五种染色方法对小鼠圆形精子染 色效果的比较 作者 : 刘建伟, 孟小倩, 陈玉洁, 潘杰, 艾洪滨, 刘树真 ( 山东师范大学生命科学学院, 山东省动物抗性生物学重点实验室, 济南 ) 摘要 : 比较五种染色方法对小鼠圆形精子 (round spermatid,ros) 染色的效果, 寻

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1 内容摘要 五种染色方法对小鼠圆形精子染色效果的比较 沟稃草属叶表皮微形态的研究

2 五种染色方法对小鼠圆形精子染 色效果的比较 作者 : 刘建伟, 孟小倩, 陈玉洁, 潘杰, 艾洪滨, 刘树真 ( 山东师范大学生命科学学院, 山东省动物抗性生物学重点实验室, 济南 ) 摘要 : 比较五种染色方法对小鼠圆形精子 (round spermatid,ros) 染色的效果, 寻找一种鉴定圆形精子简单 有效的染色方法 以性成熟的昆明白鼠为实验材料, 制备睾丸细胞悬液, 分别用瑞氏 瑞氏 - 姬姆萨 姬姆萨 改良品红 苏木精五种方法对小鼠生精细胞进行染色, 比较不同染色方法下圆形精子的形态 相比于其它四种染色方法, 瑞氏 - 姬姆萨染色后能清晰地观察到圆形精子细胞膜和核膜的边缘, 核质分明, 与其它时期生精细胞区别明显 瑞 - 姬染色法是一种简单 有效的鉴定圆形精子形态的染色方法 关键词 : 小鼠 ; 圆形精子 ; 鉴定 ; 染色方法中图分类号 :R318 文献标识码 :A 文章编号 : (2010) 引言 哺乳动物的精子发生是一个非常复杂的过程, 大体上可分为三个阶段 :(1) 精原细胞的有丝分裂期, 包括精原干细胞的 精子为第二次减数分裂完成后的产物, 其细胞核中具有与成熟精子完全相同的单倍染色体组, 能够与卵子中的单倍染色体组配对 在男性不育症中, 约有 10% 的患者为无精子症, 许多无精子症患者在精液 附睾和睾丸中都没有精子, 还有一些不育男性即便是在睾丸中存在精子, 也常常是死精子或者严重畸形的精子 对于此类患者可用圆形精子代替成熟精子做胞质内显微注射以使患者得到自己的后代 1993 年, Ogura 分别将仓鼠和小鼠的圆形精子注入卵周隙, 然后加一直流脉冲, 使圆形精子融入卵母细胞, 分别获得 20%-40% 和 30% 的融合率, 并首次证实圆形精子具有与精子同样的发育潜能 1995 年, 人圆形精子注射 (round spermatidinjection, ROSI) 和长形精子细胞注 (elongated spermatid injection, ELSI) 相继获得成功, 用人的 ROS 注射诞生正常后代, 给男性不育的治疗带来了无限的生机 因此, 人睾丸或精液中 ROS 的分离和鉴定越来越受到人们重视 但是, ROS 的受精率和妊娠率却令人失望, 除了 ROS 核蛋白不完全成熟及卵子激活因素外, 如何正确选择 ROS 成为限制这项技术成功的主要难题 比如, 圆形精子与精原细胞 单核细胞等其它的圆形细胞区分就比较困难 为此, 本实验以小鼠为模型, 比较了五种染色方法对小鼠圆形精子的染色效果, 希望得到一种简单 有效的鉴定圆形精子形态的染色方法 增殖 更新和精原细胞的分化 ;(2) 精母细胞的减数分裂期经过两次减数分裂后初级精母细胞分化为单倍体的圆形精子 ; (3) 精子形成期, 圆形精子经过一系列形态变化形成精子 圆形

3 2 材料与方法 2.3 小鼠生精细胞固定取 1~ 2 ml 细胞悬液, 加入 Carnoy 固定液 2~ 2.1 实验动物 主要试剂和器材 性成熟的昆明白雄性小鼠,8 ~ 10 周, 体重 35 5ml, 静置固定 20 min, 期间不能剧烈吹打细 胞 ~45 g, 由山东大学实验动物中心提供 ; 胰蛋白酶 (Gibco 分装 ); 马血清 ( 宝生物 ); 磷酸盐缓冲液 (PBS) Carnoy 固定液 瑞氏染液 姬姆萨染液 改良品红染液 苏木精染液均按标准方法配制, 瑞氏 - 姬姆萨染液为使用前按瑞氏染液 : 姬姆萨染液 =9:1 将两者混匀 ; 电子天平 ( 北京赛多利斯仪器公司 ); 低速离心机 (TDZ4- WS); 解剖镜 ; 生物显微镜 (BA210); 摄像用生物显微镜 (Olympus corporation) 睾丸的采集 取成年雄性小鼠, 35 ~ 45 g, 颈椎脱臼法处死, 取出双侧睾丸, 置于预冷的磷酸盐缓冲液 (PBS) 中 在解剖镜下剥离结缔组织 外层包膜及毛细血管后称重 加少量 PBS, 理出曲细精管, 经二层细尼龙网 (100 目 ) 过滤, 收集尼龙网上的曲细精管 2.4 小鼠生精细胞染色 瑞氏染色取 1 滴未固定的小鼠睾丸细胞悬液滴于载玻片上, 自然干燥 加 3 ~ 4 滴瑞氏染液, 覆盖样品, 染色 1~ 3 min, 滴加等量的 PBS 并混匀, 染色 5 min 染色完毕后使用自来水冲洗载玻片至其为无色, 自然干燥, 镜检, 拍摄照片 瑞 - 姬染液染色取 1 滴未固定的小鼠睾丸细胞悬液, 用瑞 - 姬染液染色, 方法同瑞氏染色, 染色时间为 10 min 姬姆萨染色取 1 滴固定后的小鼠睾丸细胞悬液滴于载玻片上, 自然干燥, 滴加 3 ~ 4 滴姬姆萨染液, 染色 5 min 染色完毕后使用自来水冲洗载玻片至其为无色, 自然干燥, 镜检, 拍摄照片 改良品红染色方法同姬姆萨染色, 染色时间为 15~ 20 min 苏木精染色方法同姬姆萨染色, 染色时间为 5 min 3 结果 睾丸悬液的制备 参考吴鑑等的方法, 作适当改进 :(1) 先加入少量预冷的 PBS, 用剪刀将曲细精管剪碎, 成浆糊状 ( 镜检时可以看到少量的细胞游离出来 ), 再按照 1 g 组织 20 ml PBS 的比例, 补加剩余的 PBS (2) 加入胰蛋白酶, 使终浓度为 0.4%,37 水浴保温 20 min, 不时用吸管吹打细胞, 使之易于分散 (3) 镜检见细胞已分散时, 加马血清至终浓度为 8%, 冰箱内冷却 10 min (4) 用二层细尼龙网 (100 目 ) 过滤除去小块状物 (5)1 000 rpm, 离心 10min, 收集细胞沉淀 (6) 用 PBS 洗两次 ( 每次 1000rpm, 离心 10 min), 最后按照每克组织 20 ml PBS 的比例加入 PBS, 得到分散的细胞悬液 显微镜下观察到染色后各种细胞的形态结构有区别 : 精原细胞呈椭圆形或是圆形, 直径 12 μm, 细胞核圆形, 染色质着色较深, 有 1 至 2 个核仁, 细胞体积较圆形精子大 初级精母细胞其体积可达精原细胞体积的二倍, 细胞器完备 次级精母细胞由于存在时间较短, 在视野中细胞数量很少 圆形精子直径 8 ~ 10 μm, 其细胞核圆形, 较小 浓缩 3.1 瑞氏染色法 生精细胞的细胞核与细胞质着色相同, 二者没有区分度 生精细胞的形态基本完整, 细胞膜边缘光滑, 细胞染色不均匀, 一部分细胞着色深, 一部分细胞着色浅, 可以观察细胞大小, 但仅依据细胞大小无

4 法判定一个生精细胞为圆形精子, 见图 1A 3.2 瑞 - 姬染色法 染色后背景清晰, 不同发育阶段的生精细胞均被染色, 染色均匀 细胞膜 细胞核膜边缘完整, 胞核着深紫红色, 胞质呈浅紫红色, 核质分明 个别细胞可以观察染色体核型 镜检观察, 圆形精子的特征 : 体积较小, 直径约为 10 μm, 具有单一的细胞核, 核多位于细胞中央, 轮廓清晰, 细胞核着色深而呈深紫红色 ; 精原细胞体积略大于圆形精子, 有 2 个核仁 ; 初级精母细胞体积较大, 约为精原细胞的两倍, 细胞器完备, 未观察到明显的细胞核, 见图 1B 3.3 姬姆萨染色法 染色后背景比较清晰, 不同发育阶段的生精细胞均被染色, 染色不均匀, 部分细胞染色较浅, 细胞膜边缘模糊, 核膜完整, 整体着色清晰, 细胞核着蓝紫色, 细胞质着淡蓝色 镜检观察, 圆形精子的特征 : 体积较小, 直径约为 10 μm, 具有单一的核, 细胞核多位于细胞中央, 细胞核着色深而呈蓝紫色 ; 精原细胞体积较圆形精子大, 细胞质着色深, 见图 1C 3.4 改良品红染色法 染色后背景比较清晰, 绝大多数细胞形状发生改变, 细胞膜边缘不光滑, 细胞核着蓝紫色, 细胞质呈淡紫红色, 细胞整体染色不清晰 镜检观察, 圆形精子的特征 : 直径约为 10 μm, 具有单一的核, 细胞核多位于细胞中央, 细胞核着色深而呈蓝紫色 ; 初级精母细胞体积较大, 胞质染色不清晰 ; 见图 1D 3.5 苏木精染色法 染色后背景比较清晰, 不同发育阶段生精细胞被染色且形态完整, 细胞膜边缘光滑, 核膜边缘模糊 细胞核着色深, 呈蓝紫色, 细胞质着色浅, 呈淡蓝色, 核质染色后对比明显 由于细胞着色很浅, 不易观察细胞形态 镜检观察, 圆形精子的特征 : 体积较小, 直径约为 10 μm, 具有单一的核, 细胞核多位于细胞中央, 细胞核着色深而呈蓝紫色 ; 精原细胞体积较圆形精子大, 但是两者区分不明显 ; 初级精母细胞体积约为精原细胞的两倍, 图 1 五种染色方法的显微照片 (400 ) A. 瑞氏染色 ;B. 瑞氏 - 吉姆萨染色 ;C. 吉姆萨染色 ;D. 改良品红染色 ;E. 苏木精染色 ( 黑色箭头所示为圆形精子 ; 黑色加粗箭头所示为精原细胞 ; 点状箭头所示为初级精母细胞 ) Fig 1 Photomicrographs of five staining methods(400 ) A.Wright' s staining;b.wright -Giemsa staining;c.g iemsa staining ;D.Magenta staining ;E.Hematoxylin staining (Dark arrow indi cates roundspermdtid ;Bold dark arrow indicates spermatogonium ;Dotted arrow indi catesprimary spermatocyte.)

5 4 讨论 目前男性不育现状令人堪忧, 不少研究致力于如何解决男性不育的难题 ROSI 和 ELSI 的成功, 使人们看到了治疗男性不育的希望 但是, 如何在倒置显微镜下从睾丸活检标本中寻找和鉴定存活的圆形精子比较困难, 这成为限制该项技术成功的主要难题 而且目前的相关文献大部分报道的是成熟精子的染色鉴定方法, 对于圆形精子的鉴定鲜有报道 本实验比较了五种染色方法对小鼠 ROS 形态的染色效果, 找到了一种简单 有效的 ROS 形态染色方法, 明确了染色后 ROS 的形态, 为小鼠圆形精子的形态学鉴定提供了可靠的依据, 对 ROS 的活检也具有一定的参考价值 在制备睾丸悬液的过程中, 参考相关文献, 我们做了如下改进, 取得了较好的效果 (1) 在使用胰蛋白酶进行消化之前, 将曲细精管剪碎, 呈浆糊状, 再进行酶的消化, 可以缩短消化时间 加入胰蛋白酶 20 min 后, 取悬液镜检, 可以观察到细胞分散状态良好, 相比于之前的消化方法 ( 胰蛋白酶消化 40 min), 节省了 20 min 胰蛋白酶作用时间的缩短, 减少了酶对细胞膜的损伤 (2) 为了防止破碎细胞游离的 DNA 造成的细胞聚集, 在黄均蓉和吴鑑的方法中分别使用了 DNase Ⅱ 和 DNase Ⅰ, 在本实验中缩短了胰蛋白酶的作用时间, 镜检时破碎的细胞很少, 因此不需要加入 DNase, 节约了时间和成本 (3) 之前的文献中, 未出现详细的对生精细胞固定方法的介绍, 我们发现在加入固定液后, 不能立即进行吹打混匀, 否则生精细胞的破碎很严重 生精细胞的形态学评估主要通过染色法完成 生精细胞的染色原理是碱性染料与酸性细胞核发生中和反应使细胞核着色, 酸性染料则将细胞质中碱性蛋白质染色, 染色主要是化学作用, 是正负离子彼此结合的反应 由此通过生精细胞各组分异嗜性不同而导致染色效果不同来分析细胞形态 由于五种染液均含有碱性成分, 都可以使细胞核着色, 不同染液中的酸性成分则可使细胞质着色 五种染色方法中, 瑞 - 姬染色法染色效果最佳, 染色后圆形精子整体形态完整, 细胞质膜 核膜边缘清晰光滑, 细胞核着蓝紫色, 细胞质着淡蓝色, 核质区分度较好, 因此瑞 - 姬染色法是一种简单 有效的鉴定圆形精子形态的染色方法 致谢 本次试验得到了山东师范大学付荣恕老师 张凡老师 李六文老师 黄艳红博士以及李国荣老师 何成强老师的帮助和指导 另外, 刘愿 代元元 蒋利刚和庞丽同学对于本次实验的顺利完成也提供了很多的帮助, 在此特表示感谢

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