101 年度 中藥檢驗分析實務訓練 初階課程 微生物檢驗 SOP 實務訓練 報告機構 : 財團法人中央畜產會 報告人 : 陳月娥 連絡電話 :08-7230341-8226 中華民國 101 年 06 月 20 日 1
講課內容 參考依據 SOP 解說 2
參考依據 依據行政院衛生署 100 年編印 - 中華藥典第七版 3
SOP 解說 項目檢驗方法 抑菌試驗 ( 預試驗 ) 好氧性微生物總數酵母菌與黴菌總數大腸桿菌沙門氏菌 行政院衛生署中華藥典編修委員會 2010 中華藥典第七版, 附錄柒 特殊檢驗法 (7005) 微生物限量檢驗法, 第 109~112 頁, 行政院衛生署, 台北 行政院衛生署中華藥典編修委員會 2010 中華藥典第七版, 附錄柒 特殊檢驗法 (7006) 好氧性微生物總數, 第 113 頁, 行政院衛生署, 台北 行政院衛生署中華藥典編修委員會 2010 中華藥典第七版, 附錄柒 特殊檢驗法 (7006) 酵母菌與黴菌總數, 第 113 頁, 行政院衛生署, 台北 行政院衛生署中華藥典編修委員會 2010 中華藥典第七版, 附錄柒 特殊檢驗法 (7007.1) 大腸桿菌, 第 113 頁, 行政院衛生署, 台北 生化鑑定 :IMViC / VITEK 2 COMPACT 30 行政院衛生署中華藥典編修委員會 2010 中華藥典第七版, 附錄柒 特殊檢驗法 (7007.2) 沙門氏菌, 第 114 頁, 行政院衛生署, 台北 生化鑑定 :API 20E 生化套組 / VITEK 2 COMPACT 30 4
一 目的 二 範圍 三 內容 : SOP 撰寫 包括 - 儀器設備 試劑配製 四 參考文獻 培養基 操作流程 五 備註 : 檢驗紀錄表 5
儀器設備 無菌操作台 乾熱滅菌器 : 玻璃用具等之滅菌用, 其內部中心溫度能達 170 以上, 並維持該溫度 1 小時以上 高壓滅菌釜 : 培養基及稀釋液等不能以乾熱滅菌之材料及用具等之滅菌用 滅菌溫度 121 ( 約 15 lb/in 1kg/cm), 並能維持 15 分鐘以上 培養皿 : 已滅菌, 內徑約 90 mm, 深度約 15 mm, 底皿之內外面應平坦, 無氣泡 刮痕或其他缺點 吸管輔助器 (Pipette aid) 或微量分注器及吸管 接種針及接種環 ( 直徑約 3 mm): 鎳鉻合金, 鉑銥或鉻線材質, 或可拋棄式者 試管 :16 125mm 13 100mm 試管或其他合適者 玻璃棒 剪刀 藥勺 小刀及鑷子 : 可滅菌 ph 測定儀及 ph 試紙 振盪器 (Shaker) 電子天平 : 可稱量到 2,000g, 靈敏度可達 + 0.1g 精密天平 : 可稱量至 120g, 靈敏度可達 + 1mg 載玻片及蓋玻片 6
培養基 好氧性微生物總數及酵母菌與黴菌總數 大豆分解蛋白質 - 乾酪素培養基 (Soybean-Casein Digest Medium) 大豆分解蛋白質 - 乾酪素瓊脂培養基 (Soybean-Casein Digest Agar Medium) 大豆卵磷脂消化乾酪素 - 油酸聚醇山梨酯 20 培養基 (Fluid Casein Digest-Soy Lecithin-Polysorbate 20 Medium) 油酸聚醇山梨酯 平板計數培養基 (Plate Count Agar) 大腸桿菌 乳糖培養基 (Fluid Lactose Medium) 馬康奇瓊脂培養基 (MacConkey Agar Medium) 伊紅亞甲藍瓊脂培養基 (Levine s Eosin-Methylene Blue Agar Medium,L-EMB) 沙門氏菌 乳糖培養基 (Fluid Lactose Medium) 亞硒酸鹽胱胺酸培養基 (Fluid Selenite Cystine Medium) 四硫磺酸鹽培養基 (Fluid Tetrathionate Medium) 煌綠瓊脂培養基 (Brilliant Green Agar Medium) 亞硫酸鉍瓊脂培養基 (Bismuth Sulfite Agar Medium) 木糖離胺酸去氧膽酸鹽瓊脂培養基 (Xylose-Lysine-Desoxycholate Agar Medium) 三糖鐵瓊脂培養基 (Triple Sugar-Iron Agar Medium) 7
抑菌試驗 ( 預試驗 ) 秤取檢品 10.0 g, 加入大豆分解蛋白質 - 乾酪素培養基 (Soybean-Casein Digest Medium) 或乳糖培養基, 使全量為 100 ml, 取標準菌大腸桿菌 (Escherichia coli) 及沙門氏桿菌 (Salmonella) 等菌種, 加入約 10-3 之菌液 1 ml, 再依試驗操作進行 試驗結果, 均應有增殖現象 若試驗結果某菌種於其接種之培養基中不生長, 則該部分檢驗結果無效 8
抑菌試驗 ( 預試驗 )- 續 所有檢驗方法皆即須採下述任一處理法調整之後再重新執行該試驗 : 1. 增加菌種稀釋液之量 ; 但檢品量不變 2. 於菌種稀釋液中加入適量之不活化劑 - 如培養基可加入大豆卵磷脂 0.5% 或油酸聚醇山梨酯 20 4.0%, 以抵消檢品中所含抑菌物質 採 1 及 2 節方法處理, 以抵消檢品中所含之抑菌作用 ; 再依試驗操作進行 9
好氧性微生物總數檢驗方法 - 培養皿法 秤取檢品 10.0 g, 加入 ph 7.2 大豆分解蛋白質 - 乾酪素培養基 (Soybean-Casein Digest Medium), 使全量為 100 ml, 並做一系列稀釋 將每個稀釋倍數之稀釋液各吸取 1.0 ml, 分別置入二個已滅菌之培養皿中, 迅速各加已先溶化並冷卻至 45 之大豆分解蛋白質 - 乾酪素瓊脂培養基 (Soybean-Casein Digest Agar Medium) 15~20 ml 於室溫下凝固, 倒置於 30~35 培養 48 至 72 小時後 計算菌落數 ( 菌落數落在 30 至 300 個之間者進行計算 ) 若 1:10 之檢品稀釋液中無菌落產生, 表示此檢品每 g 或每 ml 檢品之微生物總數為 10 個以下 10
酵母菌與黴菌總數 秤取檢品 10.0 g, 加入大豆分解蛋白質 - 乾酪素培養基 (Soybean-Casein Digest Medium), 使全量為 100 ml, 並做一系列稀釋 將每個稀釋倍數之稀釋液各吸取 1.0 ml, 分別置入三個已滅菌之培養皿中, 迅速各加已先溶化並冷卻至 45 之馬鈴薯葡萄糖洋菜培養 (Potato Dextrose Agar Medium)18~20 ml 於室溫下凝固, 置於 20~25 培養 5 日後 計算菌落數 ( 菌落數落在 15 至 150 個之間者進行計算 ) 若 1:10 之檢品稀釋液中無菌落產生, 表示此檢品每 g 或每 ml 檢品之微生物總數為 10 個以下 11
大腸桿菌檢驗方法 取檢品 10mL 或 10g, 加乳糖培養基使成 100mL, 混合均勻, 於 30~ 35 培養 24 至 48 小時 若有菌落產生 ( 混濁 ), 則以接種環沾取菌液, 劃線接種於麥康奇瓊脂培養基之表面, 於 30~35 培養 24 至 48 小時 觀察菌落型態, 典型大腸桿菌菌落為磚紅色菌落圍有膽汁沉澱環 若無典型菌落即表示此檢品符合無大腸桿菌之規定 若麥康奇瓊脂培養基有可疑菌落, 再接種於伊紅亞甲藍瓊脂培養基表面, 作劃線培養於 30~35 培養 24 至 48 小時 觀察菌落之外觀於反射光下有特殊光澤於透射光下為藍黑色菌落 作革蘭氏染色並鏡檢, 其結果若呈革蘭陰性桿菌 若無典型菌落即表示此檢品符合無大腸桿菌之規定 特殊培養基 菌落特徵 麥康奇瓊脂培養基 磚紅色 圍有膽汁沈澱環 格蘭氏染色陰性桿菌陰性桿菌 伊紅亞甲藍瓊脂培養基 反射光下有特殊光澤於, 透射光下為藍黑色菌落 12
大腸桿菌檢驗方法 ( 續 ) 自每一片伊紅亞甲藍瓊脂培養基 (Levine Eosine- Methylene Blue Agar Medium) 培養基上取 2 個可疑菌落或比較可疑之菌落移殖於平板計數培養基 (Plate Count Agar) 斜面上, 並於 35 培養 18~24 小時, 以備生化試驗 (IMViC 試驗 ) IMViC 試驗 : 吲哚試驗 (Indole Test) 歐普氏試驗 (VP Test) 甲基紅試驗(MR Test) 檸檬酸鹽利用試驗 (Citrate Utilization Test) 自每一片 L-EMB 培養基上取 2 個可疑菌落或比較可疑之菌落移殖於 PCA 培養基斜面上,35 培養 18~24 小時, 以進行 VITEK2 生化試驗鑑定系統 13
沙門氏桿菌檢驗方法 取檢品 10mL 或 10g, 加乳糖培養基使成 100mL, 混合均勻, 於 30~35 培養 24 至 48 小時 若有菌落產生 ( 混濁 ), 則輕輕搖混合均勻, 並以無菌吸管分別吸取菌液 1.0 ml 至 SC 及 TT 培養基 10 ml 之試管中, 混合均勻 ; 於 30~35 培養 12 至 24 小時 以接種環沾取 SC 及 TT 培養基菌液, 劃線接種於煌綠瓊脂培養基 亞硫酸鉍瓊脂培養基及木糖離胺酸去氧膽酸鹽培養基 ; 於 30~35 培養 24 至 48 小時, 觀察菌落外觀 若無典型菌落即表示此檢品符合無沙門氏菌之規定 14
沙門氏桿菌檢驗方法 ( 續 ) 煌綠瓊脂培養基 木糖離胺酸去氧膽酸鹽瓊脂培養基 亞硫酸鉍瓊脂培養基, 典型沙門氏桿菌菌落之性狀如下 : 特殊培養基 煌綠瓊脂培養基 木糖離胺酸去 氧膽酸鹽培養 基 菌落特徵 菌落形小 透明 無色或粉紅色至白色 ( 常有粉紅色至紅色圈 ) 呈紅色菌落, 有 ( 或無 ) 黑色中心 亞硫酸鉍瓊脂培養基 菌落為綠色或黑色, 有 ( 或無 ) 黑色中心 三糖鐵瓊脂培養基 斜面培養 : 紅色 格蘭氏染色陰性桿菌陰性桿菌陰性桿菌陰性桿菌 15
沙門氏桿菌檢驗方法 ( 續 ) 若有可疑典型沙門氏菌落, 則將菌落同時以穿刺及斜面劃線於三糖鐵瓊脂培養基 (Triple Sugar-Iron Agar Medium) 中, 於 35 培養 24 ± 2 小時後觀察, 其結果若斜面呈紅色反應, 底部呈黃色 ( 或無色 ) 反應, 且培養基顏色不論有無變黑, 皆可能是沙門氏桿菌 可疑的菌落須進行多價本體 (O) 抗血清試驗及 API 20E 生化檢測套組檢測, 如二者均為正反應, 則判定沙門氏桿菌為陽性 使用 VITEK2 生化試驗鑑定系統 16
微生物檢驗室之品保 實驗室環境監測 藥品及培養基品保 : 培養基驗收 配製培養基之 QC 內部人員測試檢驗人員每年需進行盲樣測試 儀器設備品保儀器設備每日登記溫度 每月保養維護 1 次 每 3 個月內部查驗 1 次及每年定期校正 17
微生物檢驗室之品保 ( 續 ) 測試方法 : 每批樣品 / 每項檢驗項目執行之品管監控空白樣品分析 : 樣品 培養基重複樣品分析陽性對照 : 標準菌株 - 為確保檢測標準菌之有效追溯, 實驗室所使用之菌種皆購置 生物資源保存及研究中心 (BCRC) 18