FastaTm 快速定点突变试剂盒 Fast Mutagenesis Kit V2 北京赛百盛基因技术有限公司 全国统一热线 400 666 3029 地址 北京市海淀区上地四街一号院二号楼202室 邮编 00085 传真 00-82784290 Http:// 电话 00-62969345/46 Email:info@sbsbio.com 使用说明书 Version 4.
目 录 Catalog /产品概要 FastaTm Fast Mutagenesis Kit V2是基于FastaTm快速克隆技术的定点突变系统 使用本试剂盒 目标质粒扩增产物经DpnI消化 重组环化后直接进行转化即可完成定点突变 该试剂盒由两个 模块组成 高保真扩增模块和快速克隆模块 Phanta Max超高的保真度显著降低了扩增过程中引 入新突变的可能性 其卓越的长片段扩增能力 广泛适用于长度小于20 kb的任何质粒扩增 Fasta快速克隆系统利用高效的同源重组反应替代了传统的退火成环反应 因此 使用Fasta定点突 变试剂盒进行DNA定点突变时 引物设计更加灵活 且扩增反应不再以线性方式进行 模板使用 量极低 有利于原始甲基化模板的彻底降解 Fasta克隆技术可以高效完成两个PCR产物的无缝拼 接 因此该试剂盒还能以单次扩增的方式对目标质粒上不连续的两个位点同时进行突变 此外 如 扩增产物特异 其DpnI消化产物可不进行DNA纯化而直接用于重组反应 高度优化的反应缓冲液 快捷的操作流程以及惊人的定点突变效率 使得Fasta Fast Mutagenesis Kit V2成为DNA定点突 变首选试剂盒 产品优点 - Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase高保真度提供突变率最低的高保真PCR - Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase卓越的长片段扩增能力 广泛适用于20 kb以内的 任何质粒扩增 - 扩增以指数方式进行 模板使用量极低 有利于原始甲基化模板的彻底降解 - DpnI消除原始模板污染 - Fasta快速克隆系统高效环化PCR产物 - 扩增产物经DpnI消化后可直接用于重组反应 - 可对目标质粒上单个位点或两个不连续位点(相距超过50 bp)同时进行定点突变 应用范围 DNA定点突变 注意 如使用本品对质粒进行定点突变 请使用甲基化酶无缺陷的宿主菌(例如Top0 DH5α JM09)扩增原始质粒 版本升级说明 - 扩增模块由Phanta Super-Fidelity DNA Polymerase升级为Phanta Max Super-Fidelity DNA 产品概要 产品组成 贮藏与保质期 单碱基(或连续多碱基)定点突变实验方案 不连续双碱基定点突变实验方案(两突变位点相距超过50 bp) Polymerase 扩增能力更强 模板兼容性更广且高GC片段扩增成功率显著提高 - 优化了单点突变引物设计方式 由 正反向扩增引物5 端包含2 bp反向互补区域 各引物非互 补区域长度至少为20 bp 修改为 正反向扩增引物5 端包含5-2 bp反向互补区域(gc含量40% 60%为佳) 各引物非互补区域长度至少为5 bp (待突变位点至引物3 端区域Tm值高于60 为佳) 新的设计方式可以降低引物长度5-0 bp 不仅减少了引物合成费用 更可以显著提高扩增效率 注意事项 常见问题与解决方案 0/ 02
4.2 引物设计 2/产品组成 FMTG-25 (25rxn) 组 分 2 Max Buffer.25 ml dntp Mix (0 mm each) Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase DpnI (0 U/μl) 5 CE II Buffer 00 μl Exnase II 向质粒引入单碱基或连续多碱基定点突变 只需设计一对引物将质粒进行反向PCR扩增即可 引 物设计原则为 正反向扩增引物5 端包含5-2 bp反向互补区域(gc含量40% - 60%为佳) 各引 物非互补区域长度至少为5 bp (待突变位点至引物3 端区域Tm值高于60 为佳) 所需引入突变 可以包含在互补区域内(需要两条引物上均引入点突变) 也可以包含在任一条引物的非互补区域( 只需在一条引物上引入点突变) 请勿将突变位点置于引物末端 以向pUC8引入单碱基突变为例 引物设计具体方案如图二所示 3/贮藏与保质期 本产品应置于-20 储存 保质期为一年 4/单碱基(或连续多碱基)定点突变实验方案 4. 实验流程概览 (图一) ). 引物设计(参见4.2) 2). 目标质粒扩增(图一 I 参见4.3) 3). 扩增产物DpnI消化 去除甲基化模板质粒 (图一 I 参见4.4) 4). 进行重组反应(图一 II 参见4.5) 5). 反应产物转化 涂板 克隆鉴定 (图一 III 参见4.6) 图二 向质粒引入单碱基或连续多碱基定点突变引物设计示意图 注意 计算引物Tm值时 应计算待突变位点至引物3 端这一区域内的碱基 调整引物长度使这一段Tm值高于 60 待突变位点至引物5 端区域内的碱基不应参与计算 4.3 目标质粒扩增 使用 Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase对目标质粒进行扩增 反应各组分解冻后请充 分摇匀 使用完毕后及时放回-20 推荐反应体系如下 Up to 2 Max Buffer 25 μl dntp Mix (0 mm each) a Optional 模板DNA b 引物 (0 μm) 引物2 (0 μm) 图一 使用FastaTm定点突变Kit进行单碱基定点突变实验流 Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase c 程 a. 请勿使用dUTP和带有尿嘧啶的引物或模板 设计部分反向互补的引物 对原始质粒进行反向扩增(图一 I) b. 在质粒能正常扩增的前提下 应尽量减少使用量 推荐使用 ng新鲜提取的质粒作模板 扩增产物经DpnI消化(图一 I)后 进行重组环化(图一 II) c. 推荐的酶的终浓度为 U/反应 可将Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase在0.5-2 U/之间进 重组产物直接进行转化即可完成定点突变(图一 III) 行优化 但不要超过2 U/ 尤其当扩增子长度大于5 kb时 03/ 04
DpnI消化产物最适使用量 = [0.02 目标质粒碱基对数] ng (0.03 pmol) 体系配制完成后进行扩增反应 推荐PCR反应条件 循环步骤 温度 时间 循环数 预变性a 30 sec 变性a 5 sec 退火b 60 5 sec 延伸c 30-60 sec/kb 彻底延伸 5 min 例如 向长度为5 kb的目标质粒引入单点突变 DpnI消化产物最适使用量应为 0.02 5000 = 00 ng 注意 DNA量太多或者太少都将降低环化效率 请务必通过琼脂糖电泳预先确认DNA浓度 尽量严格按照推荐 30 d 量配制反应体系 当DpnI消化产物最适使用量计算值不足50 ng或者超过400 ng时 反应时加入50 ng或400 ng 即可 DpnI消化产物不纯化直接用于重组反应时 使用量不应超过反应总体积的/5 即4 μl 体系配制完成后 用移液器上下轻轻吹打几次混匀各组分 避免产生气泡(请勿剧烈震荡或者涡旋 a. 对于大多数质粒 变性温度使用即可 b. Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase能够促进模板和引物高效退火 一般来说 退火温度 混匀) 置于37 反应 30 min 待反应完成后 立即将反应管置于冰水浴中冷却5 min 之后 反 设置为引物Tm值即可 如果需要 可以建立一个温度梯度反应去寻找引物模板结合的最适温度 退 应产物可直接进行转化 也可储存于-20 待需要时解冻转化 火时间太长可能导致扩增产物在胶上呈现弥散状 c. 长的延伸时间有助于扩增产量提高 4.6 反应产物转化 涂板 克隆鉴定 d. 为了防止扩增过程中引入非目标突变 强烈建议扩增循环数 35 如果扩增效率良好的话 推荐 取20 μl冷却反应液 加入到200 μl感受态细胞中 轻弹管壁数下混匀 在冰上放置30 min 42 热 扩增循环数应 30 激45 90秒 冰水浴孵育2 min 加入900 μl SOC或LB培养基 37 孵育0 min充分复苏 37 摇 反应结束后取少量扩增产物进行琼脂糖电泳检测 如目标质粒正确扩增 则可进行下步 菌45 min 取00 μl菌液均匀涂布在含有适当抗生素的平板上 将平板倒置 于37 过夜培养 实验 注意: 推荐使用转化效率>08 cfu/μg的感受态细胞 如果感受态转化效率<08 cfu/μg(例如用cacl2法新鲜制备的 4.4 扩增产物DpnI消化 去除甲基化模板质粒 感受态转化效率通常在06-07 cfu/μg之间) 请将培养菌液在5000 rpm离心3 min收集菌体 用00 μl LB培养基 因4.3扩增产物中包含原始模板质粒 为防止其在转化后形成假阳性转化子 必须在进 重悬后全部涂板 行重组环化之前进行DpnI消化 推荐反应体系如下 DpnI 扩增产物 40 轻轻吹打混匀后 将上述反应体系置于37 恒温反应 2小时 如4.3扩增特异 产物 5/不连续双碱基定点突变实验方案(两突变位点相距超过50 bp) 条带单一 DpnI消化产物无需纯化 可直接用于后续重组反应 如扩增不特异 DpnI消 5. 实验流程概览 (图三) 化结束后应胶回收纯化目标扩增产物 ).引物设计(参见5.2) 2).目标质粒分段扩增(图三 I 参见5.3) 4.5 进行重组反应 正反向扩增引物5 端包含完全反向互补的一段序列 因此在Exnase II催化下扩增产物5 末端和3 末端可以发生同源重组 完成扩增产物环化过程 于冰水浴中 将下列组分依 次加到无菌的.5 ml Eppendorf管或PCR管的管底 如果不慎将液体粘在管壁 请务必 3).扩增产物DpnI消化 去除甲基化模板质粒(图三 I 参见5.4) 4).进行重组反应(图三 II 参见5.5) 5).反应产物转化 涂板 克隆鉴定(图三 III 参见5.6) 通过短暂离心使其沉入管底 5 CE II Buffer DpnI消化产物 Exnase II Up to 20 μl 4 μl 50 400 ng Exnase II单点突变重组反应体系最适DNA使用量为0.03 pmol 该摩尔数对应的DNA质量 可由以下公式粗略计算获得 05/ 06
5.2 引物设计 向质粒两个不连续位点引入定点突变 只需设计两对引物将质粒分为两段进行扩增即可 引物设 计基本原则为 在每个待突变位点处设计部分反向互补的扩引物对 每对正反向引物5 端包含5-2 bp反向互补区域 所需引入突变可以包含在互补区域内(需要两条引物上均引入点突变) 也可以包 含在任一条引物的非互补区域(只需在一条引物上引入点突变) 请勿将突变位点置于引物末端 以 向pUC8引入双碱基突变为例 引物设计具体方案如图四所示 图四 向质粒引入不连续双碱基定点突变引物设计示意图 注意 计算引物Tm值时 应计算待突变位点至引物3 端这一区域内的碱基 调整引物长度使这一段Tm值高于 60 待突变位点至引物5 端区域内的碱基不应参与计算 5.3 目标质粒分段扩增 以待突变位点A B为界 将质粒分为AB段和BA段 使用 Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase 对AB段和BA段分别进行扩增 AB段扩增引物对为 待突变位点A正向扩增引物和待突变位点B反 向扩增引物 BA段扩增引物对为 待突变位点B正向扩增引物和待突变位点A反向扩增引物 反应各组分解冻后请充分摇匀 使用完毕后及时放回-20 推荐反应体系如下 2 Max Buffer dntp Mix (0 mm each) a 模板DNA b 图三 使用FastaTm定点突变Kit进行不连续双碱基定点突变实验流程 Up to 25 μl Optional 引物 (0 μm) 引物2 (0 μm) Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase c 以待突变位点A B为界 将质粒分为AB段和BA段 在每个待突变位点处设计部分反向互补的引物 a. 请勿使用dUTP和带有尿嘧啶的引物或模板 以原始质粒为模板 分别扩增AB段(A Forward Primer 和B Reverse Primer)和BA段(A Reverse Primer b. 在质粒能正常扩增的前提下 应尽量减少使用量 推荐使用 ng新鲜提取的质粒作模板 和B Forward Primer) (图三 I) 扩增产物经DpnI消化(图三 I)后 进行重组环化(图三 II) 重组产 c. 推荐的酶的终浓度为 U/反应 可将Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase在0.5-2 U/之间进 物直接进行转化即可完成双点突变(图三 III) 行优化 但不要超过2 U/ 尤其当扩增子长度大于5 kb时 07/ 08
5.5 进行重组反应 体系配制完成后进行扩增反应 推荐PCR反应条件 循环步骤 温度 时间 循环数 AB段和BA段扩增产物末端分别包含完全一致的一段序列 因此在Exnase II催化下两扩增产物末 端可以分别发生同源重组 完成环化过程 于冰水浴中 将下列组分依次加到无菌的.5 ml Eppendorf 预变性 30 sec 变性a 5 sec 退火b 60 5 sec 延伸c 30-60 sec/kb 彻底延伸 5 min a 管或PCR管的管底 如果不慎将液体粘在管壁 请务必通过短暂离心使其沉入管底 30 d 5 CE II Buffer a. 对于大多数质粒 变性温度使用即可 b. Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase能够促进模板和引物高效退火 一般来说 退火温度 Up to 20 μl 4 μl AB段Dpn I 消化产物 20 200 ng BA段Dpn I 消化产物 20 200 ng Exnase II 设置为引物Tm值即可 如果需要 可以建立一个温度梯度反应去寻找引物模板结合的最适温度 退 Exnase II 双点突变重组反应体系最适DNA使用量为 较长片段0.03 pmol 较短片段0.06 pmol 火时间太长可能导致扩增产物在胶上呈现弥散状 这些摩尔数对应的DNA质量可由以下公式粗略计算获得 c. 长的延伸时间有助于扩增产量提高 d. 为了防止扩增过程中引入非目标突变 强烈建议扩增循环数 35 如果扩增效率良好的话 推荐扩 增循环数应 30 较长片段DpnI消化产物使用量 = [0.02 片段碱基对数] ng (0.03 pmol) 较短片段DpnI消化产物使用量 = [0.04 片段碱基对数] ng (0.06 pmol) 反应结束后取少量扩增产物进行琼脂糖电泳检测 如目标质粒正确扩增 则可进行下步 实验 例如 AB段长度为 kb BA段长度为5 kb 则DpnI消化产物最适使用量为 AB段0.04 000 = 40 ng BA段0.02 5000 = 00 ng 5.4 扩增产物DpnI消化 去除甲基化模板质粒 因5.3扩增产物中包含原始模板质粒 为防止其在转化后形成假阳性转化子 必须在进行 注意 DNA量太多或者太少都将降低环化效率 因此请务必通过琼脂糖电泳预先确认DNA浓度 尽量严格按照 重组环化之前进行DpnI消化 推荐反应体系如下 推荐量配制反应体系 当DpnI消化产物最适使用量计算值不足20 ng或者超过200 ng时 加入20 ng或200 ng即 DpnI 扩增产物 40 将上述反应体系置于37 恒温反应 2小时 如5.3扩增特异 产物条带单一 DpnI消 化产物无需纯化 可直接用于后续重组反应 如扩增不特异 DpnI消化结束后应胶回收 纯化目标扩增产物 可 DpnI消化产物不纯化直接用于重组反应时 总使用量不应超过反应体积的/5 即4 μl 体系配制完成后 用移液器上下轻轻吹打几次混匀各组分 避免产生气泡(请勿剧烈震荡或者涡旋 混匀) 置于37 反应30 min 待反应完成后 立即将反应管置于冰水浴中冷却5 min 之后 反 应产物可直接进行转化 也可储存于-20 待需要时解冻转化 5.6反应产物转化 涂板 克隆鉴定 取20 μl冷却反应液 加入到200 μl感受态细胞中 轻弹管壁数下混匀 在冰上放置30 min 42 热 激45 90秒 冰水浴孵育2 min 加入900 μl SOC或LB培养基 37 孵育0 min充分复苏 37 摇菌45 min 取00 μl菌液均匀涂布在含有适当抗生素的平板上 将平板倒置 于37 过夜培养 注意: 我们推荐您使用转化效率>08 cfu/μg的感受态细胞 如果感受态转化效率<08 cfu/μg (例如用CaCl2法新 鲜制备的感受态转化效率通常在06-07 cfu/μg之间) 请将培养菌液在5000 rpm离心3 min收集菌体 用00 μl LB培养基重悬后全部涂板 09/ 0
6/注意事项 2 平板上长不出克隆或克隆数目很少 下表列出了使用FastaTm定点突变Kit进行DNA定点突变时主要注意事项(表一) 一组转化质粒的对照实验 以检测感受态细胞的转化效率 实验步骤 引物反向互补区选择 推荐这样做 不应该这样做 尽量选择无重复序列 且GC含量比 较均匀的区域 当这一区域内GC含 量在40% 60%范围之内时 重组环 化效率将达到最大 选择带有重复序列 或高GC 高AT 区域 引物设计 按照图二/四所示进行设计 实验方案选择 双位点突变时 如两突变位点相距超 过 50 bp 按照5/不连续双碱基定点 突变实验方案进行实验 如两突变位 点相距小于 50 bp时 将其视为一个 突变位点 按照4/单碱基(或连续多 碱基)定点突变实验方案进行实验 引物反向互补区域少于推荐长度或者 添加错误 双位点突变时 不考虑两突变位点之 间的距离 按照5/不连续双碱基定点 突变实验方案进行实验 质粒PCR扩增 PCR模板质粒使用量 PCR模板应为甲基化质粒 PCR模板质粒质量 DpnI消化产物纯化 DpnI消化产物DNA定量 重组反应体系配制 进行重组反应 终止重组反应 转化 进行高特异性扩增反应 在不影响扩增产量的情况下尽可能少 的使用模板 使用甲基化酶无缺陷的宿主菌(例如 Top0 DH5α JM09)扩增原始质 粒 长期放置 反复冻融会导致模板质粒 断裂 开环或降解 因此应使用新鲜 制备的质粒作为模板 扩增产物不特异时 应进行胶回收纯 化 琼脂糖电泳检测 在冰水浴中配制 根据实际浓度 按 照重组反应最适DNA量以及比例配制 DpnI消化产物不纯化直接用于重组反 应时 使用总体积不应超过反应体积 的/5 (4 μl) 在温控比较精确的仪器内(PCR仪或 水浴锅) 37 反应30 min 反应完成后立即将反应管置于冰水浴 中冷却5 min 冷却后的反应产物应在 hr内进行转化 转化之前应一直保持冰水浴低温 如 需储存 于-20 进行 表一 使用Fasta 项 a).感受态效率低 使用新制备或妥善冻存的感受态细胞 确保转化效率>07 cfu/μg 每次可设置 b).重组反应体系中dna量不足 或者比例不佳(双碱基突变) 尽量按照推荐DNA的量配制反应体 系 请务必预先检测DpnI消化产物的浓度 常用的吸光度测量法极易受DNA纯度 DNA稀释液 ph等因素影响 测定值和DNA实际浓度往往偏差非常大 因此 我们强烈推荐您通过琼脂糖电泳 来测定样品中的DNA浓度 c).重组环化反应体系中dna不纯 抑制反应 未纯化DpnI消化产物加入重组反应体系内的总体积 不应超过4 μl (反应体系体积/5) 尝试对DpnI消化产物进行胶回收纯化 重组反应体系中应尽量 避免金属络合剂(如EDTA)的带入 因此 我们推荐您将DNA纯化产物溶解在pH8.0的中保 扩增不特异 杂带较多 质粒模板使用过量 使用甲基化酶缺陷的宿主菌扩增原始 质粒 使用长期放置 反复冻融过的质粒作 为模板 扩增产物不特异时 未进行胶回收纯 化 吸光度法检测 在室温下配制 不考虑DNA浓度随意 配制 DpnI消化产物不纯化直接用于 重组反应时 使用总体积超过4 μl 存(常规胶回收试剂盒中的洗脱液可用pH8.0的替代) 请勿使用TE进行DNA保存 d).感受态细胞中加入了过多的反应产物 反应产物的转化体积不应超过感受态细胞体积的/0 否则会降低转化效率 e).出现转化抑制效应 当转化的DNA浓度太高时 会抑制转化反应 将重组反应产物稀释5倍后 取/5进行转化 3 定点突变未正确完成 a).引物设计错误 核对引物设计方案 b).扩增反应所用模板为非甲基化的质粒 DpnI只能识别甲基化DNA 请务必使用从甲基化酶无缺 陷的宿主菌中扩增的质粒作为PCR模板 反应温度偏离37 太多 反应时间 不足或者超过30 min 反应完成后室温放置 冷却后的反应产物置于室温长时间放 置后进行转化 4 长时间储存后进 行转化 定点突变Kit进行DNA定点突变时主要注意事 Tm c).扩增反应使用过多的模板质粒 对于大多数质粒 ng模板量已足以使扩增反应正常进行 过 多的质粒模板将会导致DpnI消化不完全 降低突变成功率 4 非目标位点突变 a).模板质粒携带未知位点突变 测序确认模板质粒序列正确性 b).扩增循环数过多 为了防止扩增过程中引入非目标突变 扩增循环数不宜超过35 如果扩增效 率良好的话 推荐扩增循环数应不超过30 7/常见问题与解决方案 5 特别提醒 质粒模板无法正常扩增 a).在选择引物反向互补区时 应避免选择有重复序列的区域 当这一区域内GC含量在40% a).引物设计有误 核对引物设计方案 60%范围之内时 重组环化效率将达到最大 如这部分区域GC含量高于70%或者低于30% 重组 b).扩增体系配制错误 重复实验 环化效率会受到较大影响 c).扩增反应条件不优化 调整Mg2+浓度 酶量 扩增程序 b).双碱基定点突变方案同样可用于进行单碱基突变(其中一个位点不进行碱基修改即可) 因此 d).模板质粒质量偏差 长期放置 反复冻融会导致模板质粒断裂 开环或降解 应使用 在进行单碱基突变时如扩增无法进行 可尝试使用双碱基突变方案 新鲜制备的质粒作为模板 / 2