2014 年 9 月 Vol.32 No.9 September 2014 Chinese Journal of Chromatography 992 ~ 998 研究论文 DOI: 10.3724 / SP.J.1123.2014.06016 高效液相色谱 三重四极杆质谱同时测定与筛查海洋浮游藻类中的 5 种色素 郑立洋, 陈娟娟, 徐继林, 周成旭, 严小军 ( 宁波大学海洋学院, 浙江宁波 315211) 摘要 : 对海洋藻类色素的高效液相色谱 三重四极杆质谱 (HPLC QqQ MS) 分析方法的有效性进行了验证 该方法 采用 C 16 氨基色谱柱为固定相, 以甲醇 乙腈和乙酸铵为流动相, 在选择反应监测模式下对叶绿素 a 叶绿素 b β,β 胡萝卜素 叶黄素和岩藻黄素的含量进行了测定 结果表明,5 种色素标准品的线性关系良好, 相关系数 ( r 2 ) 均高 于 0 996, 回收率在 82 77% ~ 99 83% 之间, 日内和日间精密度的相对标准偏差 (RSD) 均小于 5% ( n = 5); 方法的检 出限 (LOD) 在 0.02~ 0 16 μg / L 之间, 定量限 (LOQ) 在 0 06 ~ 0 54 μg / L 之间 利用该方法对 11 种藻类中 5 种色 素的含量进行分析, 比较了赤潮异弯藻 卡罗藻 微小原甲藻 微拟球藻 蛋白核小球藻 颗石藻 定鞭金藻 中肋骨 条藻 威氏海链藻和假微型海链藻之间的物种色素分布情况 该方法具有简单 灵敏度高 重复性好 回收率高等 优点, 适合藻类色素分析, 为进行藻类生物量计算提供了分析手段 关键词 : 高效液相色谱 三重四极杆质谱 ; 色素 ; 海洋浮游藻类 中图分类号 :O658 文献标识码 :A 文章编号 :1000 8713(2014)09 0992 07 Simultaneous determination and screening of five pigments in marine phytoplanktons by high performance liquid chromatography triple quadrupole mass spectrometry ZHENG Liyang, CHEN Juanjuan, XU Jilin, ZHOU Chengxu, YAN Xiaojun (School of Marine Sciences, Ningbo University, Ningbo 315211, China) Abstract: A quantitative method based on high performance liquid chromatography coupled with electrospray ionization tandem triple quadrupole mass spectrometry ( HPLC ESI QqQ MS) has been established for five pigments in marine phytoplanktons. The HPLC method used terna ry solvent systems and a reversed phase C 16 amide column. In addition, methanol, acetonitrile and aqueous ammonium acetate were used as mobile phases. Five pigments ( chlorophyll a, chlorophyll b, β, β carotene, lutein and fucoxanthin) were quantified in selective reaction mode. As results, good linear relationships were achieved between the concentrations and the peak areas of the five pigment standards. And their correlation coefficients ( r 2 ) were higher than 0 996. The recoveries of the pigment standards were between 82 77% and 99 83%. The inter day and intra day precisions were lower than 5% (n = 5). The detection limits of the pig ments for this method were between 0.02 and 0 16 μg / L and the quantification limits were in the range from 0 06 to 0 54 μg / L. According to the above method, eleven algae (Heterosigma akashiwo ( NMBRah03 2), Heterosigma akashiwo ( NMBRah03 2 2), Karlodinium veneficum ( NMBjah047 1 ), Prorocentrum minimum ( NMBjah042 ), Nannochloropsis oceanic ( NMBluh014), Chlorella pyrenoidosa ( NMBluh015 1), Pleurochrysis sp. ( NMBjih026 1), Prymnesium sp. ( NMBjih029), Skeletonema costatum ( NMBguh004 1), Thalassiosira weiss flogii ( NMBguh021) and Thalassiosira pseudonana) ( NMBguh005)) have been investigated 通讯联系人.E mail:chenjuanjuan@ nbu.edu.cn. 基金项目 : 国家自然科学基金项目 (31172448); 宁波市科技攻关项目 (2013C10014); 浙江海洋技术创新团队项目 (2010R50029, 2012R10029); 宁波市海洋藻类技术创新团队项目 (2011B81007). 收稿日期 :2014 06 12
第 9 期郑立洋, 等 : 高效液相色谱 三重四极杆质谱同时测定与筛查海洋浮游藻类中的 5 种色素 993 for comparing the pigment distributions. The method is sensitive, accurate, reproducible, and useful for the study of alga compositions. Key words: high performance liquid chromatography triple quadrupole mass spectrometry ( HPLC QqQ MS); pigments; marine phytoplanktons 海洋浮游藻类是海洋的初级生产者, 在物质循 环与能量转换 海洋食物网结构的基础环节, 在海洋 生态系统的过程中起到至关重要的作用 [1] 浮游 藻类色素已被证实为浮游植物分类的重要化学分类 标志物 [2], 并被应用于传统显微镜镜检难以确定的 微型浮游藻和由于过滤损失或预处理易被破坏的微 藻种类鉴别中 [3] 浮游藻类色素主要分为 3 类 : 叶 绿素 类胡萝卜素和藻胆蛋白, 其中叶绿素 a 普遍存 在于所有藻类细胞中并被广泛用作测定生物量的标 志物, 叶绿素 b 和叶黄素被认为是绿藻的特征色 素,β,β 胡萝卜素广泛存在于海洋浮游藻类中, 岩藻 黄素被认为是硅藻的特征色素 [4,5] ; 这 5 种色素对 海洋藻类生物量研究具有重要意义 如今, 采用高效液相色谱 ( HPLC) 分析色素的 方法已广泛应用于调查研究海洋藻类组成和浮游藻 类群生物量, 一次运行可分离超过 50 种色素且具有 较好的分离度, 实现了自动快速对样品进行定性定 量分析 [6] HPLC 分析浮游藻类色素的方法已被应 用于确定浮游藻种类 评估自然水体中浮游藻生物 量和生物多样性等 [7] 现已发展多种用于 HPLC 分离的色谱柱 :C 8 色谱柱 [8,9] C 18 色谱柱 [10-12] C 30 [13] 色谱柱和 C 16 氨基色谱柱 [6] C 18 色谱柱对极性 叶绿素和二乙烯基叶绿素的分离效果不好,C 30 色谱 柱常被用于食品色素分析而在浮游藻类色素分析上 有局限性 [13] [6] 2011 年,Jayaraman 等首次使用反 相 C 16 氨基色谱柱 C 16 氨基色谱柱最初是为药物制 备纯化和分析而设计, 以其酰胺官能团特有的性质 使得 C 16 氨基色谱柱在承受高比例含水流动相 分 离物质极性范围 洗脱能力等方面优于 C 8 色谱柱和 C 18 色谱柱 自然界中色素种类繁多 化学结构相 似 极性差别大等给 HPLC 分离带来了难度 HPLC MS 技术可以为这类结构类似物提供更多 更 有价值的色谱与电子光谱数据 [14] ; 该技术可以通过 色素质荷比的不同和特征离子的差异进行分离和判 定目标物质 [15] HPLC MS 技术越来越广泛地应用 于海洋光合色素分析中 其中, 高效液相色谱 三重 四极杆质谱联用 (HPLC QqQ MS) 系统以其定量精 确性成为色素分析的新手段 [16] 色素中存在大量的同分异构体, 比如原脱植基 叶绿素与甲基脱植基叶绿素, 海胆酮 隐藻黄素与蓝 藻黄素, 角黄素与别藻黄素,β,β 胡萝卜素 β,ε 胡萝卜素 ε,ε 胡萝卜素与 β,ψ 胡萝卜素等 LC MS 定量分析过程中, 由于色谱分离原因, 一个色谱峰中可能含有几种不同的组分, 即保留时间相同 相对分子质量也相同的同分异构体, 使得这类物质的精确定量受到影响 为了消除干扰, 串联质谱的选择反应监测 (SRM) 模式是最佳选择,SRM 模式以组分相对应的特征碎片离子作为定量离子, 有效消除了干扰组分的影响, 从而使得定量更加精确 本文利用 HPLC QqQ MS 的 SRM 模式建立了 5 种色素叶绿素 a 叶绿素 b β,β 胡萝卜素 叶黄素和岩藻黄素的定量分析方法, 并利用该方法比较了赤潮异弯藻 卡罗藻 微小原甲藻 微拟球藻 蛋白核小球藻 颗石藻 定鞭金藻 中肋骨条藻 威氏海链藻和假微型海链藻之间物种色素的分布情况 1 实验部分 1.1 仪器 试剂与材料 TSQ Quantum Access 液相色谱 三重四极杆质谱联用系统 ( 美国 ThermoFisher Scientific 公司 ), 超纯水系统 ( 法国 Millipore 公司 ) 叶绿素 a( 纯度 >95%) 叶绿素 b( 纯度 >90%) β,β 胡萝卜素 ( 纯度 >95%) 叶黄素 ( 纯度 > 75%) 岩藻黄素 ( 纯度 > 95%) 甲醇和乙腈 ( HPLC 级, 美国 Sigma Aldrich 公司 ), 丙酮 ( HPLC 级, 国药集团化学试剂有限公司 ), 乙酸铵 (HPLC 级, 美国 TEDIA 公司 ) 其他试剂均为国产分析纯 1.2 标准溶液的配制准确称取叶绿素 a 叶绿素 b β,β 胡萝卜素 叶黄素和岩藻黄素各 1 0 mg, 分别用丙酮 90% (v / v) 丙酮水溶液 氯仿 丙酮和乙醇溶解并定容至 10 ml 棕色容量瓶中, 均配制成 0 1 g / L 的单标准储备液, 置于 -80 冰箱中保存 制作工作曲线时, 用甲醇将储备液稀释成不同浓度的标准溶液 1.3 藻种培养和收获藻种由浙江省海洋生物工程重点实验室微藻种质库提供, 分离自浙江沿海和胶州湾 选用藻种有甲藻 绿藻 针胞藻 定鞭藻和硅藻 甲藻 : 卡罗藻 (Karlodinium veneficum)(nmbjah047 1) 和微小原甲藻 (Prorocentrum minimum)(nmbjah042);
994 色谱第 32 卷 绿藻 : 微拟球藻 ( Nannochloropsis oceanic ) (NMBluh014) 和蛋白核小球藻 ( Chlorella pyre noidosa) ( NMBluh015 1); 针胞藻 : 赤潮异弯藻 (Heterosigma akashiwo) ( NMBRah03 2) 和赤潮异弯藻 ( Heterosigma akashiwo ) ( NMBRah03 2 2); 定鞭藻 : 颗石藻 ( Pleurochrysis sp.) ( NMB jih026 1 ) 和定鞭金藻 ( Prymnesium sp.) ( NMBjih029 ); 硅藻 : 中肋骨条藻 ( Skeletonema costatum) ( NMBguh004 1) 威氏海链藻 ( Thalas siosira weissflogii) ( NMBguh021) 和假微型海链藻 ( Thalassiosira pseudonana ) ( NMBguh005 ) 藻种培养在 F / 2 培养基中, 置于光暗周期比为 12 h 12 h 的光照培养箱内, 光照强度范围为 40 ~ 70 μmol quanta / (m 2 s), 生长温度为 20 藻种在指数生长期末尾收获约 100 ml 藻种培养液, 在弱真空 ( <0 03 MPa) 和微光下过滤到 0 22 μm What man GF / F 玻璃纤维滤膜上 滤膜用锡箔纸包裹保存在 -80 下冷冻保存 冷冻的滤膜需在一个月内进行色素提取和分析 1.4 色素提取将冷冻的滤膜快速解冻后剪碎放入 10 ml 具塞棕色玻璃试管中, 加入 2 7 ml 冷丙酮后在冰水浴中超声 2 min, 再加入 0 3 ml 的超纯水, 使丙酮最终含量为 90%, 将超声后的玻璃试管放在 -20 冰箱中静置过夜提取 上机检测前先于 12 000 r / min 下离心 10 min, 取上清液再用聚四氟乙烯 (PTFE) 滤膜针筒过滤器过滤, 去除杂质和细胞碎片 检测时在 300 μl 的检测样品中加入 300 μl 0 5 mol / L 乙酸铵溶液以提高分离度和改善峰形 [6] 所有操作均在暗室中的冰盒内进行 处理后的样品必须在 48 h 内上机检测以降低色素降解对结果的影响 1.5 HPLC QqQ MS 条件色素提取物通过 TSQ Quantum Access 高效液相色谱系统分离 使用 Supelco Discovery C 16 氨基色谱柱 ( 150 mm 4 6 mm, 粒径 5 μm, 孔径 18 nm), 进样量为 10 μl, 柱温为 30 ; 流动相为甲醇 (A) 乙腈(B) 和 0 5 mol / L 乙酸铵溶液 (C), 流速为 1 0 ml / min, 按 1 4 的分流比进入离子源 线性梯度洗脱程序 : 0 min, 80% A, 20% C; 7 min, 72% B, 20% C; 11 min, 77% B, 18% C; 19 min, 85% B, 2% C; 30 min, 80% B, 20% A; 34 min, 60% B, 40% A; 36 min, 80% A, 20% C, 保持 4 min; 洗脱总时间为 40 min 样品室温度设定为 4, 二极管阵列检测器 ( FINNIGAN SURVEYOR PDAPlus) 的 检测波长为 350 ~ 750 nm 采用电喷雾电离源 (ESI) 正离子电离模式, 喷雾电压 2 5 kv, 鞘气流量 25 L / min, 辅助气流量 5 L / min, 离子传输毛细管温 度 320, 喷雾器温度 300 扫描采用 SRM 模 式 特征碎片离子及碰撞能量见表 1 采集时间均 为 0 2 s, 碰撞气体采用高纯氩气, 碰撞气压力 0 2 Pa Q1 和 Q3 分辨率均设定为半峰宽 0 7 Da 表 1 5 种色素标准品在 HPLC ESI QqQ MS SRM 模式下的特征碎片离子和碰撞能量 Table 1 Transitions monitored of the five pigments by HPLC ESI QqQ MS in SRM mode Compound Transition 1 Ion pair (m / z) Collision energy / V Transition 2 Ion pair (m / z) Collision energy / V Chlorophyll a 893.6>614.9 37 893.6>555.0 30 Chlorophyll b 907.6>629.3 29 907.6>569.2 30 β,β Carotene 536.3>444.3 14 536.3>429.1 20 Lutein 568.4>476.3 13 568.4>338.1 33 Fucoxanthin 659.3>641.3 10 659.3>581.1 15 2 结果与讨论 2.1 质谱离子化条件的选择 以流动注射方式对 1 ng / L 的 5 种色素标准溶 液进行 ESI MS 分析, 分别在正 负离子模式下检 测 对比两种模式, 各目标物的正离子信号比负离 子信号强度高 1 ~ 3 个数量级, 因此选择正离子模式 作为质谱采集模式 在正离子模式下离子峰的信号 最强, 叶绿素 a 叶绿素 b 和岩藻黄素产生的 [ M + H] + 分别为 m / z 893 6 907 6 和 m / z 659 3; β,β 胡萝卜素和叶黄素产生的 [ M] + 分别为 m / z 536 3 和 m / z 568 4 故选择各目标化合物的 [M+H] + 或 [M] + 作为 SRM 模式的母离子进行二级质谱扫描, 叶绿素 a 的母离子在二级质谱中脱去二十碳烯链形 成 [M+ H - C 20 H 40 ] + 离子峰, 再脱去一个乙酸形成 [M+H-C 20 H 40 -CH 3 COOH] + 离子峰, 其二级碎裂如 图 1a 所示, 主要产生碎片离子 m / z 615 3 和 m / z 555 2 叶绿素 b 在二级质谱中的裂解规律与叶绿 素 a 相同 ( 因为两者在结构上差异小, 叶绿素 b 的 侧链上为 -CHO, 叶绿素 a 为 -CH 3 ), 其二级碎裂如 图 1b 所示, 主要产生碎片离子 m / z 628 8 和 m / z 569 3 β,β 胡萝卜素的母离子在二级质谱中脱去 一个甲苯形成 [M-C 7 ] + 离子峰, 再脱去一个甲基 形成 [M-C 7 -CH 3 ] + 离子峰, 其二级碎裂如图 1c, 主要产生碎片离子 m / z 444 3 和 m / z 429 1 叶黄 素的母离子在二级质谱中脱去一个甲苯形成 [ M- C 7 ] + 离子峰, 再脱去一个 β 环形成 [ M - C 7 -
第９期 郑立洋 等 高效液相色谱 三重四极杆质谱同时测定与筛查海洋浮游藻类中的 ５ 种色素 Ｃ ９ Ｈ １３ Ｏ 离子峰 其二级碎裂如图 １ｄ 主要产生碎 片离子 ｍ ｚ ４７６ ３ 和 ｍ ｚ ３３８ １ 岩藻黄素的母离 子在二级质谱中脱去一分子水形成 Ｍ Ｈ Ｈ ２ Ｏ 离子峰 再脱去一分子水和一个乙酸形成 Ｍ Ｈ ２Ｈ ２ Ｏ ＣＨ ３ ＣＯＯＨ 离子峰 其二级碎裂如图 １ｅ 主 ９９５ 要产生碎片离子 ｍ ｚ ６４１ １ 和 ｍ ｚ ５６７ １ 选择上 述母离子和主要碎片离子作为定量离子 以 ＳＲＭ 正 离子模式优化锥孔电压 ｔｕｂｅ ｌｅｎｓ ｏｆｆｓｅｔ 碰撞能 量 ｃｏｌｌｉｓｉｏｎ ｅｎｅｒｇｙ 等质谱参数 ５ 种色素标准溶 液的 ＳＲＭ 离子流图如图 ２ 所示 图 １ ５ 种色素的裂解原理图 Ｆｉｇ １ Ｓｃｈｅｍｅ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ｏｆ ｔｈｅ ｆｉｖｅ ｐｉｇｍｅｎｔｓ ａ ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｌｌ ａ ｂ ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｌｌ ｂ ｃ β β ｃａｒｏｔｅｎｅ ｄ ｌｕｔｅｉｎ ｅ ｆｕｃｏｘａｎｔｈｉｎ ２ ２ 方法验证 ２ ２ １ 标准曲线 检出限 ＬＯＤ 和定量限 ＬＯＱ 用标准储备液分别精确配制含叶绿素 ａ 叶绿 素 ｂ β β 胡萝卜素和叶黄素为 １０ ５０ １００ ５００ 和 １ ０００ μｇ Ｌ 岩藻黄素为 １００ １５０ ２００ ５００ 和 １ ０００ Ｔａｂｌｅ ２ Ａｎａｌｙｔｅ Ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｌｌ ａ Ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｌｌ ｂ β β Ｃａｒｏｔｅｎｅ Ｌｕｔｅｉｎ Ｆｕｃｏｘａｎｔｈｉｎ 表２ μｇ Ｌ 的 混 合 标 准 溶 液 采 用 １ ５ 节 的 条 件 进 行 ＨＰＬＣ ＭＳ 分析 结果显示 ５ 种色素标准品在其线 性范围内的相关系数 ｒ ２ ０ ９９６ 其标准曲线如表 ２ 所示 各取 １０ μｌ １ μｇ Ｌ 叶绿素 ａ １ μｇ Ｌ 叶绿素 ｂ ５ 种色素标准品的线性方程 相关系数 线性范围 检出限和定量限 Ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ ｅｑｕａｔｉｏｎｓ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔｓ ｒ ２ ｌｉｎｅａｒ ｒａｎｇｅｓ ＬＯＤｓ ａｎｄ ＬＯＱｓ ｏｆ ｔｈｅ ｆｉｖｅ ｐｉｇｍｅｎｔｓ Ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ ｅｑｕａｔｉｏｎ ｙ ５ ７７２４ １０ ｘ ５ ４８６ １０ ｙ ６ ４６５５ １０ ３ ｘ １ ３ １０ ５ ３ ４ ｙ １ ４３５５ １０ ３ ｘ ４ ４８２４ １０ ４ ｙ １ １１３５ １０ ３ ｘ ３ １４５２ １０ ４ ｙ ７６ ７８ｘ ９ ７６０７ １０ ３ ｒ２ ０ ９９９８ Ｌｉｎｅａｒ ｒａｎｇｅ μｇ Ｌ ＬＯＤ μｇ Ｌ ＬＯＱ μｇ Ｌ ０ ９９７４ ０ ０２ ０ ０６ ０ ９９９３ ０ ９９８３ ０ ９９６１ ｙ ｐｅａｋ ａｒｅａ ｏｆ ｔｈｅ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｉｏｎ ｘ ｍａｓｓ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ μｇ Ｌ １００ １０００ ０ ０２ ０ ０４ ０ ０４ ０ １６ ０ ０７ ０ １４ ０ １３ ０ ５４
996 色谱第 32 卷 图 2 5 种色素标准溶液的 SRM 谱图 Fig. 2 Selected reaction monitoring chromatograms of the five pigment standard solutions 1 μg / L β,β 胡萝卜素 1 μg / L 叶黄素和 10 μg / L 岩 藻黄素标准溶液进行分析, 测定此浓度下的信噪比 (S / N) 将对应 S / N = 10 和 S / N = 3 的各标准溶液 浓度分别作为定量限 (LOQ) 和检出限 (LOD), 结果 如表 2 所示 方法的 LOD 均不高于 0 16 μg / L, LOQ 在 0 06 ~ 0 54 μg / L 之间 而 HPLC 方法的检 出限和定量限分别在 1 05 ~ 12 70 μg / L 和 3 14 ~ 38 11 μg / L 之间 [17], 表明本方法检测色素的灵敏 度很高 2.2.2 方法的精密度和回收率 取低 中 高 3 个浓度的混合标准溶液进行测 定, 计算方法的精密度 在一天内连续进样测定 5 次, 记录 5 种色素的峰面积及保留时间, 分别计算各 色素的保留时间和峰面积的精密度, 各色素的保留 时间和峰面积的相对标准偏差 (RSD) 见表 3 由此 可见, 保留时间的日内 RSD 为 0 07% ~ 0 41%, 峰面 积的日内 RSD 为 0 42% ~ 4 20%; 连续 5 天每天连 续进样测定 5 次, 记录 5 种色素的峰面积及保留时 间, 分别计算各色素的保留时间和峰面积的日间精 密度, 各色素保留时间和峰面积的日间 RSD 见表 3 由此可见, 保留时间的日间 RSD 为 0 04% ~ 0 40%, 峰面积的日间 RSD 为 0 57% ~ 4 30% 实 验结果表明本方法的精密度良好 通过空白添加实验方法测定方法的回收率 以 空白滤膜为样品, 分别添加低 中 高 3 个水平的标 准溶液进行加标回收实验, 每个加标水平平行测定 3 次, 结果见表 3 由此可见 5 种色素的加标回收率 均在 82% 以上,RSD 低于 8% 该方法较好地满足 了藻类样品中色素含量的测定要求 2.3 样品测定 藻种收获时先用显微镜进行细胞计数, 分别取 100 ml 赤潮异弯藻 ( NMBRah03 2) 赤潮异弯藻 (NMBRah03 2 2) 卡罗藻 ( NMBjah047 1) 微小原 甲藻 ( NMBjah042) 微拟球藻 ( NMBluh014) 蛋白 核小球藻 (NMBluh015 1) 颗石藻 (NMBjih026 1) 定鞭金藻 ( NMBjih029) 中肋骨条藻 ( NMBguh004 1) 威氏海链藻 ( NMBguh021) 和假微型海链藻 (NMBguh005), 测定藻的密度分别为 2 75 10 5 8 25 10 4 7 75 10 4 8 25 10 4 1 75 10 5 6 76 10 4 2 00 10 5 7 25 10 5 2 18 10 6 3 95 10 4 和 1 40 10 6 cell / ml 然后按照所建立的方法对每个 藻种进行处理, 每个样品平行上机检测 3 次 线性 方程计算结果显示 : 叶绿素 a 和 β,β 胡萝卜素存在 于所有检测的藻种中, 其中叶绿素 a 含量在颗石藻 (NMBjih026 1) 中最高 (6 19 10-3 ng / cell), 在赤 潮异弯藻 ( NMBRah03 2 2) 中最低 ( 4 42 10-5 ng / cell); β, β 胡萝卜素含量在赤潮异弯藻 (NMBRah03 2 2) 中最高 (6 65 10-4 ng / cell), 在 微拟球藻 ( NMBluh014 ) 中最低 ( 1 75 10-5 ng / cell); 叶绿素 b 仅在微拟球藻 ( NMBluh014) 和 蛋白核小球藻 (NMBluh015 1) 中检测到, 含量分别 为 1 46 10-5 和 7 85 10-6 ng / cell; 叶黄素仅在微拟 球藻 ( NMBluh014) 和蛋白核小球藻 ( NMBluh015 1) 中检测到, 含量分别为 1 53 10-6 和 1 21 10-6
第 9 期郑立洋, 等 : 高效液相色谱 三重四极杆质谱同时测定与筛查海洋浮游藻类中的 5 种色素 997 ng / cell; 岩藻黄素在赤潮异弯藻 (NMBRah03 2) 赤潮异弯藻 ( NMBRah03 2 2) 颗石藻 ( NMBjih026 1) 定鞭金藻 ( NMBjih029) 中肋骨条藻 ( NMB guh004 1) 威氏海链藻( NMBguh021) 和假微型海链藻 ( NMBguh005) 中检测到, 其中在赤潮异弯藻 (NMBRah03 2 2) 中含量最高 (4 17 10-4 ng / cell), 假微型海链藻 ( NMBguh005) 中含量最低 ( 1 57 10-5 ng / cell) 藻种样品检测结果如表 4 所示 所 [18-21] 测得的藻种中 5 种色素含量基本上与文献一 致 本方法可对保留时间相同的色素进行一次性定 量分析, 且灵敏度较高, 因此采用该方法分析色素更 加高效, 为今后的藻群组成及藻类生物量测定提供 了测定方法 由于除了上述 5 种色素外, 其余色素 未能购买到或者价格较为昂贵, 本文未进行藻类生 物量的测定, 后续将开展色素的纯化工作, 为进一步 进行藻类生物量的相关研究提供物质基础 Analyte 表 3 5 种色素的空白加标回收率和日内 日间测定精密度 Table 3 Spiked recoveries in a blank sample and intra day and inter day detection precisions ( RSDs) of the five pigments Mass concentration / (μg / L) Spiked recovery test (n = 3) Recovery / % RSD / % RSDs of intra day (n = 5) / % Retention time Peak area RSDs of inter day (n = 5) / % Retention time Peak area Chlorophyll a 10 96.17 3.27 0.08 0.42 0.04 0.78 100 98.61 1.37 0.15 1.17 0.11 2.06 1000 94.24 1.48 0.09 0.81 0.14 0.57 Chlorophyll b 10 97.62 3.71 0.07 1.22 0.07 2.45 100 99.83 1.02 0.09 0.77 0.08 0.88 1000 95.13 0.87 0.14 1.06 0.08 0.91 β,β Carotene 10 84.37 6.33 0.19 2.06 0.06 1.32 100 86.46 4.47 0.12 1.29 0.05 1.74 1000 82.77 2.53 0.14 1.84 0.07 0.87 Lutein 10 93.64 7.52 0.15 1.33 0.15 3.37 100 96.34 3.55 0.11 0.72 0.15 1.37 1000 91.18 1.24 0.22 2.05 0.11 1.17 Fucoxanthin 100 87.56 5.04 0.20 2.51 0.12 4.30 200 90.29 2.73 0.41 4.20 0.14 3.47 1000 85.24 3.36 0.36 2.06 0.40 1.58 Alga Table 4 表 4 实际藻种样品中 5 种色素的含量 Contents of the five pigments in real alga samples Chlorophyll a / Chlorophyll b / β,β Carotene / Lutein / Fucoxanthin / Heterosigma akashiwo (NMBRah03 2) 2.55 10-3 ND 1.98 10-4 ND 1.38 10-4 Heterosigma akashiwo (NMBRah03 2 2) 4.42 10-5 ND 6.65 10-4 ND 4.17 10-4 Karlodinium veneficum (NMBjah047 1) 3.83 10-3 ND 4.03 10-4 ND ND Prorocentrum minimum (NMBjah042) 2.28 10-3 ND 3.55 10-4 ND ND Nannochloropsis oceanic (NMBluh014) 1.50 10-4 1.46 10-5 1.75 10-5 1.53 10-6 ND Chlorella pyrenoidosa (NMBluh015 1) 9.51 10-5 7.85 10-6 6.67 10-5 1.21 10-6 ND Pleurochrysis sp. (NMBjih026 1) 6.19 10-3 ND 3.50 10-4 ND 1.38 10-4 Prymnesium sp. (NMBjih029) 2.33 10-3 ND 2.06 10-5 ND 5.36 10-5 Skeletonema costatum (NMBguh004 1) 9.75 10-5 ND 2.90 10-5 ND 2.19 10-5 Thalassiosira weissflogii (NMBguh021) 3.98 10-4 ND 4.24 10-4 ND 7.93 10-5 Thalassiosira pseudonana (NMBguh005) 5.41 10-4 ND 5.30 10-5 ND 1.57 10-5 ND: not detected. 3 结论本文对反相 C 16 氨基柱高效液相色谱 三重四极杆质谱联用系统分析色素的方法进行了有效性验证, 包括方法的线性关系 相关系数 检测限和定量限 精密度和回收率等 利用该方法分析比较了 11 种藻类中 5 种色素的分布情况, 发现颗石藻细胞内的叶绿素 a 赤潮异弯藻(NMBRah03 2 2) 细胞内的 β,β 胡萝卜素和岩藻黄素含量均高于其他藻类, 叶 绿素 b 和叶黄素仅在绿藻中检测到 该方法分离 度好 灵敏度高 重复性好, 为今后利用色素含量进 行藻种分类及藻群组成分析提供了实验分析手段 参考文献 : [1] Smith W O, Sakahaug E. Polar Phytoplankton, Polar Ocea nography, Part B: Chemistry, Biology and Geology. San Di ego: Academic Press, 1990
998 色谱第 32 卷 [2] Millie D F, Paerl H W, Hurley J P. Can J Fish Aquat Sci, 1993, 50: 2513 [3] Wong C K, Wong C K. Chemosphere, 2003, 52: 1633 [4] Jeffrey S W, Wright S W. Photosynthetic Pigments in Marine Microalgae: Insights from Cultures and the Sea. Enfield: Science Publishers, 2006 [5] Nair A, Sathyendanath S, Platt T, et al. Rem Sens Environ, 2008, 112: 3366 [6] Jayaraman S, Knuth M L, Cantwell M, et al. J Chromatogr A, 2011, 1218: 3432 [7] Jeffrey S W, Wright S W, Zapata M. Mar Freshwater Res, 1999, 50: 879 [8] Yu X Q, Jin H Y, Chen J F, et al. Journal of Marine Sci ences ( 余小青, 金海燕, 陈建芳, 等. 海洋学研究 ), 2011, 29 (3): 145 [9] Yao P, Yu Z G, Deng C M, et al. Oceanologia et Limnologia Sinica ( 姚鹏, 于志刚, 邓春梅, 等. 海洋与湖沼 ), 2013, 44 (4): 866 [10] Zapata M, Rodriguez F, Garrido J L. Mar Ecol Prog Ser, 2000, 195: 29 [11] Hou Y S, Liang W, Zhang L P, et al. Resource and Envi ronment in the Yangtze Basin ( 侯燕松, 梁威, 张丽萍, 等. 长江流域资源与环境 ), 2009, 18(6): 563 [12] Garcia de Blas E, Mateo R, Vinuela J, et al. J Chromatogr B, 2011, 879: 341 [13] Sander L C, Sharpless K E, Pursch M. J Chromatogr A, 2000, 880: 189 [14] Fang X D, Na G S, Yun X, et al. Marine Environmental Science ( 方小丹, 那广水, 云霞, 等. 海洋环境科学 ), 2012, 31(1): 140 [15] Aris R L, Keely B J. Rapid Column Mass Spectrum, 2000, 14(3): 125 [16] Van Breem R B, Schmitz H H, Schwartz S J. J Agric Food Chem, 1995, 43: 384 [17] Deng C M, Yao P, Yu Z G, et al. Periodical of Ocean Uni versity of China ( 邓春梅, 姚鹏, 于志刚, 等. 中国海洋大学学报 ), 2011, 41: 272 [18] Butron A, Madariga I, Orive E. Estuar Coast Shelf Sci, 2012, 107: 141 [19] Calbet A, Bertos M, Fuentes Grünewald C, et al. Harmful Algae, 2011, 10: 654 [20] Place A R, Bowers H A, Bachvaroff T R, et al. Harmful Algae, 2012, 14: 179 [21] Reichardt T A, Collins A M, Garcia O F, et al. Algal Res, 2012, 1: 22