('!0!&''&)!"''!% 中国临床医学 年 月 第 卷 第 期 2*'00 论 著 早期乳腺癌患者循环肿瘤细胞 1 磷脂酰肌醇 / 激酶基因突变分析 及其与患者临床病理特征的相关性 林 健 贾淞淋 方 敏 吴雅妮 刘超乾 苏东玮 于 跃 李恒宇 盛 盢 海军军医大学附属长海医院甲状腺乳腺外科 上海 摘要 目的 检测早期乳腺癌患者循环肿瘤细胞 '&',.!0- 计数及其 -+ 磷脂酰肌醇 激酶 + 基因突变情况 探讨基因突变结果与患者临床病理特征的相关性 方法 收集 例乳腺癌和良性乳腺肿瘤确诊患者的 临床资料及血液 尿液标本 采用!!&( 法检测患者外周血 - 数目 采用微滴式数字 +3"! "','&+3""+3 技术检测患者血 - 和尿标本中 -+383:3: 和 +/:3 基因位点突变情况 分析基因突变情况与患者临床病理特征 发病年龄 肿瘤大小 组织学分级 分子分型 腋窝淋巴结转移和 ' 指数等 间的相 关性 结果 最终纳入 例患者 患者血 - 和尿标本中共获得 个基因检测结果 其中发生基因突变的 个 < 种基因位点的突变率不同 差异有统计学意义 " 突变率最高的基因是 -+3: 有 个突变 < 突 变率最低的是 +/ 仅发生 个 < 突变 - 血和尿标本间 种基因位点的突变率差异有统计学意义 "> ""> 类样本中突变率最高的基因都是 -+3: 乳腺癌分子分型和 ' 指数与 - 标 本中 -+38 基因突变相关 ">"> 而腋窝淋巴结转移可能与 - 标本中 -+3: 基因突变 有关 "> 结论 早期乳腺癌患者的肿瘤分子分型和 ' 指数与 - 中 -+38 基因突变相关 而腋窝淋巴 结转移可能与 - 中 -+3: 基因突变相关 提示 - 标本中 -+ 基因突变是早期乳腺癌治疗方案选择及预后判 断的潜在指标 关键词 乳腺肿瘤 肿瘤细胞 循环 % 突变分析 -+ 磷脂酰肌醇 激酶 尿液检查 中图分类号 3 文献标志码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收稿日期 接受日期 基金项目 国家自然科学基金青年项目 第二军医大学精准医学转化应用研究专项 99!"#$?( +*! %&'&%&&'!!"&'('&&" (!!'&3!0!&(+,&.+!'0')!"''!-&0.&' &"'&'#$!")''&$)!"'&5';!0'$99 作者简介 林 健 硕士 住院医师 /.&'. 通信作者!0"',&(0-!/.&'"($6.&'.-!/.&'0(!,$&.
中国临床医学 年 月 第 卷 第 期 ('!0!&''&)!"''!% #!1!!-+,!!.&'&" (!''&(,'&!&!00.!&'!01'(#!&0 &!-(!.!& $! #!&0 &!&" (!"!,!!'1!!!&!"1'( (!.&'-+38'-0!'.!'0(!0/6& -!0 >">">-(!&6'&$$.("!.!&0&0'01&0!&!" (!.&'-+3:,!!'-0!'.!0">(-(!.!&&0''&'#!&0&!&" (!"!,!!..&!' &!&0'&!"1'(-+ 38.&''-0!'.!0.&'!01'(!&$#!&0 &!6'&$$.("!.!&0&0'0.&$&0#!&0'&!"1'(-+3:.&''-0!'.!0'00,,!0!" (& (!.&'-+,!! '-0!'.!0.&$#!&!'&'"'&(!0!!'!&.!!,'.!&",0'0!&$#!&0&! $!%#!&0!&0.0!&0'!0'&',%.&'&&&$0'0-++0$ 乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一 晚期预后较差 因此早期监测肿瘤负荷对评判治疗效果 和预防疾病进展非常重要 '0&'' 等 采 用!!&( 法对外周血循环肿瘤细胞 '&',.!0- 进行筛选计数 证实 - 是转移性乳腺癌进展和患者生存的独立预后因素 - 数 量升高 个.7 与预后不良及乳腺癌进展 密切相关 肿瘤患者体内来自肿瘤细胞的 % 会 持续释放入血或其他体液形成循环肿瘤 % '&',.%% 是反映转移性乳 腺癌治疗反应特异性和敏感性最高的生物学指 标 % 包含肿瘤特异性的基因突变 可作为 一种特异性的基因标志或生物标志物 乳腺癌最常见的突变基因是 -+ 和磷脂酰肌 醇 激酶 (0(&'"$'0''&0!+ 抑癌基因 -+ 突变与多种人类肿瘤发生和发展密 切相关 乳腺癌患者 -+ 的突变率为 < < -+ 常见的突变位点有 3: 38 和 3: 等 这些突变常导致下游基因的激活功能丢失 基因组稳定性降低 + 信号通路异常激活与乳腺癌的发生和发展密切相 关 约 < 的乳腺癌中发现 + 突变 其常见突 变位点是 + 基因编码螺旋形区域的 / 和 / 位点及编码激酶区域的 :3 位点 这些突变会导致下游信号增强 促肿瘤发生和发展 -+ 和 + 基因不同位 点的突变与肿瘤不同的发生 发展和预后相关 因此 -++ 突变检测常被用于各类肿瘤治疗 管理 &10 等 发现转移性乳腺癌中 % -++ 突变位点的检测能更敏感 更早期地预测乳腺癌的治疗反应和疾病进展情况 因此 本研 究选择 -+ 基因的 383: 3: 位点及 + 基因的 / :3 位点进行检测 已有研究 采用检测 尿液 % 特定基因突变诊断列腺癌或膀胱癌甚 至监测非小细胞肺癌 但尚无利用尿液来监测早期 乳腺癌的报道 因此 本研究尝试采用尿液作为检 测标本来源 为了进一步探讨 -++ 突变在早期乳腺 癌中的作用 本研究收集了患者的血液和尿液标 本 采用!!&( 法采集血中 - 并检测其数 目 并采用微滴式数字 +3""+3 技术检测患者 血 - 及尿标本中 -+38-+ 3:-+3:+/ 和 +:3 共 种基因位点的突变情况 同时收集所有患者的临床资料 分析基因突变和临床 病理特征间的相关性 探讨 --++ 基因突 变检测对乳腺癌诊疗和预后的判断作用 以期在早 期乳腺癌防治上寻找更有价值的生物学指标 & 资料与方法 一般资料 选择 年 月 月海军军医大学附属长海医院收治的女性乳腺癌患者和良性 肿瘤患者共 例 纳入标准 无其他肿瘤病史 术前未进行过任何抗肿瘤治疗 病理证实为 乳腺癌或乳腺良性肿瘤 术前检查无转移相关 证据 无其他严重系统性疾病或感染 其中 例乳腺癌初诊患者接受手术治疗 例良性乳腺肿 瘤患者接受肿块切除 例患者入院前已接受过乳 腺肿块切除手术 其免疫组织化学检测结果未携 带 因此未被纳入本研究 所有患者发病年龄为 岁 平均 = 岁 其中 例乳腺癌患者平均年龄为 = 岁 例乳腺癌患者按分子分型 7.'& 型 例 <7.'& 型 例 < :/3 阳性型 例 < 三阴性 例 < 根据临床分期 最多的是 期 例 < 其余 分别为 期 例 < 期 例 < 期 例 < 期 例 < 期
('!0!&''&)!"''!% 中国临床医学 年 月 第 卷 第 期 例 < 按病理类型 浸润性导管癌 例 < 导管原位癌 例 < 非特殊性浸润 癌 例 < 多形性癌 例 < 髓样特征的 浸润性癌 例 < 例良性肿瘤患者均为乳 腺纤维腺瘤 所有患者的临床信息均从医院电子病历管理 系统中提取 本研究经医院伦理委员会审核批准 参与研究的患者均签署了正式的知情同意文件 病理学检查 乳腺癌的组织类型 组织分级 雌激素受体 /3 孕激素受体 +3:/3 和 ' 水平等均来自患者的病理报告 其中 /3+3 :/3 和 ' 指数等来自免疫组织化学染色结果 :/3 表达是免疫组织化学检测和 或 荧光 原位杂交 : 结果 :/3 阳性是指免疫组织 化学检测结果为 和 或 : 结果 :/3 阴性是指免疫组织化学检测结果为 A 和 或 : - 计数 术前抽取.7 静脉全血于含 /- 抗凝及细胞防腐剂的!&;! 管中 室温保存 ( 内 采用!!&( 系统!'"!6 分离和 计数 - 采用!!&(/'(!'&!' 处 理标本 结果用!'!&$! 分析 荧光染 色特性为 /) AA+A 和 的细胞即为 - 血浆 尿液的收集及 % 抽提 术前使用 - 管抽取至少.7 全血 并留取.7 尿液 血标本抽取后 ( 内分别以 B& 和 B &C 离心.' 去除血细胞 每.7 上清液分装到.7 离心管中 C 冻存 然后根据 操作手册 使用 8&.'&',%!''" ' 德国 8'&,! 公司产品 抽提血浆中 % 尿液 - 的 % 抽提参考既往文献 进行 基因突变检测 按照 84 -) 微滴式数字 +3"! "','&+3""+3 系统 美国 ' 3&" 公司产品 操作说明进行基因突变检测 ""+3 反应体系共 7 包括 7B""+3!)'67% 模板 7 引物.'6 和 7 去离子水 将 7 反应体系依次加入 孔板 随 后加入 7 微滴发生油 在自动微滴发生器中生 成微滴 微滴生成结束后 将 孔板放入热封仪中 封铝膜 随后放入 +3 扩增仪进行 +3 扩增 +3 反应程序 C.'C0C.' 个循环 最后 C.' 扩增结束后采用 84! 3!&"! 软件进行分析 并用 8&& 分析软件计算突变等位基因浓度 '!0 7)5- 引物由生工生物工程 上海 股份有限公司合成 引物序列信息参考以往文 献 报道 统计学处理 采用 + 统计软件进行统计学分析 连续型数据采用 = 表示 各变量间 比较采用 检验或 '0(! 精确检验 检验水准 为 结 果 - 计数 共 例女性乳腺癌或良性肿瘤患者接受了 - 筛查和血 尿 -++ 基因检 测 其中 例乳腺癌患者因就诊前已在外院接受乳 腺肿块切除术而缺乏免疫组织化学检测结果 因此 被排除出研究 纳入研究的 例患者中 良性肿瘤 患者 例 均未检测到 - 乳腺癌患者 例 其 中 例 < 未检测到 - 例 < 检测 到 -- 个者 例 <- 数值范 围为 平均数为 = 中位数为 按临床分期 除 期患者外 其余均检测到 - 其中 和 期患者全部检测到 - 期 患者检测到 - 较多 平均数目为 按分子分 型 7.'& 和三阴性乳腺癌全部检测到 - 其中 - 检测数目最高的为三阴性乳腺癌 平均 - 检测数为 岁的患者 - 检出率较高 ">- 与患者其他临床病理特征的相 关性无统计学意义 -++ 基因突变 总体突变情况 例患者血 - 和尿标本 共获得 个基因检测结果 种检测的基因位 点总共有 个发生突变 < 各基因突变率 不同 最高的是 -+3: 有 个 < 突变结果 -+38-+3: 和 +:3 分别有 << 和 < 个突变结果 最低为 +/ 仅 个 < 发生突变 种基因位点间突变率差异有统计学意义 >" 三类标本总体基因突变情况 血 - 和尿三类标本中检测到 种基因突变分别为 个 < 个 < 和 个 < 突变率差异 无统计学意义 >"> 良恶性肿瘤 种基因突变情况 结果显示
中国临床医学 年 月 第 卷 第 期 ('!0!&''&)!"''!% 每类标本的每种基因突变在良恶性肿瘤间突变构 成情况无差异 个基因突变结果中 乳腺癌的 -+383:3: 及 + /:3 突变数分别为 个 良性肿瘤的这 种基因突变数分别为 统计分析显示在良恶性肿瘤间 种基因突变构成差异无统计学意义 "> 三类标本中 种基因突变情况 血 - 尿三类标本中 种基因突变分布情况差异有统计学 意义 >" 其中 份 - 标 本中 突变率最高的是 -+3: 有 份 < 发生突变 -+38 和 -+ 3: 均有 份发生突变 <+ :3 有 份 <+/ 无突 变 种基因突变率差异有统计学意义 "> 份血标本中 突变率最高的是 -+3: 有 份 < 发生突变 -+38 和 -+3: 分别有 份 < 和 份 < 发生突变 + / 和 + :3 均无突变 种基因突变率差异有统计 学意义 >" 份尿标本中 突变率最高的是 -+3: 有 份发生突 变 <-+38 和 -+3: 均有 份 < 发生突变 +:3 有 份 < 发生突变 最低的是 +/ 仅 份 < 发生突变 种基因突变率差异有统计学意义 >"> -++ 突变与乳腺癌临床病理特征的相关性 结果 表 表明 乳腺癌分子分型和 ' 指数与 - 中 -+38 突变相关 '0(! /6& -!0>">"> 其中 7.'& 型和 ' 指数小于 < 的乳腺癌 -+38 突变率较高 提示在治疗 7.'& 型乳腺癌时需要考虑 -+38 基因突变带来的内分泌药物抵抗等因素 腋窝淋巴结转移可 能与 - 标本中 -+3: 基因突变有关 "> 其中发生淋巴结转移的乳腺癌患者 -+3: 未突变较多 未在血标本中检测到 7.'& 型患者有基因突变 而且年龄小于 岁的乳腺癌患者未检测到 - 标本有基因突变 其 余临床病理特征与基因突变间无明显相关性 讨 论 - 是转移性乳腺癌进展和生存的独立预后 因素 众多围绕 - 数量 表型甚至单细胞测序 等开展的研究进一步证实 - 对乳腺癌转移具有 监测作用 并已被应用于晚期乳腺癌的疗效评 估和预后判断 然而针对早期乳腺癌 - 的 作用还不确切 本课题组前期针对早期非转移性乳腺癌检测 - 时发现 肿瘤负荷重和激素受体阴性的乳腺癌患者往往 - 数量高 :/3 阳性和三阴性乳腺 癌中 - 较少表达角蛋白 提示激素受体阴性可能 与 - 上皮 间质转化有关 本研究再次证实 临床分期较高或三阴性乳腺癌患者的 - 数量 较多 本研究进一步将 - 与 % 基因突变相结 合来分析乳腺癌患者的临床病理特征 通过 ""+3 检测 - 中 -+ 和 + 基因的突变情况 分析结合 - 和 -++ 突变检测对乳腺 癌肿瘤负荷和疗效监测及预后评估的作用 结果 发现 在早期乳腺癌中分子分型和肿瘤指标 ' 与 - 标本中 -+38 基因突变相关 腋 窝淋巴结转移情况可能与 -+3: 基因突 变有关 提示这两种基因突变检测对确定早期乳腺 癌的治疗方案及判断患者预后具有很好的指导作 用 由于样本量有限 本研究尚未发现早期乳腺癌 - 与其他临床病理特征的相关性 这与之前的研究 结果一致 但通过检测 - 可预先评估疗 效 判断特定患者可能出现的预后情况 或用来监 控病情变化 在乳腺癌的诊疗全程管理中 要充分考虑 + 基因突变可能带来的影响 一项最新的大数据汇 总分析表明 约 < 的早期乳腺癌患者发生 + 突变 编码螺旋形区域 // 与编码 激酶区域 :3 的突变分别占 < 和 < + 突变更多见于较大年龄 /3 阳性 低级别和小肿瘤 且 + 突变与较好的临床结局 无浸润生 存 无远处转移生存和总生存 显著相关 以往 研究 还提示 +:3 突变与淋巴结转 移阴性有关 +/ 突变与较大年龄有 关 本研究结果与之前报道一致 + :3 突变共 例 例发生于淋巴结阴性乳腺癌患者 而 例 +/ 突变发生在年龄大 于 岁的乳腺癌患者 因此 今后治疗乳腺癌不仅 依据是否发生 + 突变 还要根据特定的突变位 点来设计诊疗方案
('!0!&''&)!"''!% 中国临床医学 年 月 第 卷 第 期 表 & 乳腺癌患者血 15,067((15,067((15,&81. 基因突变与临床病理特征的相关性 临床特征 血病例数 -+ 38 '0(!!6&!0 " 值 --+ 38 '0(!!6&!0 " 值 --+ 3: '0(!!6&!0 " 值 年龄 岁 腋窝淋巴结 无转移 转移 肿瘤大小.. 未知 组织学分级 缺失 - 肿瘤分子分型 :/3 阳性 7.'& 7.'& 三阴性 ' 指数 < < /3 阴性 阳性 +3 阴性 阳性 :/3 阴性 阳性 " " -+ 突变与原发肿瘤和复发肿瘤突变的一致率高达 < 在血或其他体液中检测到 -+ 突 变比常用的肿瘤监测指标 能更早发现肿瘤 进展 相比无突变的野生型 -+ 乳腺癌患者 -+ 突变患者对药物治疗的反应和疾病预后更差 临床试验也提示 -+ 不同位点 突变对预后的作用不同 本研究涉及的 -+ 突变位点密码子转录后 翻译为不同的氨基酸 影
中国临床医学 年 月 第 卷 第 期 ('!0!&''&)!"''!% 响整个 蛋白功能 因此不同部位 -+ 突变会 产生不同的生物学影响 本研究检测的血 - 和 尿三类标本基因总体突变情况无差异 提示三类标 本均可作为突变检测标本来源 但各标本内不同位 点突变有差异 均是 -+3: 突变率最高 但 -+3: 在三类标本中的突变情况与患 者临床病理特征无显著相关 仅在 - 标本中提示 腋窝淋巴结转移可能与 -+3: 基因突变 有关 "> 这可能与本研究纳入样本量较 少有关 有研究指出 胚系 -+ 突变与乳腺癌诊 断年龄和 :/3 状态有关 诊断乳腺癌时年龄每 增加 岁 -+ 突变率减少 < 而年轻女性 :/3 阳性乳腺癌的 -+ 突变风险增加近 倍 但本研究结果与之有差别 年龄 岁组患者 -+ 突变有 例 <:/3 阴性组有 例 < -+ 的预后价值与淋巴结转移和肿瘤大小有关 本研究中肿瘤增殖指标 ' 指数与 - 中 -+38 突变相关 "> 且腋窝 淋巴结转移可能与 - 标本中 -+3: 基因突变有关 "> 这些结果提示 -+ 突变与肿瘤预后可能相关 尤其是 -+ 3: 基因突变的患者发生淋巴结转移的可 能性较小 预后较好 而一项针对 多例乳腺 癌患者的基因和转录分析表明 按乳腺癌分子分型 来看 -+ 突变最容易发生在三阴性乳腺癌 < 其次是 :/3 阳性乳腺癌 < 7.'&< 和 7.'&< 型乳腺癌 本研究同样揭示 乳腺癌分子分型与 - 标本中 -+38 突变相关 "> 提示乳腺癌不同分子分型中 -+ 突变率不同 但本研究各 基因突变分布与既往研究不同 另外 汇总三类标 本 种基因位点的总体突变情况 发现 7.'& 型患者的血标本中未检测到突变 年龄 岁的 - 标本中未检测到突变 这可能与 7.'& 型患者较少有关 本研究中 - 在年龄 岁组患 者中检测率高 这可能影响了 岁以下组 - 标 本的基因突变检出率 综上所述 本研究采用!!&( 方法对早期 乳腺癌患者进行 - 检测 并收集血 - 和尿三 类标本 通过 ""+3 方法来检测 -+ 和 + 基 因的突变情况 并结合 - 和 -++ 突变检 测分析其对乳腺癌肿瘤负荷 疗效和预后的监测作 用 结果提示 在早期乳腺癌中 乳腺癌分子分型 和肿瘤指标 ' 与 - 标本中 -+38 基因突变相关 腋窝淋巴结转移可能与 -+ 3: 基因突变有关 这为早期乳腺癌治疗方案的选择和预后判断提供了新的依据 尽管本实验 中 - 和 -++ 突变情况与早期乳腺癌的 大部分临床病理特征无明显相关 但根据既往文 献 报道 了解掌握 -++ 基因突变情 况有助于针对乳腺癌患者开展个性化用药 疗效监 测和预后判断 另外 本研究首次采用尿液作为早 期乳腺癌检测标本 扩展了乳腺癌检测有效生物标 志的来源 且本研究发现三类标本的基因突变检测 结果无明显差异 提示可以根据临床需要获取合适 的检测标本 由于 - 汇聚了多种肿瘤疗效和预 后监测的生物指标 因此检测 - 突变基因的效能 更强 更有可能在早期肿瘤中发现阳性结果 未来 建立个体化的多生物指标联合分析方法可能成为 一种更有效地发现早期肿瘤进展和预后的方法 参考文献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
('!0!&''&)!"''!% 中国临床医学 年 月 第 卷 第 期 &(1&$'#!&0 &!2,'0 :5/:2 )2%! &'& "'!!!0#!1!! 1&00!0,!'.&'' (! +,!!'(!.'($03!0.. 7?%753! &)&0-+3: &" 3 # 3!(&! &!!.&',&$:. )& 3 3:25?! &+&'!0!'' '&',. % "!!' "',!&"*;& (!.(!&$''!!,&';!#!&0&!'(!. %%/7:/7/% /3//3! & -&,!!"0!!',!;!&0-+&0&!'&"'&,0' #'.&!' (!0!&.! 0;!'&!(!&"&"! &!2&,! )2:95::+323//% )!!' 3.&'''!%&0&.!&"'&,0' &'!(!'&&"0&'&'.&+7 2!! :3-/%/% / 3/%)+/)-3@/3 %23/%-2-! &7''"#'0$&&$0'03 &"+ (0.&'0"'0!&0!0;!'&!' #&""!&!/5 :/%9:257! &5'&$'&',% "!!' "$&.' &', /3.&'0 %7&'!0!&!"1'(/3-0'-&0 2 :/%?%-7:! &.&'0&&$'!.&!0!0!&(&"':&&('"!!', '&',.!0 2&,! 3/ 73//)% )773 )! &!!' 3/ &" '.!&.& '&',.!0#$ "! "','&+3 ' '(!. +3%2% 7/ +239 )! & /6&$&&$0'0-+.&'0''&',. %&0#'.&!0!&.!!00!&'!01'(!&0!"(',(,&"!0!0;&'&&'.&&!0!';! 0"$+7)!"! -/:- -?))2-2??))2-2 55)! &+,0'!+.&'0!!!%'!&$0&,! '!!,&';!#!&0 &! &!'?5 )3 --%/3! &'&', #!&0.!0!6('#' "$&.'(&,!0'!'(!'&&".!0!($.&.0'''!! )2-/3-/5/3- )3%! &!!!6!00' '!0' '&',.!0!"',0'0'.!&0&' #!&0 &! &'!0 2 23%2 /7/-2% 7:/! & /0&#'0(.! &";&'"&''&',.!#&0!",0'.,&.0''0'!.!&0&'#!&0 &! &'!0'&!3!0 4577:! &(&&!'&''&',.!0'!1$"'&,0!"#!&0&!27! 93-/ )3/7/7)7%/ 3 7! & -.+,!$!&",0'0'!&$0&,!#!&0 &!&!"&&$0'0'"';'"&&'! "&&' 22 7%?7 ):/5?! &+.&'&00'&!01'('.;!".!'#!&0 &! '&!3!0 2/++2:23/2572! &!!.&' $!,0'&"!"'';!;&!0-+ 0&0''.&$#!&0 &!&'!023! /3%%/95/- 7 2)% 7% 72-:+! &+,0'&"!"'';!;&!-+.&'0'"!0'';!#!&0&!&'!0!&!"1'( &(&$'! &(&$'!&6&!#&0!" &"*;& (!&$!00. (!(&0! '&!&0 &!3!03 53-::+:%!&-(!,!.'&" &0'.'&('!!#!&0.0!;!&0 ;!0#,0%&! 本文编辑 张艺鸣 贾泽军