分子生物学实验常用试剂、缓冲液的配制方法

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1 实验常用试剂 缓冲液的配制方法 1 1M Tris-HCl 组份浓度 1 M Tris-HCl (ph7.4,7.6,8.0) 配置方法 1. 称量 121.Tris 置于 1L 烧杯中 2. 加入约 800mL 的去离子, 充分搅拌溶解 3. 按下表量加入浓盐酸调节所需要的 ph 值 ph 值浓 HCl 7.4 约 70mL 7.6 约 60mL 8.0 约 42mL 4. 将溶解定容至 1L 5. 高温高压灭菌后, 室温保存 注意 : 应使溶液冷却至室温后再调定 ph 值, 因为 Tris 溶液的 ph 值随温度的变化差很大, 温度每升高 1, 溶液的 ph 值大约降低 0.03 个单位 M Tris-HCl 组份浓度 1.5 M Tris-HCl (ph8.8) 配置方法 1. 称取 181.7gTris 置于 1L 烧杯中 2. 加入约 800mL 的去离子, 充分搅拌溶解 3. 用浓盐酸调 ph 值至 将溶液定容至 1L 5. 高温高压灭菌后, 室温保存 注意 : 应使溶液冷却至室温后再调定 ph 值, 因为 Tris 溶液的 ph 值随温度的变化差异很大, 温度每升高 1, 溶液的 ph 值大约降低 0.03 个单位 3 10 TE Buffer 组份浓度 100 mm Tris-HCl,10 mm EDTA (ph 7.4,7.6,8.0) 配置方法 1. 量取下列溶液, 置于 1L 烧杯中 1 M Tris-HCl Buffer(pH7.4,7.6,8.0) 100mL 500 mm EDTA(pH8.0) 20mL 2. 向烧杯中加入约 800mL 的去离子, 均匀混合 3. 将溶液定至 1L 后, 高温高压灭菌 4. 室温保存 4 3 M 醋酸钠 组份浓度 3 M 醋酸钠 (ph5.2) 配制量 100mL 配置方法 1. 称取 40.8gNaOAc 3H2O 置于 100~200mL 烧杯中, 加入约 40mL 的去离子搅拌溶解 2. 加入冰乙酸调节 ph 值至 加入去离子将溶液定容至 100mL 4. 高温高压灭菌后, 室温保存 5 PBS Buffer 组份浓度 137 mm NaCl,2.7mM KCl,10 mm Na2HPO4,2 mm KH2PO4 配置方法 1. 称量下列试剂, 置于 1L 烧杯中 NaCl 8 g KCl 0. Na2HPO g KH2PO4 0.27g 2. 向烧杯中加入约 800 ml 的去离子, 充分搅拌溶解 3. 滴加 HCl 将 ph 值调节至 7.4, 然后加入去离子将溶液定容至 1L 4. 高温高压灭菌后, 室温保存 注意 : 上述 PBS Buffer 中无二价阳离子, 如需要, 可在配方中补充 1mM CaCl2 和 0.5 mm MgCl M 醋酸铵 组份浓度 10 M 醋酸铵 配制量 100mL 配置方法 1. 称量 77. 醋酸铵置于 100~200 ml 烧杯中, 加入约 30 ml 的去离子搅拌溶解 2. 加去离子将溶液定容至 100mL 3. 使用 0.22μm 滤膜过滤除菌 4. 密封瓶口于室温保存 注意 : 醋酸铵受热易分解, 所以不能高温高压灭菌 7 Tris- HCl 平衡苯酚 配置方法 1. 使用原料 : 大多数市售液化苯酚是清亮无色的, 无需重蒸馏便可用于分子生物学实验 但有些液化苯酚呈粉红色或黄色, 应避免使用 同时也应避免使用结晶苯酚, 结晶苯酚必须在 160 对其进行重蒸馏除去诸如醌等氧化产物, 这些氧化产物可引起磷酸二酯键的断裂或导致 RNA 和 DNA 的交联等 因此, 苯酚的质量对 DNA RNA 的提取极为重要, 我们推荐使用高质量的苯酚进行分子生物学实验 2. 操作注意 : 苯酚腐蚀性极强, 并可引起严重灼伤, 操作时应戴手套及防护镜等 所有操作均应在通风橱中进行, 与苯酚接触过的皮肤部位应用大量清洗, 并用肥皂和洗涤, 忌用乙醇 3. 苯酚平衡 : 因为在酸性 ph 条件下 DNA 分配于有机相, 因此使用苯酚前必须对苯酚进行平衡使其 ph 值达到 7.8 以上, 苯酚平衡操作方法如下 : 1 液化苯酚应贮存于 -20, 此时的苯酚呈现结晶状态 从冰柜中取出的苯酚首先在室温下放置使其达到室温, 然后在 68 浴中使苯酚充分溶解 2 加入羟基喹啉 (8-Quinolinol) 至终浓度 0.1% 该化合物是一种还原剂 RNA 酶的不完全抑制剂及金属离子的弱螯合剂,

2 同时因其呈黄色 有助于方便识别有机相 3 加入等体积的 1M Tris-HCl(pH8.0), 使用磁力搅拌器搅拌 15 分钟, 静置使其充分分层后, 除去上层相 4 重复操作步骤 3 5 加入等体积的 0.1M Tris-HCl(pH8.0), 使用磁力搅拌器搅拌 15 分钟, 静置使其充分分层后, 除去上层相 6 重复操作步骤 5, 稍微残留部分上层相 7 使用 ph 试纸确认有机相的 ph 值大于 将苯酚置于棕色玻璃瓶中 4 避光保存 8 苯酚/ 氯仿 / 异戊醇 配置方法 1. 说明 : 从核酸样品中除去蛋白质时常常使用苯 / 酚 / 氯仿 / 异戊醇 (25:24:1) 氯仿可使蛋白(25 :24 :1) 质变性并有助于液相与有机相的分离, 而异戊醇则有助于消除抽提过程中出现的气泡 2. 配置方法 : 将 Tris-HCl 平衡苯酚与等体积的氯仿 / 异戊醇 (24:1) 均匀混合后, 移入棕色玻璃瓶中 4 保存 9 10%(W/V)SDS 组份浓度 10%(W/V)SDS 配制量 100mL 配置方法 1. 称量 高纯度的 SDS 置于 100~200mL 烧杯中, 加入约 80mL 的去离子,68 加热溶解 2. 滴加数滴浓盐酸调节 ph 值至 将溶液定容至 100mL 后, 室温保存 10 2 N NaOH 组份浓度 2N NaOH 配制量 100mL 配置方法 1. 量取 80mL 去离子置于 100~200mL 塑料烧杯中 (NaOH 溶解过程中大量放热, 有可能使玻璃烧杯炸裂 ) 2. 称取 8g NaOH 小心地逐渐加入到烧杯中, 边加边搅拌 3. 待 NaOH 完全溶解后, 用去离子将溶液体积定容至 100mL 4. 将溶液转移至塑料容器中后, 室温保存 N HCl 组份浓度 2.5 N HCl 配制量 100mL 配置方法 1. 在 78.4mL 的去离子中加入 21.6mL 的浓盐酸 (11.6N), 均匀混合 2. 室温保存 12 5 M NaCl 组份浓度 5 M NaCl 配置方法 1. 称取 292. NaCl 置于 1L 烧杯中, 加入约 800mL 的去离子后搅拌溶解 2. 加去离子将溶液定容至 1L 后, 适量分成小份 3. 高温高压灭菌后,4 保存 13 20%(W/V)Glucose 组份浓度 20%(W/V)Glucose 配制量 100mL 配置方法 1. 称取 Glucose 置于 100~200mL 烧杯中, 加入约 80mL 的去离子后, 搅拌溶解 2. 加去离子将溶液定容至 100mL 3. 高温高压灭菌后,4 保存 14 Solution I 组份浓度 25 mm Tris-HCl(pH8.0),10mM EDTA,50mM Glucose ( 质粒提取用 ) 配置方法 1. 量取下列溶液, 置于 1L 烧杯中 1M Tris-HCl(pH8.0) 25mL 0.5 M EDTA(pH8.0) 20mL 20%Glucose(1.11M) 45mL dh2o 910mL 2. 高温高压灭菌后,4 保存 3. 使用前每 50 ml 的 Soliution I 中加入 2mL 的 RNase A(20mg/mL) 15 Solution II 组份浓度 250mM NaOH,1%(W/V)SDS ( 质粒提取用 ) 配制量 500mL 配置方法 1. 量取下列溶液置于 500mL 烧杯中 10%SDS 50mL 2N NaOH 50mL 2. 加灭菌定容至 500mL, 充分混匀 3. 室温保存 此溶液保存时间最好不要超过一个月 注意 :SDS 易产生气泡, 不要剧烈搅拌 16 Solution III 组份浓度 3M KOAc,5M CH3COOH ( 质粒提取用 ) 配制量 500mL 配置方法 1. 量取下列溶液置于 500mL 烧杯中 KOAc 147g CH3COOH 57.5mL 2. 加入 300mL 去离子后搅拌溶解 3. 加去离子将溶液定容至 500mL 4. 高温高压灭菌后,4 保存 M EDTA 组份浓度 0.5 M EDTA (ph8.0) 配置方法 1. 称取 186. Na2EDTA 2H2O, 置于 1L 烧杯中 2. 加入约 800mL 的去离子, 充分搅拌 3. 用 NaOH 调节 ph 值值 8.0( 约 NaOH) 注意 :ph 值至 8.0 时,EDTA 才能完全溶解 4. 加去离子将溶液定容至 1L 5. 适量分成小份后, 高温高压灭菌 6. 室温保存 18 1 M DTT 组份浓度 1 M DTT 配制量 20mL 配置方法 1. 称取 3.09g DTT, 加入到 50mL 塑料离心管内 2. 加 20mL 的 0.01 M 的 NaOAc(pH5.2), 溶解后使用 0.22μm 滤器过滤除菌 3. 适量分成小份后,-20 保存 19 10mM ATP 组份浓度 10mM ATP 配制量 20mL 配置方法 1. 称取 121mg Na2ATP 3H2O, 加入到 50mL 塑料离心管内 2. 加 20mL 的 25mM Tris-HCl(pH8.0), 搅拌溶解 3. 适量分成小份,-20 保存 分子生物学实验常用培养基的配制方法

3 1 Ampicillin 组份浓度 100mg/ml Ampicillin (100mg/ml) 配制量 50mL 配置方法 1. 称量 Ampicillin 置于 50mL 离心管中 2. 加入 40mL 灭菌, 充分混合溶解后, 定容至 50mL 3. 用 0.22μm 滤膜过滤除菌 4. 小份分装 (1mL/ 份 ) 后,-20 保存 2 IPTG 组份浓度 24mg/mL IPTG (24mg/mL) 配制量 50mL 配置方法 1. 称量 1. IPTG 置于 50mL 离心管中 2. 加入 40mL 灭菌, 充分混合溶解后, 定容至 50mL 3. 用 0.22μm 滤膜过滤除菌 4. 小份分装 (1mL/ 份 ) 后,-20 保存 3 X- Gal 组份浓度 20mg/mL X- Gal (20mg/mL) 配制量 50mL 配置方法 1. 称取 X-Gal 置于 50mL 离心管中 2. 加入 40mL DMF( 二甲基甲酰胺 ), 充分混合 溶解后, 定容至 50mL 3. 小份分装 (1mL/ 份 ) 后,-20 保存 4 LB 培养基 组份浓度 1%(W/V),0.5%(W/V) Yeast Extract,1%(W/V)NaCl 配置方法 1. 称量下列试剂, 置于 1L 烧杯中 Yeast Extract NaCl 2. 加入约 800mL 的去离子, 充分搅拌溶解 3. 滴加 5N NaOH( 约 0.2mL), 调节 ph 值至 高温高压灭菌后,4 保存 5 LB/Amp 培养基 组份浓度 1%(W/V) 0.5%(W/V) Yeast Extract 1%(W/V) NaCl 0.1mg/mL Ampicillin 配置方法 1. 称量下列试剂, 置于 1L 烧杯中 Yeast Extract NaCl 2. 加入约 800mL 的去离子, 充分搅拌溶解 3. 滴加 5N NaOH( 约 0.2mL), 调节 ph 值至 加去离子将培养基定容至 1L 5. 高温高压灭菌后, 冷却至室温 6. 加入 1mL Ampicillin(100mg/mL) 后均匀混合 7. 4 保存 6 TB 培养基 组份浓度 1.2%(W/V) 2.4%(W/V) Yeast Extract 0.4%(V/V) Glycerol 17mM KH2PO4 72mM K2HPO4 配置方法 1. 配制磷酸盐缓冲液 (0.17M KH2PO4,0.72M K2HPO4)100mL 磷酸盐缓冲液 2. 称取下列试剂, 置于 1L 烧杯中 1 Yeast Extract 24g Glycerol 4mL 3. 加入约 800mL 的去离子, 充分搅拌溶解 4. 加去离子将培养基定容至 1L 后, 高温高压灭菌 5. 待溶液冷却至 60 以下时, 加入 100mL 的上述灭菌 6. 4 保存 7 TB/Apm 培养基 组份浓度 1.2%(W/V) 配置方法 2.4%(W/V) Yeast Extract 0.4%(V/V) Glycerol 17mM KH2PO4 72mM K2HPO4 0.1mg/mL Ampicillin 1. 配制磷酸盐缓冲液 (0.17M KH2PO4,0.72M K2HPO4)100mL 溶解 2.3 KH2PO4 和 2.54g K2HPO4 于 90mL 的去离子中, 搅 拌溶解后, 加去离子定容至 100mL, 高温高压灭菌 2. 称取下列试剂, 置于 1L 烧杯中 1 Yeast Extract 24g Glycerol 4mL 3. 加入约 800mL 的去离子, 充分搅拌溶解 4. 加去离子将培养基定容至 1L 后, 高温高压灭菌 5. 待溶液冷却至 60 以下时, 加入 100mL 的上述灭菌磷酸盐缓冲 液和 1mL Ampicillin(100mg/mL) 6. 均匀混合后 4 保存 8 SOB 培养基 组份浓度 2%(W/V) 0.5%(W/V) Yeast Extract 0.05%(W /V) NaCl 2.5mM KCl 10mM MgCl2 配置方法 1. 配制 250mM KCl 溶液 在 90mL 的去离子中溶解 1.86g KCl 后, 定容至 100mL 2. 配制 2M MgCl2 溶液 在 90mL 的去离子中溶解 19g MgCl2 后, 定容至 100mL, 高温高压灭菌 3. 称取下列试剂, 置于 1L 烧杯中 Yeast Extract NaCl 加入约 800mL 的去离子, 充分搅拌溶解 5 量取 10mL 250 mm KCl 溶液, 加入到烧杯中 6. 滴加 5N NaOH 溶液 ( 约 0.2mL), 调节 ph 值至 加入去离子将培养基定容至 1L 8. 高温高压灭菌后,4 保存

4 9. 使用前加入 5mL 灭菌的 2M MgCl2 溶液 9 SOC 培养基 组份浓度 2%(W/V) 0.5%(W/V) Yeast Extract 0.05%(W /V) NaCl 2.5mM KCl 10mM MgCl2 20mM 葡萄糖 配制量 100mL 配置方法 1. 配制 1M 葡萄糖溶液 将 18g 葡萄糖溶于 90mL 去离子中, 充 分溶解后定容至 100mL, 用 0.22μm 滤膜过滤除菌 2. 向 100mL SOB 培养基中加入除菌的 1M 葡萄糖溶液 2mL, 均匀 混合 3. 4 保存 10 2 YT 培养基 组份浓度 1.6%(W/V), 1%(W/V) Yeast Extract,0.5%(W/V)NaCl 配置方法 1. 称取下列试剂, 置于 1L 烧杯中 16g Yeast Extract NaCl 2. 加入约 800mL 的去离子, 充分搅拌溶解 3. 滴加 1N KOH, 调节 ph 值至 加离子将培养基定容至 1L 5. 高温高压后,4 保存 11 Φb broth 培养基 组份浓度 2%(W/V), 0.5% (W/V)Yeast Extract,0.5%(W/V)MgSO4 7H2O 配置方法 1. 称取下列试剂, 置于 1L 烧杯中 Yeast Extract MgSO4 7H2O 2. 加入约 800mL 的去离子, 充分搅拌溶解 3. 滴加 1N KOH, 调节 ph 值至 加离子将培养基定容至 1L 5. 高温高压后,4 保存 12 NZCYM 培养基 组份浓度 0.5%(W/V) Yeast Extract 0.1%(W/V) Casamino Acid 1%(W /V) NZ 胺 0.5%(W /V) NaCl 0.2%(W /V) MgSO4 7H2O 配置方法 1. 称取下列试剂, 置于 1L 烧杯中 Yeast Extract Casamino Acid NZ 胺 NaCl MgSO4 7H2O 2. 加入约 800mL 的去离子, 充分搅拌溶解 3. 滴加 5N NaOH 溶液 ( 约 0.2mL), 调节 ph 值至 加离子将培养基定容至 1L 5. 高温高压后,4 保存 13 NZYM 培养基 组份浓度 0.5%(W/V) Yeast Extract 1%(W /V) NZ 胺 0.5%(W /V) NaCl 0.2%(W /V) MgSO4 7H2O 配置方法 NZYM 培养基除不含 Casamino Acid( 酪蛋白氨基酸 ) 外, 其他成份与 NZCYM 培养基相同 14 NZM 培养基 组份浓度 1%(W /V) NZ 胺 0.5%(W /V) NaCl 0.2%(W /V) MgSO4 7H2O 配置方法 NZM 培养基除不含 Yeast Extract( 酵母提取物 ) 外, 其他成份与 NZYM 培养基相同 15 一般固体培养基的 配置方法 1. 按照液体培养基配方准备好 液体培养基, 在高温高压灭菌前, 加入下列试剂中的一种 配制 Agar( 琼脂 : 铺制平板用 ) 1/L Agar( 琼脂 : 配制顶层琼脂用 ) 7g/L Agarose( 琼脂糖 : 铺制平板用 ) 15 g/l Agarose( 琼脂糖 : 配制顶层琼脂用 ) 7g/L 2. 高温高压灭菌后, 带上手套取出培养基, 摇动容器使 琼脂或琼脂糖充分混匀 ( 此时培养基温度很高, 小心烫伤 ) 3. 待培养基冷却至 50~60 时, 加入热不稳定物质 ( 如 抗生素 ), 摇动容器充分混匀 4.. 铺制平板 (30~35mL 培养基 /90mm 培养皿 ) 16 LB/Amp/X-Gal/IPTG 组份浓度 1%(W /V) 平板培养基 0.5%(W/V) Yeast Extract 1%(W/V) NaCl 0.1mg/mL Ampicillin 0.5%(W /V) IPTG 0.04mg/mL X-Gal 1.5%(W /V) Agar 配置方法 1. 称取下列试剂, 置于 1L 烧杯中 Yeast Extract NaCl 2. 加入约 800mL 的去离子, 充分搅拌溶解 3. 滴加 5N NaOH 溶液 ( 约 0.2mL), 调节 ph 值至 加离子将培养基定容至 1L 后, 加入 1Agar 5. 高温高压灭菌后, 冷却至 60 左右 6. 加入 1mL Ampicillin(100mg/mL) 1mL IPTG (24mg/mL) 2mL X-Gal(20mg/mL) 后均匀混合 7. 铺制平板 (30~35mL 培养基 /90mm 培养基 ) 8. 4 保存平板 17 TB/Amp/X-Gal/IPTG 组份浓度 1.2%(W /V) 平板培养基 2.4%(W/V) Yeast Extract 0.4%(W/V) Glycerol 17mM KH2PO4

5 72mM K2HPO4 0.1mg/mL Ampicillin 0.024mg/mL IPTG 0.04mg/mL X-Gal 1.5%(W /V) Agar 配置方法 1. 配制磷酸盐缓冲液 (0.17M KH2PO4,0.72M K2HPO4)100mL 2. 称取下列试剂, 置于 1L 烧杯中 1 Yeast Extract 24g Glycerol 4mL 3. 加入约 800mL 的去离子, 充分搅拌溶解 4. 加离子将培养基定容至 1L 后, 加入 1Agar 5. 高温高压灭菌后, 冷却至 60 左右 6. 加入 100mL 的上述灭菌磷酸盐缓冲液 1mL Ampicillin(100mg/mL) 1mL IPTG(24mg/mL) 2mL X-Gal (20mg/mL) 后均匀混合 7. 铺制平板 (30~35mL 培养基 /90mm 培养基 ) 8. 4 保存平板 生物化学实验常用试剂的配制方法 1 0.5mol/L 氢氧化钠溶液 组份浓度 0.5mol/L 配制量 2L 配置方法 1. 准确称取氢氧化钠 40g 2. 用去离子溶解并稀释至 2L 2 0.5mol/L 盐酸溶液 组份浓度 0.5mol/L 配制量 2L 配置方法 1. 准确量取盐酸 83.4mL 2. 用去离子稀释至 2L 4 0.2% 葡萄糖标准溶液 组份浓度 0.2% 配置方法 1. 称取葡萄糖 2. 置于称量瓶中, 在 70 干燥 2 小时 2. 干燥器中冷却至室温, 重复干燥, 冷却至恒重 3. 准确称取葡萄糖 2.000g 4. 用去离子溶解并定容至 1L 5. 于 4 保存 5 250μg/mL 牛血清 组份浓度 250μg/mL 白蛋白标准液 配制量 2L 配置方法 1. 准确称取 250mg 标准牛血清白蛋白 2. 用 0.03mol/LpH7.8 的磷酸缓冲液溶解并定容至 1L 3.4 保存 6 Folin 试剂甲 配置方法 1. 称取 氢氧化钠溶于 400mL 去离子中, 加入 50g 无碳酸钠, 溶解, 待用 2. 称取 0. 酒石酸钾钠, 溶于 80mL 去离子中, 加入 0.2 硫酸铜 5, 溶解 3. 将 1:2: 去离子按 20:4:1 的比例混合即可 4. 4 保存, 可用一周 7 Folin 试剂乙 配置方法 1. 在 500mL 的磨口回流装置内加入钨酸钠 g, 钼酸钠 g, 去离子 175mL,85% 磷酸 12.5mL, 浓盐酸 25mL, 充分混合 2. 回流 10 小时, 再加硫酸锂 37., 去离子 12.5mL 及数滴溴 3. 然后开口沸腾 15min, 以驱除过量的溴, 冷却后定容到 250mL 4. 于棕色瓶中保存, 可使用多年注意 : 上述制备地 Folin 试剂乙地贮备液浓度一般在 2mol/L 左右, 几种操作方案都是把 Folin 试剂乙稀释至 1mol/L 的浓度作为应用液, 我们这时是把贮备液于使用前稀释 18 倍, 使之浓度为 0.1mol/L 略高 这种稀释 18 倍后的 Folin 试剂乙就是上文称之为的 应用液 Folin 试剂乙贮备液浓度的标定, 一般是以酚酞为指示剂 用 Folin 试剂乙去滴定 1mol/L 左右的标准氢氧化钠溶液, 当溶液颜色由红变为紫灰, 再突然变成墨绿即为终点, 如果用氢氧化钠去滴定 Folin 试剂乙, 终点不太好掌握, 溶液地颜色是由浅黄变为浅绿, 再变为灰紫色为终点 8 DNS 试剂 配置方法 1. 取 3,5- 二硝基杨酸, 加入 2mol/L 氢氧化钠溶液 200mL (3,5- 二硝基杨酸试剂 ) 2. 将 3,5- 二硝基杨酸溶解, 然后加入酒石酸钾钠 300g 3. 待其完全溶解, 用去离子稀释至 2000mL, 棕色瓶保存 9 5% 蔗糖溶液 组份浓度 5% 配置方法称取蔗糖 50g, 用去离子溶解定容至 1L mol/L 蔗糖溶液 组份浓度 0.1mol/L 配置方法称取蔗糖 g, 用去离子溶解并定容至 1L 11 20% 乙酸溶液 组份浓度 20% 配制量 1.2L 配置方法量取冰乙酸 300mL, 用去离子稀释至 1200mL 12 30%(W/V)Acrylamide 组份浓度 30%(W/V)Acrylamide 0.05% 配置方法 1. 称量下列试剂, 置于 1L 烧杯中 Acrylamide 290g BIS 2. 向烧杯中加入约 600mL 的去离子, 充分搅拌溶解 3. 加入去离子将溶液定容至 1L, 用 0.45μm 滤膜滤去杂质 4. 于棕色瓶中 4 保存 注意 : 丙稀铣胺具有很强的神经毒性, 并可通过皮肤吸收, 其作用有积累性, 配制时应戴手套等 聚丙烯酰胺无毒, 但也应谨慎操作, 因为有可能含有少量的未聚合成份 13 40%(W/V)Acrylamide 组份浓度 40%(W/V)Acrylamide 0.05% 配置方法 1. 称量下列试剂, 置于 1L 烧杯中 Acrylamide 380g BIS 2. 向烧杯中加入约 600mL 的去离子, 充分搅拌溶解 3. 加入去离子将溶液定容至 1L, 用 0.45μm 滤膜滤

6 去杂质 4. 于棕色瓶中 4 保存 注意 : 丙稀铣胺具有很强的神经毒性, 并可通过皮肤吸收, 其作用有积累性, 配制时应戴手套等 聚丙烯酰胺无毒, 但也应谨慎操作, 因为有可能含有少量的未聚合成份 14 10%(W/V) 过硫酸铵 组份浓度 10%(W/V) 过硫酸铵 配制量 10mL 配置方法 1. 称取 过硫酸铵 2. 加入 10mL 的去离子后搅拌溶解 3. 贮存于 4 注意 :10% 过硫酸胺溶液在 4 保存时间可使用 2 周左右, 超过期限会失去催化作用 15 考马斯亮蓝 R-250 染色液 组份浓度 0.1%(W/V) 考马斯亮蓝 R-250,25%(V/V) 异丙醇, 10%(V/V) 冰醋酸 配置方法 1. 称取 考马斯亮蓝 R-250, 置于 1L 烧杯中 2. 量取 250mL 的异丙醇加入上述烧杯中, 搅拌溶解 3. 加入 100mL 的冰乙醋酸, 均匀搅拌 4. 加入 650mL 的去离子, 均匀搅拌 5. 用滤纸出去颗粒物质后, 室温保存 16 考马斯亮蓝染色脱色液 组份浓度 10%(V/V) 醋酸,5%(V/V) 乙醇 配置方法 1. 量取下列溶液, 置于 1L 烧杯中 醋酸 100mL 乙醇 50mL dh 2 O 850mL 2. 充分混合后使用 17 凝胶固定液 组份浓度 50%(V/V) 甲醇,10%(V/V) 醋酸 (SDS-PAGE 银氨染色用 ) 配制量 100L 配置方法 1. 量取下列溶液, 置于 1L 烧杯中 甲醇 500mL 醋酸 100mL dh 2 O 400mL 2. 均匀混合后室温保存 18 凝胶处理液 组份浓度 50%(V/V) 甲醇,10%(V/V) 戊二醛 (SDS-PAGE 银氨染色用 ) 配置方法 1. 量取下列溶液, 置于 1L 烧杯中 甲醇 50mL 戊二醛 10mL dh 2 O 40mL 2. 均匀混合后室温保存 19 凝胶染色液 组份浓度 0.4%(W/V) 硝酸银,1%(V/V) 浓氨, (SDS-PAGE 银氨染色用 ) 0.04%(W/V) 氢氧化钠 配制量 100L 配置方法 1. 量取下列试剂, 加入 100~200mL 试剂瓶中 20% 硝酸银 2mL 浓氨 1mL 4% 氢氧化钠 1mL dh 2 O 96mL 2. 均匀混合 该溶液应为无色透明状 如氨浓度过低时溶液会呈现混浊状, 此时应补加浓氨, 直至透明 3. 本染色液应现用现配, 不宜保存 20 显影液 组份浓度 0.005%(V/V) 柠檬酸,0.02%(V/V) 甲醛 (SDS-PAGE 银氨染色用 ) 配置方法 1. 称取下列试剂, 置于 1L 试剂瓶中 柠檬酸 50mg 甲醛 0.2mL 2. 加入 1L 去离子后, 摇动混合后溶解 3. 室温保存 21 45% 乙醇溶液 组份浓度 45% 配置方法量取无乙醇 450mL, 加入去离子 550mL, 混匀 22 5% 的十二烷基硫酸钠溶液 组份浓度 5% (W/V) 配制量 0.1L 配置方法 : 称取 5.0g 十二烷基硫酸钠, 溶于 100mL4% 的乙醇溶液中 23 三氯甲烷 - 异戊醇混合试剂 配置方法取 500mL 三氯甲烷试剂, 加入 21mL 异戊醇试剂, 混匀 % 乙醛溶液 组份浓度 1.6% 配制量 0.1L 配置方法取 47% 乙醛 3.4mL, 用去离子定容至 100mL 25 二苯胺试剂 配置方法 1. 称取二苯胺试剂 0.8g, 溶解于 180mL 冰乙酸中, 2. 再加入 8mL 高氯酸混匀 3. 临用前加入 0.8mL 1.6% 乙醛溶液 注意 : 配制完成后试剂应为无色 26 15% 三氯乙酸溶液 组份浓度 15% 配制量 2L 配置方法称取三氯乙酸 300g, 用去离子溶解定容至 2000mL 27 1% 谷氨酸溶液 组份浓度 1% 配制量 0.5L 配置方法 1. 称取 谷氨酸, 先用适量得用去离子溶解 2. 再用氢氧化钾溶液中和至中性 3. 最后用去离子定容至 0.5L 28 1% 丙酮酸溶液 组份浓度 1% 配制量 0.5L 配置方法 1. 称取 丙氨酸, 先用适量得用去离子溶解 2. 再用氢氧化钾溶液中和至中性 3. 最后用去离子定容至 0.5L % 的碳酸氢钾溶液 组份浓度 0.1% 配制量 0.5L 配置方法称取碳酸氢钾 0., 用去离子溶解定容至 0.5L

7 % 的碘乙酸溶液 组份浓度 0.05% 配制量 0.25L 配置方法称取 0.12 碘乙酸, 用去离子溶解定容至 0.25L 31 Locke 氏溶液 配制量 2L 配置方法称取 18g,0.84g 氯化钾, 48g 氯化钙,0.3g 碳酸氢钠, 葡萄糖, 用去离子溶解定容至 2000mL mol/L 的丁酸溶液 组份浓度 0.2mol/L 配置方法 1. 量取 18mL 正丁酸试剂 2. 用 1mol/L 的氢氧化钠中和 3. 再用去离子定容至 1L mol/L 的硫代硫酸钠溶液 组份浓度 0.1mol/L 配制量 10L 配置方法称 g 硫代硫酸钠, 用去离子溶解并定至 10L mol/L 的碘溶液 组份浓度 0.1mol/L 配置方法 1. 称取碘 12.7g 和碘化钾 2 2. 用去离子溶解并定容至 1L 3. 用 0.1mol/L 的硫代硫酸钠标定 35 10% 氢氧化钠溶液 组份浓度 10% 配制量 2L 配置方法称取 200g 氢氧化钠, 用去离子溶解并定容至 2L 36 10% 盐酸溶液 组份浓度 10% 配制量 0.2L 配置方法量取浓盐酸 49.3mL, 用去离子定至 0.2mL % 标准丙氨酸溶液 组份浓度 0.1% 配制量 0.5L 配置方法称取丙氨酸 0., 用去离子溶解并定容至 0.5mL % 标准谷氨酸溶液 组份浓度 0.1% 配制量 0.5L 配置方法称取谷氨酸 0., 用去离子溶解并定容至 500mL % 合茚三酮乙醇溶液 组份浓度 0.1% 配置方法称取 合茚三酮试剂, 溶于 无乙醇中 40 酚溶液 配置方法在大烧杯中加入 80mL 去离子, 再加入 300g 苯酚, 在浴中加热搅拌 混合至苯酚完全溶解 将该溶液倒入盛有 200mL 去离子的 分液漏斗内, 轻轻振荡混合, 使其成为乳状液 静止 7~10 小时, 乳状液变成两层透明溶液, 下层为被饱和的酚溶液, 放出下层, 贮存于棕色瓶中备用 % 淀粉溶液 组份浓度 0.5% 配制量 0.1L 配置方法称取淀粉 0., 用去离子溶解定容至 0.1L 42 对羟基联苯试剂配置方法称取对羟基联苯 1., 溶于 100mL0.5% 氢氧化钠溶液中, 配制成 1.5% 的溶液 若对羟基联苯颜色较深, 应用丙酮或无乙醇重结晶, 放置时间较长后, 会出项针状结晶, 应摇匀后使用 生物化学实验常用缓冲液的配制方法 mol/l 磷酸缓冲液 组份浓度 0.2mol/L (ph 6.0) 配置方法 1. 称取磷酸氢二钠 g 2. 称取磷酸二氢钠 g 3. 用去离子溶解并定容至 1L 室温保存 注意 : 此为母液, 使用时稀释 40 倍使用 2 洗脱液 组份浓度 0.15mol/L ( 含 0.15mol/L 氯 配制量 10L 化钠的 0.005mol/L 配置方法 1. 称取 87.66g ph 6.0 的磷酸缓冲液 ) 2. 用 0.2mol/L ph6.0 的 磷酸缓冲液 250mL 溶解 3. 用去离子稀释至 10 L 室温保存 3 0.3mol/L 磷酸缓冲液 组份浓度 0.3mol/L (ph7.8) 配制量 0.5L 配置方法 1. 准确称取磷酸氢二钠 g 2. 磷酸二氢钠 g 3. 用去离子溶解并定容至 0.5L 室温保存 注意 : 此为母液, 使用时稀释 10 倍使用 4 0.2mol/L 乙酸缓冲液 组份浓度 0.2mol/L (ph4.6) 配制量 2L 配置方法 1. 准确称取乙酸钠 g 2. 加入 23mL 冰乙酸, 溶解 3. 用去离子溶解并定容至 2L 4 保存 5 0.2mol/L 磷酸 - 柠檬酸 组份浓度 0.2mol/L 缓冲液 配制量 各 1L (ph ) 配置方法 1. 母液 A(0.2mol/L 的 Na 2 HPO 4 溶液 ): 称取 Na 2 HPO g, 用去离子定容至 2L 2. 母液 B(0.1mol/L 的柠檬酸溶液 ): 称取柠檬酸 g 用去离子溶解定容至 2L 3. ph 的三种缓冲液如下表配制 : ph 值 A(mL) B(mL) 按上表混匀后,4 保存 6 20 SSC 缓冲液 (ph7.0) 配置方法 1. 准确称取 准确称取 88. 柠檬酸钠 2 3. 溶解于 800mL 去离子中 4. 加入数滴 10mol/L 氢氧化钠溶液调节 ph 值至 加去离子定容至 1L 注意 : 按实验需要可分装后高压灭菌 10 SSC 5 SSC 1 SSC 可由 20 SSC 做相应稀释得到 mol/L - 组份浓度 0.15mol/L 乙二胺四乙酸二钠 缓冲液 配置方法 1. 准确称取 8.77g (ph8.0) 2. 称取乙二胺四乙酸二钠 溶于 800mL 去离子中 4. 用固体的氢氧化钠调 ph 值为 加去离子定容至 1L

8 8 1/15mol/L 的磷酸盐 组份浓度 0.15mol/L 缓冲液 (ph7.6) 配置方法 1. 溶液甲 (1/15mol/L 的 KH 2 PO 4 溶液 ): 称取 KH 2 PO g, 用去离子溶解定容至 1L 2. 溶液乙 (1/15mol/L 的 Na 2 HPO 4 溶液 ): 称取 Na 2 HPO g ( 或磷酸氢二钠 g) 用去离子溶解定容至 1L 3.pH7.6 磷酸盐缓冲液 : 将 1 和 2 按 1.4:8.6 比例混合即可 9 5 Tris-GlycineBuffer 组份浓度 0.125M Tris,1.25M Glycine,0.5%(w/v)SDS (SDS-PAGE 电泳缓冲液 ) 配置方法 1. 称取下列试剂, 置于 1L 烧杯中 Tris 15. Glycine 94g SDS 5.0g 2. 加入约 800mL 的去离子, 搅拌溶解 3. 加去离子将溶液定容至 1L 后, 室温保存 10 5 SDS-PAGE 组份浓度 250mM Tris-HCl(pH6.8) Loading Buffer 10%(W/V) SDS 0.5%(W/V) BPB 50%(V/V) 甘油 5%(W/V) β- 巯基乙醇 配制量 5mL 配置方法 1. 量取下列试剂, 置于 10mL 塑料离心管中 1M Tris-HCl 1.25mL SDS 0. BPB 25mg 甘油 2.5mL 2. 加入去离子溶解后定容至 5mL 3. 小份 (500μl/ 份 ) 分装后, 于室温保存 4. 使用前将 25μl 的 2-ME 加到每小份中 5. 加入 2-ME 的 Loading Buffer 可在室温下保存一个月左右生物化学实验常用柱料数据及性质 1 DEAE 阴离子交换纤维素 (1) 纤维素的处理取纤维素干品用浸泡, 充分溶涨并搅拌均匀, 过夜 次日再搅匀, 静止 30min 留下沉集部分 ( 重复 3 次 ), 用真空泵抽干 然后用适量的 0.5mol/L 的氢氧化钠溶液浸泡 30min, 抽干, 洗至中性 ; 再用适量的 0.5mol/L 的盐酸溶液浸泡 30min, 抽干, 洗至中性 ; 重复用 0.5mol/L 的氢氧化钠溶液浸泡 30min, 抽干, 洗至中性 最后用 0.005mol/L ph6.0 的磷酸缓冲液浸泡待用 (2) 纤维素的重生回收的纤维素先用 0.5mol/L -0.5mol/L 氢氧化钠溶液浸泡, 再按上述 (1) 操作处理, 即可再次投入使用 (3) 纤维素的保存回收后, 用 0.5mol/L 氢氧化钠溶液浸泡 30min 后, 洗至中性, 抽干, 于鼓风干燥箱中 60 烘干后, 保存 2 SephadexG 型葡聚糖凝胶 (1) 凝胶的特性要点 葡聚糖 G 后面的数字代表不同的交联度, 数值越大交联度越小, 吸 量越大 其数值大致为吸量 X 的 10 倍 Sephadex 对 碱和弱酸稳定 ( 在 0.1mol/L 盐酸中可以浸泡 1~2 小时 ) 在中性时可以高压灭菌 不同型号中又有颗粒粗细之分 颗粒粗的分离效果差, 流速快 颗粒越细分离效果越好, 但流速也越慢 交联葡聚糖工作时的 ph 稳定在 2~11 的范 围内 葡聚糖 G 型凝胶分离的分子量分级范围为 700~ SephadexG 型葡聚糖凝胶的数据见下表 * 本表数值取自 Pharmacia Biotech Biodirectory 1996 ** 为 cm 层析柱在 25 用测定之值 D=Darcy s law (2) 凝胶的溶胀 * G 系交联葡聚糖凝胶亲性强, 只能在中溶胀 ( 仅有少量的有机 溶剂也可以使之溶胀 ), 有机溶剂或含有有机溶剂较多的溶液会 改变其孔隙, 使之收缩失去或降低凝胶的分离能力 在中溶胀时 如在室温则需要较长时间, 才能达到充分溶胀的程度, 但可煮沸到 100, 以缩短其溶胀时间 见下表 Sephadex G 型葡聚糖凝胶溶胀所需时间 凝胶型号 所需最小溶胀时间 * G-10~G ~22 ( 室温 ) 100 ( 沸浴 ) Sephadex G G G G G

9 G G G * 溶胀时要将凝胶浸泡在过量的或缓冲液中 在整个溶胀 过程中应避免剧烈地搅拌, 尤其不能使用电磁搅拌, 以免 破坏了它的颗粒结构, 以及产生许多碎末而影响洗脱时的 流速 (3) 凝胶的回收与保存 凝胶的再生最好不要在柱上进行 ( 有些凝胶可以在 位清洗 ), 可将凝胶在 0.5mol/L 及 0.5mol/L 氢氧化 钠的混合溶液中浸泡 ; 一般约需 30 分钟以上 然后用蒸馏 洗至中性, 最后用缓冲液平衡即可恢复使用 经常使用的凝胶, 一般加入一些抗菌剂放在普通 冰箱中, 即可保存较长的时间 如确切在相当长的时间里不准备使 用时, 则以保存干凝胶为好 处理时可先用较浓的浸泡 ( 如 0.5mol/L), 在用 0.5mol/L 的氢氧化钠处理并用洗至中性, 然 后用递增百分比浓度的乙醇分多次作脱处理 一般可从 30% 的 乙醇开始 ; 每次均应让凝胶在乙醇中多浸泡一些时间 在无乙醇 处理后, 最后再用乙醚处理一次以加速乙醇的挥发 处理后的凝胶 宜在 80 以下的温度烘干 在进行凝胶的回收时, 如在每一步操 作时, 均使用布氏漏斗抽滤可大大地加快整个回收过程 注意 a. 凝胶在氢氧化钠溶液中浸泡的时间不要太长 b. 不要图快过早地使用百分浓度太大地乙醇, 以免凝胶颗粒收缩 太快, 破坏了它地结构, 因而影响了它地分离能力 c. 在乙醚未充分挥发完以前, 切不可将含有多量乙醚地凝胶放入 烘箱, 以免发生危险 d. 溶胀了地凝胶不可放入低温冰箱中冻结, 以免其球形结构被破 坏 微生物学实验常用培养基的配制 1 牛肉膏培养基( 培养细菌用 ) 牛肉膏 3g 琼脂 15~ ph 7.0~ 灭菌 20min 2 高氏(Gause)1 号培养基 ( 培养放线菌用 ) 可溶性淀粉 硝酸钾 0. 磷酸氢二钾 0. 硫酸镁 0. 硫酸亚铁 0.0 琼脂 ph 7.2~7.4 配制时, 先用少量冷将淀粉调成糊状, 倒入煮沸的中, 在 火上加热, 边搅拌边加入其他成分, 溶化后, 补足分至 121 灭菌 20min 3 查氏(Czapek) 培养基 ( 培养霉菌用 ) 硝酸钠 磷酸氢二钾 氯化钾 0. 硫酸镁 0. 硫酸亚铁 0.0 蔗糖 30g 琼脂 15~ ph 自然 121 灭菌 20min 4 马丁氏 (Martin) 琼脂培养基 ( 分离真菌用 ) 葡萄糖 磷酸二氢钾 七合硫酸镁 0. 1/3000 孟加拉红 (rose 100mL bengal, 玫瑰红溶液 ) 琼脂 15 ph 自然 800mL 112 灭菌 30min 临用前加入 0.03% 链霉素稀释液 100mL, 使每毫升培养基中含 链霉素 30μg 5 马铃薯培养基( 简称 PDA)( 培养真菌用 ) 马铃薯 200g 蔗糖 ( 或葡萄糖 ) 琼脂 15 ph 自然 培养基的配制 : 马铃薯去皮, 切成块煮沸 30min, 然后用纱布 过滤, 再加糖及琼脂, 熔化后补足至 121 灭菌 30min 6 麦芽汁琼脂培养基培养基的配制 : (1) 取大麦或小麦若干, 用洗净, 浸 6 12 小时, 至 15 阴暗处发芽, 上面盖纱布一块, 每日早 中 晚淋一次, 麦根伸 长至麦粒的两倍时, 即停止发芽, 摊开晒干或烘干, 贮存备用 (2) 将干麦芽磨碎, 一份麦芽加四份, 在 65 浴中糖化 3 4 小时, 糖化程度可用碘滴定之 加约 20mL, 调匀至生泡沫时为 止, 然后倒在糖化液中搅拌煮沸后再过滤 (3) 将糖化液用 4 6 层纱布过滤, 滤液如混浊不清, 可用鸡蛋 白澄清, 方法是将一个鸡蛋白加约 20mL, 调匀至生泡沫时为止, 然后倒在糖化液中搅拌煮沸后再过滤 (4) 将滤液稀释到 5 6 波美度,pH 约 6.4, 加入 2% 琼脂即成 121 灭菌 30min 7 无氮培养基 ( 自生固氮菌 钾细菌 ) 甘露醇 ( 或葡萄糖 ) 磷酸二氢钾 0.

10 七合硫酸镁 二合硫酸钙 0. 碳酸钙 ph 灭菌 30min 8 半固体肉膏培养基肉膏液体培养基 100mL 琼脂 g ph 灭菌 20min 9 合成培养基偏磷酸铵 氯化钾 0. 七合硫酸镁 0. 豆芽汁 10mL 琼脂 ph 7.0 加 12 ml0.04% 的溴钾酚紫 (ph , 颜色由黄变紫, 作指示剂 ) 121 灭菌 20min 10 豆芽汁蔗糖( 或葡萄糖 ) 培养基黄豆芽 100g 蔗糖 ( 或葡萄糖 ) 50g ph 自然培养基的配制 : 称新鲜豆芽 100g, 放入烧杯中, 加入, 煮沸约 30min, 用纱布过滤 用补足原量, 再加入蔗糖 ( 或葡萄糖 )50g, 煮沸熔化 121 灭菌 20min 11 油脂培养基 牛肉膏 香油或花生油 1.6% 中性红溶液 1mL 琼脂 15 ph 灭菌 20min 注 :(1) 不能使用变质油 (2) 油和琼脂及先加热 (3) 调好 ph 值后, 再加入中性红 (4) 分装时, 需不断搅拌, 使油均匀分布于培养基中 12 淀粉培养基 牛肉膏 可溶性淀粉 琼脂 灭菌 20min 13 明胶培养基 牛肉膏液 100mL 明胶 12 18g ph 7.6 在浴锅中将上述成分溶化, 不断搅拌 溶化后调 ph 灭菌 30min 14 培养基 ph 灭菌 20min 15 糖发酵培养基 培养基 1.6% 溴钾酚紫乙醇溶液 1 2mL ph 7.6 另配制 20% 糖溶液 ( 葡萄糖 乳糖 蔗糖等 ) 各 10mL 培养基的配制 : (1) 将上述含指示剂的培养基(pH7.6) 分装于试管 中, 在每管内放一倒置的小玻璃管 (Durham tube), 使之充满培 养液 (2) 将已分装好的和 20% 的各种糖溶液分别灭菌, 121 灭菌 20min; 糖溶液 112 灭菌 30min (3) 灭菌后, 每管以无菌操作分别加入 20% 无菌糖溶液 0.5 ml ( 按每 10mL 培养基中加入 20% 的糖液 0.5mL, 则成 1% 的浓度 ) 配制用的试管必须洗干净, 避免结果混乱 16 葡萄糖培养基 葡糖糖 磷酸氢二钾 将上述各成分溶于 中, 调 ph , 过滤 分装 试管, 每管 10mL,112 灭菌 30min 17 麦氏(Meclary) 琼脂 ( 酵母菌 ) 葡萄糖 氯化钾 1.8g 酵母浸膏 2. 醋酸钠 8. 琼脂 灭菌 20min 18 柠檬酸盐培养基 磷酸二氢铵 磷酸氢二钾 硫酸镁 0. 柠檬酸钠

11 琼脂 15 1% 溴麝香草酚蓝乙醇液 10 ml 培养基的配制 : 将上述各成分加热溶解后, 调 ph6.8, 然后加入指示剂, 摇匀, 用脱脂棉过滤 制成后为黄绿色, 分装试管,121 灭菌 20min 后制成斜面, 注意配制时控制好 ph, 不要过碱, 以黄绿色为准 19 醋酸铅培养基 ph7.4 的牛肉膏琼脂 100 ml 硫代硫酸钠 % 醋酸铅溶液 1 ml 培养基的配制 : 将牛肉膏琼脂 100 ml 加热溶解, 待冷却至 60 时加入硫代硫酸钠 0.2, 调至 ph7.2, 分装于三角瓶中, 115 灭菌 15min 取出后待冷却至 55 60, 加入 10% 醋酸铅溶液 ( 无菌的 )1mL, 混匀后倒入灭菌试管或平板中 20 血琼脂培养基 ph7.6 的牛肉膏琼脂 100 ml 脱纤维羊血 ( 或兔血 ) 10 ml 培养基的配制 : 将牛肉膏琼脂加热熔化, 待冷却至 50 时, 加入无菌脱纤维羊血 ( 或兔血 ) 摇匀后倒平板或制成斜面 37 过夜检查无菌生长即可使用 21 玉米粉蔗糖培养基玉米粉 60g 磷酸二氢钾 3g 维生素 B 1 100mg 蔗糖 七合硫酸镁 灭菌 30min, 维生素 B1 单独灭菌 15min 后另加 22 酵母膏麦芽汁琼脂 麦芽粉 3g 酵母浸膏 灭菌 30min 24 棉籽壳培养基培养基的配制 : 棉籽壳 50%, 石灰粉 1%, 过磷酸钙 1%, 65% 70%, 按比例称好料, 充分搅拌均匀后装瓶, 较薄地平摊盘上 25 复红亚硫酸钠培养基( 远藤氏培养基 ) 乳糖 磷酸氢二钾 3. 琼脂 20 30g 5% 碱性复红乙醇溶液 20 ml 培养基的配制 : 先将琼脂加入 900 ml 中, 加热溶解, 再加入磷酸氢二钾及, 使溶解, 补足至, 调 ph 至 加入乳糖, 混匀溶解后,115 灭菌 20min 称取亚硫酸钠置一无菌空试管中, 加入无菌少许使溶解, 再在浴中煮沸 10min 后 立刻滴加于 20 ml 5% 碱性复红乙醇溶液中, 直至深红色褪成淡粉红色为止 将此亚硫酸钠与碱性复红的混合液全部 加至上述已灭菌的并仍保持熔化状态的培养基中, 充分混匀, 倒平 板, 放冰箱中备用, 贮存时间不宜超过 2 周 26 伊红美蓝培养基(EMB 培养基 ) 培养基 100 ml 20% 乳糖溶液 2 ml 2% 伊红溶液 2 ml 0.5% 美蓝溶液 1 ml 培养基的配制 : 将已灭菌的培养基 (ph7.6) 加热熔化, 冷却至 60 左右时, 再把已灭菌的乳糖溶液, 伊红溶液及美蓝 溶液按上述量以无菌操作加入 摇匀后, 立即倒平板 乳糖在高 温灭菌易被破坏必须严格控制灭菌温度,115 灭菌 20min 27 乳糖培养液( 的细菌学检查 用 ) 牛肉膏 3g 乳糖 1.6% 溴甲酚紫乙醇溶液 1 ml 培养基的配制 : 将 牛肉膏 乳糖及加热溶解于 中, 调 ph 至 加入 1.6% 溴甲酚紫乙醇溶 液 1 ml, 充分混匀, 分装于有小倒管的试管中 115 灭菌 20min 28 石蕊牛奶培养基 牛奶粉 100g 石蕊 0.07 ph 灭菌 15min 29 LB(Luria-Bertani) 培养基 酵母膏 ph 灭菌 20min 30 基本培养基 磷酸氢二钾 10. 磷酸二氢钾 4.5 硫酸铵 二合柠檬酸钠 灭菌 20min 需要时灭菌后加入 : 糖 (20%) 10 ml 维生素 B1( 硫胺素 )(1%) 0.5 ml 七合硫酸镁 (20%) 1 ml 链霉素 (50mg/ ml)4 ml, 终浓度 200μg/ ml 氨基酸 (10mg/ ml)4 ml, 终浓度 40μg/ ml ph 自然 ( 7.0) 31 庖肉培养基

12 培养基的配制 : (1) 取已去肌膜 脂肪之牛肉 500g, 切成小方块, 置 中, 以弱火煮 1 小时, 用纱布过滤, 挤干肉汁, 将肉汁保留备用 将肉渣用绞肉机绞碎, 或用刀切成细粒 (2) 将保留的肉汁加, 使总体积为 2000 ml, 加入, 葡萄糖,, 及绞碎的肉渣, 置烧瓶摇匀, 加热使溶化 (3) 取上层溶液测量 ph, 并调整其达到 8.0, 在烧瓶壁上用记号笔标示瓶内液体高度,121 灭菌 15min 后补足蒸发的分, 重新调整 ph 值 8.0, 再煮沸 10 20min, 补足量后调整 ph7.4 (4) 将烧瓶内容物摇匀, 将溶液和肉渣分装于试管中, 肉渣约占培养基的 1/4 左右 经 121 灭菌 15min 后备用, 如当日不用, 应以无菌操作加入已灭菌的石蜡凡士林, 以隔绝氧气 32 乳糖牛肉膏培养基乳糖 牛肉膏 酵母膏 葡萄糖 琼脂粉 1 ph 马铃薯牛乳培养基培养基的配制 :200g 马铃薯 ( 去皮 ) 煮出汁, 脱脂鲜乳 100mL, 酵母膏, 琼脂粉 1, 加 ph7.0 制平板培养基时, 牛乳与其他成分分开灭菌, 倒平板前再混合 34 尿素琼脂培养基尿素 琼脂 1 磷酸二氢钾 酚红 0.01 ph 6.8±0.2 培养基的配制 : 在或去离子 100mL 中, 加入上述所有成分 ( 除琼脂外 ) 混合均匀 过滤灭菌 将琼脂加入 900mL 或去离子中, 加热煮沸腾 在 15 磅 121 灭菌 15min 冷却至 50, 加入灭菌好的基本培养基, 混匀后, 分装于灭菌的试管中, 放在倾斜位置上使其凝固 微生物学实验常用试剂的配制 1 3% 酸性乙醇溶液浓盐酸 3mL 95% 乙醇 97mL 2 中性红指示剂中性红 0.04g 95% 乙醇 28mL 72mL 中性 ph6.8~8 颜色由红变黄, 常用浓度为 0.04% 3 淀粉解试验用碘液( 卢戈氏碘液 ) 碘片 碘化钾 300mL 先将碘化钾溶解在少量中, 再将碘片溶解在碘化钾溶液中, 待碘全溶后, 加足分即可 4 溴甲酚紫指示剂 溴甲酚紫 0.04g 0.01mol/LNaOH 7.4g 92.6mL 溴甲酚紫 ph5.2~5.6, 颜色由黄变紫, 常用浓度为 0.04% 5 溴麝香草酚蓝指示剂溴麝香草酚蓝 0.04g 0.01mol/LNaOH 6.4mL 93.6mL 溴麝香草酚蓝 ph6.0~7.6, 颜色由黄变蓝, 常用浓度为 0.04% 6 甲基红试剂 甲基红 (Methyl red) 0.04g 95% 乙醇 60mL 40mL 先将甲基红溶于 95% 乙醇中, 然后加入即可 7 V. P. Y 试剂 (1).5%α- 萘酚无乙醇溶液 α- 萘酚 无乙醇 100mL (2).40%KOH 溶液 KOH 40g 用定容至 100mL 即可 8 吲哚试剂 对二甲基氨基苯甲醛 95% 乙醇 190mL 浓盐酸 40mL 玻璃仪器的洗涤及各种洗涤液的配制实验中所使用的玻璃器皿清洁与否直接影响实验结果 由于器 皿的不清洁或被污染, 往往造成较大的实验误差, 甚至会出现相反的实验结果 因此, 玻璃器皿的洗涤清洁工作是非常重要的 玻璃器皿在使用前必须洗刷干净 将锥形瓶 试管 培养皿 量筒等浸入含有洗涤剂的中, 用毛刷刷洗, 然后用自来及蒸溜冲洗 移液管先用含有洗涤剂的浸泡, 再用自来不及冲洗 洗刷干净的玻璃器皿置于烘箱中烘干备用 1. 初用玻璃器皿的清洗新购买的玻璃器皿表面常附着有游离的碱性物质, 先用肥皂 ( 或去污粉 ) 洗刷, 再用自来洗净, 然后浸泡在 1%~2% 盐酸溶液中过夜 ( 不少于 4h), 再用自来冲洗, 最后用冲洗 2~3 次, 在 100~130 烘箱内烘干备用 2. 使用过的玻璃器皿的清洗 (1) 一般玻璃器皿如试管 烧杯 锥形瓶等 ( 包括量筒 ) 先用自来洗刷至无污物, 再选用大小合适的毛刷蘸取去污粉 ( 掺入肥皂粉 ) 刷洗或浸入肥皂内 将器皿内外, 特别是内壁, 细心刷洗, 用自来冲洗干净后再用洗 2~3 次, 热的肥皂去污能力更强, 可

13 有效地洗去器皿上的油污 洗衣粉与去污粉较难冲洗干净而常在器壁上附有一层微小粒子, 故要用多次甚至 10 次以上充分冲洗, 或可用稀盐酸摇洗一次, 再用冲洗 烘干或倒置在清洁处备用 凡洗净的玻璃器皿, 不应在器壁上带有珠, 否则表示尚未洗干净, 应再按上述方法重新洗涤 若发现内壁有难以去掉的污迹, 应分别使用下述的各种洗涤剂予以清除, 再重新冲洗 用过的载玻片与盖玻片如滴有香柏油, 要先用皱纹纸擦去或浸在二甲苯内摇晃几次, 使油垢溶解 再在肥皂中煮 5~10min, 用软布或脱脂棉擦拭, 立即用自来冲洗, 然后在稀洗涤液中浸泡 0.5~2h, 自来冲去洗涤液, 最后用换洗数次, 待干后, 浸于 95% 乙醇中保存备用. 使用时在火焰上烧去乙醇 用此法洗涤和保存的载玻片和盖玻片清洁透亮, 没有珠 检查过活菌的载玻片或盖玻片应先在 2% 新洁尔灭溶液中浸泡 24h, 然后上述方法洗涤方法洗涤与保存 玻璃器皿经洗涤后, 若内壁的均匀分布成一薄层, 表示油垢完全洗净, 若挂有珠, 则还需要用洗涤液浸泡数小时, 然后用自来充分冲洗, 最后用洗 2~3 次后备用 (2) 量器如吸量管 滴定管 量瓶等 使用后应立即浸泡于凉中, 勿使物质干涸 工作完毕后用流冲洗, 以除去附着的试剂 蛋白质等物质, 晾干后浸泡在铬酸洗液中 4~6h( 或过夜 ), 再用自来充分冲洗, 最后用冲洗 2~4 次, 风干备用 (3) 其他具有传染性样品的容器 ( 如分子克隆 病毒玷污过的容器 ) 常规先进行高压灭菌或其他形势的消毒, 再进行清洗 盛过各种毒品 ( 特别是剧毒药品和放射性核素物质的容器 ) 必须经过专门处理, 确知没有残余毒物存在时方可进行清洗 否则使用一次性容器 装有固体培养基的器皿应先将其刮去, 然后洗涤 带菌的器皿在洗涤前先浸在 2% 煤酸皂溶液 ( 来苏 ) 或 0.25% 新洁尔灭消毒液内 24h 或煮沸 0.5h, 再用上述方法洗涤 3. 洗涤液的种类和配制方法 (1) 铬酸洗液 ( 重铬酸钾一硫酸洗液, 简称洗液或清洁液 ) 广泛用于玻璃器皿的洗涤, 常用的配制方法有 4 种 1 取 100mL 工业浓硫酸置于烧杯内, 小心加热, 然后慢慢地加入重铬酸钾粉末, 边加边搅拌, 待全部溶解后冷却, 贮于带玻璃塞的细口瓶内 2 称取 重铬酸钾粉末置于 250mL 烧杯中, 加 5mL, 尽量使其溶解 慢慢加入 100mL 浓硫酸, 边加边搅拌, 冷却后贮存备用 3 称取 80g 重铬酸钾, 溶于 自来中, 慢慢加入工业浓硫酸, 边加边搅拌 4 称取 200g 重铬酸钾, 溶于 500mL 自来中, 慢慢加入工业浓硫酸 500mL, 边加边搅拌 (2) 浓盐酸 ( 工业用 ) 可洗去垢或某些无机盐沉淀 (3)5% 草酸溶液可洗去高锰酸钾的痕迹 (4)5%~10% 磷酸三钠 (Na 3 PO 4 12H 2 O) 溶液可洗涤油污物 (5)30% 硝酸溶液 洗涤 CO 2 测定仪器及微量滴管 (6)5%~10% 乙二铵四乙酸二钠 (EDTA) 溶液加热煮沸可洗去玻璃器皿内壁的白色沉淀物 (7) 尿素洗涤液为蛋白质的良好溶剂, 适用于洗涤盛蛋白质制剂及血样的容器 (8) 酒精与浓硝酸混合液最适合于洗净滴定管, 在滴定管中加入 3mL 酒精, 然后沿管壁慢慢加入 4mL 浓硝酸 ( 相对密度 1.4), 盖住滴定管管口 利用所产生的氧化氮洗净滴定管 (9) 有机溶液如丙酮 乙醇 乙醚等可用于洗脱油脂 脂溶性染料等污痕 二甲苯可洗去油漆污垢 (10) 氢氧化钾 - 乙醇溶液和含有高锰酸钾的氢氧化钠溶液它是两种强碱性的洗涤液, 对玻璃器皿的侵蚀性很强, 清除容器内壁污垢, 洗涤时间不宜过长 使用时应小心谨慎 上述洗涤液可多次使用, 但使用前必须将待洗涤的玻璃器皿先用冲洗多次, 除去肥皂液 去污粉或各种废液 若仪器上有凡士林或羊毛脂时, 应先用软纸擦去, 然后再用乙醇或乙醚擦净 否则会使洗涤液迅速失效 例如肥皂 有机溶剂 ( 乙醇 甲醛等 ) 及少量油污物均会使重铬酸钾 - 硫酸液变绿, 降低洗涤能力 4. 细胞培养级玻璃器皿的洗涤处理 (1) 按上述方法对玻璃器皿进行初洗, 晾干 (2) 将玻璃器皿浸泡入洗液中,24~48h 注意玻璃器皿内应全部充满洗液, 操作时小心勿将洗液不溅到衣服及身体各部 (3) 取出, 沥去多余的洗液 (4) 自来充分冲洗 (5) 排列 6 桶, 前 3 桶为去离子, 后 3 桶为去离子双蒸 (6) 将玻璃器皿依次过 6 桶, 玻璃器皿在每桶中过 6~8 次 (7) 倒置,60 烘干 (8) 用硫酸纸包扎,160 干烤 3h