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1 呼出气冷凝分析在呼吸系统疾病中的应用 成都军区昆明总医院呼吸内科成都军区呼吸内科中心 刘 翱 呼出气冷凝液 (exhaled breath condensate,ebc) 技术是一种不干扰呼吸道本身生理或病理过程的无创 非侵入性检测呼吸道生化成分的新技术 与以往诱导痰和肺泡灌洗检查相比,EBC 有无创 简单易行 和可重复操作的特点, 可用于研究肺部非呼吸功能 分析肺部炎症 氧化应激状态 H 肿瘤标志物以及用于气道炎症监测等方面 目前国内外对 EBC 的研究日见深入, 并有了初步的结果, 特别是在气道炎症研究方面 1 概 述 2 BEC 收集原理及方法 1 概述 3 BEC 在评估气道炎症及氧化应激中的作用 4 BEC 分析在呼吸道疾病中的应用 最早的呼出气生化分析 呼出气冷凝液 (EBC) 成分测定优势 Antoine Laurent de Lavoisier ( ) 1794) 法国 监测呼出气体冷凝物中炎性介质浓度的方法是 1980 年由俄罗斯学者 Sidorenko 提出来的, 但当时未引起大家的重视 直到 1992 年以后该项检测方法才引起了研究者的极大兴趣 完全无创 任何年龄 EBC 生化肺功能 简单 可靠 任何病况 6

2 2 BEC 收集原理及方法 EBC 中超过 99% 的成分是水, 而小于 1% 的物质为各种生化物质, 有数千种之多, 这些物质包括了许多生理物质 炎症和抗炎介质, 了解它们在肺内的变化, 可了解肺脏功能和结构变化, 所以以被称为生化肺功能 EBC 中主要可检测以下三类物质 www, com 试验室分析方法 正常体温时可挥发的物质 如 H 2 O 2 以及挥发性的有机物等,EBC 中可以很容易的检测到这些物质 比色电极法 分光度计量法 EBC 难以挥发又不溶于水的物质 如白三烯和前列腺素等, 可以随水的蒸发而进入 EBC, 酶免疫分析法 EBC 放射免疫测定法 无挥发性又易溶于水的物质 如蛋白, 目前认为分子量 <65ku 的可溶性蛋白可随平静呼吸携带而进入 EBC, 如白介素及干扰素等 化学发光法 液相色谱和质谱测量法 分析得到的生化指标 呼出气冷凝液的收集原理及方法 Leukotrienes B Leukotrienes C4,D4,E rostaglandins E EC/EX ng/ml roteins also glycosylated roteins sep. lines IL 1ß sil 2R U/ml TNFα Stress roteins (HSB) D Dimer Tumor Markers SCC, TA M,CYFRA DNA ng/ml Hydrogen peroxide (H 2 O 2 ) 0,03...0,60 μm 呼气阀 冷凝套 吸气阀 口器 冷凝回路

3 吸气 / 呼气阀 冷凝套 现在市售的收集 EBC 的装置有两种 : 一种为德国耶格公司生产的 EcoScreen 患者将呼出气直接呼入取样管中, 在取样管中, 呼出气被冷却到 20 二为美国研制的装置, 其装置为以制冷的铝管道, 中间放置聚丙烯管, 使用注射器活塞将管壁的液体推出 另有自制简易装置 制冷器 呼出气冷凝液的 收集方法 3 BEC 在评估气道炎症及氧化应激中的作用 呼出气冷凝液 与疾病 呼出气体冷凝物 值变化可用来评估内源性气道酸化的程度,COD 患者 EBC 中 H 同 EBC 中过氧化氢浓度 诱导痰的白细胞数呈很强的负相关, 同时与 FEV1 呈明显正相关 且 值变化与气道内中性粒细胞介导的炎症反应有关 值下降可以导致支气管收缩 破坏纤毛的运动 增加气道分泌黏液的黏度等, 这些机制可以促进气道炎症疾病的发展 呼出气冷凝液 H 2 O 2 与疾病 体内激活的中性粒细胞产生的超氧阴离子, 在超氧化物歧化酶作用下, 被歧化成 H 2 O 2 EBC 中 H 2 O 2 浓度在吸烟者 上呼吸道感染 哮喘 COD 肺囊性纤维化 支气管扩张症和 ARDS 患者中都有升高, 而且在病情加重时升高特别明显 EBC 的 值变化与哮喘的严重程度呈正相关

4 呼出气冷凝液烷类物质与疾病 呼出气冷凝液中氨 (NH 3 ) 与疾病 Gs( 前列腺素 ) 和 LTs( 白三烯 ) 是在中性粒细胞 单核细胞 巨噬细胞中的花生四烯酸分别在环氧酶和脂氧酶作用下形成的, 是体内重要的炎症介质, 这些介质在哮喘 COD ARDS OSAS 肺囊性纤维化等患者的 EBC 中都有升高 异丙前列腺素化学性质稳定 在体内形成, 可作为脂质过氧化的标记物, 具有收缩支气管平滑肌等生物活性作用 其中研究最多的是 8- 异丙前列腺素, 可以在健康人 EBC 中测得, 能够反映肺部氧化应激反应的程度 氨可能在保持呼吸道酸碱度中起重要作用, 可能与哮喘患者 EBC 的 值降低有关 在哮喘和上呼吸道感染者 EBC 中则明显升高 某些细菌 ( 如新型隐球菌 ) 能产大量尿素酶, 因此 EBC 中氨的测定可能有助于这些病原体的诊断 呼出气冷凝液中 NO 相关物质与疾病 呼出气冷凝液中腺苷与疾病 吸烟者 哮喘 COD 肺囊性纤维化患者 EBC 中氮氧化合物 ( 硝酸盐 亚硝酸盐 S- 半胱硫 硝基酪氨酸等 ) 也受到广泛重视 在哮喘 COD 肺囊性纤维化等肺部炎症性疾病患者中,EBC 硝基酪氨酸 (RS-NOs) 升高, 而且它的浓度因不同疾病而异, 和哮喘的严重度也有关 EBC 中 RS-NOs 的测定可作为反映肺部炎症的一种无创生化标记 腺苷是人体内 AT 降解过程中形成的产物 过敏性及运动性哮喘患者气道阻塞的程度, 与血浆中腺苷的浓度有关 哮喘患者的呼吸道也可以合成腺苷, 是由活化的肥大细胞释放, 并参与气道炎症反应 EBC 中腺苷的浓度在哮喘稳定期明显高于健康对照组, 急性加重期将进一步升高, 吸入糖皮质激素治疗后, 气道内肥大细胞的数目减少,EBC 中腺苷的浓度也随之下降 腺苷可作为生物标记物, 用于监测气道炎症反应的变化 EBC 中蛋白质 细胞因子与疾病 EBC 中其它成分与疾病 白细胞介素 4(IL-4) 和干扰素 γ (IFN- γ) 是与哮喘有关的两个细胞因子,EBC 中 IL-4 浓度升高, 而 IFN- γ 浓度下降, 糖皮质激素治疗后 EBC 中 IL4 浓度下降, 而 IFN-γ 浓度升高 非小细胞肺癌患者 EBC 中 IL-6 浓度升高 ; 缺血再灌注损伤的患者 EBC 中 IL-10 的浓度升高 囊性纤维化急性加重期患者 EBC 中 IL-8 浓度升高, 抗生素治疗后, 逐渐降至稳定期水平, 但仍高于正常对照组 谷胱苷肽 CEA 电解质等成分也能在 EBC 中测定 哮喘急性发作患者 EBC 中镁离子的浓度下降, 钙离子的浓度升高 ; 囊性纤维化患者 EBC 中钠离子和氯离子的浓度均升高, 其发生机制还不清楚

5 1 BEC 分析在呼吸道疾病中的应用 我们的研究 主要内容 EBC 成分测定在气道炎症疾病的的初步研究 一 哮喘患者 EBC 及 8 异前列腺素水平检测的评价及临床研究 二 COD 中呼出气冷凝液中 IL 6 和 8-isoprostane 及 测定的评价及临床研究 ATHMA COD OSAS 四 OSAS 患者 EBC 中炎症标志物 IL 6 IL 10 和 TNFα 及氧化应激指标 8 异前列腺素的评价及临床研究 27 材料 -- 研究对象 ( 一 ) 表 1 哮喘组和健康对照组临床资料 组别例数 年龄 FEV1 男 女 ( 岁 ) (%) 健康对照组 ± ±12.6 哮喘组 ±8 74.9±20.5 急性发作期 ±9 55.9±18.2 非急性发作期 ±8 81.5±16.9 轻度间歇 ±6 94.7±8.5 轻度持续 ±8 88.5±6.8 中 重度持续 ± ±15.0 方法 ---- 观察指标及治疗方法 (1) 观察指标 : EBC 中 cys-lts 8-isoprostane 值 肺通气指标 (FEVI%) 轻度持续哮喘患者治疗前后 ACT 得分 (2) 治疗方法 : 选择轻度持续哮喘患者经吸入氟替卡松 125ug, 每日二次治疗 疗程 3 个月

6 结果 ( 一 ) 表 2 哮喘组和健康对照组 EBC 检测结果比较 ( x ±s) Cys-LTs 8-isoprostane 值 () () 哮喘组 (n=59) 健康对照组 (n=13) 66.3± ± ± ± ± ±0.19 哮喘组患者 EBC 中 Cys-LTs 8-isoprostane 水平均较对照组有显著性增高 (<.0001), 值较对照组 有显著性降低 (<.0001) 结果 ( 二 ) 表 3 不同分期的哮喘组 EBC 检测结果比较 ( x ±s) Cys-LTs () 哮喘非急性发作组 (n=44) 51.4±24.8 哮喘急性发作组 (n=15) 110.0±7.6 8-isoprostane 值 () 24.5± ± ± ±0.49 哮喘急性发作组患者 EBC 中 Cys-LTs 8-isoprostane 水平均较非急性发作组有显著性增高 (<.0001), 值较非急性发作组有显著性降低 (<.0001) 结果 ( 三 ) 表 5 不同分级的非急性发作期哮喘组 EBC 检测结果比较 ( x ±s) 结果 ( 六 ) 轻度间歇哮喘组轻度持续哮喘组 p 轻度间歇哮喘组中 重度持续哮喘组 Cys-LTs () 26.5± ± ± ±8.9 8-isoprostane () 13.5± ± ± ± ± ± ± ±0.73 表 7 轻度持续哮喘组治疗前后 ACT 分值及肺功能检测结果比较 ( x ±s) FEV 1(%) ACT 分值 ( 分 ) * 治疗 1 个月治疗前 ± ± ± ±1.1 p 轻度持续哮喘组中 重度持续哮喘组 40.3± ± ± ± ± ±0.73 治疗 3 个月 ** 97.2± ± * 为治疗 1 个月与治疗前的比较,** 为治疗 3 个月与治疗前的比较 哮喘轻度持续组及中 重度持续组的患者 EBC 中 Cys-LTs 8-isoprostane 水平均较轻度间歇组有显著性增高 (<.0001), 值均较轻度间歇组有显著性降低 (<.01,<.0001) 哮喘中 重度持续组的患者 EBC 中 Cys-LTs 8-isoprostane 水平均较轻度持续组有显著性增高 用药 1 个月后, 轻度持续哮喘组患者 FEV 1% 无显著性升高 (>0.05),ACT 分值有显著性升高 (<.0001) 用药 3 个月后,FEV 1% 及 ACT 分值均有显著性升高 (<.01,<.0001) (<.0001), 值均较轻度持续组有显著性降低 (<.01) 结果 ( 七 ) 结果 ( 九 ) 表 8 轻度持续哮喘组治疗前后 EBC 检测结果比较 ( x ±s) Cys-LTs 8-isoprostane () () * 治疗 1 个月治疗前治疗 3 个月 ** ± ± ± ± ± ± ±0.09 * 为治疗 1 个月与治疗前的比较,** 为治疗 3 个月与治疗前的比较 从表 10 可见, 用药 1 个月后, 轻度持续哮喘组患者其 EBC 中 Cys-LTs 8-isoprostane 水平均无显著 性下降 (>0.05), 值无显著性升高 (>0.05) 用药 3 个月后, 值有显著性降低 (<.0001) 表 10 哮喘患者 EBC 中 cys-lts 与 8-isoprostane 的相关性 r 急性发作组非急性发作组轻度间歇哮喘组轻度持续哮喘组中 重度持续哮喘组 哮喘患者 EBC 中 cys-lts 与 8-isoprostane 正性相关, 相关性有统计学意义 ( 均<0 05)

7 结果 ( 十 ) 结果 ( 十一 ) 哮喘急性发作组 Cys-LTs 与 8-isoprostane 哮喘轻度间歇组 Cys-LTs 与 8-isoprostane 表 11 哮喘患者 EBC 中 cys-lts 水平与 EBC- 值的相关性 r 急性发作组 异前列腺素 8- 异前列腺素 非急性发作组 哮喘轻度持续组 Cys-LTs 与 8-isoprostane 哮喘中 重度持续组 Cys-LTs 与 8-isoprostane 轻度间歇哮喘组 轻度持续哮喘组 中 重度持续哮喘组 哮喘患者 EBC 中 cys-lts 水平与 EBC- 值的负性相关, 相关性有统计学意义 ( 均<0 05) 8- 异前列腺素 8- 异前列腺素 结果 ( 十二 ) 哮喘急性发作组 Cys-LTs 与 值 哮喘轻度间歇组 Cys-LTs 与 值 哮喘气道炎症与气道酸化的关系卤化物 EOS EO 氧化 次氯酸 内源性气道酸化 中性粒细胞 MO (+) Cl - + NO - 2 NO H 2 O 2 哮喘轻度持续组 Cys-LTs 与 值 哮喘中 重度持续组 Cys-LTs 与 值 肥大细胞组胺粘膜泌 H + 巨噬细胞 EOS 的 H + -AT 酶 ( ) 谷氨酰胺 谷氨酰胺酶 干扰素 肿瘤坏死因子 ( ) 激素 (+) 氨 结论 哮喘患者 (1) 哮喘患者 EBC 中 Cys LTs 和 8-isoprostane 水平均较健康对照组显著升高, 值显著降低, 而且与病情的严重程度有关, 进一步肯定了炎症介质 Cys LTs 氧化应激因素 8- isoprostane 及气道酸化在哮喘气道病变中的作用 (2)EBC 中 Cys LTs 与 8-isoprostane 水平呈正相关, 与 值负相关, 进一步证明了哮喘患者气道炎症与氧化应激 气道酸化相互作用, 相互影响, 密切相关 (3) 吸入糖皮质激素能纠正内源性气道酸化, 但并不能完全充分地抑制哮喘气道的所有炎症反应, 而且在控制哮喘气道的脂质过氧化反应及氧化应激损伤方面亦是有限的 Distribution of IL-6 in EBC by AHI group Distribution of TNF-a in EBC by AHI group Distribution of IL-10 in EBC by AHI group Distribution of 8-isoprostane in EBC by AHI group

8 Figure.2.The correlation matrix and paired scatter plots. Distribution of IL-6 in Serum by AHI group Distribution of IL-10 in Serum by AHI group ahi eil eil etnf Distribution of TNF-a in Serum by AHI group Distribution of 8-isoprostane in Serum by AHI group e8.iso sil s il stnf s8.iso 结论 OSAS 患者 结论 COD 患者 1 EBC 中 IL 6 和 IL 10 的测定可以成为监测 OSAS 患者严重程度的方法, 与多导睡眠图检查相比, 具有简单 无需病人需留院检查等优点 2 在不能进行多导睡眠图监测时,IL 6 TNF α 测定可以作为阻塞性睡眠呼吸暂停综合征患者治疗后随访的检测工具 ; 3 OSAS 病人经治疗后发现其 EBC 中 IL 6 TNF α 可下降, 监测 EBC 中炎症介质含量可了解患者病情变化 1 COD 患者 EBC 中 8 异前列腺素,IL 6 浓度显著的升高, 且与疾病的严重程度相关 ; 8 异前列腺素和 IL 6 可作为监测 COD 气道炎症及氧化应激的有效指标, 2 COD 急性加重期时 EBC 明显低于治疗后 ; 治疗后仍然低于对照组 提示 COD 气道酸化明显, 特别是在急性加重期 结论 COD 患者 3 GRE 阳性 COD 组患者 EBC H 低于 GRE 阴性者, 表明胃食管反流能降低气道 H, 加重气道酸化, GRE 阳性 COD 组患者肺功能低于 GRE 阴性者, 提示反复胃食管反流加重气道阻塞, 使气流受限更加明显 4 对 GRE 阳性 COD 组和 GRE 阴性 COD 组均抗反流 + 常规治疗后,GRE 阳性 COD 组 H 升高大于 GRE 阳性 COD 组, 说明 GRE 在气道酸化中起重要作用 对怀疑有 GRE 增加抗酸治疗可提高临床疗效

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