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生物质与生物能源实验室 常用试剂配方手册 2013 年 7 月制

感谢夏涛 王艳婷 邹维华 陈鹏 丰胜求 王令强等老师对本手册的编制工作, 提出宝贵的意见 使用过程中, 如发现有任何不足和需要增补的内容, 欢迎老师和同学们反馈在后附备页上, 作为日后修订的重要依据 主编 : 李丰成 编委 : 李英黄江锋李傲万灿冯永清熊科胡振董舒超

目 录 一.DNA 提取...1 CTAB (1.5X)...1 0.5 M EDTA (ph 8.0) 贮存液...1 1 M Tris HCl (ph 8.0) 贮存液...1 氯仿 : 异戊醇 (v:v=24:1)...1 75% 乙醇溶液...1 二.RNA 提取...2 3 M NaAc (ph 5.2)...2 75% 乙醇溶液...2 三. 大肠杆菌操作...3 LB 培养基...3 低盐 LB 培养基...3 溶液 I...3 溶液 II...3 溶液 III...4 0.1 M CaCl 2 溶液...4 2 M MgCl 2 溶液...4 SOB 培养基...4 SOC 培养基...5 四. 酵母操作...6 YPD 培养基 ( 液体 )...6 YPD 培养基 ( 平板 )...6 YPDA 培养基 ( 液体 )...6 YPDS+Agar...7 溶壁酶 ( 蜗牛酶 纤维素酶 R-10) 反应缓冲液...7

0.1 M 磷酸缓冲液 (ph 7.0)...7 酵母破碎缓冲液...7 100 mm PMSF...8 酚 / 氯仿 (Tris 饱和酚配制 )...8 1.0 M LiAc...8 五. 常用抗生素...9 六. 分子标记...10 6% 丙烯酰胺胶液...10 5 TBE...10 0.5 M EDTA...11 10% AP...11 硅化剂...11 染色液...11 显影液...12 Loading Buffer...12 七. 蛋白常用试剂...13 PBS (ph 7.4)...13 50 mm Tris HCl (ph 8.0)...13 0.5M NaCl (ph 8.0)...13 100 mm 醋酸钠...13 10 mm 还原型谷胱甘肽...13 5 SDS Loading buffer...14 30% 丙烯酰胺母...14 10% AP...14 10% SDS...15 1.5 M Tris (ph 8.8)...15 1.5 M Tris (ph 6.8)...15 5 Tris-Gly Buffer...15

染色液...15 脱色液...16 转膜 Buffer...16 10 TBS 缓冲液...16 TTBS 缓冲液...16 封闭液...16 DAB/NiCl 显色液...17 一抗...17 二抗...17 八. 纤维素合成...18 50 mm Mops buffer...18 蛋白酶抑制剂...18 去污剂...18 九. 组织培养...19 N 6 max 母液 (10X)...19 N 6 min 母液 (100X)...19 Fe 2 EDTA 贮存液 (100X)...19 Vitamin 贮存液 (100X)...20 MSmax 母液 (10X)...20 MSmin 母液 (100X)...20 2,4-D 贮存液 (1 mg/ml)...21 6-BA 贮存液 (1 mg/ml)...21 NAA 贮存液 (1 mg/ml)...21 IAA 贮存液 (1 mg/ml)...21 KT 贮存液 (1 mg/ml)...21 AS 贮存液 (0.002 M)...22 1 M KOH 贮存液...22 CN 贮存液 (50 mg/ml)...22 HN 贮存液 (50 mg/ml)...22

Cef 贮存液 (100 mg/ml)...22 HgCl 2 (10 mg/ml) (10X) 贮存液...22 十. 组织染色...23 木质素染色...23 胼胝质染色...23 纤维素染色...23 十一. 细胞壁成分测定...24 0.5 M 磷酸 buffer (ph 7.0)...24 氯仿 - 甲醇 (100 ml)...24 DMSO-H 2 O...24 0.5% 草酸铵...24 4 M KOH...24 乙酸 - 硝酸 - 水 (8:1:2)...25 H 2 SO 4 - 蒽酮...25 A 试剂 ( 苔黑酚 )...25 B 试剂 (FeCl 3 )...25 67% (v/v) H 2 SO 4-72% (w/w) H 2 SO 4...25 2.88% (w/w) H 2 SO 4...25 苯 - 乙醇...26 Na 2 B 4 O 7 -H 2 SO 4...26 间羟基联苯溶液...26 2% (w/v) NaHCO 3...26 1 mm EDTA...26 十二. 半纤维素单糖测定...27 0.5 M 磷酸 buffer (ph 7.0)...27 氯仿 - 甲醇...27 IS...27 10% NaHB 4...27

十三. 木质素单体测定...28 苯 - 乙醇...28 2 M NaOH...28 乙基香兰素内标...28 二氯甲烷 - 乙酸乙酯...28 6 M HCl...28 流动相...28 十四. 纤维素 DP 测定...29 1 M 铜乙二胺溶液的制备...29 十五. 细胞壁降解转化...30 醋酸 buffer (ph 4.8)...30 2% NaOH...30 1%(v/v)H 2 SO 4...30 3.2 g/l 纤维素复合酶液...30 十六. 糖醇转化...31 磷酸 buffer (ph 4.8)...31 5% K 2 Cr 2 O 7...31 十七. 拟南芥消毒 种植...32 次氯酸钠消毒水...32 MS 培养基 ( 固体 )...32 MS 培养基 ( 液体 )...32 1/2 MS 培养基 ( 固体 )...33 1/2 MS 培养基 ( 液体 )...33 注 :[ ] 为分子量

一.DNA 提取 CTAB (1.5X) CTAB 十六烷基三甲基溴化铵 15 g 1 M Tris HCl (ph 8.0) 75 ml 0.5 M EDTA (ph 8.0) 30 ml NaCl [58.5] 61.4 g 单蒸水定容至 1L, 室温保存 0.5 M EDTA (ph 8.0) 贮存液 Na 2 EDTA 2H 2 O [372.24] 186.1 g NaOH [40] 20 g ddh 2 O [18] 800 ml 调节 ph 至 8.0, 单蒸水定容至 1L 1 M Tris HCl (ph 8.0) 贮存液 Tris Base 121.1 g 浓 HCl 42 ml ddh 2 O 800 ml 调节 ph 至 8.0, 单蒸水定容至 1L 氯仿 : 异戊醇 (v:v=24:1) 配制 100 ml 溶液, 氯仿 96 ml, 异戊醇 4 ml 75% 乙醇溶液 无水乙醇 :ddh 2 O(v/v)=3:1, 终浓度为 75% 1

二.RNA 提取 3 M NaAc (ph 5.2) NaAc [82.08] 24.624 g 冰醋酸调节 ph 至 5.2, DEPC 处理过的双蒸水定容至 100 ml 75% 乙醇溶液 无水乙醇 :ddh 2 O(v/v)=3:1, 终浓度为 75% 采用 DEPC 处理过的双蒸水配制 2

三. 大肠杆菌操作 LB 培养基 NaCl [58.5] 10 g 蛋白胨 10 g 酵母提取物 5 g 单蒸水定容至 1 L, 固体添加 15 g 琼脂 121 o C 灭菌 20 分钟, 冷到 55 o C 左右, 加抗生素 低盐 LB 培养基 ( 用于 Zeocin 抗生素 ) NaCl [58] 5 g 蛋白胨 10 g 酵母提取物 5 g 单蒸水定容至 1 L, 固体添加 1.5% 琼脂 121 o C 灭菌 20 分钟, 冷到 55 o C 左右, 加抗生素 Zeocin, 避光 4 o C 保存 溶液 I 葡萄糖 Glucose H 2 O [198] 0.99 g 0.5 M EDTA (ph 8.0) 2 ml 1 M Tris (ph 8.0) 2.5 ml 单蒸水定容至 100 ml, 高压灭菌 4 o C 保存 溶液 II NaOH [40] 0.80 g SDS [288] 1.0 g 单蒸水至 100 ml,4 保存 3

溶液 III 乙酸钾 [98] 29.4 g 冰醋酸 [60] 11.5 ml 单蒸水定容至 100 ml,4 保存 0.1 M CaCl 2 溶液 CaCl 2 2H 2 O [147] 1.47 g ddh 2 O 定容至 100 ml 注意事项 : 灭菌后 4 o C 预冷, 新鲜配制使用 2 M MgCl 2 溶液 MgCl 2 [95] 19 g 单蒸水定容至 100 ml, 灭菌 20 min SOB 培养基 1) 蛋白胨 20 g 酵母提取物 5 g NaCl [58.5] 0.5 g 加入 950 ml 单蒸水, 玻璃棒搅拌至完全溶解 2) 加 10 ml 250 mm KCl 溶液, KCl [74.5] 1.86 g 单蒸水定容至 100 ml 3) 5 M NaOH 调 ph 值至 7.0, 单蒸水定容至 1 L, 灭菌 20 min; NaOH [40] 2 g 单蒸水定容至 10 ml 4) 使用前, 加入 5 ml 灭菌的 2 M MgCl 2 4

SOC 培养基 1) 1 M 葡萄糖溶液 : 葡萄糖 Glucose H 2 O [198] 19.8 g 加单蒸水定容至 100 ml, 用 0.22 μm 滤膜过滤除菌 2) 向 100 ml SOB 培养基中加入除菌的 1 M 的葡萄糖溶液 2 ml, 混匀 3) 配好后分装,1 ml 每管, 用封口膜封好,-20 保存 5

四. 酵母操作 YPD 培养基 ( 液体 ) 酵母提取物 10 g 蛋白胨 20 g 溶解在单蒸水 900 ml 中,35 分钟液体灭菌 (liquid cycle) 后, 加 100 ml 灭过菌的浓度为 20% 的右旋葡萄糖 (Dextrose) YPD 培养基 ( 平板 ) 酵母提取物 10 g 蛋白胨 20 g ( 制备平板, 再加 20 g 琼脂 Agar) 溶解在单蒸水 900 ml 中,35 分钟液体灭菌 (liquid cycle) 后, 加 100 ml 灭过菌的浓度为 20% 的右旋葡萄糖 (Dextrose) YPDA 培养基 ( 液体 ) 酵母提取物 10 g 蛋白胨 20 g 腺嘌呤 [135] 0.03 g 溶解在单蒸水 900 ml 中,35 分钟液体灭菌 (liquid cycle) 后, 加 100 ml 灭过菌的浓度为 20% 的右旋葡萄糖 (Dextrose) 6

YPDS+Agar 酵母提取物 10 g 蛋白胨 20 g 山梨醇 (Sorbitol) 182.2 g ( 制备平板, 再加 20 g 琼脂 Agar) 溶解在单蒸水 900 ml 中,35 分钟液体灭菌 (liquid cycle) 后, 加 100 ml 灭过菌的浓度为 20% 的右旋葡萄糖 (Dextrose), 冷却后, 加抗生素 溶壁酶 ( 蜗牛酶 纤维素酶 R-10) 反应缓冲液 山梨醇 [182] 21.84 g 加 0.1 M 磷酸缓冲液定容至 100 ml 0.1 M 磷酸缓冲液 (ph 7.0) 1) Na 2 HPO 4 577 ml 0.1 M Na 2 HPO 4 12H 2 O [358] 20.665 g 溶于单蒸水定容至 1L 2) NaH 2 PO 4 423 ml 0.1 M NaH 2 PO 4 2H 2 O [156] 6.599 g 溶于单蒸水定容至 1 L 3) 混匀 酵母破碎缓冲液 Na 2 EDTA 2H 2 O [372.24] 0.186 g DTT [154] 0.077 g 甘油 50 ml PMSF 10 ml 100 mm ( 现用现加 ) 加入 0.1 M 磷酸缓冲液定容至 1 L 7

100 mm PMSF PMSF (Sigma, p7626) [174] 0.1742 g 加入 10 ml 异丙醇,-20 o C 保存 酚 / 氯仿 (Tris 饱和酚配制 ) Tris 饱和酚 40 ml 氯仿 [119] 40 ml Tris 缓冲液 20 ml 注意事项 : 使用前需确认购买的 Tris 饱和酚是黄色, 如已经变为红色则不可用 ; 先将 Tris 饱和酚和氯仿混合后再加 Tris 缓冲液液封 ; 充分混匀后 4 o C 静置过夜方可使用,4 o C 保存 1.0 M LiAc LiAc [66] 6.5990 g 加灭菌单蒸水定容至 100 ml, 用 0.22 μm 滤膜过滤除菌 8

五. 常用抗生素 母液浓度 工作浓度 溶剂 储藏温度 备注 Amp 100 mg/ml 100 ug/ml ddh 2 O 4 o C 过滤灭菌 Kan 50 mg/ml 50 ug/ml ddh 2 O 4 o C 过滤灭菌 Spec 100 mg/ml 100 ug/ml 甲醇 4 o C 无需灭菌 Rif 50 mg/ml 50 ug/ml DMSO 4 o C 过滤灭菌 9

六. 分子标记 6% 丙烯酰胺胶液 尿素 [60.06] 840 g 丙烯酰胺 [71.8] 114 g 甲叉 - 丙烯酰胺 [154.2] 6 g 5 TBE 缓冲液 200 ml 单蒸水定容至 2 L 注意事项 : 穿带实验服 口罩 手套, 避免污染和中毒 ; 磁力搅拌器搅拌至清澈 ; 使用前用双层滤纸过滤 ; 4 o C 保存 5 TBE Tris-base [111] 54 g H 3 BO 3 [61.83] 27.5 g 0.5M EDTA (ph 8.0) 20 ml 单蒸水定容至 1 L 注意事项 : 可用温水加速溶剂溶解 ; 室温保存 10

0.5 M EDTA Na 2 EDTA 2H 2 O [372.24] 93.06 g NaOH [40] 10 g 单蒸水定容至 500 ml 注意事项 : 调 ph 为 8.0; 高温高压灭菌后, 室温保存 10% AP AP [228] 4 g 单蒸水定容至 40 ml, 放久易失效 注意事项 : 溶解后保存在 4 o C 硅化剂 氯仿或无水乙醇 500 ml 二氯二甲基硅烷 25 ml 总体积 525 ml 注意事项 : 摇床上摇匀过夜 ; 室温保存 染色液 硝酸银 [170] 2 g 单蒸水定容至 2 L 注意事项 : 避光保存 11

显影液 NaOH [40] 30 g 无水 Na 2 CO 3 [106] 0.6 g 单蒸水定容至 2 L 注意事项 : 使用前降温至 4 o C 使用 Loading Buffer 0.5 M EDTA (ph 8.0) 1 ml 溴酚蓝 0.1 g 二甲苯菁 0.1 g 去离子甲酰胺定容至 50 ml 注意事项 : 配制时先精确称量溴酚蓝和二甲苯菁, 转入 50 ml 容量瓶中, 再加入 0.5 M EDTA, 用去离子甲酰胺定容至 50 ml; 在通风橱中进行 12

七. 蛋白常用试剂 PBS (ph 7.4) NaCl [58.5] 40 g KCl [74.5] 1 g KH 2 PO 4 [136.09] 1.2 g Na 2 HPO 4 12H 2 O [358.14] 18.1 g 单蒸水定容至 5 L 50 mm Tris HCl (ph 8.0) Tris [121.14] 6.055 g 溶于 900ml 单蒸水中, 用 HCl 调 ph 到 8.0 后定容至 1 L 0.5M NaCl (ph 8.0) NaCl [58.5] 29.25 g 溶于 900 ml 水中, 用 NaOH 调 ph 到 8.0 后定容至 1 L 100 mm 醋酸钠 醋酸钠 [82.03] 8.2 g 溶于 1 L 单蒸水中 10 mm 还原型谷胱甘肽 还原性谷胱甘肽 [307.32] 0.15366 g 溶于 50 ml 50 mm Tris-HCl (ph 8.0) 中 13

5 SDS Loading buffer 1 M Tris-HCl 12.5 ml SDS [288.38] 5 g 溴酚蓝 [607.02] 0.25 g 甘油 25 ml H 2 O 12.5 ml 使用前按上述配方配 50 ml 的总量, 使用时分装小管, 每 1 ml buffer 加 50 ul 巯基乙醇 30% 丙烯酰胺母 丙烯酰胺 [71.08] 29 g N,N - 亚甲基双丙烯酰胺 [54.16] 1 g 溶于 60 ml 去离子水中, 搅拌加热溶解后, 补单蒸水至终体积为 100 ml 注意事项 : 配置时带口罩, 手套, 剧毒 ; 由于固体的体积比较多, 所以加水的总体积大约为 80 ml; 分析滤纸过滤至用锡纸包的瓶中,4 保存 ; 在烧杯中配制, 提前量好烧杯的 100 ml 的刻度, 做记号 ; 因为固体占较多体积, 所以加水的总体积少于 100 ml 10% AP 过硫酸铵 [228.20] 0.1 g 溶于 1 ml 单蒸水 注意事项 : 一次配 2-3 ml 即可, 放久易失效 14

10% SDS SDS [288.38] 5 g 加单蒸水 50 ml 1.5 M Tris (ph 8.8) Tris [121.14] 18.15 g 溶于 80 ml 去离子水中, 调 ph 至 8.8, 定容至 100 ml 1.5 M Tris (ph 6.8) Tris [121.14] 18.15 g 溶于 80 ml 去离子水中, 调 ph 至 6.8, 定容至 100 ml 5 Tris-Gly Buffer Tris [121.14] 15.1 g 甘氨酸 [75.07] 94 g 10% SDS 50 ml 单蒸水定容至 1 L 染色液 考马斯亮蓝 R-250 [824] 1 g 冰乙酸 100 ml 异丙醇 250 ml 单蒸水定容至 1 L 15

脱色液 冰乙酸 100 ml 乙醇 50 ml 单蒸水定容至 1 L 转膜 Buffer Tris [121.14] 3.0 g 甘氨酸 [75.07] 14.4 g SDS [3.7] 10 ml 甲醇 200 ml 单蒸水定容至 1 L 10 TBS 缓冲液 Tris [121.14] 12.1 g NaCl [58.5] 87.7 g 溶于 800 ml 单蒸水中, 用 HCl 调 ph 至 8.0 定容至 1 L TTBS 缓冲液 1 TBS 缓冲液 100 ml Tween20 50 ul 封闭液 5 g 脱脂奶粉溶于 100 ml TTBS 中 注意事项 : 封闭液在冰箱中长时间存储, 容易长菌 使用前, 应检查是否污染 并且应根据实际需求量进行配制, 以免造成浪费 16

DAB/NiCl 显色液 100mM Tris-HCl (ph 7.5) 10 ml DAB 储存液 [40] 200 ul NiCl 溶液 [80] 50 ul 30% H 2 O 2 30 ul 一抗 一般按 1:1000 稀释, 即在 15 ml TTBS 中加入 15 ul 抗体 如果抗体的效价较低, 可增加抗体的浓度 二抗 一般按照 1:5000 稀释, 即 15 ml TTBS 中加入 3 ul 羊抗兔的二抗 二抗浓度不宜过高, 不然杂交时会出现非特异性条带 二抗是公用的, 只能使用 15 次, 因此每用 1 次, 都应做上记号 17

八. 纤维素合成 50 mm Mops buffer Mops [209.30] 10.464 g, 蔗糖 [342.29] 85.576 g 加单蒸水约 900 ml, 用 NaOH 调 ph 至 7.5, 然后定容至 1 L 蛋白酶抑制剂 所有蛋白酶抑制剂来源于 Sigma 公司 1> 0.1 M PMSF 取 0.1742 g PMSF, 溶于 10 ml 异丙醇, 注意反复震荡促其溶解 2> 1 mm pepstaina 取 0.0008 g pepstaina 溶于 1 ml 甲醇, 注意称取量很小时称量纸不归零 3> 1 mm leupeptin 取 0.0014 g leupeptin 溶于 3 ml 单蒸水中 去污剂 1% digitonin ( 毛地黄皂苷 1229.31) Digitonin 0.01 g 溶于 1 ml 单蒸水中 18

九. 组织培养 N 6 max 母液 (10X) 硝酸钾 /KNO 3 [101.10] 28.3 g 磷酸二氢钾 /KH 2 PO 4 [136.09] 4.0 g 硫酸铵 /(NH 4 ) 2 SO 4 [132.14] 4.63 g 硫酸镁 /MgSO 4 7H 2 O [246.47] 1.85 g 无水氯化钙 /CaCl 2 [110.98] 1.66 g 逐一依次溶解, 室温下单蒸水定容至 1 L,4 o C 保存备用 N 6 min 母液 (100X) 碘化钾 /KI [166] 0.08 g 硼酸 /H 3 BO 3 [61.83] 0.16 g 硫酸锰 /MnSO 4 H 2 O [169.02] 0.44 g 硫酸锌 /ZnSO 4 7H 2 O [287.56] 0.15 g 室温下单蒸水定容至 1 L,4 o C 保存备用 Fe 2 EDTA 贮存液 (100X) 在一个大三角瓶中加入 300 ml 蒸馏水和 FeSO 4 7H 2 O [278.02] 2.78 g; 在另一个大三角瓶中加入 300 ml 蒸馏水并加热至 70, 然后加入 Na 2 EDTA 2H 2 O [372.24] 3.73 g, 充分混合溶解后,70 o C 水浴中螯合 2 小时, 定容至 1 L,4 o C 保存备用 19

Vitamin 贮存液 (100X) 烟酸 /Nicotinic acid [123.11] 0.05 g 维生素 B1/Thiamine HCl (VB1) [337.27] 0.1 g 维生素 B6/Pyridoxine HCl (VB6) [205.64] 0.05 g 甘氨酸 /Glycine [75.07] 0.2 g 肌醇 /Inositol [180.16] 10 g 双蒸水定容至 1 L, 避光 4 o C 保存备用 MSmax 母液 (10X) 硝酸铵 /NH 4 NO 3 [80.04] 16.5 g 硝酸钾 /KNO 3 [101.01] 19.0 g 磷酸二氢钾 /KH 2 PO 4 [136.09] 1.7 g 硫酸镁 /Mg 2 SO 7H 2 O [246.47] 3.7 g 无水氯化钙 /CaCl 2 [110.98] 3.33 g 室温下溶解, 单蒸水定容至 1 L,4 o C 保存备用 MSmin 母液 (100X) 碘化钾 /KI [166] 0.083 g 硼酸 /H 3 BO 3 [61.83] 0.62 g 硫酸锰 /MnSO 4 H 2 O [169.02] 0.652 g 钼酸钠 /Na 2 MoO 4 2H 2 O [241.95] 0.025 g 硫酸铜 /CuSO 4 5H 2 O [249.68] 0.0025 g 氯化钴 /CoCl2 6H 2 O [206.92] 0.0025 g 室温下溶解, 单蒸水定容至 1 L 20

2,4-D 贮存液 (1 mg/ml) 2,4-D C 8 H 6 Cl 2 O 3 [221.04] 100 mg. 1 ml 1 M KOH 溶解 5 分钟, 然后加入 10 ml 加热后的单蒸水溶解完全 定容至 100 ml, 室温保存备用 6-BA 贮存液 (1 mg/ml) 6-BA C 12 H 11 N 5 [225.26] 100 mg. 1 ml 1 M KOH 溶解 5 分钟, 然后加 10 ml 单蒸水溶解完全后 定容至 100 ml, 室温保存备用 NAA 贮存液 (1 mg/ml) NAA C 12 H 10 O 2 [186.21] 100 mg. 1 ml 1 M KOH 溶解 5 分钟, 然后加 10 ml 单蒸水溶解完全后 定容至 100 ml,4 o C 保存备用 IAA 贮存液 (1 mg/ml) IAA C 10 H 9 NO 2 [175.19] 100 mg. 1 ml 1 M KOH 溶解 5 分钟, 然后加 10 ml 单蒸水溶解完全后 定容至 100 ml,4 o C 保存备用 KT 贮存液 (1 mg/ml) KT C 10 H 9 N 5 O [215.21] 100 mg. 1 ml 1 M HCl 溶解 5 分钟, 然后加 10 ml 单蒸水溶解完全后 定容至 100 ml,4 o C 保存备用 21

AS 贮存液 (0.002 M) 乙酰丁香酮 /AS [196.20] 0.392 g 二甲基亚砜 /DMSO 10 ml 分装至 1.5 ml 离心管内,4 o C 保存备用 1 M KOH 贮存液 氢氧化钾 /KOH [56.11] 5.6 g 单蒸水溶解定容至 100 ml, 室温保存备用 CN 贮存液 (50 mg/ml) 羧苄青霉素二钠盐 Carbenicillin Disodium Salt [225.16] 0.5 g CN 溶于 10 ml 双蒸水中 (50 mg/ml) 注意事项 : 分装后,-20 o C 避光保存 CN 在水溶液中会逐渐分解, 配后不宜长期存放 HN 贮存液 (50 mg/ml) 潮霉素 B Hygromycin B C 20 H 37 N 3 O 13 [527.53] 液体贮存液 (50 mg/ml):20 ml( 灭菌的 PBS 中保存 ) Cef 贮存液 (100 mg/ml) 头孢霉素 Cefotaxime Sodium Salt C 16 H 16 N 5 NaO 8 S 2 [477.45] 0.1 g Cef 溶于 1 ml 双蒸水中 (100 mg/ml), 分装后 -20 o C 避光保存 HgCl 2 (10 mg/ml) (10X) 贮存液 HgCl 2 10 g 溶于 1 L 双蒸水中 (10 mg/ml), 室温避光保存 使用时将母液稀释成 1 倍使用 22

十. 组织染色 木质素染色 5 % (w/v) 间苯三酚间苯三酚 5 g 溶于 100 ml 95% 乙醇中注意事项 : 间苯三酚为白色粉末, 见光易氧化, 变为褐色或棕色则不能使用 间苯三酚易氧化, 乙醇易挥发, 因此溶液最好现配现用 染色用量不大, 建议每次配 5-10 ml 胼胝质染色 1> 0.07 M 磷酸盐缓冲液 (ph 9.0) Na 2 HPO 4 2.507 g 溶于 100 ml 单蒸水, 用 4 M NaOH 调 ph 至 9.0 2> 脱色苯胺蓝 (Decolorized aniline blue stain,dabs) Aniline Blue 5 mg 溶于 0.07 M 磷酸缓冲液, 定容至 100 ml 注意事项 : 溶液静置褪色成无色后使用 DABS 将胼胝质 (Callose) 在紫外光下产生黄绿色荧光 纤维素染色 1> 0.1 M Tris-HCl (ph 8.5) Tris-base 1.5764 g 溶于 80 ml 单蒸水,HCl 调 ph 至 8.5, 定容至 100 ml 2> 荧光增白剂 (Calcofluor) 浸没样品约 2.5μl 23

十一. 细胞壁成分测定 0.5 M 磷酸 buffer (ph 7.0) K 2 HPO 4 3H 2 O [228.22] 70.1 g KH 2 PO 4 [136] 26.1 g 单蒸水定容至 1 L 氯仿 - 甲醇 (100 ml) 氯仿 50 ml 甲醇 50 ml DMSO-H 2 O 二甲亚砜 (DMSO) [78] 90 ml 单蒸水 10 ml 0.5% 草酸铵 草酸铵 [124] 2.5126 g H 2 O 500 ml 4 M KOH KOH [56] 112 g NaHB 4 [37.8] 500 mg 单蒸水定容至 0.5 L 注意事项 : 配制时烧杯冷水浴降温, 向 KOH 中缓慢加入单蒸水, 并用玻棒搅拌降温 24

乙酸 - 硝酸 - 水 (8:1:2) 乙酸 80 ml 硝酸 10 ml H 2 O 20 ml H 2 SO 4 - 蒽酮 蒽酮 [194] 0.2 g 浓硫酸 100 ml A 试剂 ( 苔黑酚 ) 苔黑酚 [142] 0.6 g 无水乙醇 10 ml B 试剂 (FeCl 3 ) FeCl 3 [270] 0.1 g 浓盐酸 100 ml 67% (v/v) H 2 SO 4-72% (w/w) H 2 SO 4 浓硫酸 :332.5 ml 溶于 150 ml 水, 冷却后用单蒸水定容至 500 ml 2.88% (w/w) H 2 SO 4 72% (w/w) H 2 SO 4 10 ml 单蒸水定容至 250 ml 25

苯 - 乙醇 苯 [78] 67 ml 乙醇 33 ml Na 2 B 4 O 7 -H 2 SO 4 Na 2 B 4 O 7 10H 2 O [381] 0.5 g H 2 SO 4 100 ml 间羟基联苯溶液 间羟基联苯 0.15 g NaOH [40] 0.5 g 单蒸水定容至 100 ml 2% (w/v) NaHCO 3 NaHCO 3 [84] 2 g 单蒸水 100 ml 1 mm EDTA Na 2 EDTA 2H 2 O [372.24] 0.372 g 单蒸水定容至 1 L 26

十二. 半纤维素单糖测定 0.5 M 磷酸 buffer (ph 7.0) K 2 HPO 4 3H 2 O [228.22] 70.1 g KH 2 PO 4 [136.09] 26.1 g 单蒸水定容至 1 L 氯仿 - 甲醇 氯仿 50 ml 甲醇 50 ml IS 肌醇 [180] 0.2 g 水 100 ml 10% NaHB 4 NaHB 4 [37.8] 1 g 氨水 10 ml 27

十三. 木质素单体测定 苯 - 乙醇 苯 [78] 67 ml 乙醇 33 ml 2 M NaOH NaOH [40] 80 g 用水定容至 1 L 乙基香兰素内标 乙基香兰素 0.4 g 2 M NaOH [40] 100 ml 二氯甲烷 - 乙酸乙酯 二氯甲烷 500 ml 乙酸乙酯 500 ml 6 M HCl 浓盐酸 100 ml 水 100 ml 流动相 甲醇 250 ml 乙醇 10 ml 水 740 ml 28

十四. 纤维素 DP 测定 1 M 铜乙二胺溶液的制备 称取 100 g 分析纯硫酸铜, 放人盛有 800 ml 蒸馏水的 1 L 烧杯中, 加热至沸腾,( 这步直接加入沸水就行 ) 待硫酸铜全部溶解后, 在磁力搅拌器的搅拌下, 缓慢加人约 58 ml 浓氨水, 使硫酸溶液由最初的蓝色转变为翠绿色, 最后变为蓝色 继续搅拌 20 min 后, 静置, 使其沉淀 用广泛 ph 试纸测试上部清液, 如呈弱碱性, 则氨水过量, 可用 1:5 的硫酸中和 倾去上部清液, 用倾斜法反复洗涤沉淀 先用热蒸馏水洗 4 次, 再用冷蒸馏水洗若干次 在搅拌器的不断搅拌下加人约 400 ml 蒸馏水, 搅拌 l0 min 后, 静置 当洗至用 10% 氯化钡溶液检验清液中无硫酸根离子时为止 最后加人足够的蒸馏水于沉淀物中, 使总体积为 600 ml, 置于冰箱中, 冷却至 10 o C 以下 取出后, 不断搅拌, 并缓慢加人 340 ml 20% 的氢氧化钠溶液 ( 预先冷却氢氧化钠溶液 ), 再用倾斜法反复洗涤氢氧化铜沉淀, 至清液用酚酞检验无色时为止 ( 约 13 次 ) 然后, 用足量的蒸馏水将氢氧化铜沉淀移人棕色细口瓶中, 使总体积为 250 ml, 再加人无水乙二胺 40 g ( 含量 98% 的约加人 45 ml), 摇匀后, 静置 1 一 2 天 将上层清液缓缓倒人量筒中记下体积, 移人另一棕色瓶中 ( 原棕色瓶中的黑色沉淀弃去 ), 以备标定 29

十五. 细胞壁降解转化 醋酸 buffer (ph 4.8) NaAc [82.03] 49.2 g 冰醋酸 28.88 ml 单蒸水定容至 5 L 2% NaOH NaOH [40] 2 g 水 98 ml 1%(v/v)H 2 SO 4 H 2 SO 4 1 ml 单蒸水定容至 100 ml 3.2 g/l 纤维素复合酶液 纤维素复合酶 0.32 g 醋酸 buffer (ph 4.8) 100 ml 30

十六. 糖醇转化 磷酸 buffer (ph 4.8) Na 2 HPO 4 [141.96] 0.284 g NaH 2 PO 4 2H 2 O [156.01] 31.2 g 单蒸水定容至 1 L 5% K 2 Cr 2 O 7 K 2 Cr 2 O 7 [294.19] 5 g 单蒸水 50 ml 浓硫酸 10 ml 单蒸水定容至 100 ml 31

十七. 拟南芥消毒 种植 次氯酸钠消毒水 NaClO 溶液 100 ml Triton X-100 100μl 单蒸水定容至 1 L MS 培养基 ( 固体 ) 20 大量元素 50 ml 100 EDTA-Fe 10 ml 1000 微量元素 1 ml 蔗糖 10 g 琼脂 10 g 单蒸水定容至 1 L, KOH 调 ph 至 5.8 MS 培养基 ( 液体 ) 20 大量元素 50 ml 100 EDTA-Fe 10 ml 1000 微量元素 1 ml 蔗糖 10 g 单蒸水定容至 1 L, KOH 调 ph 至 5.8 32

1/2 MS 培养基 ( 固体 ) 20 大量元素 25 ml 100 EDTA-Fe 5 ml 1000 微量元素 500μl 蔗糖 10 g 琼脂 10 g 单蒸水定容至 1 L, KOH 调 ph 至 5.8 1/2 MS 培养基 ( 液体 ) 20 大量元素 25 ml 100 EDTA-Fe 5 ml 1000 微量元素 500μl 蔗糖 10 g 单蒸水定容至 1 L, KOH 调 ph 至 5.8 33

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