2011 年 10 月第 34 卷第 5 期 湖南师范大学自然科学学报 JournalofNaturalScienceofHunanNormalUniversity Vol.34 No.5 Oct.,2011 1, 1, 2, 1, 1, 1, 2, 1 (1 贵阳中医学院, 中国贵阳 550002;2 遵义医学院附属医院, 中国遵义 563003)! " 目的 : 构建人源噬菌体展示单链抗体 (ScFv) 库, 筛选抗结核杆菌特异性 高亲和力的 ScFv. 方法 : 从结核患者的外周血淋巴细胞中, 提取 RNA 并通过 RT PCR 扩增出 VH 和 VL 基因, 并采用 SOE PCR 构建 ScFv 基因, 将其克隆入噬粒载 pcantab5e 中, 转化于大肠杆菌 TG1, 通过辅助噬菌体 M13K07 援救构建噬菌体单链抗体库. 结果 : 初级库库容量为 3.5 10 6, 在大肠杆菌 TG1 中重组后得到 2.6 10 6 的次级抗体库. 结论 : 成功构建噬菌体展示 ScFv 库并获得人源抗结核杆菌特异性 ScFv, 为进一步研制抗抗结核杆菌的高特异性 高亲和力的基因工程抗体奠定了基础. #$% 结核杆菌 ; 人源噬菌体单链抗体 ; 制备及筛选 &' R378 91 + 1 () A *+ 1000 2537(2011)05 0070 05 ConstructionandScreeningofHumanSingle chainantibody LibraryofAnti Mycobacterium Smegmatis HEGuang zhi 1,TIANWei yi 1,GAOYing 2,WANGPing 1, WANGWen jia 1,WANGQian yu 1,HUANGGao 2,ANChuan wei 1 (1.GuiyangColegeofTraditionalChineseMedicine,Guiyang550002,China; 2.AfiliatedHospitalofZunyiMedicalColege,Zunyi563003,China) Abstract Aim:Toconstructahumanphage displayedsingle chainfvantibody(scfv)libraryandscreen specificscfvagainstmycobacteriumsmegmatis.methods:thetotalrnawasextractedfromperipheralbloodlym phocytesinpatientswithmycobacteriumsmegmatis,firststrandcdnasynthesiswasperformedusingacdnasyn thesiskitandanoligo(dt) 18primer.TohumanimmunoglobulinHchainandLchainvariableregionofdegener ateprimers,cdnafirststrandasatemplate,wereamplifiedhchainandlchainvariableregiongenes.soe PCR methodtovhandvlfragmentswereasembledintoscfvfragmentsandthenclonedintopcantab5escfvvector andtransformedintocompetenttg1electricbacteriabyhelperphagerescuem13k07getmycobacteriumsmegma tissinglechainantibodyphagedisplaylibrary.results:aprimarylibraryof3.5 10 6 andasecondlibraryof2.6 10 6 wereconstructed.conclusion:theresultslayasolidfoundationforpreparationofhumanengineeringanti bodytomycobacteriumsmegmatisreportedhereinwithhigherafinity. Keywords MycobacteriumSmegmatis;humansingle chainantibody;constructionandscreening 结核分枝杆菌 (MycobacteriumSmegmatis) 是引起结核病的病原菌, 也称结核杆菌. 可侵犯全身各器官, 但以肺结核为最多见. 目前全球约有 20 亿肺结核带菌者, 现症结核患者 2000 万, 每年有 1000 万人新发病和 300 万人死亡. 我国结核患者人数居世界第二位, 全国 1/3 的人口曾受到结核菌的感染 [1]. 噬菌体抗体库技术是抗体工程领域的最重要进展, 各种小分子抗体相继产生, 在疾病的诊断与防治 自,-./:2011 04 26 01 : 贵州省 2011 年社会发展科技攻关资助项目 ( 黔科合 SY 字 (2011)3020),E mail:heguangzhi7711@sina.com
第 5 期 何光志等 : 抗结核杆菌人源噬菌体单链抗体库的构建及筛选 71 身免疫性疾病与病毒性疾病的鉴别研究 肿瘤的影像分析和导向治疗或基因治疗等多个领域有着潜在的优势. 该技术具有简单易行 生产成本低 筛选容量大等优点 [2]. 本研究尝试利用噬菌体展示技术构建大容量天然人源性噬菌体抗体库, 从中筛选出结核杆菌的人源性单链抗体 (singlechainfvfragment,scfv), 为进一步研制抗结核杆菌的特异性的基因工程抗体奠定了基础. 1 23 100mL 外周血来自 10 例康复 1 月的结核患者 ( 遵义医学院附属医院检验科提供 ), 淋巴细胞分离液, 购自上海华精生物高科技有限公司. 总 RNA 抽提试剂盒 (TRIzol.R.TotalRNAIsolation.Reagent) 逆转录试剂盒 (RevertAidFirstStrandcDNASynthesisKit),GIBCOBRL 公司产品 ;DNAPurificationSystem,Promega, 公司产品 ;100bpDNALadder,SfiⅠ 和 NotⅠ 限制性内切酶 TaqDNA 聚合酶和 T4DNA 连接酶, 购自大连宝生物公司 ; 噬菌粒载体 pcantab 5E 辅助噬菌体 M13K07 大肠杆菌 E.coliTG1 HRP/ 抗 M13 单克隆抗体, Amersham 公司产品 ; 结核杆菌抗原 ( 批号 :984010), 购自上海晶莹生物制品公司. 2 45 2.1 VH6 VL07 PCR89 引用文献 [3] 中报道的引物, 上游引物 :VH1af:5 ACTGCGGCCCAGCCGGCCCAGGTGCAGCTGG TGCAGTCTGG 3,VH2af:5 ACTGCGGCCCAGCCGGCCCAGGTCAACTTAAGGGAGTCTGG 3, VH3af:5 ACTGCGGCCCAGCCGGCCCAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGG 3,VH4af:5 ACTGCGGCC CAGCCGGCCCAGGTGCAGCTGCAGGAGTCTGG 3,VH5af:5 ACTGCGGCCCAGCCGGCCCAG GTGCAGCTGTTGGAGTCTGG 3,VH6af:5 ACTGCGGCCCAGCCGGCCCAGGTACAGCTGCAG GAGTCAGG 3,ScFvf:5 ATCGACGCTACTGCGGCCCAGCCGGCCCAGGT 3, 下划线部分为 SfiⅠ 酶切位点. 对应的下游引物 (ScFvf 对应两条下游引物 ):Jκ1r:5 GCGTCAGAGTGCGGCCGCACGTTTG ATTTCCACCTTGGTCCC 3,Jκ2r:5 GCGTCAGAGTGCGGCCGCACGTTTGATCTCCAGCTTGGT CCC 3,Jκ3r:5 GCGTCAGAGTGCGGCCGCACGTTTGATATCCACTTTGGTCCC 3,Jκ4r:5 GCG TCAGAGTGCGGCCGCACGTTTGATCTCCACCTTGGTCCC 3,scFvr1:5 ACGGCTGCGTCAGAG TGCGGCCGCACGTTT 3 ;Jλ1r:5 GCGTCAGAGTGCGGCCGCACCTAGGACGGTGACCTTGGTCCC 3,Jλ2r:5 GCGTCAGAGTGCGGCCGCACCTAGGACGGTCAGCTTGGTCCC 3,Jλ3r:5 GCGTCA GAGTGCGGCCGCACCTAAAACGGTGAGCTGGGTCCC 3,ScFvr2:5 ACGGCTGCGTCAGAGTGC GGCCGCACCTA 3, 下划线部分为 NotⅠ 酶切位点. 所有引物及 Linker 基因序列均由大连宝生物有限公司合成. 以合成的 cdna 为模板,VHf 和 VHr 引物等物质的量混合扩增 VH 基因,Vκf/Vκr 和 Vλf/Vλr 不同引物等物质的量混合液扩增 VL 基因.VL 的 PCR 反应条件为 :95 预变性 10min;94 60s,66 30s,72 30s, 共 30 个循环 ; 最后 72 延伸 10min.VH 的退火温度为 65, 其他反应条件同 VL.PCR 产物经 20g/L 琼脂糖凝胶电泳鉴定, 切胶回收目的基因片段. 2.2 ScFv07 通过重叠延伸拼接法将 VH 和 VL 基因拼接成 ScFv 基因. 取纯化的 VH 和 VL 基因片段经 94 40s,55 1min,72 1.5min,10 个循环后, 加含有酶切位点的引物 VHf(SfiⅠ) 和 VLr(NotⅠ),94 30s,66 45s,72 90s,35 个循环.PCR 产物经 10g/L 琼脂糖凝胶电泳鉴定并回收. 2.3 将上述 PCR 产物 ScFv 纯化回收, 用 SfiⅠ 和 NotⅠ 进行酶切, 与经同样双酶切的表达载体 pcantab5e 用 T4DNA 连接酶, 电转化大肠杆菌 TG1, 铺 SOBAG 平板. 用 2 YTAG 培养基洗脱菌落, 稀释至 A 600 =0.5, 加入辅助噬菌体 M13K07 继续振摇 1h, 离心后用 2 YTAK 培养基重悬后振摇过夜, 次日离心收集上清, 加入 1/5 体积的 PEG/NaCl 溶液, 冰浴, 离心, 重悬沉淀即为噬菌体 ScFv 库, 过滤后于 4 储存备用. 2.4 :; 6<=>? 取适量抗体库接种在 20mL2 YT ATK( 含 10g/LGlucose,100mg/LAmp 及 20mg/LTet) 培养基中, 37, 振摇培养至 A 600 =0.68, 加入辅助噬菌体 M13K07 于 37 静置 60min;4,3500 g 离心 15min, 沉
72 湖南师范大学自然科学学报第 34 卷 淀重悬于 20mL2 YT ATK( 含 100mg/LAmp,20mg/LTet,70mg/LKan) 中培养过夜 ; 在 4 条件下, 8000 g 离心 15min, 上清用 40g/LPEG 8000 和 30g/LNaCl 沉淀,4,10000 g 离心 30min 弃上清, 离心管倒置除去 PEG 液 ; 沉淀用适量的 PBS 重悬, 移入另一离心管, 反复吹打混匀,10000 g 离心 5min, 上清即为噬菌体抗体库, 检测库容. 用 SB 培养液将所制备的噬菌体抗体库进行 10 倍系列稀释, 分别加入 100μL 大肠杆菌 TG1(A 600 =1), 室温下感染 20min, 涂 SOBAG 平板 ( 含 100mg/LAmp), 于 37 过夜培养, 次日计数噬菌落形成个数, 计算噬菌体抗体库的库容,4 保存. 从 SOBAG 平板上随机挑取 15 个单菌落, 进行 PCR 扩增用琼脂糖凝胶电泳检测 ScFv 的重组情况 ; 提取 PCR 鉴定为阳性单菌落的质粒, 用 SfiⅠ 和 NotⅠ 进行双酶切, 采用 10g/L 琼脂糖凝胶电泳分析酶切图谱 ; 随机挑取阳性克隆, 采用 PCR 扩增 ScFv 基因片段, 电泳回收后, 用 BstNⅠ 酶切,10g/L 琼脂糖凝胶电泳分析酶切图谱. 2.5 用包被液稀释结核杆菌抗原 1μg/mL 包被 96 孔 ELISA 板,100μL/ 孔, 含 30g/LBSA 的 PBS 封闭,PBS 洗涤后, 加入噬菌体抗体库 100μL,37 温育 2h; 吸去噬菌体抗体液, 以 PBST 洗涤 1 次 ( 第 2 轮洗涤 5 次, 第 3~5 轮洗涤 10 次 ),PBST 洗涤 1 次, 加入 100μL 洗脱液 [ 含 0 1mol/LHCl(pH2) 和 1g/LBSA], 于室温静置 10min; 将洗脱液稍加吹打后吸出, 立即用 6μL2mol/LTris 中和, 加入 2mL 大肠杆菌 E.coliTG1,37 静置 20min, 加入 20mLSB( 含氨苄西林和四环素 ),37 培养 2h; 加入 M13K07 卡那霉素. 进行 5 次反复淘洗, 收集沉淀. 特异性噬菌体抗体得到高度富集. 2.6 ScFv @A> 将第 5 轮筛选后洗脱的噬菌体感染大肠杆菌 TG1, 涂于 SOBAG 平板, 过夜培养后, 随机挑选细菌菌落接种于 4mL 含 Amp 和四环素的 SOBAG 培养基中,37 振荡培养过夜 ; 取 200μL, 加至 4mL 含相同抗生素的 SOBAG 中,37 振荡培养 2h 后加入 40μLM13K07, 培养 2h; 再加入 Kan 至 70mg/L,30 振荡培养 12~ 16h 离心收集上清, 即为单克隆噬菌体抗体,4 保存. 将待检噬菌体抗体与等量 10g/LBSA 混合, 室温孵育 20min, 加至经抗结核抗原包被和 BSA 封闭的 ELISA 板中, 于 37 温育 2h, 用 PBST 洗板 4 次,PBS 洗涤 2 次后, 以 HRP 标记的 M13 噬菌体单克隆抗体进行结合反应,TMB 显色. 3 B 3.1 : 6C DE 07 PCR89 以提取出的 RNA 为模板逆转录合成 cdna 第一链后, 再以 cdna 为模板进行 PCR 反应分别扩增抗体基因重链和轻链可变区. 产物经 10g/L 琼脂糖凝胶电泳检测, 分别在 300~400bp 间出现条带, 结果见图 1. 3.2 DE (ScFv) ; 6 89 采用 SOE PCR 的方法将抗体轻 重链可变区基因组装成 ScFv 片段, 经 10g/L 琼脂糖凝胶电泳证实, 组装后的 ScFv 基因在 700~800bp 间出现条带 ( 图 2). M:100bpDNALadder;VH 和 VL:RT PCR 扩增产物 (RT PCRproduct) ' 1 VH! VL"# RT PCR$%&' M:100bpDNALadder;1:RT PCR 扩增产物 (RT PCRproduct) ' 2 ScFv"# PCR$%&' 3.3 F :; 构建的初级抗体库经 ( 库容 = 涂板后生长出的噬菌斑数数目 / 涂板菌液量 / 涂板菌液稀释的倍数 ) 计算, 初级库容量为 3.5 10 6. 随机挑取 20 个菌落, 经 PCR 鉴定表明, 重组率为 80%, 故次级库的库容量为 2.6 10 6 ; 阳性质粒做双酶切鉴定, 电泳示在 700~800bp 间出现条带 ( 图 3).
第 5 期 何光志等 : 抗结核杆菌人源噬菌体单链抗体库的构建及筛选 73 3.4 <=> 随机挑取的 10 个单克隆, 经 PCR 扩增 ScFv 基因片段, 电泳回收后, 以 BstNⅠ 酶切,10g/L 琼脂糖凝胶电泳分析显示, 抗体库中抗体分子的多样性良好, 见图 4. M:100bpDNALadder;1: 双酶切产物 (Doubleenzymedigestionproduct) ' 3 () pcantab5e* ScFv+,-./ M:DNAmarkerDL2000;1~10: 随机挑选的单克隆 ' 4 01 BstNⅠ,- 3.5 将抗结核杆菌抗原噬菌体抗体库进行 5 轮 吸附 洗脱 扩增 的筛选. 可以看到随着洗涤次数的增加, 噬菌体抗体的收获率增加, 经过 5 轮筛选增加约 110 倍, 表明噬菌体抗体库得到富集 ( 见表 1). G 1 2345673848 9: paninground inputedphages elutedphages yield/% 1 3.30 10 11 4.80 10 5 1.45 10-6 2 2.90 10 11 4.30 10 5 1.48 10-6 3 3.50 10 11 5.70 10 5 1.67 10-6 4 3.40 10 12 5.00 10 6 1.47 10-6 5 4.30 10 12 6.80 10 7 1.58 10-8 3.6 ScFv@A> HI 从第 5 轮筛选得到的菌落中随机挑选 20 个克隆, 制备噬菌体抗体, 经 ELISA 检测, 阳性克隆孔中液体显色, 阴性孔中液体不变色. 显色后, 阴性对照孔 450nm 时 A 值为 0.076,15 株 ELISA 的 A 值较高, 呈现阳性反应, 其 450nm 时 A 值分布于 0.256~0.532 之间, 阳性克隆检出率约为 75%. 对其中 12 号阳性克隆的可变区 DNA 序列和氨基酸进行分析, 结果该克隆重链可变区与 GenBank 中登录的免疫球蛋白 IgG 重链可变区 VH3 有 92% 同源性,κ 可变区与 V J4 有 92% 同源性. 表明 12 号阳性克隆为抗结核杆菌抗原噬菌体抗体. 4 JK 噬菌体抗体库技术是采用 PCR 的方法将 B 细胞全套可变区基因克隆出来, 与噬菌体包膜蛋白融合表达, 从而展示于噬菌体表面, 即可建成噬菌体抗体库.ScFv 的基本结构为 VH Linker VL 或 VL Linker VH, 由于 ScFv 抗体分子量只有全抗体的 1/6, 抗体只有可变区片段, 不含恒定区, 免疫原性较低, 故易于穿过血管壁和组织屏障, 没有 Fc 段, 所以减少了与组织的非特异性结合, 同时保留了与抗原结合的特异性和亲和性, 具有结构简单, 易于大规模生产, 成本低等优点, 因此在临床 科研 工业和新药设计等领域均具有诱人的应用前景 [4 6]. ScFv 抗体在感染性疾病的诊断与防治 自身免疫性疾病与病毒性疾病的鉴别研究 肿瘤的影像分析和导向治疗或基因治疗 新型药物设计等多个领域发挥着越来越重要的作用 [7 13]. 目前, 在多种噬菌体抗体库的构建, 并从其中筛选出多株具功能活性的小分子抗体, 如抗 HBV HIV RSV TNF erbbz 和 gpl20 等单链抗体或 Fab 抗体 [14 17], 有些已进入了临床 I/I 期试验. 人源抗体的问世彻底解决了小分子抗体的人源化问题, 极大地推动了人源抗体的研究及应用 [18 20]. 抗体重链可变区 (VH) 和轻链可变区 (VL) 基因由相对保守的骨架区和能够根据不同抗原做出相应变化的抗体互补决定区 (CDR) 组成, 虽然抗体分子可变区有着数量巨大的多样性, 但其骨架区的序列和前导序
74 湖南师范大学自然科学学报第 34 卷 列相对保守, 所以抗体可变区 PCR 引物的设计应可能考虑亲本抗体可变区序列的完整性和真实性. 库容量大小影响抗体库质量的最主要因素, 而基因的多样性是决定库容量大小, 其直接决定了接下来筛选高亲和力的单链抗体 [21]. 因为淋巴细胞含目的抗体基因的 mrna 是高丰度, 有利于所建文库被筛选及克隆出高亲和力的抗体, 所以选用淋巴细胞建库较好 [3]. 本研究扩增设计可变区引物时引用路艳等的工作 [3], 通过提取患者康复后的外周淋巴细胞总 RNA, 经 RT PCR 分别扩增出 H 链和 L 链可变区基因, 将 VH 和 VL 片段随机拼接成 ScFv 片段克隆至 pcantab5e 载体, 并转化至感受态 TG1 菌, 经辅助噬菌体 M13K07 拯救, 获得人源抗结核杆菌噬菌体展示单链抗体库, 本研究为结核病的预防 诊断 治疗等研究奠定了基础. 此研究为结核临床防治研究奠定了基础. LM : [1] 吴虢东, 王玲. 抗结核中药的研究进展 [J]. 医学综述,2007,13(6):475 476. [2] 李菁, 林彤, 宋帅, 等. 基因工程重组抗体技术的研究进展 [J]. 生物技术通报,2009(10):40 44. [3] 路艳, 韩跃武, 韩亚萍, 等. 抗白念珠菌人源性单链抗体库的构建及筛选 [J]. 中国生物制品学杂志,2009,22(11): 1063 1067. [4] HUSTONJS,LEVINSOND,MUDGET HUNTERM,etal.Proteinengineeringofantibodybindingsites:recoveryofspecifi cactivityinananti digoxinsingle chainfvanalogueproducedinescherichiacoli[j].porcnatlacadsciusa,1988,85(16): 5879 5883. [5] WHITLOW M,BELLBA,FENGSL,etal.Animprovedlinkerforsingle chainfvwithreducedaggregationandenhanced proteolyticstability[j].proteineng,1993,6(8):989 995. [6] BETTERrM,CHANGCP,ROBINSONR,etal.Escherichiacoilsecretionofanactivechimericantibodyfragment[J].Sci ence,1988,240(4855):1041 1043. [7] WINTERG.Synthetichumanantibodiesandastrategyforproteinengineering[J].FEBSLet,1998,430:92 94. [8] SHAHEENF,DUANL,ZHUM,etal.Targetinghumanimmunodeficiencyvirustype1reversetranscriptasebyintracelular expresionofsingle chainvariablefragmentstoinhibitearlystagesofthevirallifecycle[j].jvirol,1996,70(6):3392 3400. [9] ANNC,COLLIERM,ROBERTW,etal.Treatmentofhumanimmunodeficiencyvirusinfectionwithsaquinavir,zidovudine, andzalcitabine[j].newengljmed,1996,334(16):1011 1077. [10] FINNERNR,BYEJM,DOLMANKM,etal.Molecularcharacteristicsofanti selfantibodyfragmentsagainstneutrophilcy toplasmicantigensfromhumanvgenephagedisplaylibraries[j].clinexpimmunol,1995,102(3):566 574. [11] HUDSONPJ.Recombinantantibodyconstructsincancertherapy[J].CurOpinImmunol,1999,11(5):548 557. [12] WUAM,WILLIAMSLE,ZIERANL,etal.Targetedgenedeliverytomammaliancelsbyfilamentousbacteriophage[J]. TumorTargeting,1999,49(1):47 54. [13] FITZGERALD K,HOLLIGER P,WINTER G.Improvedtumourtargetingbydisulphidestabilizeddiabodiesexpresedin pichiapastoris[j].jmolbiol,1999,288:203 211. [14] ZEBEDEESL,BARBASCF,HOM YL,etal.HumancombinatorialantibodylibrariestohepatitisBsurfaceantigen[J]. ProcNatlAcadSciUSA,1992,89:3175 3179. [15] CAIX,GARENA.Anti melanomaantibodiesfrommelanomapatientsimmunizedwithgeneticalymodifiedautologoustumor cels:selectionofspecificantibodiesfrom single chainfvfusionphagelibraries[j].procnatlacadsciusa,1995,92: 6537 6541. [16] HOOGENBOOMHR,BRU?NEAP,HUFTONSE,etal.Antibodyphagedisplaytechnologyanditsapplications[J].Immu notechnology,1998,4(1):1 20. [17] 季永镛. 免疫学进展学术讨论 抗体工程及其应用 [J]. 上海免疫学杂志,1997,17(2):126 129. [18] 陈竞华, 王淡, 刘群英, 等. 人源噬菌体抗体库的构建及 HBsAg 人单抗的筛选 [J]. 中华微生物和免疫学杂志,1995, 15(3):155 162. [19] 章美云, 孔健. 人癌胚抗原单链抗体基因的构建和筛选 [J]. 生物化学与生物物理进展,1996,23(5):470 474. [20] TRISTANJ,VAUGHAN,JANEK,etal.Humanantibodiesbydesign[J].NatBioTechnol,1998(16):535. [21] 田学军, 寿成超, 董志伟. 人源噬菌体抗体库的构建及抗 8YG 抗体的初步筛选分析 [J]. 中国生物化学与分子生物学报,2000,16(2):200 205. (; )