March 1942, New Haven 细菌耐药与临床 penicillin 孙景勇 June 2010, Belgium 上海交通大学医学院附属瑞金医院临床微生物科 NDM-1 A 抗菌药物的作用方式 B 细菌耐药机制 b. 通透性降低 f. 靶位酶的高产 E D C a. 抗菌药物泵出 e. 产生代谢旁路 c. 酶对抗菌药物的降解 A. 作用于细菌的细胞壁 ( 如青霉素 万古霉素 ) B. 抑制细菌核酸合成 ( 利福平 喹诺酮 ) C. 抑制细菌蛋白质的合成 ( 四环素 氯霉素 ) D. 作用于细菌的细胞膜 ( 如多粘菌素 ) E. 干扰酶代谢系统 ( 磺胺甲恶唑 / 甲氧苄啶 ) d. 酶对抗菌药物的修饰 By Jen Philpott 耐万古霉素耐药肠球菌 (VRE) 抑制细胞壁合成 万古霉素 敏感菌 细胞壁合成 万古霉素 耐药菌 耐药菌产生一种分子结构不同于敏感菌的肽聚糖前体末端二肽,D- 丙氨酰 -D- 乳酸 D- 丙氨酰 -D- 丝氨酸或 D- 丙氨酸, 使万古霉素不能与之结合, 而细菌能够照样合成细胞壁
抗菌药物的选择压力无处不在细菌的耐药机制 细菌耐药性的产生 所有耐药性均有自发突变产生 抗菌药物的选择压力筛选出耐药菌 L. Silvia Munoz-Price & Robert A. Weinstein. N Engl J Med. 2008;358:1271-81. 耐药菌 耐药基因在环境细菌中早已存在, 但范围和数量少 抗菌药物的选择压力无处不在, 愈来愈重 70 60 50 40 30 20 10 瑞金医院门诊病人尿路感染大肠埃希菌耐药趋势 AMK %R CZO %R CEC %R CTX %R CAZ %R CIP %R Antibiotic spread through the environment 0 99 2000 2001 2002 w03 w04 w05 w06 w07 w08 w09 细菌耐药性的扩散 细菌耐药性的扩散 细菌的特殊遗传结构促进了耐药性的扩散和多重耐药 接合 ( 质粒 ) 转化 转导 转座子 整合子 ISCR1( 共同插入序列 ) 细菌的特殊遗传结构促进了耐药性的扩散和多重耐药 接合 ( 质粒 ) 转化 转导 转座子 整合子 ISCR1( 共同插入序列 ) 通过媒介的传播 医疗环境中人员 器械的传播 国际国内人员 商品的流通 自然环境中的食物链 通过媒介的传播 自然环境中的食物链 国际间人员 商品的流通 医疗环境中人员 器械的传播
耐药性在细菌间的水平转移 耐药基因在细菌内 DNA 中的转移方式 转化 接合 转座子 转座子 转导 整合子 ISCR1 Horizontal Gene Transfer. By Fan Sozzi 转化 : 是细菌吸收外源 DNA 片段 转导 : 是以噬菌体为载体来传递 DNA 接合 : 则是两个细菌之间通过性菌毛直接交换 DNA 接合 我们目前面临的主要耐药问题 β- 内酰胺酶分类 革兰阴性杆菌 产生 β- 内酰胺酶 ESBL ( 超广谱 β 内酰胺酶 ) AmpC 酶 产碳氢霉烯酶的肠杆菌科细菌 泛耐药 铜绿假单胞菌 鲍曼不动杆菌 革兰阳性球菌 PNSP - 青霉素耐药的肺炎链球菌 MRSA - 苯唑西林耐药的金葡菌 VRE - 万古霉素耐药的肠球菌 VRSA - 万古霉素耐药的金葡菌 丝氨酸 β- 内酰胺酶 金属 β- 内酰胺酶 难辨梭菌 OC Zn CH CH2OH H2O HN Zn O H H 碳青霉烯酶 指所有能明显水解亚胺培南或美罗培南等碳青霉烯类抗生素的一类 β 内酰胺酶 分别属于 Ambler 分子分类中的 A 类 B 类 D 类酶 分子学分类酶常见菌 Class A SME, IMI, NMC, GES, 肠杆菌科细菌 KPC ( 铜绿假单胞菌 ) Class B ( 金属酶 ) IMP, VIM, GIM, SPM,NDM-1 铜绿假单胞菌肠杆菌科细菌鲍曼不动杆菌 Class D OXA 鲍曼不动杆菌 肠杆菌科细菌中的主要碳氢霉烯酶 KPC NDM-1,VIM, IMP OXA-48
碳氢霉烯酶表型筛查试验 纸片扩散法 : 美罗培南 (10ug) 或亚胺培南 (10ug): 抑菌圈直径 22mm 肉汤稀释法或 Etest 法 美罗培南或亚胺培南 :MIC 2ug/ml 亚胺培南适合于大肠埃希菌, 克雷伯菌属, 沙门菌属, 肠杆菌属 变形杆菌属 普罗威登斯菌属和摩根菌属对亚胺培南敏感性下降是由产碳青霉烯酶外的其他机制引起, 因此对这些菌株尚未建立用亚胺培南 MIC 法进行筛选和确认碳青霉烯酶, 并且亚胺培南纸片法对所有肠杆菌科碳青霉烯酶的筛查效果都不好 大肠杆菌 ATCC 25922 #2 阳性 碳氢霉烯酶的确证试验 #1 阳性 改良 Hodge 试验 厄他培南对大肠杆菌 ATCC25922 的抑菌区 #3 阴性 1. 制备大肠杆菌 ATCC25922 的 0.5 麦氏浊度菌悬液, 再 10 倍稀释 2. 用棉签蘸取菌液涂布 MH 平皿如纸片扩散法试验 ; 将厄他培南或美罗培南 ( 最好 ) 纸片贴于平皿上 3. 将待测菌株 (#1 - #3) 从纸片边缘向外划线 ( 使用 1 微升接种环 ) 4. 孵育过夜 5. 观察划线菌株周围大肠杆菌的生长 - 提示碳青霉烯水解酶 [1] Yong D et al. Antimicrob Agents Chemother. 2009 Dec;53(12):5046-54. [2] Kumarasamy KK et al. Lancet Infect Dis. 2010 Sep;10(9):597-602. 大肠杆菌 ATCC25922 的增强生长 CLSI M100-S19. App G. CLSI 肠杆菌科细菌碳青霉烯类的折点的改变 纸片扩散法 (mm) 稀释法 (mg/l) 抗菌药物 M100-S20 M100-S22 M100-S20 M100-S22 S R S R S R S R 多利培南 - 23 19-1 4 厄他培南 22 15 22 18 2 8 0.5 2 亚胺培南 16 13 23 19 4 16 1 4 美罗培南 16 13 23 19 4 16 1 4 肺炎克雷伯菌产生的碳青霉烯酶 KPC (Klebsiella Pneumoniae Carbapenemase) 2001 年在美国北卡罗来纳州首次报道 属于 A 类丝氨酸碳青霉烯酶 β- 内酰胺酶 水解包括碳青霉烯类抗生素在内的所有 β- 内酰胺类抗生素, 但对头孢他啶和头孢西丁相对较弱 酶抑制剂如克拉维酸有部分抑制作用 编码基因位于质粒上 主要位于肠杆菌科细菌 产 KPC 菌株的快速播散 产 KPC 菌株的快速播散 2001: 美国 2001-2008: 美国, 24 州 2005: 法国 ( 病人曾经在美国住院治疗 ) 2006: 哥伦比亚 以色列 2007: 中国 2008: 希腊 古巴 苏格兰 英国 2009: 巴西 挪威 瑞典 爱尔兰 波兰 目前我国已在浙江 上海 江苏 安徽 武汉 福建等地发现该酶 产 KPC 酶肠杆菌科细菌的分布 Patrice Nordmann, Thierry Naas, and Laurent Poirel. Emerging Infectious Diseases, 2011,17(10)
KPC 酶的检测 NDM-1 酶 表型筛选试验 ( 碳氢霉烯酶 ) 改良 Hodge 试验 ( 碳氢霉烯酶 ) PCR 基因型确证试验 New Delhi metallo-β-lactamase 1 (NDM-1) 新德里金属 β- 内酰胺酶 Ⅰ 型 bla NDM-1 ------- 基因 ( 核酸 ) NDM-1 ------- 酶 ( 蛋白质 ) 产 NDM-1 的 ( 肠杆菌科 ) 细菌 超级细菌 编码基因位于质粒上, 水解包括碳青霉烯类抗生素在内的所有 β- 内酰胺类抗生素 ( 氨曲南除外 ) 能够被 EDTA 抑制 产 NDM-1 菌株的分布 β- 内酰胺酶 碳青霉烯酶 金属酶 NDM-1 Patrice Nordmann, Thierry Naas, and Laurent Poirel. Emerging Infectious Diseases, 2011,17(10) NDM-1 酶的检测 表型筛选试验 ( 碳氢霉烯酶 ) 改良 Hodge 试验 ( 碳氢霉烯酶 ) 表型确证试验 ( 金属酶 ) 纸片扩散法 : Etest 法 : 双纸片协同法 : PCR 基因型确证试验 表型确证试验 纸片扩散法 : 亚胺培南 (10ug)/ 亚胺培南 (10ug)+ EDTA(500mM 10ul) 复合纸片 结果判读 : 复合纸片比单药纸片抑菌环直径增大 5mm 图 : 复合纸片法判定金属 β- 内酰胺酶示意图 ( 左纸片 : 亚胺培南 /EDTA, 右纸片 : 亚胺培南 ) [1] Yong D et al. J Clin Microbiol. 2002 Oct;40(10):3798-801.
表型确证试验 表型确证试验 Etest 法 : Etest MBL (IP/IPI MP/MPI) 双纸片协同法 : 亚胺培南 (10ug) EDTA(0.5M x 10 μl 约 0.5mg/ 片 ), 间距 10mm (0.5McF) 结果判读 : 单药与复合制剂的 MIC 比值 8 图 :Etest MBL (IP/IPI) [1] http://www.biomerieux-diagnostics.com/servlet/srt/bio/clinicaldiagnostics/dynpage?doc=cnl_cln_prd_g_prd_cln_60 图 : 亚胺培南 -EDTA 双纸片协同试验示意图 ( 图中菌种为铜绿假单胞菌 ) [1] Lee K et al. J Clin Microbiol. J Clin Microbiol. 2003 Oct;41(10):4623-9. 抗菌药物敏感试验的临床意义 指导感染性疾病的个体化治疗, 预测和改善预后 通过对药敏结果的监测, 为抗感染的经验性治疗提供依据 抗菌药物敏感试验的临床意义 90-60 rule 由敏感株所致感染,90% 的病例对相应抗菌药物的治疗有反应 由耐药株所致感染,60% 的病例对相应抗菌药物的治疗有反应 为相关感染性疾病治疗指南和国家抗菌药物相关政策的制定提供参考 监测临床致病菌的爆发流行, 为医院感染的控制提供线索 药敏试验的价值 =30% successful outcome=100rmb 药敏试验折点的确立和结果的报告 折点确立野生株 MIC 的分布 ; 药代动力学和药效学 ; 临床疗效 结果报告 S: 敏感 I: 中介和 R: 耐药 S 指菌株能被推荐使用剂量在感染部位可达到的抗菌药物浓度所抑制 I 指抗菌药物 MICs 接近血液和组织中通常可达到的浓度, 需要用高于正常剂量的抗菌药物才有效, 或抗菌药物在生理浓集部位才具有临床效力 R 指菌株不能被常规剂量抗菌药物达到的浓度所抑制, 在治疗研究中该抗菌药物对菌株的临床疗效不可靠 药敏试验 ( 体外 ) 敏感临床 ( 体内 ) 无效 病人相关原因 : 免疫抑制, 基础疾病严重感染部位药物浓度低 ( 盆腔 前列腺 脑脊液 ) 药物原因 : 给药剂量与方式不当 微生物相关原因 : D 试验病原确立错误 ( 定植敏感菌 ); 接种效应 ;5 10 5 /ml vitro vs 10 9 /ml vivo 毒力 ( 猩红热 吸入性炭疽 EHEC); 治疗中出现耐药 ( 葡萄球菌 - 喹诺酮 铜绿 诱导耐药突变 ); 产生生物膜 ( 铜绿 )
铜绿假单胞菌的生物膜 药敏试验 ( 体外 ) 敏感临床 ( 体内 ) 无效 药敏折点本身原因 : 头孢噻肟 MIC=4ug/ml S or R? 亚胺培南 MIC=4ug/ml S or R? 新的耐药机制出现 (ESBLs,KPC) 折点也随之改变 实验室药敏试验操作错误 : 头孢他啶敏感, 亚胺培南耐药 - 大肠 摩根 铜绿 CLSI 某些规定 : 头孢菌素 氨基糖苷类 - 志贺菌 沙门菌 ; 头孢菌素 氨基糖苷类 克林 复方磺胺 - 肠球菌 ; β- 内酰胺类 -MRSA 药敏试验即使敏感也应报耐药 药敏试验 ( 体外 ) 耐药临床 ( 体内 ) 有效 病人相关原因 : 免疫防御 ( 白细胞 补体 抗体 细胞因子 ); 感染部位 ( 尿液, 胆汁 ) 药物相关原因 : 增加剂量, 延长静滴时间 微生物相关原因 : 病原确立错误 ( 定植耐药菌 ); 致病力 ( 全耐药肺克 vs 全耐药鲍曼 ) 药敏折点本身原因 : 肺双 - 青霉素 S 0.006ug/ml(2008)- 2ug/ml(2009) 实验室药敏试验操作错误 一些耐药性容易改变的菌种 用第三代头孢菌素治疗肠杆菌属 枸橼酸菌属和沙雷菌属所致感染 用喹诺酮类治疗葡萄球菌属所致感染 用各种抗生素治疗铜绿假单胞菌所致感染 药敏报告结果中若有敏感的药物, 不要选择耐药的药物! 下列细菌对某些抗生素可在体外出现活性但没有临床疗效, 因此不能报告为敏感 细菌对苯唑西林耐药的葡萄球菌 肠球菌 沙门菌 志贺菌李斯特菌鼠疫耶尔森菌克柔假丝酵母 不能报告为敏感的抗生素 所有的碳青酶烯类 头孢菌素类及其他 β- 内酰胺类 例如阿莫西林 / 克拉维酸 哌拉西林 / 他唑巴坦和亚胺培南 氨基糖苷类 ( 高浓度除外 ) 头孢菌素类 克林霉素和磺胺甲恶唑 / 甲氧苄啶一代 二代头孢菌素和氨基糖苷类头孢菌素 β- 内酰胺类抗生素氟康唑 细菌枸橼酸杆菌 肠杆菌属 克雷伯菌 摩根摩氏菌 普通变形杆菌 沙雷菌弗氏枸橼酸杆菌 肠杆菌属 摩根摩氏菌 普通变形杆菌 沙雷菌克雷伯菌 弗氏枸橼酸杆菌 肠杆菌属 沙雷菌 弗氏枸橼酸杆菌 肠杆菌属 普通变形杆菌 沙雷菌鲍曼不动杆菌 洋葱伯克霍尔德菌 铜绿假单胞菌 嗜麦芽窄食单胞菌 鲍曼不动杆菌 洋葱伯克霍尔德菌 嗜麦芽窄食单胞菌 嗜麦芽窄食单胞菌 脑膜脓毒黄杆菌 铜绿假单胞菌 可预见的耐药表型氨苄西林 头孢唑林 头孢噻吩 替卡西林 头孢替坦 头孢西丁 阿莫西林 / 克拉维酸 氨苄西林 / 舒巴坦头孢呋辛 氨苄西林 头孢唑林 头孢噻吩 头孢替坦 头孢西丁 替卡西林 美洛西林或哌拉西林 庆大霉素 亚胺培南 复方磺胺 阿莫西林 / 克拉维酸 氨苄西林 / 舒巴坦 42
43 细菌 肠杆菌科 金黄色葡萄球菌 罕见的耐药表型 亚胺培南 美罗培南 万古霉素 替考拉宁 利奈唑胺 染色体 AmpC 酶的诱导 凝固酶阴性葡萄球菌 万古霉素 利奈唑胺 粪肠球菌 屎肠球菌 氨苄西林 利奈唑胺 万古霉素 替考拉宁利奈唑胺 万古霉素 替考拉宁 β 溶血链球菌 A B C 和 G 组 链球菌属 流感嗜血杆菌 青霉素 氨苄西林 超广谱头孢菌素万古霉素 利奈唑胺超广谱头孢菌素 染色体 AmpC 酶的 稳定去阻遏 耐药 最初培养 - 第一天 再次培养 - 第三天 葡萄球菌对大环内酯类抗生素的耐药机制 头孢噻肟 诱导型 (imls) 组成型 (cmls) MS 型耐药 CTX 30 头孢噻肟 erm 基因 erm 基因 msr 基因 阴沟肠杆菌 头孢噻肟 1 抗生素作用靶位改变 : 产生 erm 基因编码的 RNA 甲基化酶, 对细菌核糖体 rrna 进行甲基化, 导致细菌的耐药 (MLS 型耐药 ), 分为诱导型 (imls) 和组成型 ( cmls ) A )imls 型耐药 : 指红霉素作为诱导剂可通过衰减机制诱导 erm 基因的表达而产生耐药其表型为对红霉素耐药对克林霉素敏感, 可用 D 试验检测 B)cMLS 型耐药 : 指 erm 基因上游的启动子发生突变而使 erm 基因持续稳定表达产生耐药其表型为对红霉素和克林霉素均耐药 选择抑菌圈中的菌落重新测试 2 主动外排 : msr 基因编码外排蛋白, 介导细菌红霉素耐药, 对克林霉素敏感 (MS 型耐药 ) 46 谢谢!