DOI:1.3969/j.issn.15-6521.217.16.35 食品研究与开发 Food Research And Development 217 年 8 月第 38 卷第 16 期 157 MAE-LC-AFS 测定鸡蛋中阿散酸 洛克沙砷 硝苯砷酸 姜涛 1,2, 崔颖 2, 倪松 2 (1. 天津科技大学食品工程与生物技术学院, 天津 3461;2. 天津出入境检验检疫局, 天津 3461) 摘要 : 建立微波辅助萃取 - 液相色谱 - 原子荧光光谱法 (Microwave Assisted Extraction-Liquid Chromatography-atomic Fluorescence Spectrometry,MAE-LC-AFS) 测定鸡蛋中阿散酸 (Arsanilic, ASA) 洛克沙砷 (Roxarsone, ROX) 硝苯砷酸 (Nitarsone, NIT) 的分析方法 研究并优化液相色谱和原子荧光的工作条件 在 ~2. mg/l 范围内阿散酸 硝苯砷酸和洛克沙砷的线性关系良好, 线性相关系数大于.999, 阿散酸 硝苯砷酸 洛克沙砷检出限 (S/N=1) 分别为.1.2.2 mg/kg 阿散酸在.1.2.5 mg/kg 3 个加标水平下的平均回收率为 8.5 %~91. %, 相对标准偏差为 3.14 %~ 3.77 %; 硝苯砷酸和洛克沙砷在.2.5 2 mg/kg, 3 个加标水平下平均回收率为 81. %~91.1 % 和 82.5 %~14.9 %, 相对标准偏差为 2.72 %~4.2 % 和 1.81 %~7.52 % 关键词 : 微波辅助萃取 ; 液相色谱 - 原子荧光 ; 鸡蛋 ; 阿散酸 ; 硝苯砷酸 ; 洛克沙砷 Determination of Arsanilic,Nitarsone and Roxarsone in Eggs by MAE-LC-AFS JIANG Tao 1,2,CUI Ying 2,NI Song 2 (1. College of Food Engineering and Biotechnology, Tianjin University of Science & Technology, Tianjin 3461,China;2.Tianjin Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Tianjin 3461,China) Abstract: A method for determination of arsanilic (ASA),nitarsone (NIT) and roxarsone (ROX) residues in eggs was developed by Microwave Assisted Extraction-Liquid Chromatography-atomic Fluorescence Spectrometry (MAE-LC-AFS).The working conditions of liquid chromatography and atomic fluorescence were studied and optimized. The linearity of arsanilic, nitarsone and roxarsone in the range of -2. mg/l was good, linear correlation coefficient was greater than.999. The detection limits of ASA, NIT and ROX were.1,.2,.2 mg/kg,respectively. The average recoveries of arsanilic were 8.5 %-91. % at the levels of.1,.2,.5 mg/kg, RSDs were 3.14 %-3.77 %. The average recoveries of nitarsone and roxarsone were 81. %-91.1 % and 82.5 %- 14.9 % at the levels of.2,.5,2. mg/kg, RSDs were 2.72 %-4.2 % and 1.81 %-7.52 %. Key words: Microwave Assisted Extraction(MAE);Liquid Chromatography-atomic Fluorescence Spectrometry(LC- AFS);eggs;arsanilic(ASA);nitarsone(NIT);roxarsone(ROX) 砷是一种有毒的非金属元素, 按其存在形式分为无机砷和有机砷, 其中部分有机砷毒性较小而作为一种饲料添加剂广泛应用于养殖业, 如阿散酸 (Arsanilic, ASA) 洛克沙砷 (Roxarsone, ROX) 硝苯砷酸 (Nitarsone, NIT) 有机砷在畜禽产品中存在蓄积作用, 过量的砷会导致畜禽多重器官组织功能紊乱和器质性病变, 其蓄积作用也会通过生物链间接对人类健康造 作者简介 : 姜涛 (1987 ), 男 ( 汉 ), 助理农艺师, 本科, 主要从事食品检测 [1-3] 成影响, 所以砷含量是国家卫生标准的一项重要指 [4-6] 标 目前对有机砷的研究主要集中在饲料和肉类食 [7] 品中, 对蛋类中有机砷含量的研究较少, 蛋类在人类食物结构中占有极其重要的位置, 所以测定蛋类中的有机砷含量对于提高百姓餐桌上的安全性以及保障人民群众的身体健康有着重要意义 食品中有机砷的测定方法有原子荧光光谱法 电感耦合等离子体质谱法 (Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry, ICP-MS) 原子吸收光谱法 比色法
158 等, 其中原子荧光光谱法是近几年发展起来的一种新 [8] [9] 型痕量元素分析技术, 具有简便快速 灵敏度高 共 [1] [11] 存元素干扰少 适用于多元素同时分析等优点, 广泛应用于食品中砷元素的检测 样品测定前需要预先消化, 微波消解作为一种新型的消解方式, 具有空白值低 消解速度快 待测元素损失率低和样品被污染的可能性低等优点, 同时降低了劳动强度及分析成本, 并改善了工作环境 目前在各种样品的消解处理 [12-14] 中已得到广泛应用 1 材料与方法 1.1 仪器与试剂 LC-AFS98 液相色谱 - 原子荧光联用仪 : 北京海光仪器公司, 由液相色谱仪 ( 包括液相色谱泵和进样装置 ) 与原子荧光光谱仪组成 ;Explorer48 微波辅助萃取仪 : 美国 CEM 公司 ;T18 均质器 : 德国 IKA 公司 ; LD4-2 型离心机 : 北京医用离心机厂 ; 超纯水仪.45 μm 滤膜 : 美国 Millipore 公司 ; 反相 C18 色谱柱 : (1) mm 4.6mm,5μm,DIKMA 公司, 型号 Cat.no: 9963;(2) mm 4.6 mm,5 μm,waters 公司, 型号 WAT54275;(3) mm 4.6 mm,5 μm,phenomenex 公司, 型号 G-425-E 阿散酸 (p-arsanilic acid,cas 编号 :245--3, C 6 H 8 AsNO 3 ) 标准品 ( 纯度大于等于 99 %,Dr.Ehrenstorfer GmbH, 德国 ); 洛克沙砷 (3-Nitro-4-hydroxy-phenylarsonic acid,cas 编号 :121-19-7,C 6 H 6 AsNO 6 ) 标准品 ( 纯度大于等于 97.5 %, Dr. Ehrenstorfer GmbH, 德国 ); 硝苯砷酸 (4-Nitrophenylarsonic acid,cas 编号 :98-72- 6,C 6 H 6 AsNO 5 ) 标准品 ( 纯度大于等于 95 %, 日本和光纯药工业株式会社 ); 甲醇为色谱纯 ; 盐酸为优级纯 ; 三氟乙酸 氢氧化钠 硼氢化钾 磷酸二氢钾均为分析纯 ; 试验用水为超纯水, 鸡蛋为市售 阿散酸标准储备溶液 : 准确称取适量的阿散酸标准品, 用去离子水配成浓度为 5 μg/ml 的标准储备液 根据需要用去离子水稀释成适当浓度的标准工作液 洛克沙砷标准储备溶液 : 准确称取适量的洛克沙砷标准品, 用去离子水配成浓度为 5 μg/ml 的标准储备液 根据需要用去离子水稀释成适当浓度的标准工作液 硝苯砷酸标准储备溶液 : 准确称取适量的硝苯砷酸标准品, 用去离子水配成浓度为 5 μg/ml 的标准储备液 根据需要用去离子水稀释成适当浓度的标准工作液 1.2 液相色谱 - 原子荧光联用分析条件 液相色谱条件为色谱柱 : 反向 C18 色谱柱 ( 柱长 mm, 粒径 4.6 mm), 或相当者 ; 流动相为甲醇 - 磷酸二氢钾溶液 (5+95, 体积比 ); 流速 :1.2 ml/min; 进样量 1 μl 原子荧光工作条件为灯电流 :1 ma; 负高压 : 32 V; 载气流速 :4 ml/min; 屏蔽气流 :95 ml/min 1.3 样品前处理取一颗鸡蛋, 去壳, 把蛋清蛋黄搅匀, 放于均质器均质 5 min, 备用 2 结果与讨论 2.1 微波萃取条件的选择 称取试样 1 g( 精确至.1 g) 于微波辅助萃取内罐中, 加入 1 ml 甲醇溶液, 按照微波辅助萃取仪的标准操作步骤进行提取 提取完毕, 取出冷却至室温, 1 r/min 离心 1 min 取 4 ml 上清液, 氮气吹扫, 用甲醇溶液定容至 2 ml, 经.45 μm 有机滤膜过滤后 进行测定 按同一操作方法作空白试验 2.1.1 萃取剂浓度的选择 分别用浓度为 1 % 2 % 3 % 4 % 5 % 的甲醇溶液, 测试加.2 mg/kg 阿散酸 洛克沙砷和硝苯砷酸的混合标液的鸡蛋样品的加标回收率 微波萃取仪萃取时间为 4 min, 萃取温度为 5 不同浓度的甲醇溶液提取效率如图 1 Fig.1 由图 1 可知, 随着甲醇溶液浓度的增加, 提取效果逐渐提高, 但是当甲醇溶液提高到一定程度时, 提取 效率反而下降 因此最终选择甲醇溶液体积分数为 3 % 92 9 88 86 84 82 8 78 图 1 2.1.2 萃取时间的选择 1 2 3 4 5 6 甲醇溶液浓度 /% 甲醇溶液浓度对萃取率的影响 标准与检测 Effect of methanol concentration on extraction rate 萃取时间是影响萃取效果的重要因素 试验分别选择 2 4 6 8 1 min 的萃取时间, 微波萃取仪萃取浓度为 3 %, 萃取温度为 5, 有机砷混合标液萃取效果如图 2 由图 2 可知, 随着萃取时间的增加, 萃取 效果越高, 萃取时间超过 6 min 后, 萃取效果提高不
明显 为提高工作效率, 最终选择萃取时间为 6 min Fig.2 95 9 85 8 75 7 65 6 55 2 4 6 8 1 12 图 2 时间 /min 萃取时间对萃取率的影响 Effect of extraction time on extraction rate 液 (1 mg/l) 的峰面积 Fig.4 图 4 2 15 1 5 1 2 流动相浓度 /% 159 阿散酸硝苯砷酸洛克沙砷 不同浓度流动相对应砷形态的相对峰面积 Relative peak area of arsenic species in different mobile phases 3 2.1.3 萃取温度的选择微波萃取仪的使用温度范围为 -8 ~3 试验分别设定 45 55 65 75 85 的萃取温度, 甲醇溶液浓度为 3 %, 提取时间为 6 min, 不同萃取温度效果如图 3 由图 3 可知, 最佳萃取温度为 65 Fig.3 95 9 85 8 75 7 65 6 55 4 5 6 7 8 9 图 3 经过对影响萃取效果的 3 个因素的试验, 最终选择萃取剂浓度为 3 % 甲醇溶液, 萃取时间为 6 min, 萃取温度为 65 2.2 液相色谱条件的选择 温度 / 萃取温度对萃取率的影响 Effect of extraction temperature on extraction rate 2.2.1 流动相的选择在反相色谱分离中, 流动相通常选择甲醇或乙腈与水的混合物 本试验选择甲醇和水的混合溶液作为流动相 但如果只是简单改变甲醇和水的不同体积比混合溶液作流动相, 对于改善各有机砷形态的峰形和分离度没有多大影响 因此, 通常在反相色谱流动相中添加乙酸 三氟乙酸或甲酸等酸性缓冲液或者磷酸氢二钠 磷酸二氢钾或磷酸氢铵等缓冲盐, 这样就有助于改善色谱峰形并且提高色谱峰的分离度 试验选择甲醇和含.1 % 三氟乙酸的.5 mol/l 磷酸二氢钾溶液的体积比分别是 :5 95 1 9 15 85 2 8, 通过试验条件的优化, 最终选择 5 % 甲醇 -.1 % 三氟乙酸.5 mol/l 磷酸二氢钾为最佳流动相 图 4 为不同甲醇和含.1 % 三氟乙酸的.5 mol/l 磷酸二氢钾溶液的体积比条件下阿散酸 硝苯砷酸和洛克沙砷混合标准 2.2.2 色谱柱的选择试验使用了 3 种反相 C18 色谱柱进行测试, 规格为 mm 4.6 mm,5 μm 试验结果表明(1) 组分分离情况不好 ;(2) 柱效好, 分离时间短 ;(3) 分离效果好, 价格便宜, 能满足实际需要 从实用性和性价比考虑, 最终选择 (3) 作为试验色谱柱 2.3 原子荧光工作条件的选择 2.3.1 光电倍增管负高压和灯电流的选择增大光电倍增管负高压可提高荧光强度, 但噪声也相应增大, 当负高压增大到一定程度时, 信噪比反而开始下降 试验考察了负高压为 3 31 32 33 34 V 时的各砷形态信噪比, 如表 1 结果表明当负高压为 32 V 时, 各砷形态信噪比最高 表 1 负高压对砷形态信噪比的影响 Table 1 Effect of negative high voltage on signal-to-noise ratio of arsenic species 信噪比 /db 负高压 /V ASA ROX NIT 3.72.75.7 31.86 32.99.99.99 33.9.88 34.84.83 2.3.2 灯电流的选择增大空心阴极灯的灯电流, 荧光强度也随着增强, 但是当灯电流过大时会发生自吸现象, 此时荧光强度反而减弱, 并且过大的灯电流会缩短灯的使用寿命 试验考察灯电流为 8 9 1 11 12 ma 时的荧光强度, 结果表明当灯电流为 1 ma 时, 荧光强度最高 2.3.3 载气流速的选择载气在氢化反应过程中起着将氢化物带入到原子化器中和提供氩氢火焰燃烧需要的氩气的作用 当
载气流量较小时, 形成的氩氢火焰不够稳定, 导致测量的重现性不好 当载气流量增大到一定程度时又会冲淡稀释氢化物, 导致荧光强度降低, 过大的载气流量甚至会冲断氩氢火焰, 导致测量不到荧光信号 试验考察了载气流速为 2 ml/min~6 ml/min 时对荧光强度的影响, 结果见图 5, 可知, 当载气流速为 4 ml/min 的时候, 荧光强度最高 因此, 试验选择 4 ml/min 的载气流速 Fig.5 图 5 2.3.4 屏蔽气流速的选择屏蔽气作为氩氢火焰的外围保护气体, 能够防止周围空气将原子蒸汽氧化, 从而使氩氢火焰保持稳定状态 试验考察屏蔽气流速为 75 85 95 1 5 1 15 ml/min 时对荧光强度的影响, 结果见图 6 Fig.6 16 由图 6 表明, 当屏蔽气流量达到 95 ml/min 时, 荧光强度最高 因此, 试验选择屏蔽气的最佳流速为 95 ml/min 35 3 2 15 1 5 18 28 38 48 58 68 载气流量 /(ml/min) 载气流量对砷形态荧光信号强度的影响 Effect of carrier gas flow on fluorescence signal intensity of arsenic species 图 6 阿散酸 洛克沙砷 3 硝苯砷酸 2 15 1 5 7 8 9 1 1 1 1 2 载气流量 /(ml/min) 屏蔽气流量对砷形态荧光信号强度的影响 Effect of shield gas flow rate on fluorescence signal intensity of arsenic species 2.3.5 硼氢化钾质量浓度的选择当硼氢化钾浓度较低时, 氢化反应不完全, 而当硼氢化钾浓度过高时产生了过多的氢气, 导致样品的氢化物浓度被稀释, 灵敏度下降 试验考察了硼氢化钾质量浓度在 5. g/l~3. g/l 范围内对.2 mg/kg 混合标准溶液荧光强度的影响, 结果见图 7 从图 7 可以看出, 当达到 2. g/l 时, 荧光强度最大 之后随着硼 氢化钾浓度再升高, 荧光强度开始降低 试验选择硼氢化钾溶液的浓度为 2. g/l Fig.7 2.4 检出限 线性范围及线性关系在优化条件下, 以峰面积对浓度作图, 得到阿散酸 硝苯砷酸和洛克沙砷的线性范围 相关系数 线性方程及检出限见表 2 表 2 在所测定的浓度范围内,3 种有机砷形态化合物的线性相关系数均大于.999 2.5 加标回收率在鸡蛋样品添加不同浓度的阿散酸 硝苯砷酸和洛克沙砷, 通过 MAE-LC-AFS 的分析结果见表 3 由表 3 可知, 阿散酸的加标回收率在 8.5 %~91. % 之间, 硝苯砷酸的加标回收率在 81. %~91.1 % 之间, 洛克沙砷的加标回收率在 82.5 %~14.9 % 之间, 阿散酸的相对标准偏差小于 7.52 % 3 结论 3 2 15 1 5 图 7.3 5.3 1.3 15.3 2.3 25.3 3.3 35.3 硼氢化钾浓度 /(g/l) 硼氢化钾浓度对砷形态氢化物发生的影响 Effect of KBH 4 concentration on arsenic hydride formation 阿散酸 硝苯砷酸 洛克沙砷的线性范围 线性方程和相关系数 Table 2 名称 The linear range,linear equation and correlation coefficient of ASA,ROX and NIT 相对保留 时间 /min 3.85 1.89 16.47 线性范围 / (μg/l) ~12 ~12 ~12 线性方程 Y=2269.X-843.7 Y=1564.7X-256.5 Y=1461.4X-286.9 标准与检测 相关系数.999 7.999 2.999 4 采用微波辅助萃取 (Microwave Assisted Extraction, MAE) 的前处理方法, 液相色谱 - 原子荧光 (Liquid Chromatography-atomic Fluorescence Spectrometry, LC- AFS) 联用技术测定鸡蛋中阿散酸 洛克沙砷和硝苯砷酸 3 种有机砷形态, 阿散酸在.1.2.5 mg/kg 3 个加标水平下的平均回收率为 8.5 %~91. %, 相对标准偏差为 3.14 %~3.77 %; 硝苯砷酸和洛克沙砷在.2.5 2 mg/kg, 3 个加标水平下平均回收率为 81. %~
表 3 阿散酸 洛克沙砷和硝苯砷酸回收率和相对标准偏差 Table 3 Recoveries and relative standard deviation of ASA,ROX and NIT 161 项目 阿散酸硝苯砷酸洛克沙砷.1 mg/kg.2 mg/kg.5 mg/kg.2 mg/kg.5 mg/kg 2. mg/kg.2 mg/kg.5 mg/kg 2. mg/kg 测定值 /(mg/kg).84.174.442.179.47 1.695.168.489 1.842.83.162.413.175.436 1.756.167.494 1.736.84.163.436.162.435 1.821.168.423 1.745.87.161.446.168.417 1.698.165.457 1.843.91.175.451.163.419 1.762.172.487 2.98.85.164.447.166.416 1.784.173.421 1.746 平均值 /%.86.167.439.169.422 1.753.169.462 1.835 回收率范围 /% 83.~91. 8.5~87.5 82.6~9.2 81.~89.5 81.4~87.2 84.8~91.1 82.5~86.5 84.2~98.8 86.8~14.9 标准偏差 SD.3.6.14.7.11.49.3.33.138 相对标准偏差 RSD/% 3.44 3.77 3.14 4.2 2.72 2.8 1.81 7.25 7.52 91.1 % 和 82.5 %~14.9 %, 相对标准偏差为 2.72 %~ 4.2 % 和 1.81 %~7.52 % 本方法操作简单快速 检出限低 重现性好, 是一种适用于鸡蛋中砷形态检测的有效方法 参考文献 : [1] Xueping Liu,Wenfeng Zhang,Yuanan Hu,et al.arsenicpollution of agricultural soils by concentrated animal feeding operations(cafos) [J].Chemosphere,215,119(1):273-281 [2] 刘英俊, 朱晓华, 兰方菲, 等. 饲料中的砷制剂和氟化物对畜禽的作用及其对环境的影响 [J]. 畜牧与兽医,213,45(2):87-9 [3] 唐志刚, 温超, 周岩民. 动物源性食品重金属污染现状及其饲料控制技术 [J]. 粮食与饲料工业,212,12(5):42-44,48 [4] 季伟. 一种检测饲料中无机砷含量的方法 [J]. 中外食品工业,215 (8):58 [5] 赖亮阳, 华永标, 黄冬兰, 等. 微波消解 -ICP-AES 法测定饲料中的铅 铬和砷 [J]. 广东化工,216,43(1):124-125 [6] 杜英秋.AFS 法和 ICP-MS 法测定饲料中砷和汞的比较 [J]. 粮食与饲料工业,215(5):62-64 [7] 肖亚兵, 高健会, 曾宇, 等.HPLC-ICP-MS 法对动物源性食品中阿散酸 硝苯砷酸与洛克沙砷残留量的同时测定 [J]. 分析测试学报,28,27(11):126-129 [8] 郭同兵, 黄谦, 刘剑波. 微波消解氢化物原子荧光法测定食品中的砷和汞 [J]. 食品与机械,211,27(4):87-89,18 [9] 赵国品, 魏永义, 张莉. 午餐肉罐头中砷含量的测定 [J]. 肉类工业, 211(12):23-24 [1] 姚焕英, 祝保林. 氢化物发生 - 原子荧光光谱法测定淡水鱼中砷和汞 [J]. 光谱实验室,29,26(3):499-53 [11] 骆斌, 胡星云. 刘金娥, 等. 氢化物发生 - 原子荧光光谱法同时测定环境水中的砷和汞的研究 [J]. 西南民族大学学学报 ( 自然科学版 ),29,35(2):319-322 [12] 李俊玲, 徐燕, 王家保. 保健食品中铅 砷 汞微波消解前处理方法的研究 [J]. 职业与健康,25,21(9):1317-1319 [13] 张磊, 王晓艳, 李波. 微波消解技术在金属分析中的应用 [J]. 光谱实验室,21,27(3):953-957 [14] 聂容春, 罗乐, 徐初阳, 等. 不同消解方法对定量研究样品中有毒有害元素的影响 [J]. 现代化工,212,32(8):112-115 收稿日期 :216-11-18 888888888888888888888888888888888888888888888888