph 6.7)+ 0.05% 叠 氮 化 钠 检 测 波 长 :UV 280 nm( 微 型 比 色 皿 ) 进 样 量 :10 μl 进 样 间 隔 时 间 : 15 min ( 样 品 1 2 3 4)(100 次 进 样 后, 中 止 进 样 6 小 时 以 上 ) 进 样 次 数 : 500 次 (100 次 连 续 进 样, 共 进 样 5 次 ) 样 品 : 1 甲 状 腺 球 蛋 白 (1.5 g/l),γ- 球 蛋 白 (1.5 g/l), 蛋 清 蛋 白 (1.5 g/l), (1.5 g/l), (10 mg/l) 2 甲 状 腺 球 蛋 白 (1.5 g/l),β - 乳 球 蛋 白 (1.5 g/l),dnp-l- 丙 氨 酸 (20 mg/l) 3γ- 球 蛋 白 (1.5 g/l), 细 胞 色 素 C(1.5 g/l),dnp-l- 丙 氨 酸 (20 mg/l) 4 牛 血 清 白 蛋 白 (1.5 g/l), 溶 菌 酶 (1.5 g/l),dnp-l- 丙 氨 酸 (20 mg/l) 2-8. 填 料 的 批 间 差 异 图 示 18 所 示 为 采 用 不 同 批 次 的 填 料 测 定 标 准 蛋 白 质 混 合 样 品 的 色 谱 图 可 见 不 同 批 次 的 样 品 之 间 未 见 峰 形 状 洗 脱 位 置 有 大 的 差 异, 批 间 差 异 较 小, 生 产 的 填 料 稳 定 性 很 高 色 谱 柱 : TSKgel UP-SW3000 (4.6 mm I.D. 30 cm) 进 样 量 : 10 μl 样 品 : 1. 甲 状 腺 球 蛋 白,640,000 Da (1' 甲 状 腺 球 蛋 白 的 二 聚 体 ) 2.γ- 球 蛋 白,155,000 Da (2'γ- 球 蛋 白 的 二 聚 体 ) 3. 蛋 清 蛋 白,47,000 Da 4.,13,700 Da 5.,137 Da 图 18 标 准 蛋 白 质 的 色 谱 图 ( 填 料 的 批 间 差 异 ) - 11 -

2-9. 与 TSKgel G3000SW XL 的 对 比 在 抗 体 药 物 的 SEC 法 测 定 中, 要 求 色 谱 柱 不 仅 对 抗 体 二 聚 体 和 单 体 的 分 离, 对 单 体 和 片 段 的 分 离 也 有 更 高 的 分 离 度 采 用 2 根 串 联 的 TSKgel G3000SW XL 的 色 谱 柱 以 及 TSKgel UP-SW3000(30 cm 色 谱 柱 1 根 ), 对 比 了 二 者 对 丙 种 球 蛋 白 制 剂 及 单 克 隆 抗 体 的 分 离 性 能 图 19 所 示 为 丙 种 球 蛋 白 制 剂 的 色 谱 图 与 TSKgel G3000SW XL 相 比, TSKgel UP-SW3000 可 在 其 1/2 的 测 定 时 间 即 可 获 得 同 等 以 上 的 分 离 度 (R) 图 20 所 示 为 单 克 隆 抗 体 的 色 谱 图, 不 仅 可 使 二 聚 体 和 单 体 得 到 良 好 的 分 离, 还 显 示 单 体 及 片 段 也 得 到 良 好 的 分 离 表 4 所 示 为 各 峰 的 分 离 度 TSKgel UP-SW3000 只 要 现 有 (TSKgel G3000SW XL) 色 谱 柱 1/2 的 测 定 时 间 即 可 获 得 蛋 白 质 的 高 分 离 分 析 效 果 ( 为 获 得 TSKgel UP-SW3000 色 谱 柱 的 良 好 性 能, 必 须 减 小 样 品 在 管 路 或 进 样 阀 中 的 扩 散 ) 单 体 单 体 二 聚 体 二 聚 体 图 19 丙 种 球 蛋 白 制 剂 的 分 离 对 比 色 谱 柱 : A)TSKgel G3000SW XL (5 μm,7.8 mm I.D. 30 cm 2) B)TSKgel UP-SW3000 (2 μm,4.6 mm I.D. 30 cm) 流 速 : A)1.0 ml/min,b)0.35 ml/min 检 测 : UV 280 nm 进 样 量 : 10 μl 样 品 : 人 γ- 球 蛋 白 多 克 隆 表 20 单 克 隆 抗 体 的 分 离 效 果 对 比 色 谱 柱 : A)TSKgel G3000SW XL (5 μm,7.8 mm I.D. 30 cm 2) B)TSKgel UP-SW3000 (2 μm,4.6 mm I.D. 30 cm) 流 速 : A)1.0 ml/min,b)0.35 ml/min 检 测 : UV 280 nm 进 样 量 : 10 μl 样 品 : IgG 人 鼠 嵌 合 单 克 隆 抗 体 峰 : 1. 三 聚 体,2. 二 聚 体,3. 单 体,4. 片 段 表 4 单 克 隆 抗 体 峰 的 分 离 度 (R) 色 谱 柱 色 谱 柱 尺 寸 (mm I.D. cm) R( 峰 1/2) R( 峰 2/3) R( 峰 3/4) A)TSKgel G3000SW XL 2 7.8 30 + 7.8 30 1.60 3.63 1.77 B)TSKgel UP-SW3000 4.6 30 2.16 5.02 2.56-12 -

2-10. 与 市 售 UHPLC 用 SEC 色 谱 柱 的 对 比 为 获 得 SEC 色 谱 柱 的 高 分 离 性 能, 使 用 的 填 料 必 须 满 足 以 下 两 个 条 件 图 21 所 示 为 1. 填 料 的 粒 径 2. 填 料 的 细 孔 特 性 减 小 填 料 粒 径, 可 以 增 加 理 论 塔 板 数 提 高 分 离 度, 但 由 于 色 谱 柱 柱 压 升 高, 必 须 采 用 高 耐 压 系 统 进 行 测 定 另 一 方 面, 通 过 扩 大 填 料 的 细 孔 容 积, 使 校 正 曲 线 的 斜 率 更 平 缓, 可 以 扩 大 不 同 分 子 量 物 质 的 洗 脱 时 间 差 异, 提 高 分 离 度 但 在 一 般 情 况 下, 填 料 的 细 孔 容 积 越 大, 填 料 的 强 度 越 低, 操 作 压 强 随 之 上 升 TSKgel UP-SW3000 通 过 优 化 填 料 的 粒 径 和 细 孔 容 积, 实 现 了 色 谱 柱 性 能 的 提 升 和 色 谱 柱 操 作 压 强 的 降 低 图 22 为 采 用 TSKgel UP-SW3000 和 市 售 UHPLC 用 SEC 色 谱 柱 制 成 的 标 准 蛋 白 质 的 校 正 曲 线 在 甲 状 腺 球 蛋 白 (Mw 640,000) 至 卵 清 蛋 白 (Mw 47,000) 的 分 子 量 范 围 内,TSKgel UP-SW3000 色 谱 柱 的 校 正 曲 线 斜 率 更 为 平 缓 已 知 在 标 准 蛋 白 质 的 色 谱 图 中, 如 图 23 所 示,γ- 球 蛋 白 ( 峰 2 ) 附 近 的 峰 间 隔 扩 大,TSKgel UP-SW3000 更 适 合 抗 体 的 分 离 采 用 TSKgel UP-SW3000 和 市 售 UHPLC 用 SEC 色 谱 柱, 分 离 单 克 隆 抗 体 的 色 谱 图 如 图 24 所 示, 洗 脱 峰 的 分 离 性 能 如 表 5 所 示 与 市 售 UHPLC 用 SEC 色 谱 柱 相 比,TSKgel UP-SW3000 色 谱 柱 对 单 克 隆 抗 体 三 聚 体 / 二 聚 体 / 单 体 的 分 离 性 能 更 高 对 单 体 及 片 段 也 有 良 好 的 分 离 效 果 1. 填 料 的 粒 径 2. 填 料 的 细 孔 特 性 减 小 粒 径 扩 大 细 孔 容 积 (= 使 校 正 曲 线 的 斜 率 更 平 缓 ) 增 加 理 论 塔 板 数 增 大 色 谱 柱 柱 压 峰 间 隔 扩 大 填 料 强 度 下 降 分 子 量 分 子 量 标 准 曲 线 标 准 曲 线 溶 出 量 溶 出 量 粒 径 : 大 分 离 度 : 小 细 孔 容 积 : 小 分 离 度 : 小 粒 径 : 小 分 离 度 : 大 细 孔 容 积 : 大 分 离 度 : 大 图 21 SEC 色 谱 柱 分 离 性 能 的 两 个 决 定 性 因 素 - 13 -

TSKgel UP-SW3000 市 售 UHPLC 用 SEC 色 谱 柱 色 谱 柱 : TSKgel UP-SW3000 (2 μm,4.6 mm I.D. 15 cm) 市 售 UHPLC 用 SEC 色 谱 柱 (1.7 μm,4.6 mm I.D. 15 cm) 检 测 : UV 280 nm 进 样 量 : 5 μl 样 品 : 1. 甲 状 腺 球 蛋 白,640,000 Da (1' 甲 状 腺 球 蛋 白 的 二 聚 体 ) 2.γ- 球 蛋 白,155,000 Da (2'γ- 球 蛋 白 的 二 聚 体 ) 3. 蛋 清 蛋 白,47,000 Da 4.,13,700 Da 5.,137 Da 图 22 采 用 标 准 蛋 白 质 制 成 的 校 正 曲 线 的 对 比 市 售 UHPLC 用 SEC 色 谱 柱 (1.7 μm,4.6 mm I.D. 30 cm) 市 售 UHPLC 用 SEC 色 谱 柱 (1.7 μm, 4.6 mm I.D. 30 cm) 图 23 标 准 蛋 白 质 的 色 谱 图 对 比 色 谱 柱 : A)TSKgel UP-SW3000 (2 μm,4.6 mm I.D. 30 cm) B) 市 售 UHPLC 用 SEC 色 谱 柱 (1.7 μm,4.6 mm I.D. 30 cm) 进 样 量 : 10 μl(rheodyne 公 司 8125 型 ) 样 品 : 1. 甲 状 腺 球 蛋 白,640,000 Da (1' 甲 状 腺 球 蛋 白 的 二 聚 体 ) 2.γ- 球 蛋 白,155,000 Da (2'γ- 球 蛋 白 的 二 聚 体 ) 3. 蛋 清 蛋 白,47,000 Da 4.,13,700 Da 5.,137 Da 表 24 单 克 隆 抗 体 的 分 离 效 果 对 比 色 谱 柱 : A)TSKgel UP-SW3000 (2 μm,4.6 mm I.D. 30 cm) B) 市 售 UHPLC 用 SEC 色 谱 柱 (1.7 μm,4.6 mm I.D. 30 cm) 进 样 量 : 10 μl(rheodyne 公 司 8125 型 ) 样 品 : IgG 人 鼠 嵌 合 单 克 隆 抗 体 峰 : 1. 三 聚 体,2. 二 聚 体,3. 单 体,4. 片 段 - 14 -

表 5 单 克 隆 抗 体 峰 的 分 离 度 (R) 对 比 色 谱 柱 R( 峰 1/2) R( 峰 2/3) R( 峰 3/4) A)TSKgel UP-SW3000 2.16 5.02 2.56 B) 市 售 UHPLC 用 SEC 色 谱 柱 1.64 4.66 2.57 3. 分 离 实 例 3-1. 抗 体 类 药 物 的 精 密 分 析 图 25 所 示 为 使 用 长 30 cm 色 谱 柱, 减 缓 测 定 时 流 速, 对 单 克 隆 抗 体 进 行 的 精 密 分 析 实 例 测 定 时 流 速 为 0.35 ml/min 时, 仅 观 察 到 1 个 二 聚 体 的 吸 收 峰, 通 过 将 测 定 时 流 速 减 缓 至 0.05 ml/min, 可 以 分 离 出 二 聚 体 的 吸 收 峰 前 后 洗 脱 的 杂 质 峰 表 6 所 示 为 抗 体 四 聚 体 至 单 体 以 及 片 段 的 各 峰 的 分 离 度 已 知 低 流 速 测 定 可 提 高 分 离 度, 对 抗 体 进 行 精 密 分 析 色 谱 柱 : TSKgel UP-SW3000 (4.6 mm I.D. 30 cm) 流 速 : A)0.35 ml/min,b)0.05 ml/min 进 样 量 : 10 μl(rheodyne 公 司 8125 型 ) 样 品 : IgG 型 人 鼠 嵌 合 单 克 隆 抗 体 峰 : 1. 四 聚 体,2. 三 聚 体,3. 二 聚 体 4. 单 体,5. 片 段 图 25 低 流 速 条 件 下 的 高 分 离 分 析 表 6 单 克 隆 抗 体 峰 的 分 离 度 流 速 R( 峰 1/2) R( 峰 2/3) R( 峰 3/4) R( 峰 4/5) A)0.35 ml/min 0.88 2.20 5.07 2.52 B)0.05 ml/min 1.49 3.51 7.00 3.34-15 -

3-2. 抗 体 木 瓜 蛋 白 酶 消 化 物 的 分 离 实 例 使 用 TSKgel UP-SW3000 与 市 售 UHPLC 用 SEC 色 谱 柱 对 IgG 抗 体 ( 小 鼠 ) 木 瓜 蛋 白 酶 消 化 物 进 行 了 测 定, 获 得 的 色 谱 图 对 比 如 图 26 所 示 TSKgel UP-SW3000 可 以 分 离 分 子 量 接 近 的 Fc 和 Fab 片 段 使 用 TSKgel UP-SW3000 的 色 谱 图 分 析 了 木 瓜 蛋 白 酶 消 化 过 程, 如 图 27 所 示 IgG 抗 体 单 体 的 吸 收 峰 随 消 化 时 间 推 移 而 逐 渐 变 小, F(ab') 2 Fc 及 Fab 片 段 的 吸 收 峰 随 消 化 时 间 推 移 而 逐 渐 变 大 消 化 时 间 市 售 UHPLC 用 SEC 色 谱 柱 (1.7 μm,4.6 mm I.D. 30 cm) 图 26 抗 体 木 瓜 蛋 白 酶 消 化 物 的 分 离 对 比 色 谱 柱 : A)TSKgel UP-SW3000 (2 μm,4.6 mm I.D. 30 cm) B) 市 售 UHPLC 用 SEC 色 谱 柱 (1.7 μm,4.6 mm I.D. 30 cm) 洗 脱 液 : 200 mmol/l 磷 酸 缓 冲 液 (ph 6.5) 进 样 量 : 5 μl(rheodyne 公 司 8125 型 ) 样 品 : 木 瓜 蛋 白 酶 消 化 小 鼠 IgG 类 单 克 隆 抗 体 得 到 的 样 品 ( 消 化 时 间 30 分 钟 ) 图 27 木 瓜 蛋 白 酶 对 IgG 抗 体 消 化 过 程 的 色 谱 图 色 谱 柱 : TSKgel UP-SW3000(4.6 mm I.D. 30 cm) 样 品 : 木 瓜 蛋 白 酶 消 化 小 鼠 IgG 类 单 克 隆 抗 体 得 到 的 样 品 ( 消 化 时 间 0~120 分 钟 ) 其 他 测 定 条 件 与 图 23 相 同 4. 总 结 综 上 所 述, 对 2μm 粒 径 的 高 性 能 SEC 色 谱 柱 TSKgel UP-SW3000 进 行 了 简 要 说 明 使 用 中 要 注 意 检 测 系 统 中 的 柱 外 死 体 积 的 影 响, 与 现 有 色 谱 柱 相 比, 通 过 使 用 TSKgel UP-SW3000, 可 在 短 时 间 内 实 现 抗 体 二 聚 体 / 单 体 / 片 段 的 高 速 分 离 而 且 减 小 粒 径 加 快 测 定 时 流 速 后, 理 论 塔 板 数 下 降 幅 度 较 小, 加 快 测 定 时 流 速 后 可 进 行 高 通 量 分 析 - 16 -

TSKgel 系 东 曹 株 式 会 社 的 注 册 商 标 东 曹 ( 上 海 ) 生 物 科 技 有 限 公 司 地 址 : 上 海 市 徐 汇 区 宜 山 路 1289 号 B 座 3F,301 室 电 话 :+86-21-34610856 传 真 :+86-21-34610858 电 子 邮 箱 :info@tosoh.com.cn 网 址 :www.separations.asia.tosohbioscience.com