农业资源与环境学报 Journal of Agricultural Resources and Environment 219 年 7 月 第 36 卷 第 4 期 :541-545 July 219 Vol.36 No.4:541-545 王姊威, 刘虹, 王春龙, 等. 不同碳氮源对 降解邻苯二甲酸二甲酯的影响 [J]. 农业资源与环境学报, 219, 36(4): 541-545. WANG Zi-wei, LIU Hong, WANG Chun-long, et al. Effect of different carbon and nitrogen sources on degradation of phthalate degrading bacteria[j]. Journal of Agricultural Resources and Environment, 219, 36(4): 541-545. 不同碳氮源对 降解邻苯二甲酸二甲酯的影响 王姊威, 刘 * 虹, 王春龙, 吕志航, 刘泽平, 陈文晶, 王志刚 ( 齐齐哈尔大学生命科学与农林学院, 黑龙江齐齐哈尔 1616) 摘 要 : 邻苯二甲酸二甲酯 (Dimethyl phthalate, ) 是一种高毒性的有机污染物, 能够高效降解, 碳氮 源是微生物需求量最大的生长要素 本实验以 为研究对象, 在基础无机盐 (MSM) 培养基中分别外加不同碳 氮源 ( 碳源分别为 5 g L -1 的葡萄糖 蔗糖 乳糖和淀粉 ; 氮源分别为 5 g L -1 的硫酸铵 硝酸钠 硝酸铵和尿素 ), 研究 Paracoccus sp. QD15-1 生长和降解 能力的变化 结果表明, 外加 4 种碳源后, 菌株生物量和降解 能力均显著提高, 其中外加淀粉处理 的最大比生长率达到.13 lg(cfu) h -1,36 h 降解率为 78.2%, 半衰期为 15.6 h 外加 4 种氮源后, 降解菌的生物量均有所上升, 其中外加尿素,36 h 降解率为 62.8% 研究表明, 在不同碳氮源中均能够较好地降解, 且外加淀粉作为 碳源和外加尿素作为氮源的降解效果更佳, 在实际工程应用中具有良好前景 关键词 :Paracoccus sp. QD15-1; 邻苯二甲酸二甲酯 ; 降解 ; 碳源 ; 氮源 中图分类号 :S154.3 文献标志码 :A 文章编号 :295-6819(219)4-541-5 doi: 1.13254/j.jare.218.217 Effect of different carbon and nitrogen sources on degradation of phthalate degrading bacteria WANG Zi-wei, LIU Hong, WANG Chun-long, LÜ Zhi-hang, LIU Ze-ping, CHEN Wen-jing, WANG Zhi-gang * (College of Life Sciences and Agriculture Forestry, Qiqihar University, Qiqihar 1616, China) Abstract:Dimethyl phthalate()is a highly toxic organic pollutant. can degrade efficiently. The carbon and nitrogen sources are the important nutrients for the growth of microorganisms. In this study, the growth and degradation of Para coccus sp. QD15-1 were detected in the basic inorganic salt medium by addition of different carbon and nitrogen sources. The results showed that the growth and capacity for degrading of were significantly improved by four carbon sources. With starch addition, the maximum specific growth rate reached to.13 lg(cfu) d -1, the degrading rate of reached 78.2%, and half-life of reached at 15.6 h. The biomass of was improved significantly by the addition of nitrogen sources. With urea addition, the degrading rate of reached 62.8% at 36 h. Therefore, the addition of carbon and nitrogen sources could improve the capac ity of for degrading, and would have good prospects in practical engineering applica tions. Keywords:; dimethyl phthalate; degradation; carbon source; nitrogen source 邻苯二甲酸酯类化合物 (Phthalic acid esters, PAEs) 作为塑化剂, 被广泛应用于塑料制品 涂料和 农药生产中 [1], 而邻苯二甲酸二甲酯 (Dimethyl phthal ate,) 是一种常见的 PAEs, 分子小, 易被动 植物体吸收, 且迁移速度最快, 毒性强 [2], 已经成为大 气 水体以及土壤中检出率最高的有机污染物之 收稿日期 :218-8-27 录用日期 :218-11-2 作者简介 : 王姊威 (1991 ), 女, 哈尔滨人, 硕士研究生, 主要从事环境微生物研究 E-mail:7817746@qq.com * 通信作者 : 王志刚 E-mail:wzg19883@sina.com 基金项目 : 国家自然科学基金项目 (3167375) Project supported:the National Natural Science Foundation of China(3167375) 541
农业资源与环境学报 第 36 卷 第 4 期 [3-4] [5] 一, 对生态系统造成危害 因此, 中国环境监测 [6] 中心确定 为环境优先控制污染物, 并在 25 年开始实施的全国土壤污染现状调查专项中将 PAEs [7] 列为土壤必测项目 在土壤环境中不易降解, 且降解速度缓 [8] 慢, 而生物修复因其高效和无二次污染等优点, 在 污染修复方面具有广阔的应用前景, 被广泛关 [9-11] 注 能够高效降解, 且 [12-13] 能够以 为唯一碳源生长, 但环境中存在多种 [14-16] 碳氮源, 会影响降解菌的降解能力, 阐明 降解菌在多种碳氮源存在时的生长情况及降解效应是十分必要的 因此, 本研究以 为研究对象, 研究其生长和降解能力对碳氮源的响应, 旨在为 污染修复提供理论依据 1 材料与方法 1.1 供试材料与培养基 1.1.1 菌株 降解菌, 由齐齐哈尔大学微生物实验室提供 1.1.2 试剂 乙酸乙酯和己烷均为分析纯试剂, 购于天津市光复精细化工研究所 1.1.3 培养基基础无机盐 (MSM) 培养基 :K 2HPO 4 12H 2O 1. g,kh 2PO 4 1. g,nh 4Cl.8 g,nacl 1. g,mgso 4 7H 2O.5 g, 5 mg, 微量元素储备液 2 ml,h 2O 1 ml 碳源 : 葡萄糖 5 g L -1, 蔗糖 5 g L -1, 乳糖 5 g L -1, 淀粉 5 g L -1 氮源 : 硫酸铵 5 g L -1, 硝酸钠 5 g L -1, 硝酸铵 5 g L -1, 尿素 5 g L -1 微量元素储备液 :CaSO 4 5H 2O 4. g,feso 4 7H 2O 7. g,fecl 3 6H 2O 7. g,cocl 3 6H 2O.2 g,namo 4 2H 2O 3.4 g,cacl 2 2. g,h 2O 1 ml 1.2 方法 1.2.1 降解菌菌体浓度的测定以不同的碳源 ( 葡萄糖 蔗糖 乳糖 淀粉 ) 氮源 ( 硝酸钠 尿素 硫酸铵 硝酸铵 ) 分别配制 15 ml 的同等质量浓度的碳源 氮源无机盐液体培养基, 装于 25 ml 的三角瓶内进行灭菌 将之前保存的 Para coccus sp.qd15-1 吸取 5 μl 滴入无机盐培养基, 培养 48 h 至菌体生长 取 1 ml 活化的菌体在 4 r min -1 下离心 5 min, 取沉淀, 加入无菌水反复离心, 直至上清液澄清 将活化洗涤后的菌悬液以每个锥形瓶 1.1 1 7 cfu ml -1 的接种量接种于实验组和对照组培养基中, 然后添加 溶液, 使培养基中 终浓度为 1 mmol L -1 同时以不添加碳源 氮源的无机盐 培养液作对照 在恒温摇床中以 3 2 r min -1 振荡培养 6 h 每隔 12 h, 分别用灭菌吸管各吸取 1 ml 注入平皿, 注入 45~5 的无机盐培养基约 15 ml, 随即转动平皿, 使样品与培养基充分混合均匀, 待培养基凝固后, 翻转平皿, 置 37 ±1 培养箱内培养 24 h 后, 进行菌落计数 用肉眼观察, 记下各平皿的菌落数后计算菌体浓度, 通过公式 μ=ln2/t d (t d 为倍增时间 ), 计算比生长速率 1.2.2 降解菌降解实验培养基配制与菌株接种量同上, 在摇床中 2 r min -1 振荡培养 6 h, 每隔 12 h, 测量 残余量 取 1 ml 菌液进行离心, 将离心后的上清液倒入分液漏斗, 加入乙酸乙酯进行萃取, 取上层液体倒入旋转蒸发仪的蒸馏瓶, 待蒸馏瓶中液体蒸干后取下并加入 1 ml 甲醇, 摇晃均匀后取 1.5 ml 倒入棕色小瓶, 用液相色谱分析仪测量峰面积, 液相色谱柱为 Waters XTerra@RP18 C18 柱 (3.9 mm 15. mm,5 µm), 以 1% 的水 9% 的甲醇为流动相, 流速为 1. ml min -1, 检测波长为 254 nm, 柱温为 3 以液相色谱测得的峰面积为 X 轴, 以不同浓度为 Y 轴, 绘制标准曲线, 得出标准曲线方程为 y=.22x-47.954(r 2 =.997), 并计算 降解的半衰期 2 结果与分析 2.1 碳源对菌株 的生长和 降解的影响 2.1.1 碳源对菌株 生长的影响由图 1 可知, 作为唯一碳源时, 菌株 Paracoc cus sp.qd15-1 在 ~12 h 时处于迟缓期, 菌体生长量基本没有变化,12 h 后菌体进入对数生长期, 菌株大量生长, 到 6 h 时达到最大值, 最大比生长速率为.6 lg(cfu) h -1 在同时含有 和葡萄糖两种碳源时, 菌株迟缓期明显增长, 而在对数生长期后期生物量最大值高于对照, 最大比生长速率为.8 lg(cfu) h -1, 是外加碳源中相对生长较慢的 在同时含有 和乳糖两种碳源时, 菌株迟缓期相对较长, 在对数生长期后期生物量最大值高于对照组, 最大比生长速率为.9 lg(cfu) h -1 在同时含有 和淀粉两 542
王姊威, 等 : 不同碳氮源对 降解邻苯二甲酸二甲酯的影响 219 年 7 月 lg( 菌株浓度 /cfu ml -1 ) lg(concentration of strain/cfu ml -1 ) 14 12 1 8 6 4 2 图 1 碳源对菌株 生长的影响 Figure 1 Effect of carbon source on the growth of strain 种碳源时, 菌株进入对数生长期的时间明显提前, 且 在对数生长期后期生物量最大值明显高于对照组, 最 大比生长速率为.13 lg(cfu) h -1, 是菌株生长速度最 快的外加碳源处理组, 在 36 h 即达到最大值 在同时 含有 和蔗糖两种碳源时, 菌株迟缓期相对较短, 且在对数生长期后期生物量最大值明显高于对照组, 最大比生长速率为.9 lg(cfu) h -1 2.1.2 碳源对 降解的影响 + 葡萄糖 + 乳糖 + 蔗糖 + 淀粉 12 24 36 48 6 由图 2 可知, 为唯一碳源时,~12 h 时 的降解速度最大,12 h 后 的降解速度逐渐变慢, 6 h 时 降解率为 46.6% 在同时含有 和葡 萄糖两种碳源时,~36 h 时 浓度快速下降, 这是 由于此时菌体处于对数生长期, 生物量较大,36 h 时 降解率为 76.%, 半衰期为 24.2 h 在同时 含有 和乳糖两种碳源时,~24 h 时的 浓度 与对照组基本一致, 但 24~36 h 的 降解速度明显 变快, 且在 36 h 时 降解率为 7.6%, 半衰期 为 33.3 h 在同时含有 和淀粉两种碳源时,~ 12 h 时 含量明显降低, 且低于对照组,36 h 时 降解率高达 78.2%, 半衰期最短, 为 15.6 h 在同时含有 和蔗糖两种碳源时,~12 h 时 的降解速度较快,12~24 h 时速度变慢,36 h 时 降解率为 69.2%, 半衰期为 28.1 h 添加不同碳源 36 h 后, 的含量均较 36 h 前略有回升, 这可能是由于此时部分菌体死亡, 从细胞内释放出来 2.2 氮源对菌株 的生长和 降解的影响 2.2.1 氮源对菌株 生长的影响由图 3 可知, 在无机盐培养基中, 菌株 Paracoccus sp.qd15-1 在 ~12 h 时处于迟缓期, 菌体生长量基本没有变化,12 h 后菌体进入对数生长期, 菌株大量生长, 到 6 h 时达最大值, 其最大比生长率为.6 lg(cfu) h -1 在外加尿素时, 菌株迟缓期相对较短, 且在对数生长期后期生物量高于对照组, 最大比生长率为.8 lg(cfu) h -1 在外加硝酸钠时, 菌株迟缓期无明显变化, 在对数生长期后期生物量高于对照组, 最大比生长率为.8 lg(cfu) h -1 在外加硝酸铵时, 菌株迟缓期延长, 在对数生长期后期生物量与对照组无明显差异, 最大比生长率达到.9 lg(cfu) h -1 在外加硫酸铵时, 菌株迟缓期延长, 在对数生长期后期生物量高于对照组, 最大比生长率为.7 lg(cfu) h -1 2.2.2 氮源对 降解的影响由图 4 可知, 在无机盐培养基中,~12 h 时 的降解速度最大,12 h 后 的降解速度逐渐变慢, 6 h 时 降解率为 46.6% 在外加尿素时,~36 h 时, 含量快速下降,36 h 时, 降解率为 62.8%, 是菌株降解 最多的, 半衰期为 27.3 浓度 concentration/mg kg -1 5 4 3 2 1 + 葡萄糖 + 乳糖 + 蔗糖 + 淀粉 12 24 36 48 6 lg( 菌株浓度 /cfu ml -1 ) lg(concentration of strain/cfu ml -1 ) 1 8 6 4 2 + 硫酸铵 + 硝酸钠 + 硝酸铵 + 尿素 12 24 36 48 6 图 2 碳源对菌株 降解能力的影响 Figure 2 Effect of carbon source on degradation ability of strain 图 3 氮源对菌株 生长的影响 Figure 3 Effect of nitrogen source on the growth of strain 543
农业资源与环境学报 第 36 卷 第 4 期 h 在外加硝酸钠时,~12 h 时 含量明显下降, 且低于对照组,12~36 h 时 含量下降变慢, 半衰期为 26.7 h, 是外加氮源中半衰期最短的 在外 加硝酸铵时,~36 h 时 含量一直处于下降状态, 且速度很快, 半衰期为 33.8 h 在外加硫酸铵 时,~12 h 时的 含量与对照组基本一致,12~24 h 时速度变慢,36 h 时, 降解率为 48.8% 浓度 concentration/mg kg -1 5 4 3 2 1 图 4 氮源对菌株 Paracoccus sp. QD15-1 降解能力的影响 Figure 4 The effect of nitrogen source on degradation ability of 3 讨论 strain Paracoccus sp. QD15-1 + 硫酸铵 + 硝酸钠 + 硝酸铵 + 尿素 12 24 36 48 6 随着 PAEs 化合物的生产量和使用量不断增加, 土壤 污泥及沉积物中 PAEs 的污染问题日益凸显 [17] 现阶段, 我国土壤中的 PAEs 主要来源于农用化学品 污水灌溉和大气沉降 [18] 而农用薄膜 肥料 农药 污 泥堆肥等农业废弃物是我国农田土壤中 PAEs 的重要 来源 [19] PAEs 在土壤 污泥及沉积物中的富集过程 和迁移转化对生态环境造成了潜在的威胁, 危害人类 健康 [2] 随着近年来研究的深入, 人们对 降解 菌的研究有了很大的进展, 但有关碳源和氮源对其降 解的影响还鲜有报道 降解菌在不同环境因子 存在时对菌株的生长和降解能力也有不同程度的影 响, 而碳源和氮源是微生物生长所必需的物质 在实 验室环境中都是单一的碳氮源, 而在自然环境中的碳 氮源是复杂的 因此本实验选取四种不同碳氮源用 来研究非单一碳氮源存在时, 降解菌的降解能 [21] 力 刘丹丹等发现添加碳源可以促进菌株 Paracoc cus sp. 对阿特拉津的降解 本实验也证明了加入碳 源后 对 降解速度增加 [22] Zhang 等发现外加氮源可以刺激木质素的降解 因 此, 碳源和氮源的添加可能会对降解物产生不同的影 响, 其影响取决于碳源和氮源的类型 本研究结果表 明 QD15-1 在淀粉中生长最好, 且降解 最多 与 其他氮源相比, 外加硫酸铵时菌株生长较慢, 与加入 这四种氮源时 的降解趋势一致, 表明菌株的生 [23] 长情况直接影响到其降解能力, 此结果与 Jin 等的 研究发现一致 此外, 本实验通过添加除 以外 的四种不同碳氮源发现 : 在只含有 一种碳氮源 时, 降解菌的生长速率明显低于添加其他碳氮 源时, 其进入对数生长期的时间也比较缓慢, 且进入 衰亡期较早 ; 加入其他碳氮源后, 降解菌的降解 速度明显变快 因此, 即使在有多种碳源和氮源存在 的外界环境中, 菌株 也可以更 好地发挥其降解作用 4 结论 本实验测定了非单一碳氮源存在下, 降解 菌 的生长情况和降解能力 (1) 外加碳源后, 各处理生物量最大值均高于对 照组, 且外加四种碳源后, 降解菌的降解能力均 有所提升 其中外加淀粉的最大比生长率达到.13 lg(cfu) h -1,36 h 降解率为 78.2%, 半衰期 15.6 h (2) 加入四种氮源后, 降解菌的生物量均有所上 升, 其中外加尿素后 36 h 降解率达到 62.8% (3) 外加碳源比外加氮源更有效促进 Paracoccus sp.qd15-1 的生长及其对 的降解 参考文献 : [1] 陈波, 倪静. 土壤中的邻苯二甲酸酯及其生态毒理学效应 [J]. 广东农业科学, 211, 38(2):155-157. CHEN Bo, NI Jing. Phthalates in soil and toxicological effects of phthalic acid esters[j]. Guangdong Agricultural Sciences, 211, 38(2): 155-157. [2] 张惠. 邻苯二甲酸二甲酯 () 对黄瓜生育期毒性效应研究 [D]. 哈尔滨 : 东北农业大学, 215. ZHANG Hui. Toxic effect of dimethy phthalate() on cucumber in growth stage[d]. Harbin:Northeast Agricultural University, 215. [3] Dickson-Spillmann M, Siegrist M, Keller C, et al. Phthalate exposure through food and consumers risk perception of chemicals in food[j]. Risk Anal, 29, 29(8):117-1181. [4] 聂湘平, 吴志辉, 李凯彬, 等. 不同暴露方式下酞酸酯在黄斑篮子鱼 体中的富集 [J]. 中国环境科学, 27, 27(4):467-471. NIE Xiang-ping, WU Zhi-hui, LI Kai-bin, et al. Effects of different ex posure ways upon the bioaccumulation of phathalate esters in Siganus oramin[j]. Chinese Environmental Science, 27, 27(4):467-471. [5] Kapanen A, Stephen R, Brüggemann J, et al. Diethyl phthalate in com post:ecotoxicological effects and response of the microbial community [J]. Chemosphere, 27, 67:221-229. 544
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