中国药事 2015 年 11 月第 29 卷第 11 期 1193 详述抗体的名称及生物学来源, 外购方名称, 提交外购方出具的抗体性能指标及检验证书, 并且企业应对抗体技术指标进行检验复核, 完整收集归档确定该抗体作为主要原材料的验证资料 ; 人工制备是获得大量抗体的有效途径, 早年人工制备抗体

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略令潘
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1 1192 中国药事 2015 年 11 月第 29 卷第 11 期便潜血检测试剂盒 ( 胶体金法 ) 技术要点探讨刘世红 1, 陈雄 1, 席仲兴所有限责任公司, 兰州 ) 2 (1. 甘肃省医疗器械检验检测所, 兰州 ;2. 兰州生物制品研究摘要目的 : 探讨便潜血检测试剂盒 ( 胶体金法 ) 生产注册过程中的技术要点方法 : 介绍试剂盒的反应原理生产过程中使用的主要原辅材料及相应质量控制要点结果与结论 : 探讨影响试剂盒的因素, 希望生产企业注册部门对该产品生产过程中的技术要点给予关注, 以期提高试剂盒的质量关键词 : 便潜血检测试剂盒 ; 胶体金法 ; 技术要点 ; 质量控制中图分类号 :R 文献标识码 :A 文章编号 : (2015) doi: /j Discussion on the Specific Technical Points of FOB Diagnostic Kits (by Colloidal Gold Method) Liu Shihong 1, Chen Xiong 1, Xi Zhongxing 2 (1.Gansu Medical Equipment Inspection and Testing Institute, Lanzhou , China; 2. Lanzhou Institute of Biological Products Co. Ltd., Lanzhou , China) Abstract Objective: To discuss the specific technical points of FOB Diagnostic Kits (by Colloidal Gold Method) in the process of production and registration. Methods: The reaction principle, the raw material and auxiliary material as well as relevant quality control during productive process were induced in this paper. Results and Conclusion: The factors which affect the quality of products were discussed. We do hope the manufacturer and registration office can pay more attention to the techniques of productive process,so as to improve the product quality of diagnostic kits. Keywords: FOB diagnostic kits; colloidal gold method; technique; quality control 便潜血 (FOB)( 亦称便隐血 ) 是指消化道少量出血, 红细胞被消化破坏, 粪便外观无异常改变, 肉眼和显微镜下均不能证实的出血在临床消化道恶性肿瘤早期,20% 的患者可出现便潜血试验阳性, 晚期病人的潜血阳性率可达到 90% 以上, 粪便潜血 (FOB) 检查可作为检测各种原因所致的消化道出血及消化道恶性肿瘤早期筛查的重要检测试验 [1] 目前临床检查便潜血(FOB) 主要有免疫学法和化学法, 免疫法所用抗体为抗人血红蛋白抗体或抗人转铁蛋白抗体, 特异性强, 不受饮食药物的影响, 免疫法灵敏度优于化学法免疫法对无症状的消化道微量出血更敏感, 在老年人消化道肿瘤筛查时更有意义 [2] 因此, 以抗人血红蛋白单克隆抗体为基础, 利用层析技术和胶体金作为标记物, 应用双抗体夹心法免疫技术原理, 制作的便潜血胶体金法检测粪便的人血红蛋白, 在临床上广为应用 1 主要原材料和辅料及相关质控点 1.1 主要原材料生产该试剂盒最主要的原材料是抗体, 抗体最显著的生物学特性是与相应抗原特异性结合, 因此, 抗体在疾病诊断免疫防治基础研究等方面发挥着重要作用企业获取抗体渠道一般有两个, 即外购和自制如抗体为企业外购, 则应在相关资料中作者简介 : 刘世红, 高级工程师 ; @qq.com

2 中国药事 2015 年 11 月第 29 卷第 11 期 1193 详述抗体的名称及生物学来源, 外购方名称, 提交外购方出具的抗体性能指标及检验证书, 并且企业应对抗体技术指标进行检验复核, 完整收集归档确定该抗体作为主要原材料的验证资料 ; 人工制备是获得大量抗体的有效途径, 早年人工制备抗体的主要途径是通过特异性抗原免疫动物, 得到相应抗血清, 随着科学技术和分子生物学的发展, 如杂交瘤技术基因工程等技术, 可制备不同特性的抗体以杂交瘤技术制备获得抗人血红蛋白单克隆抗体为例, 制备过程中关键的控制点单抗的检测项目如下 : 关键的控制点 :1 免疫动物的选择 : 根据选用的骨髓瘤细胞选择免疫用鼠系 2 免疫程序和途径 : 依据抗原性质免疫原性和小鼠的反应性而定 3 融合阳性杂交瘤细胞的筛选和克隆化培养 : 融合过程控制无菌, 阳性杂交瘤细胞的筛选要求检测的方法灵敏快速且便于大量检测, 对阳性杂交瘤细胞的克隆化培养通常采用有限稀释法进行单抗的检测项目 :1 特异性的鉴定 ( 功能性检测 ): 除用免疫原 ( 抗原 ) 进行抗体的检测外, 还应该用与其抗原成分相关的其他抗原进行交叉试验, 以确保制备单抗的灵敏度特异性符合生产需求 2 Ig 类与亚类的鉴定 : 一般在诊断试剂生产中使用的单抗为 IgG 类, 因此对单抗 Ig 类别与亚类的鉴定非常必要 3 识别抗原表位的鉴定 : 用竞争结合试验, 测相加指数的方法, 测定单抗所识别抗原的位点, 来确定单抗识别的表位是否相同一般对应用双抗体夹心法原理检测相应抗原的试剂, 特别是单抗 + 单抗的试剂要求所用几种单抗的表位尽量错位且空间位阻越小越好 4 亲合力的鉴定 : 用 ELISA 或 RIA 竞争结合试验来确定单抗与相应抗原结合的亲合力 5 稳定性的鉴定 : 一般包括酸碱和热稳定性 3 个方面 [3] 通过以上介绍可以看出, 抗人血红蛋白 (hhb) 单克隆抗体自制是一个复杂且追溯链较长的工作, 生产企业在制备过程中, 应保留原始完整的制备记录, 详述抗体的名称及生物学来源, 并且对该抗体技术指标要求 ( 如外观纯度蛋白浓度效价等 ) 的制备筛选纯化以及鉴定等要有详细试验资料 [4] 1.2 主要原辅料胶体金免疫层析试纸条通常由加样区反应区和吸附区 3 部分组成加样区含有免疫胶体金颗粒, 通常由玻璃纤维将免疫胶体金颗粒吸附在该区 ; 反应区则喷涂或点加两条反应线, 一条为检测线, 一条为质控线检测线用以检测此处的抗原物质与免疫胶体金颗粒包被抗体的反应性 ; 质控线则用以检测免疫胶体金颗粒上的包被蛋白质的活性及程度, 反应区的材料主要是硝酸纤维素膜 ; 吸附区由较厚的滤纸或类似的吸水材料制成, 将由加样区经反应区层析上来的剩余免疫胶体金颗粒等吸附于其中, 该区提供层析的动力 [5] 硝酸纤维素膜又称为 NC 膜, 在胶体金试纸中用做 C/T 线的承载体, 同时也是免疫反应的发生处, 所以 NC 膜成为该试验中最重要的耗材, 膜的质控首先是检查验收厂家提供的检验证书, 其次为物理性能检测物理性能检测 : 一是测膜厚度和宽度, 厚度不均匀影响生物原料在膜上的扩散性能, 点出来的 C/T 线宽窄不一, 同时也影响到液体爬行速度 ; 二是测移液性能, 由于金标免疫法特点就是快速和灵敏度高, 因此在选择膜时注重的就是膜的孔径, 往往膜孔径越小层析速度也越小, 那么金标复合物通过 T 线的时间也就越长, 反应也就越充分, 灵敏度越高, 但是膜孔径减小后也减慢了跑板速度, 增加了非特异性结合的机会, 也就会造成假阳性增多, 所以生产企业必须要按照与产品特点相符的检测结果挑选 NC 膜 [4] 因此, 对于像硝酸纤维素膜胶体金等生产过程使用到的每一原辅料应详述技术指标的要求以及确定使用该原辅料的依据 2 生产工艺中影响产品性能的因素 2.1 企业内部参考品设置生产企业设置企业内部参考品非常重要, 它被用于确定产品原材料选择制备鉴定的质量标准, 同时也是生产工艺建立反应体系组成的最重要标准和依据, 如果参考品的设置不合理或者存在缺陷, 将会使整个产品质量存在较大的问题, 容易在临床检测过程中出现错误结果而影响临床的诊断和治疗 [6] 目前便潜血的检测使用较为普遍的方法有传统的化学法和应用单克隆抗体夹心法原理制备的胶体金法传统的化学法特异性低, 敏感度差, 假阳性率高, 其受食物中动物血或铁剂等药物干扰 ; 胶体金法则特异性高, 敏感度好, 操作简单方便, 目前已被广泛应用于临床和批量人群的查

3 1194 体但胶体金法也受到检测下限浓度上限浓度较为敏感的浓度范围最为敏感的浓度范围等因素影响, 如前后带现象, 即胶体金反应中血红蛋白过量导致免疫夹心复合物不能正常形成的一种现象, 反而出现假阴性 [7], 为了避免漏检, 在内部参考品的设置配制标定中应关注以下几个方面 : 阳性反应参考品的设置 : 有文献报道胶体金法检测血红蛋白的下限浓度为 0.1 μg ml -1, 上限浓度为 1100 μg ml -1, 较为敏感的范围在 0.4~400 μg ml -1 之间, 最为敏感的浓度在 1.6~100 μg ml -1 之间 [7] ; 因此在胶体金试剂阳性反应参考品的设置中强阳性反应参考品浓度范围应在 1.6~100 μg ml -1 之间, 中等强度阳性反应参考品浓度范围应在 400~1100 μg ml -1 和 0.4~ 1.6 μg ml -1 之间, 弱阳性反应参考品浓度范围应在 0.1~0.4 μg ml -1, 其中主要应以弱阳性反应参考品为主, 以更好地反映产品的灵敏度阴性反应参考品的设置 : 虽然胶体金法不受食物中动物血或铁剂等药物干扰, 但为了确保该类产品的特异性, 用生理盐水或蒸馏水稀释健康人便样基质 ( 混悬液 ), 阴性反应参考品中应有如下样品 : 1) 人肌红蛋白和兔羊鸡猪的血红蛋白 ( 终浓度均为 500 μg ml -1 ) [8] 样品 ; 2) 维生素 C( 终浓度分别为 10.0 mg ml -1 和 50.0 mg ml -1 ) [9] 样品 ; 3) 其他文献报道的可能干扰因素样品 ; 4) 几例无便潜血健康人便样精密度参考品的设置 : 精密度参考品可反映产品检测的重复性以及重复检测的稳定性该试剂精密度反应参考品的设置应在最为敏感的 1.6~ 100 μg ml -1 浓度范围内选取两种浓度的样本, 其中一个浓度的样品呈现中强反应, 另一个浓度的样品呈现较弱反应最低检出限参考品的设置 : 最低检出限参考品是评价产品检测能力的重要工具, 对于定性产品是评价产品检测下限的依据, 因此其设计的合理性非常重要目前的文献报道和市面出售的该类试剂的最低检测限大多在 0.1~0.2 μg ml -1, 因此最低检出限参考品应按照 1 2 n ( 或 1 3 n ) 稀释的原则设置 4~5 个样品, 其中最后一个参比品应为生理盐水或蒸馏水稀释的无便潜血健康人便样, 次后一中国药事 2015 年 11 月第 29 卷第 11 期个参比品血红蛋白浓度为 0.1 或 0.2 μg ml -1 ( 具体设置依据该类方法学及临床需求而定 ) 2.2 生产过程关键环节抗体包被工艺是重要环节, 生产企业应对包被液量浓度时间等指标进行测试, 确定上述指标的最佳组合方案对实验体系反应条件的确定, 应考虑反应时间温度膜孔径大小 ( 或移行速度 ) 等条件对产品性能的影响 3 产品性能的研究企业应建立产品研制阶段对试剂进行的所有性能验证的研究资料, 包括具体研究方法内控标准试验数据统计分析等详细资料, 应着重对以下性能进行研究 [1] 3.1 最低检测限 ( 分析灵敏度 ) 用参考品确定最低检测限, 免疫法应不高于 0.1~0.2 μg ml 特异性分析潜在的干扰物质主要有动物血红蛋白肌红蛋白维生素含过氧化物酶的绿叶蔬菜铁剂某些中药成分, 在特异性分析中应充分考虑这些因素对试剂的影响 3.3 阳性和阴性参考品企业应设置合理的内部阳性 / 阴性参考品 3.4 钩状 (HOOK) 效应目前, 便潜血 (FOB) 定性检测试剂大多采用夹心法的原理检测样本, 考虑到方法学的缺陷, 有必要对钩状 (HOOK) 效应进行考虑建议采用高浓度的参考品进行梯度稀释后由低浓度至高浓度开始检测, 每个梯度稀释液重复 3~5 份, 将显色深度随浓度升高反而变浅时的浓度作为出现钩状效应时的最低浓度, 建议产品说明书上明示包被的抗体浓度和出现钩状效应时血红蛋白的最低浓度, 最低浓度应不低于 2000 μg ml -1 [10] 3.5 重复性检测重复性指标时建议采用检测限附近的样品进行多次检测, 然后计算同一份样品多次检测的结果或其精确性在分析试剂重复性时, 不应使用强阳性样品或明显阴性的样品, 否则无法客观地评价其检测效果 3.6 批间差取 3 个批号的检测试剂, 每个批号抽取相同数量, 按照说明书步骤操作, 对重复性进行检测,3

4 中国药事 2015 年 11 月第 29 卷第 11 期 1195 个批号测试条的结果应一致, 显色度均一 4 稳定性研究资料稳定性研究资料主要涉及两部分内容, 试剂的稳定性和适用样本的稳定性研究试剂的稳定性主要包括实时稳定性高温加速破坏稳定性运输稳定性及开瓶稳定性 ( 如涉及 ) 等研究, 对于实时稳定性研究, 应提供至少 3 批样品在实际储存条件下保存至成品有效期后的研究资料适用样本的稳定性主要包括样本正常储存条件下的研究资料 5 产品说明书说明书承载了产品预期用途标本采集及处理实验方法检测结果解释以及注意事项等重要信息, 是指导实验室工作人员正确操作临床医生针对检验结果给出合理医学解释的重要依据, 因此, 产品说明书是体外诊断试剂注册申报和指导临床使用的最重要的文件之一 [11] 根据体外诊断试剂说明书编写指导原则 ( 国家食品药品监督管理总局通告 2014 年第 17 号 ) 的要求, 应对便潜血 (FOB) 定性检测试剂说明书的重点内容进行详细说明 5.1 预期用途试剂盒用于运用免疫胶体金层析技术实现对粪便中血红蛋白的体外定性检测, 以判断消化道是否有出血 5.2 主要组成成分说明名称数量及反应体系中的比例或浓度 ; 应载明试剂的组成, 且明确不同批号试剂盒中各组分是否可以互换 5.3 储存条件及有效期对试剂盒的效期稳定性开封稳定性运输稳定性等信息作详细介绍, 并对开封后未使用产品允许暴露于空气中的温度湿度及期限等条件予以明确 5.4 样本要求样本是否受临床症状用药情况等因素的影响明确样本收集前应注意的有关事项, 建议采用新鲜粪便, 如不能采用新鲜样本应注明样本保存条件及期限 5.5 检验方法应载明试剂配制方法, 必须满足的试验条件要求, 校准程序质量控制程序, 试验结果的计算方法等 5.6 检验结果的解释可结合图示方法说明阴性阳性及无效结果的判读示例, 说明可能对试验结果产生影响的因素, 在何种情况下需要进行确认试验 5.7 检验方法局限性提醒使用者本试剂的检测结果仅供参考, 不得作为临床诊治的唯一依据, 对患者的临床管理应结合其症状体征病史其他实验室检查及治疗反应等情况综合考虑 ; 受检测试剂方法学的限制, 实验人员应对阴性结果给予更多的关注, 需结合其他检测结果综合判断, 建议对有疑问的阴性结果可采用其他方法进行复核 5.8 产品性能指标 [12] 性能指标应与本文第四部分稳定性研究资料相同 5.9 注意事项样本中常见干扰物质对检测结果的影响 ; 冰箱中冷藏保存的检测试剂, 建议检测前应从冰箱内取出, 放置到室温再打开使用, 否则会影响检测结果 ; 有关实验操作样本保存及处理等其他注意事项实际应用中, 对消化道出血少部分柏油便或黑色粪便标本, 用胶体金法检测常出现阴性结果, 对此种情况说明书中应有特别的说明或标注解决的办法, 如 :1) 当大量出血时, 红细胞来不及被破坏, 大便隐血检测出现阴性结果时应肉眼观察血便, 最好在显微镜下检查辨认红细胞 ;2) 柏油便或黑色粪便时, 血红蛋白浓度超出检测范围会出现假阴性结果, 解决办法是充分稀释便样再行测试 ;3) 出现柏油便或黑色粪便, 如充分稀释后仍为阴性, 此时可在排除饮食等其他影响因素后采用化学法加以测试等内容 [12] 应用单克隆抗体夹心法原理制备的胶体金法试剂具有高度的敏感性和特异性, 但存在方法学的缺陷 ( 如前后带现象 ), 即有被检测物下限浓度上限浓度较为敏感的浓度范围最为敏感的浓度范围等影响因素, 很难确定定量反应关系, 只有抗原抗体比例合适时才出现阳性反应, 结果只能报告阳性或阴性, 不能报告强阳性弱阳性, 因此在企业参比品设置中, 尤其阳性参比品设置中本文引用强阳性反应参考品中等阳性反应参考品和

5 1196 弱阳性反应参考品的说法, 而实际生产中未使用强阳性参考品中等阳性参考品和弱阳性参考品 6 结语通过对便潜血检测试剂盒生产过程中主要原辅材料工艺要点产品说明书的介绍, 旨在探讨影响产品的因素, 希望生产企业注册部门对该产品生产过程中的技术要点给予关注, 以期提高试剂盒产品质量参考文献 : [1] 国家食品药品监督管理局. 国家食品药品监督管理总局通告 2013 年第 8 号便潜血 (FOB) 定性检测试剂注册申报资料指导原则 [S] [2] 吕辉, 马亚平. 化学法和单克隆法检测大便潜血的诊断价值 [J]. 检验医学与临床,2011,8( 3 ): [3] 徐顺清, 刘衡川. 免疫学检验 [M]. 北京 : 人民卫生出版社,2006: [4] 国家食品药品监督管理局. 金标类检测试剂注册技术中国药事 2015 年 11 月第 29 卷第 11 期审查指导原则 [S] [5] 辛英豪. DHV-I 单克隆抗体的制备与胶体金试纸条的研制 [D]. 泰安 : 山东农业大学出版社,2010. [6] 董劲春. 定性检测用体外诊断试剂的企业内部参考品的设置 [J]. 放射免疫学杂志,2011,24(1): [7] 陈德林. 大便潜血 FOB 胶体金法的检测范围及灵敏度测定 [J]. 当代医学,2013,19(16):18-19 [8] 中国临床检验操作规程 [S]. 第二版. 南京 : 东南大学出版社,1997. [9] 毕红琳, 林玲. 三种大便隐血检测方法的比较 [J]. 检验医学与临床,2010,7(22): [10] 嵇淑玲. 胶体金法与匹拉米洞法测定大便潜血的比较 [J]. 亚太传统医药,2009,5(8): [11] 国家食品药品监督管理局. 国家食品药品监督管理总局通告 2014 年第 17 号体外诊断试剂说明书编写指导原则 [S] [12] 左祥, 刘和平. 检测大便隐血中的钩状效应及对策 [J]. 检验医学与临床,2007,4 (6): ( 收稿日期 2015 年 3 月 19 日编辑邹宇玲 )

材料方法

材料方法生物技术通报姜燕采用鼠抗人血红蛋白单克隆抗体和胶体金标记鼠抗人血红蛋白单克隆抗体及对照抗体羊抗鼠利用双抗体免疫夹心反应原理特异性地结合人血红蛋白抗原在内可得到胶体金显色结果的原理研制便潜血单克隆一步法胶体金检测试卡用于诊断因各种原因引起的消化道出血疾病应用杂交瘤技术制备两株鼠抗人血红蛋白抗体方法检测效价免疫胶体金技术制备胶体金检测试卡法检测效价的结果显示鼠抗人