版本号 170912.1 识别码 PMC048 KT110700110 KT110700150 (YK001A/B) 亿康基因
目录 产品描述...2 产品原理... 2 规格成分... 2 储存条件... 3 预期用途... 3 注意事项... 3 安全信息... 3 需要用户准备的材料... 4 产品特点... 4 适用领域... 5 样本要求... 5 实验准备... 6 操作流程概要... 7 详细操作流程... 8 参考文献... 13 问题解决方案... 14 1
产品描述 MALBAC 单细胞全基因组扩增试剂盒能够在 4 小时内, 从单细胞 单条染色体或者等量 DNA( 如 0.5pg gdna) 中有效扩增出 2~5µg 的全基因组 DNA 本试剂盒也可用于其他 DNA 模板量有限的情况, 例如, 少于百个细胞或低于 ng 级的 DNA 对于大多数的哺乳动物细胞, 例如, 单个胚胎卵裂球 极体 单细胞 精子, 本试剂盒均可获得 95% 以上的基因扩增成功率, 并可实现 AT-GC 富集区的成功扩增 本试剂盒可从微量样本中进行高度重复的扩增, qpcr 的 Ct 值经多个单细胞重复反应后均可得到大于 0.9 的相关系数 本试剂盒能够扩增 90% 以上的基因组, 产物可用于多个分析平台, 例如实时定量 PCR 和高通量测序 产品原理 本产品可实现高度均一的全基因组扩增, 其核心技术为多次退火环状循环扩增 (MALBAC) 技术 [1], 该技术利用独特的具有链置换活性的 DNA 聚合酶进行准线性的全基因组预扩增, 再通过 PCR 技术进行指数式扩增, 为下游分析提供充足的实验材料 规格成分 组分标签名 KT110700110 KT110700150 细胞裂解液 ( 不包含酶 ) Cell Lysis Buffer 100 300 细胞裂解酶 Cell Lysis Enzyme 10 30 预扩增缓冲液 Pre-Amp Buffer 300 750 X 2 预扩增酶 Pre-Amp Enzyme Mix 10 50 扩增缓冲液 Amplification Buffer 300 750 X 2 扩增酶 Amp Enzyme Mix 8 40 2
储存条件 -20 储存,24 个月 可以按需求进行分装冻存, 避免反复冻融 预期用途本产品可用于单细胞或其他微量样本中 DNA 提取和全基因组扩增, 扩增产物可用于实时定量 PCR 高通量测序等技术平台 本试剂盒的扩增产物也可用于多种下游实验 : 基因点突变分析检测单核苷酸多态性 (SNP) 基因分型基因拷贝数 (CNV) 分析微阵列比较基因组杂交 (Array CGH) SNP 芯片技术注意事项本产品仅供科学研究使用, 不得用于临床医学诊断及其他非合理用途 安全信息使用本试剂盒进行实验操作时, 请穿着实验防护服, 戴好一次性手套和防护眼镜, 务必做好生物安全防护措施 如需更多安全信息, 请查阅材料安全数据表 3
需要用户准备的材料 产品特点 序号名称序号名称 1 无核酸酶水 6 微型离心机 2 1.5mL,200μL 离心管 7 漩涡混和仪 3 移液器 8 紫外分光光度计 4 移液器吸头 9 PCR 仪 5 1 PBS 缓冲液 单细胞经扩增后可获得 2~5µg 的 DNA 产物 ; 单管操作 3 步完成 仅需 4 小时 中间产物无需纯化 ; 可从流式分选出的细胞或 0.5pg 级 DNA 中扩增出全基因组 DNA, 且成功率达 95% 以上 ; 可在 AT-GC 富集区得到准确 高重复度的连续扩增结果 ; 全基因组覆盖度高, 仅存在 <10% 的等位基因丢失 适用领域 MALBAC 单细胞全基因组扩增试剂盒的适用范围十分广泛, 多种原始材料和微量样本均可通过该试剂盒进行全基因组扩增, 包括基因组 DNA 新鲜或干燥的血液 新鲜或冷冻的组织 司法痕量物证等材料 4
本产品适用的领域有 : 人和动物研究 生物标志物研究 (CNVs SNVs) 体外受精胚胎植入前基因筛查和诊断 (PGS/PGD) 转基因动物基因分型胚胎和干细胞单精子 卵细胞研究, 神经元细胞等研究 肿瘤研究体细胞遗传变异分析肿瘤进化和发展肿瘤干细胞循环肿瘤细胞 (CTCs) 微生物研究宏基因组学研究微生物基因分型 样本要求 1. 样本起始量 本试剂盒是针对单细胞的全基因组扩增设计的, 同时适用于起始模板量为单染色体或范围在 0.5pg~1 ng 级的基因组 DNA 5
2. 样本收集方式 通过流式细胞仪分选, 缓冲液稀释, 显微操作和激光显微切割等方式获得的单细胞均可利用本试剂盒进行全基因组扩增 此外, 本试剂盒也适用于经过多聚甲醛固定或激光显微切割的组织细胞样本 3. 样本预处理 为避免细胞准备过程中外源 DNA 的污染, 建议在实验前对细胞进行清洗, 清洗液为不含 Mg 2+ 和 Ca 2+ 的 1 PBS 溶液, 需注意, 确保后续实验中的 PBS 溶液的体积不超过 2 µl 实验准备 1. 预扩增样本准备区的隔离 为避免样本受外界因素干扰或 DNA 扩增产物的污染, 在扩增前, 预扩增样本的准备过程需在单独隔离的实验室或专门工作区完成, 并预备专用的实验材料和仪器, 例如, 移液器 移液管 PCR 管 1.5mL 的离心管 离心管架 离心机 漩涡混和仪和实验服等 ; 请将 DNA 扩增产物与预扩增试剂分开储存 ; 所有的下游分析处理, 如 DNA 纯化 测序前的准备工作, 请 在另一实验室中进行 2. 对照组 DNA 样本 (5 μl) 阳性对照配置 : 用无核酸酶水将 DNA 存储液稀释为 30pg/μL 的 DNA, 取 30 pg/μl DNA 溶液 1 μl, 加入含 4 μl Cell Lysis Buffer 的 PCR 管中, 作为阳性对照 6
阴性对照配置 : 取 1μL 无核酸酶水, 加入到含 4μL Cell Lysis Buffer 的 PCR 管中, 作为阴性对照 操作流程概要 细胞裂解 预扩增 指数式扩增 2-5ug DNA 体积 =5 μl 体积 =35 μl 体积 =65 μl 步骤一 : 细胞裂解 步骤二 :MALBAC 预扩增 步骤三 : 指数式扩增 1. 准备细胞裂解混合液 2. 将细胞加至裂解混合液 3. 在 PCR 仪中进行裂解反应 1. 准备预扩增混合液 2. 将 30μL 预扩增混合液加至 步骤一 细胞裂解液中 3. 在 PCR 仪中进行预扩增反应 1. 准备扩增混合液 2. 将 30μL 指数扩增混合液加至 步骤二 的扩增产物中 3. 在 PCR 仪中进行扩增反应 7
详细操作流程 注意 : 由于单细胞全基因组扩增实验全程在同一 PCR 管中进行且反应体积较小, 因此加液操作时, 移液器吸头 不要接触管中液体, 避免将单细胞或 DNA 裹挟出反应体系 ; 移液时, 请沿管壁小心添加, 勿吹打 PCR 管中液 体 ; 反应前, 请进行短暂离心 ( 微型离心机,2000 转,3-4 秒 ), 确保反应体系中的液体混和均匀 使用前请将细胞裂解酶 预扩增酶和扩增酶置于冰浴中, 其他组分可在用前置于冰上解冻 步骤一 : 细胞裂解 1. 根据反应的数量 (N), 混和 Cell Lysis Buffer 和 Cell Lysis Enzyme, 用于准备细胞裂解混合液 反应体系如下表 : 细胞裂解混合液 体积 Cell Lysis Buffer ( 蓝盖 ) 5µLx N Cell Lysis Enzyme ( 蓝盖 ) 0.1 µlx N 总体积 5.1 µlx N 2. 将单细胞收集在含有 5µL 细胞裂解混合液的 PCR 管中 ( 含有单细胞样本的 PBS 溶液体积不得超过 1µL) 8
3. 在预热的 PCR 仪中孵育样本, 条件如下表 : 循环温度时间 步骤二 :MALBAC 预扩增 1 50 50 分钟 80 10 分钟 4 维持 4. 根据反应的数量 (N), 混和 Pre-Amp Buffer 和 Pre-Amp Enzyme Mix, 用于准备预扩增混合液 预扩增混合液 体积 Pre-Amp Buffer ( 绿盖 ) 30 µlx N Pre-Amp Enzyme Mix ( 绿盖 ) 1 µlx N 总体积 31 µlx N 5. 在 5µL 的细胞裂解产物或对照组 DNA 样本中加入 30µL 预扩增混合液 ( 此时反应总体积为 35µL) 6. 在 PCR 仪中扩增, 反应条件如下 : 9
循环 温度 时间 1 94 3 分钟 20 40 秒 30 40 秒 40 30 秒 8 50 30 秒 60 30 秒 70 4 分钟 95 20 秒 58 10 秒 1 4 维持 7. 立即进行下一步指数式扩增 步骤三 : 指数式扩增 8. 根据反应的数量 (N), 混和 Amplification Buffer 和 Amp Enzyme Mix, 准备扩增混合液 扩增混合液 体积 Amplification Buffer ( 红盖 ) 30 µlx N Amp Enzyme Mix ( 红盖 ) 0.8 µlx N 总体积 30.8 µlx N 10
9. 在 35µL 的预扩增产物中加入 30µL 扩增混合液 ( 此时溶液总体积为 65µl) 10. 在 PCR 仪中进行扩增, 反应条件如下 : 循环温度时间 1 94 30 秒 17* 94 20 秒 58 30 秒 72 3 分钟 1 4 维持 * 说明 : 对于 100pg 的 gdna, 我们建议设定 14 个循环 ; 对于流式分选等方式获得的单细胞, 设定 17 个循环 ; 对于 单染色体, 设定 19-21 个循环 ; 对于其他种类的细胞或其他方式获得的样本, 建议在 PCR 前, 对循环次数 进行优化 扩增产物检测 1. 琼脂糖凝胶电泳取 5ul 扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳 (1% 琼脂糖凝胶,110V,25-35 分钟 ), 扩增产物大小为 300~2000bp, 产物电泳如图 2 所示 2. Nanodrop 定量对扩增产物进行纯化, 纯化产物使用 Nanodrop 进行定量, 终产量为 2-5ug 11
M:DM 2000 DNA ladder;1: 阴性对照 ;2: 阳性对照,30pg 的人类基因组 DNA;3: 单细胞扩增产物 ;4: 单细胞扩增产物 ( 重复 ) 产物保存 纯化产物请保存于 -20 12
参考文献 1. C. Zong, S. Lu, A.R. Chapman, X.S. Xie. Genome-Wide Detection of Single-Nucleotide and Copy Number Variations of a Single Human Cell. Science, 2012, 338, 1622-1626. 2. Lu S, Zong C, Xie XS, et al. Probing Meiotic Recombination and Aneuploidy of Single Sperm Copy Number Variations of a Single Human Cell. Science, 2012, 338, 1622-1626. 3. Hou Y, Fan W, et al. Genome Analyses of Single Human Oocytes. Cell, 2013, 155(7):1492-506.(Meiotic Recombination) 4. Ni X, Zhuo M, Xie XS, et al.reproducible copy number variation patterns among single circulating tumor cells of lung cancer patients. PNAS, 2013, 110(52):21083-8. 5. Yu Z, Lu S, Huang Y. Microfluidic whole genome amplification device for single cell sequencing. Anal. Chem., 2014 Oct 7; 86 (19):9386-90. 6. Huang J, Yan L, Xie XS, Qiao J, et al. Validation of multiple annealing and looping-based amplification cycle sequencing for 24-chromosome aneuploidy screening of cleavage-stage embryos. Fertil. Steril., 2014, Dec;102(6):1685-91. 13
问题解决方案 问题原因措施 无扩增产物 扩增产物含量低 阴性对照产生了与单细胞全基因组扩增相似的产物 样本在收集过程中丢失 起始样本中含有的聚合酶抑制剂可能是导致全基因组扩增反应失败的原因 酶失活 样本中含有聚合酶抑制剂 基因组 DNA 降解 试剂被外源性 DNA 污染 操作台被外源性 DNA 污染 阴性对照溶液被外源性 DNA 污染 重新收集样本, 确保操作正确建议实验前应使用不含 Ca2+ Mg2+ Mo2+ 或肝素等成分的 1 PBS 缓冲液对细胞进行清洗, 确保样本中不含有聚合酶抑制剂试剂盒中所有的组份都应该在 -20 的条件下保存 ; 试剂复融过程需在冰上进行, 避免反复冻融建议实验前应使用不含 Ca2+ Mg2+ Mo2+ 或肝素等成分的 1 PBS 缓冲液对细胞进行清洗, 确保样本中不含有聚合酶抑制剂避免细胞因储存方法或准备方法不当造成 DNA 的降解, 影响扩增效率 避免试剂盒的组份与扩增产物接触, 并使用无核酸酶和无核酸污染的实验耗材进行单细胞全基因组扩增, 建议实验前应使用不含 Ca2+ Mg2+ Mo2+ 或肝素等成分的 1 PBS 缓冲液对细胞进行清洗, 确保不含有外源 DNA 污染 使用防核酸污染试剂彻底清理操作台使用新阴性对照 14