第 42 卷第 4 期陕西师范大学学报 ( 自然科学版 ) Vol.42 No.4 2014 年 7 月 JournalofShaanxiNormalUniversity (NaturalScienceEdition) Jul.,2014 文章编号 :1672 4291(2014)04 0073 05 正交提取双水相体系纯化新楝果核印楝素的工艺研究 王曼, 王佳静, 栾龙, 孙润广 ( 陕西师范大学物理学与信息技术学院, 陕西西安 710119) 摘要 : 采用乙醇 无机盐双水相技术, 研究了从国产新楝果核中提取印楝素的工艺. 通过单因素实验和正交实验探讨了无机盐的质量浓度 提取时间 料液比对印楝素提取率的影响. 实验结果表明 : 正交提取 双水相体系纯化印楝素的最佳条件是 : 无机盐浓度为 0.62g/mL, 提取时间为 1.5h, 料液比为 1 10(g ml), 此时印楝素的提取率为 1.23%. 关键词 : 双水相纯化 ; 提取率 ; 印楝素中图分类号 :Q949.753.1 文献标志码 :A 犛狋狌犱狔狅狀狊犲狆犪狉犪狋犻狅狀狅犳犪狕犪犱犻狉犪犮犺狋犻狀犳狉狅犿狀犲狑狀犲犲犿犽犲狉狀犲犾狊犫狔狅狉狋犺狅犵狅狀犪犾犱犲狊犻犵狀犿狅犱犲犪狀犱犪狇狌犲狅狌狊狋狑狅 狆犺犪狊犲狊狔狊狋犲犿 WANG Man,WANGJiajing,LUAN Long,SUN Runguang (ColegeofPhysicsandInformationTechnology, ShaanxiNormalUniversity,Xi an710119,shaanxi,china) 犃犫狊狋狉犪犮狋 :Theseparationofazadirachtinfromnewneemkernelswasstudiedbyalcohol inorganicsalta queoustwo phaseextractiontechnology.thesinglefactorandorthogonalexperimentsweredonetoin vestigatethevaritaionofazadirachtinextractionratiorelatingtoinorganicsaltconcentration,extraction timeandmaterial solventratio.theresultsshowedthattheextractionrateofazadirachtinwas1.23% undertheoptimumconditionthattheconcentrationofinorganicsaltwas0.62g/ml,theextractiontime was1.5h,andthematerial solventratiowas1 10(g ml). 犓犲狔狑狅狉犱狊 :purifyingbyaqueoustwo phase;extractionrate;azadirachtin 印楝素是四环三萜类化合物, 它是从印楝树种果实中提取的一种生物杀虫剂, 可防治 200 多种农 [1] 林 仓储和卫生害虫, 是世界公认的广谱 高效 低毒 易降解 无残留的杀虫剂. 印楝素还有广泛的药用价值, 人们已从印楝种仁 树皮等分离出多种化学活性物质, 它们具有忌避 拒食 生长调节 抗颤栗 抗细菌 抗溃疡 止痛 抗关节炎 抗真菌等作用 [2 5]. 目前关于印楝植物中提取印楝素的工艺已有许多报道, 按其提取工艺方法可分为溶剂提取 超临界流体 [6 11] 萃取和超声提取, 然而后期溶剂处理问题不易解决. 而双水相萃取技术易于有机溶剂回收与重复 [12 13] 使用的优点, 已引起人们的高度重视. 双水相 萃取技术是最近几年发展起来的一种新的高效分离技术, 它是基于液 液萃取原理, 具有条件温和 提取时间短 易于连续操作 目标产物分配系数大 投资少等特点 [14]. 我们采用正交提取 双水相体系纯化国产新楝果核中印楝素的新工艺, 可为印楝素的开发利用提供一定参考. 1 实验 1.1 材料和仪器印楝素 A 标品 ( 纯度 95%, 由 Sigma 购得 ), 国产新楝果核 ( 南京大渊生物技术工程有限责任公司提供 ), 石油醚 (30 60), 无水乙醇, 乙醇 (95%), 无机 收稿日期 :2014 01 17 基金项目 : 国家自然科学基金资助项目 (10874108); 陕西省自然科学基础研究计划 (SJ08A16). 第一作者 : 王曼, 女, 硕士研究生, 研究方向为天然产物药用成份的提取.E mail:1641597473@qq.com. 通信作者 : 孙润广, 男, 教授, 博士研究生导师.E mail:sunrunguang@snnu.edu.cn.
74 陕西师范大学学报 ( 自然科学版 ) 第 42 卷 盐 ( 试剂均为分析纯 ), 乙腈 ( 色谱纯 ), 甲醇 ( 色谱纯 ). TU 1810 紫外可见分光光度计 ;Waters1525 高效液相色谱仪 ;HPX 9162 MBE 数显电热培养箱 ( 上海博迅实业有限公司医疗设备厂 );HY 4 调频多用振荡器 ( 金坛市城东新瑞仪器厂 );JJ 1 精密增力电动搅拌机 ( 金坛市富华仪器有限公司 ). 1.2 实验方法 1.2.1 低级醇 盐双水相体系低级醇 盐双水相体系中水溶性有机溶剂选择乙醇, 成相盐选择一种无机盐, 通过改变盐的用量可以控制双水相体系的形成, 本文选取乙醇浓度为 75%, 确定出当乙醇浓度为 40%~50% 时分相效果最好, 通过改变无机盐的量来控制双水相体系的形成. 1.2.2 印楝素的振荡提取及双水相纯化用超速粉碎机将国产新楝果核破碎, 脱脂 ( 加入 10 倍体积的石油醚, 机械搅拌 12h) [15] ; 重复 3 次 ; 过滤回收石油醚, 滤渣烘干待用. 将浓度为 75% 乙醇溶液加入到脱脂国产新楝果核粉中, 然后进行振荡 1.5h, 抽滤得到乙醇提取液, 向滤液中加入一定量无机盐和水的混合溶液, 通过搅拌 静置分层, 取上层清液, 旋转蒸发回收乙醇, 烘干得到黄褐色印楝素粗提物. 1.2.3 印楝素提取 纯化工艺的优化在预实验的基础上, 选取无机盐浓度 料液比 提取时间等 3 因素 3 水平来确定最佳工艺参数. (1) 无机盐浓度的单因素实验精确称取 5g 脱脂的国产新楝果核于 7 个 100 ml 具塞锥形瓶中, 分别加入 75% 的乙醇溶液 15 ml 提取时间 1h; 抽滤 ; 分别取提取液 10mL, 向其加入浓度为 0.66 0.64 0.62 0.6 0.58 0.56 0.54 g/ml 的无机盐 9mL, 搅拌 10min, 静置分层 ; 取上层乙醇相 2mL 置于 25mL 试管中烘干 ; 加入 5mL 无水乙醇, 振荡均匀于 212nm 处测其吸光度. (2) 料液比的单因素实验精确称取 5g 脱脂的国产新楝果核于 10 个 100 ml 具塞锥形瓶中, 分别加入 75% 的乙醇溶液 15 25 35 45 50 65 75 85 95 100mL, 提取时间 1h; 抽滤 ; 分别取提取液 10 ml, 向其加入浓度为 0.615 g/ml 的无机盐 9mL, 搅拌 10min, 静置分层 ; 取上层乙醇相 2mL 置于 25mL 试管中烘干 ; 加入 5mL 无水乙醇振荡均匀于 212nm 处测其吸光度. (3) 提取时间的单因素实验精确称取 5g 脱脂的国产新楝果核于 5 个 100 ml 具塞锥形瓶中, 分别加入 75% 的乙醇溶液 50 ml, 振荡提取时间 1 2 3 4 5h; 抽滤 ; 分别取提取液 10mL, 向其加入浓度为 0.615g/mL 的无机盐 9 ml, 搅拌 10min, 静置分层 ; 取上层乙醇相 2mL 置于 25mL 试管中烘干 ; 加入 5mL 无水乙醇, 振荡均匀于 212nm 处测其吸光度. 1.2.4 鉴定方法和提取率计算 (1) 紫外吸收光谱鉴定法精确称取一定量的印楝素 A 标品, 溶于无水乙醇中, 在 190~500nm 范围内进行全波长扫描, 确定出最大吸收峰. 然后在该吸收峰下测定不同浓度印楝素 A 的吸光度并绘制标准曲线. (2) 高效液相色谱鉴定法 [16 20] 关于测定印楝素方法的报道较多, 但采用 HPLC 的检测方法较为理想. 本研究采用外标法测定, 测定条件 : 柱型 DiamonsilC 18 (250 mm 4.6 mm,5μm); 紫外光检测器, 检测波长 218nm; 流动相乙腈 水 =40 60( 体积比 ); 流速为 1 ml/min; 进样量为 20μL; 柱温为 25. (3) 印楝素提取率的计算提取得到的印楝素质量印楝素提取率 = 脱脂国产新楝果核粉质量 100%. 2 结果与讨论 2.1 无机盐的质量浓度对印楝素提取率的影响乙醇能与水无限互溶, 但在乙醇 水体系中加入 [21 27] 某种分相盐时可形成双水相, 常用的分相盐主要有 (NH 4 ) 2 SO 4 NaNO 3 Na 2 CO 3 Na 3PO 4 Na 2SO 4 K 2HPO 4 NaAc 或 NaCl 等. 实验选择其中一种无机盐为分相盐, 其优点是价格便宜 室温溶解度高 温度效应低. 无机盐的质量浓度对印楝素提取率影响的结果见图 1. 图 1 无机盐的质量浓度对印楝素提取率的影响犉犻犵.1 犈犳犲犮狋狅犳狉犪狋犻狅狅犳犐狀狅狉犵犪狀犻犮狊犪犾狋犮狅狀犮犲狀狋狉犪狋犻狅狀狅狀狋犺犲犲狓狋狉犪犮狋犻狅狀狉犪狋犲狅犳犃狕犪犱犻狉犪犮犺狋犻狀
第 4 期王曼等 : 正交提取双水相体系纯化新楝果核印楝素的工艺研究 75 由图 1 可知, 随着无机盐浓度的变化, 印楝素提取率也将随之发生变化, 当无机盐浓度为 0.62 g/ml 时, 印楝素提取率最大, 这是因为物质在双水相中的萃取分离受分配定律支配, 在乙醇 无机盐双水相中, 上相由混有少量水及乙醇构成, 下相由溶解无机盐的水及少量乙醇构成. 由于印楝素具有一定的醇溶性, 且微溶于水. 同时根据相似相溶原理, 得出结论 : 印楝素在含乙醇的上相中富集, 随着无机盐浓度的增加, 其物质在特定的体系中的分配系数也 分解的缘故. 2.4 印楝素的鉴定 2.4.1 紫外吸收光谱法鉴定印楝素精确称取定量的印楝素 A 标品 印楝素粗品, 分别加入无水乙醇, 在 190~500nm 波长范围内测定它的吸收曲 [28] 线 ( 见图 4 5). 随之改变, 从而影响印楝素提取率. 2.2 料液比对印楝素提取率的影响 料液比对印楝素提取率影响的结果见图 2. 图 4 印楝素犃紫外分光光度法全波长 犉犻犵.4 犃狕犪犱犻狉犪犮犺狋犻狀犃犫狔犝犞狊狆犲犮狋狉狅狆犺狅狋狅犿犲狋狉狔狑犪狏犲犾犲狀犵狋犺 图 5 印楝素粗品紫外可见光全波长 图 2 料液比对印楝素提取率的影响犉犻犵.2 犈犳犲犮狋狅犳狉犪狋犻狅狅犳犿犪狋犲狉犻犪犾狋狅犾犻狇狌犻犱狅狀狋犺犲犲狓狋狉犪犮狋犻狅狀狉犪狋犲狅犳犃狕犪犱犻狉犪犮犺狋犻狀由图 2 可知, 印楝素提取率随着料液比增大而逐渐增大, 但是当料液比为 1 13 时出现变动, 之后随着料液比的改变, 出现了一定的波动, 结合对成本的考虑, 料液比越大成本就越高. 因此得出结论 : 料液比选择为 1 10. 2.3 提取时间对印楝素提取率的影响振荡时间对印楝素提取率影响的结果见图 3. 犉犻犵.5 犆狉狌犱犲犲狓狋狉犪犮狋犻狀犵狊犳狉狅犿狀犲犲犿犲犾犲犿犲狀狋狌犾狋狉犪狏犻狅犾犲狋狏犻狊犻犫犾犲犾犻犵犺狋狑犪狏犲犾犲狀犵狋犺精确称取纯度为 95% 的印楝素 A 标品, 用无水乙醇定容, 置于超声水浴中振荡 溶解 混匀, 得到质量浓度为 70μg/mL 的标准溶液, 将标准溶液稀释成 52.50 39.38 29.53 22.15 16.61μg/mL 的浓度梯度, 用紫外可见分光光度计检测 212nm 处吸光度, 绘制浓度 吸光度标准曲线 ( 见图 6). 图 6 印楝素犃标品分光光度法标准曲线 犉犻犵.6 犖犲犲犿犃狊狆犲犮狋狉狅狆犺狅狋狅犿犲狋狉狔狊狋犪狀犱犪狉犱犮狌狉狏犲 图 3 提取时间对印楝素提取率的影响犉犻犵.3 犈犳犲犮狋狅犳狉犪狋犻狅狅犳犲狓狋狉犪犮狋犻狅狀狋犻犿犲狅狀狋犺犲犲狓狋狉犪犮狋犻狅狀狉犪狋犲狅犳犃狕犪犱犻狉犪犮犺狋犻狀由图 3 可以看出 : 印楝素提取率随振荡时间的延长, 在 2h 后提取率达到最高, 随着时间的继续延长提取率反而下降, 这可能是由于印楝素在溶液中部分 2.4.2 高效液相色谱法鉴定印楝素对印楝素 A 检测方法采用高效液相色谱鉴定法. 精确称取 1mg 标品, 用甲醇定容, 充分溶解, 得到标品浓度为 0.5 mg/ml. 印楝素粗品溶解 : 准确称取 0.4g 印楝素粗品, 用甲醇定容, 充分溶解, 得到印楝素粗品质量浓度为 0.04g/mL. 高校液相检测得出 ( 见图 7,8).
76 陕西师范大学学报 ( 自然科学版 ) 第 42 卷 表 2 三因素正交实验结果与分析 犜犪犫.2 犚犲狊狌犾狋狊犪狀犱犪狀犪犾狔狊犻狊狅犳狅狉狋犺狅犵狅狀犪犾犲狓狆犲狉犻犿犲狀狋狑犻狋犺狋狑狅犳犪犮狋狅狉狊 图 7 印楝素犃标品高效液相色谱图犉犻犵.7 犖犲犲犿犃狊狋犪狀犱犪狉犱狆狉狅犱狌犮狋, 犺犻犵犺狆犲狉犳狅狉犿犪狀犮犲犾犻狇狌犻犱犮犺狉狅犿犪狋狅犵狉犪狆犺狔 ( 犎犘犔犆 ) 犳犻犵狌狉犲 试验号 因素 犃犅犆 印楝素提取率 /% 1 1 1 1 0.86 2 1 2 2 1.02 3 1 3 3 1.24 4 2 1 3 1.45 5 2 2 1 1.35 6 2 3 2 1.23 7 3 1 2 0.58 8 3 2 3 1.49 9 3 3 1 1.94 T1 1.04 0.97 1.19 T2 1.34 1.29 1.47 T3 1.34 1.47 1.06 R 0.31 0.50 0.41 通过表 2 极差 R 值可知, 三因素对印楝素提取 效果的影响主次为犅 > 犆 > 犃, 以料液比影响最大. 得出最佳提取条件为犃 2 犅 3 犆 2, 即无机盐浓度 0.62 图 8 印楝素粗品高效液相色谱图 犉犻犵.8 犆狉狌犱犲犲狓狋狉犪犮狋犻狀犵狊犳狉狅犿狀犲犲犿 ( 犺犻犵犺狆犲狉犳狅狉犿犪狀犮犲犾犻狇狌犻犱犮犺狉狅犿犪狋狅犵狉犪狆犺狔 ( 犎犘犔犆 ) 犳犻犵狌狉犲 紫外检测中由图 4 得出标品在 212nm 处有吸收峰, 同样由图 5 得出 : 印楝素粗品在 212nm 处也出现同一吸收峰, 可以初步判断它们是同一种物质. 由图 7 和图 8 高效液相图可以得出 : 印楝素粗品和印楝素 A 标品的保留时间一致, 便可以进一步确定它们是同一种物质. 2.5 最佳工艺参数的确定 准确称取 5g 脱脂的国产新楝果核粉末, 以无机盐浓度 料液比 提取时间, 作为考察的 3 个因素, 各取 3 个水平, 选用 L 9 (3 4 ) 正交表进行实验, 以印楝素提取率为指标, 研究 3 个因素对印楝素提取率的影响. 正交实验因素水平和实验结果分别见表 1 和 2. 水平 犜犪犫.1 表 1 无机盐浓度 正交实验设计表 犗狉狋犺狅犵狅狀犪犾犱犲狊犻犵狀狋犪犫犾犲 犃 /(g ml -1 ) 犅 /(g ml) 犆 /h 1 0.64 1 6 1 2 0.62 1 8 1.5 3 0.60 1 10 2 因 素 料液比 提取时间 g/ml, 料液比为 1 10 提取时间 1.5h. 选取最佳提取工艺条件, 振荡重复提取 5 次, 使用 HPLC 检测其含量, 得到脱脂的国产新楝果核的平均提取率为 1.23%. 3 结论 传统的印楝素萃取方法具有提取时间长 提取效率低的缺点, 且在完成提取后存在废弃溶剂, 需要进行后期处理 [29]. 针对这些问题我们提出的印楝素的双水相纯化技术是在接近生理环境的体系中进行纯化, 不会引起生物活性物质失活或变性, 整个操作过程在常温常压下进行, 条件温和 设备简单 操作方便, 且分离快 回收率高. 为了验证双水相纯化技术在新楝果核中提取印楝素的可行性, 我们进行了大量的单因素实验, 结果表明 : 印楝素的提取率和使用的料液比 提取时间 无机盐的质量浓度等因素有关. 最后通过正交实验给出使用双水相纯化技术提取印楝素的最佳条件为 : 无机盐的质量浓度为 0.62 g/ml, 提取时间为 1.5h, 料液比为 1 10(g ml), 此时印楝素的提取率为 1.23%. 参考文献 : [1] 李晓东, 赵善欢. 印楝素对昆虫毒理作用机制 [J]. 华南农业大学学报,1995,17(1):118 122. [2]MordueAJ,BlackwelA.Azadirachtin:anupdate[J]. JournalofInsectPhysiology,1993,39:903 924. [3]SayahF,IdaomarM,Sora NzoL.Endocrineandneuro
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