第 3 卷第 9 期光学学报 Vol.3,No.9 0 年 9 月犃犆犜犃犗犘犜犐犆犃犛犐犖犐犆犃犛犲狆狋犲犿犫犲狉,0 体视学与激光共聚焦显微镜图像分析黑色素瘤细胞三维形态学参数的变化 张莹 胡纳 汪韆 杨春梅 杨立 胡新华 3 冯远明,4 烄天津大学精密仪器与光电子工程学院天津市生物医学检测技术与仪器重点实验室, 天津 30007 烌 DepartmentofInternalMedicine,BrodySchoolofMedicine,EastCarolinaUniversity,Greenvile,NC7858,USA 3 DepartmentofPhysics,EastCarolinaUniversity,Greenvile,NC7858,USA 烆 4 天津医科大学肿瘤医院放射治疗科, 天津 300060 烎 摘要体视学是由形态学与数学交叉形成的一门新兴学科, 通过二维结构信息定量测量和分析三维形态结构特征 采用体视学点计数方法, 对肿瘤细胞 B6F0 B6/Vector 及 B6/GPR4 各 0 组的共聚焦显微镜图像进行测量, 定量分析了其三维形态参数的差异 对比三类细胞的体视学参数发现, 对照组 B6/Vector 和原始细胞 B6F0 没有明显差异, 实验组 B6/GPR4 的细胞比表面及相对形状因子参数与另两类细胞相比均表现出了显著性差异 ( 狆值分别小于 0.05 和 0.0, 即 B6/GPR4 细胞形态光滑, 没有较多的突触和伪足 ), 与前期 Transwel 小室细胞侵袭及迁移实验研究结果相吻合, 体现出 B6/GPR4 细胞中 G 蛋白耦联受体 4(GPR4) 基因对细胞迁移性抑制的生物 特性 研究结果表明, 体视学和激光扫描共聚焦显微镜细胞图像的结合, 可以实现细胞三维结构参数的快速测量, 是细胞生物学尤其是细胞形态学分析的有效研究方法 关键词医用光学 ; 肿瘤细胞三维形态 ; 体视学 ; 激光扫描共聚焦显微镜 ;B6F0 黑色素瘤细胞 ;G 蛋白耦联受体 4 中图分类号 R38.5 文献标识码 A 犱狅犻 :0.3788/ 犃犗犛 03.09700 犛狋犲狉犲狅犾狅犵犻犮犪犾犪狀犱犔犪狊犲狉犛犮犪狀狀犻狀犵犆狅狀犳狅犮犪犾犕犻犮狉狅狊犮狅狆犻犮犃狀犪犾狔狊犻狊狅犳 3 犇犻犿犲狀狊犻狅狀犪犾犕狅狉狆犺狅犾狅犵狔狅犳犕犲犾犪狀狅犿犪犆犲犾狊 烄 犣犺犪狀犵犢犻狀犵 犎狌犖犪 3 犎狌犡犻狀犺狌犪 犠犪狀犵犢犪狀 犢犪狀犵犆犺狌狀犿犲犻,4 犉犲狀犵犢狌犪狀犿犻狀犵 犢犪狀犵犔犻 犜犻犪狀犼犻狀犓犲狔犔犪犫狅狉犪狋狅狉狔犳狅狉犅犻狅犿犲犱犻犮犪犾犕犲犪狊狌狉犲犿犲狀狋犜犲犮犺狀狅犾狅犵狔犪狀犱犐狀狊狋狉狌犿犲狀狋犪狋犻狅狀, 犆狅犾犲犵犲狅犳犘狉犲犮犻狊犻狅狀犐狀狊狋狉狌犿犲狀狋犪狀犱犗狆狋狅 犈犾犲犮狋狉狅狀犻犮狊犈狀犵犻狀犲犲狉犻狀犵, 犜犻犪狀犼犻狀犝狀犻狏犲狉狊犻狋狔, 犜犻犪狀犼犻狀 30007, 犆犺犻狀犪 犇犲狆犪狉狋犿犲狀狋狅犳犐狀狋犲狉狀犪犾犕犲犱犻犮犻狀犲, 犅狉狅犱狔犛犮犺狅狅犾狅犳犕犲犱犻犮犻狀犲, 犈犪狊狋犆犪狉狅犾犻狀犪犝狀犻狏犲狉狊犻狋狔, 犌狉犲犲狀狏犻犾犲, 犖犆 7858, 犝犛犃 烌 3 犇犲狆犪狉狋犿犲狀狋狅犳犘犺狔狊犻犮狊, 犈犪狊狋犆犪狉狅犾犻狀犪犝狀犻狏犲狉狊犻狋狔, 犌狉犲犲狀狏犻犾犲, 犖犆 7858, 犝犛犃 4 烆犇犲狆犪狉狋犿犲狀狋狅犳犚犪犱犻犪狋犻狅狀犗狀犮狅犾狅犵狔, 犜犻犪狀犼犻狀犕犲犱犻犪犾犝狀犻狏犲狉狊犻狋狔犆犪狀犮犲狉犎狅狊狆犻狋犪犾, 犜犻犪狀犼犻狀 300060, 犆犺犻狀犪烎 犃犫狊狋狉犪犮狋犛狋犲狉犲狅犾狅犵狔犻狊犪狀犻狀狋犲狉犱犻狊犮犻狆犾犻狀犪狉狔犿犲狋犺狅犱犳狅狉 3 犇犿狅狉狆犺狅犾狅犵犻犮犪犾狊狋狌犱狔犱犲狏犲犾狅狆犲犱犳狉狅犿犿犪狋犺犲犿犪狋犻犮狊犪狀犱犿狅狉狆犺狅犾狅犵狔. 犃狀犱犻狋犻狊狑犻犱犲犾狔狌狊犲犱犻狀犿犲犱犻犮犪犾犻犿犪犵犲犪狀犪犾狔狊犻狊犪狀犱犮犲犾 犫犻狅犾狅犵狔狊狋狌犱犻犲狊. 犜犺犲犾犪狊犲狉狊犮犪狀狀犻狀犵犮狅狀犳狅犮犪犾犿犻犮狉狅狊犮狅狆犻犮犻犿犪犵犲狊 ( 犔犛犆犕犐 ) 狅犳狋狌犿狅狉犮犲犾狊犪狉犲狇狌犪狀狋犻狋犪狋犻狏犲犾狔犪狀犪犾狔狕犲犱犫狔狌狊犻狀犵狊狋犲狉犲狅犾狅犵犻犮犪犾狆狅犻狀狋犮狅狌狀狋犻狀犵犿犲狋犺狅犱. 犜犺狉犲犲犵狉狅狌狆狊狅犳犮犲犾狊, 犅 6 犉 0, 犅 6/ 犞犲犮狋狅狉犪狀犱犅 6/ 犌犘犚 4 犮犲犾狊狊狌狊狆犲狀犱犲犱犻狀犮狌犾狋狌狉犲犿犲犱犻犪, 犪狉犲狊狋狌犱犻犲犱犪狀犱 0 犻犿犪犵犲狊犲狋狊狅犳犲犪犮犺犪狉犲狋犪犽犲狀犪狀犱狌狊犲犱犻狀狋犺犲犲狓狆犲狉犻犿犲狀狋狊. 犜犺犲狉犲狊狌犾狋狊狊犺狅狑狋犺犪狋狋犺犲犮狅狀狋狉狅犾犵狉狅狌狆犅 6/ 犞犲犮狋狅狉犺犪狊狀狅狊犻犵狀犻犳犻犮犪狀狋犱犻犳犲狉犲狀犮犲狊犪狊犮狅犿狆犪狉犲犱狑犻狋犺狋犺犲狆犪狉犲狀狋犪犾犅 6 犉 0 犮犲犾狊, 狑犺犻犾犲狋犺犲犲狓狆犲狉犻犿犲狀狋犪犾犵狉狅狌狆犅 6/ 犌犘犚 4 狊犺狅狑狊收稿日期 :0 0 6; 收到修改稿日期 :0 04 9 基金项目 : 国家自然科学基金 (80407,8734) 资助课题 作者简介 : 张莹 (988 ), 女, 硕士研究生, 主要从事生物医学光学方面的研究 犈 犿犪犻犾 : 狕犺犪狀犵狔犻狀犵犿犪犵犻犮 @ 犵犿犪犻犾. 犮狅犿导师简介 : 冯远明, 男, 博士, 教授, 主要从事医学物理学 放射肿瘤学临床及细胞光学等方面的研究 犈 犿犪犻犾 : 狔犿犳犲狀犵 @ 狋犼狌. 犲犱狌. 犮狀 ( 通信联系人 ) 09700
光学学报 significantdiferencesinthestereologicalparametersofthecelularsurfaceareatovolumeratio ( 犚狊狏犮 ) 犪狀犱狋犺犲狉犲犾犪狋犻狏犲犮犲犾狌犾犪狉犳狅狉犿犳犪犮狋狅狉 ( 犳 )( 狆 <0.05 犳狅狉犚狊狏犮, 犪狀犱狆 <0.0 犳狅狉犳, 狉犲狊狆犲犮狋犻狏犲犾狔 ), 狊狌犵犵犲狊狋犻狀犵狋犺犪狋犅 6/ 犌犘犚 4 犮犲犾狊犺犪狏犲犾犲狊狊狊狌狉犳犪犮犲狆狉狅狋狉狌狊犻狅狀狊犪狀犱狉犲犱狌犮犲犱犻狉狉犲犵狌犾犪狉犻狋狔. 犜犺犻狊犻狊犻狀犾犻狀犲狑犻狋犺狋犺犲狆狉犲狏犻狅狌狊狅犫狊犲狉狏犪狋犻狅狀狊狋犺犪狋犌犘犚 4 犻狀犺犻犫犻狋狊犿犻犵狉犪狋犻狅狀犪狀犱犻狀狏犪狊犻狅狀狅犳狋狌犿狅狉犮犲犾犻狀狋犺犲狋狉犪狀狊狑犲犾犪狊狊犪狔. 犜犺犲犮狅犿犫犻狀犪狋犻狅狀狅犳狊狋犲狉犲狅犾狅犵狔犪狀犱犾犪狊犲狉狊犮犪狀狀犻狀犵犮狅狀犳狅犮犪犾犿犻犮狉狅狊犮狅狆犻犮犻犿犪犵犻狀犵狋犲犮犺狀犻狇狌犲狊狆狉狅狏犻犱犲狊犪狇狌犻犮犽犪狀犱狌狊犲犳狌犾犿犲狋犺狅犱犻狀犮犲犾犫犻狅犾狅犵狔, 犪狀犱犲狊狆犲犮犻犪犾狔犻狀犮犲犾犿狅狉狆犺狅犾狅犵狔狊狋狌犱犻犲狊. 犓犲狔狑狅狉犱狊犿犲犱犻犮犪犾狅狆狋犻犮狊 ;3 犇犿狅狉狆犺狅犾狅犵犻犮犪犾狆犪狋犲狉狀狅犳狋狌犿狅狉犮犲犾 ; 狊狋犲狉犲狅犾狅犵狔 ; 犾犪狊犲狉狊犮犪狀狀犻狀犵犮狅狀犳狅犮犪犾犿犻犮狉狅狊犮狅狆犲 ; 犅 6 犉 0 犿犲犾犪狀狅犿犪犮犲犾狊 ; 犌狆狉狅狋犲犻狀 犮狅狌狆犾犲犱狉犲犮犲狆狋狅狉狊 4 犗犆犐犛犮狅犱犲狊 70.3880;70.530;70.790 引言 近 30 年来, 癌症的发病率一直呈上升趋势, 成为对人类生命健康危害最大的疾病之一 肿瘤的病理学检查是极其重要的肿瘤诊断方法之一, 病理学家可以通过血液细胞或组织样品的二维形态结构等给出肿瘤的性质 分级等关键信息, 为临床治疗提供重要的依据 显微镜下观察组织涂片, 肿瘤细胞的形态较正常细胞有明显的区别, 如细胞体积增大 形状不规则 核增大 核质比增大和异常分裂增殖等, 而恶性肿瘤由于其易迁移 侵袭及转移等性质, 其细胞有更多明显的形态学变化 传统的病理学检测只是依据二维空间的信息, 单一方向的二维投影丢失了大量的形态信息, 同时也缺乏客观的定量标准, 现代病理检测需要更全面 准确的形态信息, 从二维发展到三维空间信息 体视学是由二维结构信息定量推论三维结构信息, 由形态学与数学之间交叉形成的新兴学科, 具有 [] 无偏 快速 无伤和重复性高等特点 从概率统计的意义上来说, 一个三维体的二维切片包含其三维结构的定量信息 对二维取样设定一定的限制性条件, 可以实现三维形态信息的准确估计 因此体视学测量要求对所测样本以任意位置开始 任意等间距取样, 即满足均匀随机抽样原则 体视学技术是基于卡瓦列里 (Cavalieri) 原理和德莱塞 (Delesse) 原理发展起来的, 目前已有多种测量方法, 最常用的是 [] 点计数方法 该方法在获取的样本图像上叠加, 包含了无偏分布的点或线等几何图形的测量图, 统计样本图像和几何图形之间的联系, 如计数结构内点的个数等, 然后根据已有的体视学参数公式得到有用的三维形态学参数 在临床医学领域中, 体视学已经应用于各种医学图像 [ 如计算机断层扫描 (CT) 核碳共振成像 (MRI) 放射性核素扫描 (ECT) 超声等 ] 分析, 对组织 器官进行三维结构定量研究, 并依据结构和功能 [3~5] 的一致联系性, 为疾病诊断提供帮助 另外, 目前体视学方法也被用于细胞层面的多种测量, 如结 合光学显微镜图像, 实现三维目标计数, 测定细胞密 [6] 度 而少有细胞三维形态结构分析方面的应用研究 激光扫描共聚焦显微镜 (LSCM) 以其高对比度 高分辨率 无损断层成像等优点被广泛应用于细胞等各种生物微粒的研究 由于 LSCM 获取的二维图像为景深极小的 光学切片, 在沿与切片平面垂直方向连续移动样品时可获得样品不同深度层次的二维图像, 可以任意选择成像位置及成像间距, 得到细胞的二维均匀随机取样断层图像, 所得二维图像组数据满足体视学运用条件 使用体视学方法对同细胞系多个细胞的共聚焦显微图像数据进行处理和统计分析, 获得其三维结构参数, 具有重要意义, 可用于表征该类细胞的三维形态学特征 因此将体视学与激光扫描共聚焦显微镜成像测量结合, 实现细胞三维结构的快速定量分析 目前已有国外研究人员将体视学方法应用于生物研究的不同领域, 如胚胎学 组织学等 采用共聚焦显微体视学研究器 [7] 官 组织等结构和分布以及实现细胞计数 本文采用前期细胞生物实验所用小鼠黑色素瘤高转移细胞株 B6F0 及其基因表达改造后的细胞株 B6/ GPR4 及 B6/Vector 进行悬浮细胞激光扫描共聚焦显微图像采集, 并尝试运用体视学方法进行细胞三维结构特征测量 统计基因改造前后细胞三维结构参数 分析细胞三维形态变化 作为迁移性较强的肿瘤细胞,B6 类细胞很有可能脱落 侵袭进入血液循环, 以悬浮细胞形式变为循环肿瘤细胞, 因此研究悬浮状态下肿瘤细胞三维形态对肿瘤早期诊断及细胞生物学研究均具有重要意义 并将形态学测量结果与前期肿瘤细胞侵袭及迁移实验结果进行对比, 以验证体视学方法结合激光扫描共聚焦显微成像技术用于细胞三维结构分析的有效性 材料与方法. 细胞图像获取本研究工作所用的细胞来源于美国模式培养物 09700
张 莹等 体视学与激光共聚焦显微镜图像分析黑色素瘤细胞三维形态学参数的变化 集 存 库 ＡＴＣＣ 的 小 鼠 黑 色 素 瘤 高 转 移 细 胞 Ｂ１６１０ 实验 组 Ｂ１６ ＧＰＲ４ 细 胞 是 将 人 类 Ｇ 蛋 白 显微镜 Ｚ ｓ ｓｌｓｍ５１０ Ｚ ｓ ｓ Ｇ ｍａｙ 对 全 细 胞 进行三维 光学层 切 成 像 获 得 一 组 细 胞 二 维 图 像 耦联受体 ４ ＧＰＲ４ 基 因 片 段 稳 定 转 入 和 表 达 到 小 如图 １ 所 示 图 像 组 采 集 参 数 设 定 为 犣 方向采 鼠黑色素瘤 高 转 移 细 胞 Ｂ１６１０ 中 所 得 的 细 胞 实 样间距为 ０ ５μｍ 犡 犢 方 向 像 素 长 度 为 ０ ０７μｍ 验中的对照 组 Ｂ１６ Ｖ 细 胞 是 将 空 白 基 因 表 达 载体转入到 Ｂ１６１０ 细胞 中 所 得 的 细 胞 详 细 的 基 图像尺寸为 ５１２ｐ ｘ ５１２ｐ ｘ 由于细胞形态尺 寸的复杂性 单个 细 胞 的 有 效 共 聚 焦 断 层 图 像 层 数 因表 达 实 验 过 程 参 见 文 献 ８ 对 Ｂ１６１０ Ｂ１６ ＧＰＲ４ Ｂ１６ Ｖ 三 类 肿 瘤 细 胞 分 别 进 行 体 外 细 范围 为 ４０ ７０ 张 图 ２ 为 Ｂ１６ Ｖ 细胞和 Ｂ１６ ＧＰＲ４ 细胞的 激 光 扫 描 共 焦 显 微 图 像 从 图 中 胞培 养 ８ ９ 贴 壁 生 长 的 Ｂ１６ 细 胞 经 胰 蛋 白 酶 ＥＤＴＡ 分离后 重 新 悬 浮 在 培 养 液 中 用 于 共 聚 焦 成 可以看出 Ｂ１６ Ｖ 细 胞 有 较 多 的 突 触 和 伪 足 Ｂ１６ ＧＰＲ４ 细胞形态光滑 像研究 接着在悬浮状态下对三类细胞分别进行双荧光 染 色 利 用 ＳＹＴＯ ６１ 染 料 Ｓ１１３４３ Ｉ ｖ ｇ 对细 胞 核 染 色 在 激 光 扫 描 共 聚焦 Ｏ ｇ ＵＳＡ 显微 镜 下 被 波 长 为 ６３３ｍ 的 入 射 激 光 束 激 发 所 产生的荧光在通过边 缘 为 ６５０ｍ 波 长 的 高 通 滤 光 片后由光电倍增 管 探 测 其 １２ｂ 图 像 数 据 存 于 输 出 彩 色 图 像 文 件 的 红 色 通 道 内 用 Ｍ Ｔ ａ ｋ ７５１０ Ｉ ｖ ｇ Ｏ ｇ ＵＳＡ ａｇ 染 料 Ｍ 对线 粒 体 染 色 其 在 波 长 为 ５４３ｍ 的 入 射 激 光 束 激发 下 所 产 生 的 荧 光 在 通 过 ５６０ ６１５ｍ 波 长 的 带通滤光片后由 光 电 倍 增 管 探 测 其 １２ｂ 图 像 数 据存于输出图像文件的绿色通道内 这两种荧光染 料在细胞质区域内 都 会 产 生 弱 荧 光 信 号 但 明 显 弱 于细胞核高亮红色和线粒体高亮绿色荧光 以细胞 图 １ Ｂ１６ ＧＰＲ４ 细胞 ＬＳＣＭ 图像 外任意位置起始 固定采样间距 采用激光扫描共焦 １ ＬＳＣＭｍａｇ ｓ ｆｂ１６ ＧＰＲ４ 图 ２ 细胞 ＬＳＣＭ 图像 ａ Ｂ１６ Ｖ 细胞 ｂ Ｂ１６ ＧＰＲ４ 细胞 ２ ＬＳＣＭｍａｇ ｓ ｆ ｓ ａ Ｂ１６ Ｖ ｓ ｂ Ｂ１６ ＧＰＲ４ ｓ ２ ２ 细胞图像预处理 如图 ３ 所示 ＬＳＣＭ 得 到 的 细 胞 图 像 是 双 通 道 伪彩色图像 特异 性 荧 光 标 记 物 使 得 图 像 对 比 度 较 些杂散噪声 使用 中 值 滤 波 可 有 效 抑 制 脉 冲 噪 声 和 椒盐噪声 并能较好地保护细胞图像的边缘 好 可对所有图层进行灰度直方图统计 选择直方图 ２ ３ 体视学方法 体视学方法是基于几何概率理论的形态定量研 谷点作为阈值 去 除 图 像 背 景 荧 光 由 于 成 像 系 统 究技术 是从切片 或 截 面 影 像 中 获 得 三 维 显 微 结 构 及数据采集系统性 能 的 制 约 等 原 因 图 像 上 会 有 一 的定量工具 点计数方法使用和样本图像相同大小 ０９１７００１ ３
光 学 学 报 图 ３ Ｂ１６ ｖ 细胞 ＬＳＣＭ 图像 ａ 红色通道显示细胞核 ｂ 绿色通道显示线粒体 ａ 和 ｂ 重叠图像 ３ ＬＳＣＭｍａｇ ｓ ｆｂ１６ ｖ ｓ ａ Ｒｄｈａ ｍａｇｗ ｈｕ ｍａ ｋｄ ｂ ｇ ｈａ ｍａｇｗ ｈ ｍ ｈｄ ａｍａ ｋｄ ｖ ａｐｐｄｍａｇ ｆ ａ ａｄ ｂ 的测量图 在其上均匀分布中心对称的几何图形 如 数 为了保证参数 估 计 的 准 确 性 计 数 必 须 遵 循 一 图 ４ ５ 中符号 每个几何图形在二维图上占据一 定的原则 即有效 体 视 格 点 必 须 满 足 体 视 格 全 部 在 定的面积 三 维 空 间 则 代 表 一 定 的 体 积 称 为 体 视 目标结构范围内 或几何图形中心点被右向包围 即 格 将测量图覆盖到细胞 ＬＳＣＭ 断层 图像 上 通过 中心点右侧有目标结构像素点 如图 ４ 所示 遵照 计数结构内点的个 数 完 成 对 形 态 参 数 的 估 计 如 截 计数原则可以实现体视格的自动计数 面面积 轮廓周长 等 如 图 ５ 所 示 继 而 推 知 三 维 参 图 ４ 体视学点计数示意图 ａ 均匀随机取样 ｂ 点计数 有效格点示意 其中第一行上的 两个点被判定为无效格点 第二行上的两个点被判定为有效格点 ｕ ｇ ４ Ｓｈｍａ ｄ ａｇ ａｍ ｆｓ ｇｙｐ ｕ ａ Ｕ ｆ ｍ ａｄｍｓ ａｍｐ ｇ ｂ ｐ ｓ ｈｍａ ｄ ａｇ ａｍ ｆｖａ ｄｇ ｄｐ ｓ ｈ２ｐ ｓ ｈｕｐｐ ｗａ ｖａ ｄｗｈ ｈ２ｐ ｓ ｈ ｗ ｗａ ｖａ ｄ 图 ５ 覆盖于一幅细胞图像上的体视格和记数格点 ａ 在一幅细胞图像上放置上体视格 ｂ 落在细胞内的有效格点 由落在细胞边缘的有效格点确定的细胞轮廓线 ５ Ｓ ｇ ａ ｇ ｄ ｓａ ｄｖ ａ ｄ ｕ ｇｇ ｄｐ ｓ ｓ ｆａ ｍａ ａ Ｏ ｓ ｆ ｈ ｍａ ｖ ｄｂｙ ｇ ｇ ｓ ｇ ａ ｇ ｄｓ ｂ ｖａ ｄｇ ｄｐ ｓ ｈ ｈ ｕ ｆ ｈ ｄ ｆ ｄｂｙｖａ ｄｇ ｄｐ ｓ ｓｄｇ ０９１７００１ ４
张 莹等 : 体视学与激光共聚焦显微镜图像分析黑色素瘤细胞三维形态学参数的变化.3. 体视学准确性检测 悬浮状态的细胞取向各异, 随机选择细胞, 自下而上断层扫描, 多样本数据统计分析满足概率统计均匀随机取样原则, 可以应用体视学方法统计细胞三维参数 采用误差系数 ε 来衡量参数估计的总误差 目前公认的标准为当 ε 值小于 5% 时认为参数 [0] 估计结果是可靠的 本文采用点计数方法, 误差主要由两部分组成 : 一是体视格有效点计数造成的误差 (εnoise), 另一项则是因采样间距不同带来的误差 (εsrs) 在本实验所用细胞 LSCM 断层图像采样中, 固定步长设置为 0.5μm, 体视学则可以均匀抽取不同数量断层图像进行点计数, 如选用所有图层的全计数 间隔一层取样的二分之一计数等, 均满足均匀随机取样原则 结果的准确性和体视格大小及切片间距相关, 断层图像间隔越大, 或体视格越大, 点计数结果和真实结构差别越大, 准确性越低, 但相应的计算时间减少 对数据准确性的检测, 体视学有基于概率统计的检测标准, 误差计算公式为 犫 εnoise =0.0543 槡狊 狀狀 犘犻, () 槡 式中参数犫为形状系数, 其中犫为待测量结构平均槡狊周长, 狊为平均面积 参数狀为采样层数, 而犘为该层面上有效点数 : εsrs = 3 ( 犃 -εnoise)-4 犅 + 犆, () 狀狀 - 狀 - 式中犃 = 犘犻犘犻, 犅 = 犘犻犘犻 +, 犆 = 代表在第犻张截面图上体视格有效点的数量 : ε= 槡.3. 体视学参数选择 εsrs +ε nosie 狀 犘犻 犘犻犘犻 +, 犘犻. (3) 体视学用各种参数来表征三维结构, 如表征大小的尺寸参数 表征分布的密度参数 表征结构的形状参数等 参数的选择依研究目的而定 本实验分别测量和计算了三类细胞的平均体积犞 c 细胞核的平均体积犞 n 细胞比表面犚 svc 和细胞形状因子犳等 细胞比表面是细胞表面积犛 c 与体积犞 c 之比, 可以表示结构的尺寸大小, 甚至和细胞生理情况相关 细胞形状因子是另一个体视学常用的反映细胞形状的参数, 单层细胞截面图像的形状因子可以表示截面形状与圆相差的程度 圆的形状因子为 ; 越不规则, 形状因子越大 统计所有取样截面上细 胞的形状因子可以表征细胞三维形状的不规则性 本研究无需计算细胞形状因子绝对数值, 因此以 0 组 B6/GPR4 细胞的平均形状因子为参考标准, 测量和计算所有细胞的相对形状因子 上述体视学参 数的计算公式为 [0,] 狀犞 c = 犱 ( 犘 c 犻犪 ), (4) 狀犞 n = 犱 ( 犘 n 犻犪 ), (5) 犛 c = 4 狀犱 π 犅 c 犻 = 4 狀 π 犱 π 犘 c 犻 ( 犪, (6) ) 犛 c 犚 svc = = 犞 c 狀 4 π 狀 犅 c 犻 ( 犘 c 犻犪 ), (7) 犳 = 狀 犅 c 犻犖 4π 犘 c 犻犪, ( 8) 犻 = 式中犱为截面图像间距, 犘 c 犻, 犘 n 犻分别为第犻层细胞 和细胞核的有效格点数, 犪为像素点的实际边长, 犪 为像素点的面积 ; 犅 c 犻则为第犻层细胞等效周长, 用几何概率可以证明, 实际细胞周长和有效格点周长 犘 c 犻犪存在 π/ 的比例关系, 而细胞实际表面积犛 c 和切片周长之间有比例系数 4/π; 犖为有效细胞图像层数 3 实验结果 3. 准确性估计 分别对本研究选用的 B6F0 B6/GPR4 B6/Vector 三类细胞的全细胞和细胞核图像取不同大小的体视格, 即设置相邻体视格中几何图形中心点间隔分别为 0~30pixel 不等, 计算估计值的误差系数 ε 值 表 为对包含细胞质 细胞核等结构的全细胞图像 ε 值的计算结果, 表 为对细胞核图像 ε 值的计算结果 实验数据显示, 几种情况下的 ε 值都远远小于 5%, 即应用体视学方法, 在所列相邻体视格中几何图形中心点间隔范围为 0~ 30pixel 之间时, 测得的三维结构参数数据均可靠 由表 可见, 当选取的间隔越小, 所得 ε 值越小, 亦即测量精度越高, 但有效格点判断的复杂程度以及计算时间会相应增加 实验研究表明对应于间隔为 30pixel 和 0pixel 时计算时间相差 5 倍 为平衡复杂程度和测量结果的准确性, 实验中采用间隔 30pixel 和间隔 5pixel 的体视格分布分别计算形态学参数, 并求取平均值作为最终结果 09700 5
光学学报 表 对包含细胞质 细胞核等结构的全细胞图像 ε 值计算结果 Table Calculatedεvaluesofdiferentstereologicalgridsforcelscontainingcytoplasmandcelnuclei Cel Intervalofadjacentgrids/pixel 30 5 0 5 0 B6F0/% 0.695 0.5 0.378 0. 0.09 B6/GPR4/% 0.534 0.447 0.365 0.98 0.60 B6/Vector/% 0.653 0.598 0.56 0.38 0.04 表 对细胞核图像 ε 值计算结果 Table Calculatedεvaluesofdiferentstereologicalgridsforcelnuclei Cel Intervalofadjacentgrids/pixel 30 5 0 5 0 B6F0/%.338.04 0.75 0.558 0.344 B6/GPR4/%.09 0.786 0.54 0.39 0.46 B6/Vector/%.070 0.98 0.753 0.574 0.36 3. 体视学参数数据对上述三类细胞分别随机选取 0 组 ( 以单个细胞所有三维断层图像为一组 ) 细胞激光扫描共焦显微镜三维断层扫描图像进行体视学统计分析, 获得 体视学参数数据如表 3 所示 为检验用体视学方法计算所得数据的正确性, 将前期细胞三维重建测量形态研究中得出的相应数据列于表 4, 以便比较和分析 表 3 细胞三维参数体视学测量结果及统计分析 Table3 Measuredvaluesof3Dcelstereologicalparametersandstatisticalanalysis 犞 c/ μ m 3 犞 n/ μ m 3 B6F0 3556±5 995±36 0.50±0.080.084±0.055 B6/Vector 3786±940 0±307 0.53±0.06.09±0.007 B6/GPR4 3874±608 056±39 0.474±0.04.000±0.0 狆 value(b6f0versusb6/vector) >0. >0. >0.05 >0.05 狆 value(b6/vectorversusb6/gpr4 ) >0. >0. <0.05 <0.0 狆 value(b6f0versusb6/gpr4) >0. >0. <0.05 <0.0 狆 :probabilitytorejecttheassumptionthattwoindependentsamplesaresignificantlydiferent 犚 svc 犳 表 4 细胞三维重建后形态参数测量结果及统计分析 Table4 Measuredvaluesofcelparametersthrough3Dreconstructionandstatisticalanalysis 犞 c/ μ m 3 犞 n/ μ m 3 B6F0 89±70 858±9 0.57±0.078 B6/Vector 94±889 887±6 0.57±0.066 B6/GPR4 307±758 979± 0.470±0.048 狆 value(b6f0versusb6/vector) >0. >0. >0.05 狆 value(b6/vectorversusb6/gpr4) >0. >0. <0.05 狆 value(b6f0versusb6/gpr4) >0. >0. <0.05 狆 :probabilitytorejecttheassumptionthattwoindependentsamplesaresignificantlydiferent 由于体视格几何图形形状及分布的不同会有偏差, 绝对数值的参数, 如细胞平均体积 ( 犞 c) 核平均体积 ( 犞 n) 等, 通常用作参考 而且, 本实验的三种细胞本质属于同种细胞, 全细胞绝对体积及细胞核绝对体积数据区别不明显 ( 狆 >0.) 对照细胞三维重建后参数数据, 体视学方法对细胞及细胞核体 积计算有较大数值差异 ( 大于 0%), 但与重建后细胞参数保持一致的特征, 即三类细胞体积结果没有明显区别 ( 狆 >0.) 细胞比表面 ( 犚 svc) 反映细胞膜表面的光滑程度, 表 3 数据表明,B6F0 和 B6/Vector 差别不明显 ( 狆 >0.05), 而 B6/GPR4 的犚 svc 显著小于 犚 svc 09700 6
张 莹等 : 体视学与激光共聚焦显微镜图像分析黑色素瘤细胞三维形态学参数的变化 B6F0 和 B6/Vector 的犚 svc( 狆 <0.05) 表 4 中相应三维重建后细胞比表面犚 svc 参数数据和体视学 犚 svc 数值接近 ( 小于 7%), 且特征一致 以 B6/ GPR4 为标准的相对形状因子犳可以表现三类细胞间的形状差异 实验数据表明,B6F0 和 B6/ Vector 细胞的这个参数都大于 B6/GPR4 细胞的同一参数 ( 犳 =), 与 B6/GPR4 相比均有明显差异 ( 狆 <0.0), 表明它们的三维形态更不规则 4 讨论 GPR4 是 G 蛋白耦联受体 (GPCRs) 的一种 G 蛋白耦联受体是一类特殊的蛋白质家族, 是细胞跨膜信号传导的介质 它可以与激素 神经递质 光和气味分子等小分子物质发生相互作用, 将信息传递到膜内, 对细胞功能的调节起着重要的作用 人类很多重大疾病的发生往往都与 GPCR 功能紊乱有关 研究证明,G 蛋白耦联受体的异常表达和失调 [3,4] 与癌症迁移 侵袭及转移等密切相关 就形态学参数而言, 恶性肿瘤细胞分裂繁殖较快 迁移性较强, 三维形状不规则 会有较多的突出伪足等, 会有较大的细胞比表面及相对较大的形状因子 本课题组研究发现,B6/GPR4 的细胞形态较规则 细胞膜相对更光滑, 更少突出或伪足等类似结构, 形状因子及细胞比表面等体视学参数均显著小于空白基因表达载体改造细胞 B6/Vector 和原始细胞 B6F0 的相应参数 ; 而将 B6/Vector 与 B6F0 比较, 形态学参数未发现有显著差异 由图 3 可见, 伪足内部像素红色通道和绿色通道内的着色强度与细胞内部细胞质各自通道内的着色强度完全一致, 没有显示任何膜质存在于两者之间, 表明均为同一细胞内的细胞质的可能性很高, 基本排除伪足为残渣的可能性 根据结构和功能相关一致原理, 可以推测 GPR4 基因对细胞生理造成的影响, 可能抑制肿瘤细胞迁移 侵袭及转移等性质 这与前期 Transwel 小室细胞侵袭及迁移实验结果相吻 [8] 合 通过对体视学方法所得细胞形态特征参数 ( 表 3) 和三维重建后特征参数 ( 表 4) 数据比较可见, 用体视学方法测得的参数与前期采用三维重建测量所得参数, 在反映细胞形态特征上具有很好的一致性 体视学方法可以有效获得细胞形态特征参数 体视学和共焦显微镜细胞三维断层图像结合可以实现单细胞三维结构参数的快速测量 分析了经生物基因改造的黑色素瘤细胞功能性改变引起的形 态改变, 即应用体视学方法测量细胞共聚焦显微断层图像并有效统计分析单细胞形态结构 5 结论 体视学和激光扫描共焦显微镜细胞成像技术的有机结合, 提供了比二维投影更全面更丰富的形态结构信息, 和直接三维重建的三维分析相比计算时间要小得多 因此, 可以实现细胞三维结构参数的快速获取 而且, 基于概率统计规律, 体视学参数数据在较多样品量情况下可以获得细胞的特征参数 因此, 针对肿瘤细胞的体视学分析可以作为肿瘤细胞分析的辅助工具, 为肿瘤的诊断提供帮助 体视学和激光扫描共聚焦显微成像技术的多项优势结合, 将可以为细胞生物学及其它与细胞形态学分析相关联的研究提供一个有效的方法 参考文献 ShenHong,ShenZhongying.PracticalTechniqueofBiomedical Stereology [M].Guang Zhou:Sun Yat sen University Press, 99.~3 申洪, 沈忠英. 实用生物体视学技术 [M]. 广州 : 中山大学出版社,99.~3 H.J.G.Gundersen,P.Bagger,T.F.Bendtsen 犲狋犪犾..The new stereologicaltools:disector,fractionator,nucleator and pointsampledinterceptsandtheiruseinpathologicalresearchand diagnosis[j]. 犃犘犕犐犛,988,96(7 ):857~88 3S.Kabay,H.Ozden,M.Yucel 犲狋犪犾..Estimationofthetumor volumeandvolumeratiooncomputedtomographyin patients withrenalcelcarcinoma:astereologystudy [J]. 犑. 犎犲犪犾狋犺犛犮犻犲狀犮犲,007,53(6):664~670 4O.Yoruk,S.Dane,H.Ucuncu 犲狋犪犾..Stereologicalevaluation oflaryngealcancersusingcomputedtomographyviathecavalier method:correlationbetweentumorvolumeandnumberofneck lymphnode metastases[j]. 犑. 犆狉犪狀犻狅犳犪犮犻犪犾犛狌狉犵犲狉狔,009, 0(5):504~507 5G.Ak,M.Metintas,S.Metintas 犲狋犪犾..Three dimensional evaluation of chemotherapy response in malignant pleural mesothelioma[j]. 犈狌狉. 犑. 犚犪犱犻狅犾狅犵狔,00,74():30~35 6C.Hercher,M.Parent,C.Flores 犲狋犪犾..Alcoholdependence relatedincreaseofglialceldensityintheanteriorcingulatecortex ofsuicidecompleters[j]. 犑. 犘狊狔犮犺犻犪狋狉狔牔犖犲狌狉狅狊犮犻犲狀犮犲,009, 34(4):8~88 7L.Kubinova,J.Janacek,P.Karen 犲狋犪犾..Confocalstereology and image analysis: methods for estimating geometrical characteristicsofcelsandtissuesfromthree dimensionalconfocal images[j]. 犘犺狔狊犻狅犾. 犚犲狊.,004,53(S):S47~S55 8R.D.Castelone,N.R.Lefler,L.Dong 犲狋犪犾..Inhibitionof tumorcelmigrationandmetastasisbytheproton sensinggpr4 receptor[j]. 犆犪狀犮犲狉犔犲狋犲狉狊,0,3():97~08 9A.E.Ekpenyong,JunhuaDing,LiV.Yang 犲狋犪犾..Studyof3D celmorphologyandefectonlightscateringdistribution [C]. 犛犘犐犈,,009,7367:7367_J 0ZhenFusheng.CelStereological Morphometry [M].Beijing: UnitedPressofPeking Medical Universityand Peking Union MedicalColege,99.0~80 郑富盛. 细胞形态立体计量学 [M]. 北京 : 北京医科大学 中国协和医科大学联合出版社,99.0~80 09700 7
光学学报 YangJianru,ChenYue,GuanZengwei 犲狋犪犾..Thestudyonthe formfactorofthebreastcancercelmorphologicalquantitative analysis[j]. 犆犺犻狀犲狊犲犑. 犕犲犱犻犮犪犾犐犿犪犵犻狀犵犜犲犮犺狀狅犾狅犵狔,000, 6():30~3 杨建茹, 陈跃, 管增伟等. 对乳腺癌细胞形态定量分析中形状因子参数的研究 [J]. 中国医学影像技术,000,6(): 30~3 M.Mazonakis,K.Pagonidis,T.Schlosser 犲狋犪犾..Stereological estimationofleft ventricularvolumetricandfunctionalparameters from multidetector rowcomputedtomographydata[j]. 犈狌狉. 犑. 犚犪犱犻狅犾狅犵狔,008,8(7):338~349 3E.A.Ariazi,E.Brailoiu,S.Yerrum 犲狋犪犾..The G protein coupled receptor GPR30 inhibits proliferation of estrogen receptor positivebreastcancercels[j]. 犆犪狀犮犲狉犚犲狊犲犪狉犮犺,00, 70(3):84~89 4L.S.Singh, M.Berk,R.Oates 犲狋犪犾..Ovarian cancer G protein coupledreceptor,anew metastasissuppressorgenein prostatecancer[j]. 犑. 犖犪狋犻狅狀犪犾犆犪狀犮犲狉犐狀狊狋犻狋狌狋犲,007,99(7): 33~37 栏目编辑 : 韩 峰 09700 8