大鼠睾丸支持细胞雄激素结合蛋白mRNA在生精周期中的表达

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鬼毛
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1 大鼠睾丸支持细胞雄激素结合蛋白 mrna 在生精周期中的表达摘要目的研究大鼠睾丸支持细胞 (sertoli cell,sc) 雄激素结合蛋白 (ABP)mRNA 水平与曲细精管上皮周期的相关关系方法以地高辛标记的大鼠 ABP cdna 探针在 SD 大鼠睾丸冰冻切片上进行原位杂交, 应用激光密度扫描系统对阳性信号进行定量结果 ABP mrna 在 Ⅰ-Ⅵ 期维持低水平 ;Ⅶ-Ⅷ 期迅速升高, 达到高峰 ;Ⅸ-Ⅺ 期骤然下降, 但仍高于 Ⅰ-Ⅵ 期水平,Ⅹ Ⅱ-Ⅹ Ⅳ 期又略有回升 ; 随后迅速下降至 Ⅰ-Ⅵ 期水平结论 SC 内 ABP mrna 水平具有明显的生精周期依赖性变化关键词 : 支持细胞雄激素结合蛋白睾丸精子发生是一个极其复杂的过程, 在这一过程中, 曲细精管上皮在形态及生化方面均要经历周期性的变化 [ 1 ] 作为曲细精管上皮中的一种体细胞, 支持细胞在生精过程中发挥着重要作用支持细胞最重要的功能之一是分泌多种蛋白质, 近 20 多年的研究表明, 支持细胞分泌的蛋白已达数十种之多, 其中雄激素结合蛋白 (androgen binding protein,abp) 是最早被分离鉴定的一种蛋白, 能特异性地结合雄激素, 调节血液生殖管道内雄激素浓度目前它已被广泛用作研究睾丸, 包括支持细胞 (sertoli cell,sc) 生理病理及激素调控的一个指标 [ 2 ], 但其生物学功能尚不完全清楚为探讨 ABP 在精子发生过程中的作用, 本实验应用原位杂交方法对大鼠生精过程中睾丸支持细胞的 ABP mrna 水平进行动态观察材料和方法材料动物 : 健康雄性 SD 大鼠 4 只, 体重 400 g 左右, 由药检所实验动物中心提供探针 : 大鼠 ABP cdna, 探针长度为 1.4 kb, 内有一 EcoRⅠ 的酶切位点, 载体为 psp65 质粒 DNA 由 North Carolina 大学 David Joseph 教授提供试剂盒 : 地高辛 DNA 标记和检测试剂盒 (DIG DNA Labeling and Detection kit) 为 Boehringer Mannheim 公司产品 cdna 片段的制备参照文献 [3,4] 的方法, 将含 ABP cdna 的重组质粒用氯化钙法转化大肠杆菌 DH5α 菌株, 筛选转化成功者小量制备质粒, 用 EcoR Ⅰ 酶切鉴定大量扩增含正确 cdna 质粒的细菌克隆, 碱裂解法提取质粒, 用 PEG 法 (PEG 8000) 纯化, 限制性内切酶消化, 低熔点琼脂糖凝胶电泳法回收 cdna 片段, 测定 OD 260 和 OD 280 值, 计算 DNA 浓度, 其余置 -20 保存备用用地高辛 DNA 标记和检测试剂盒标记和检测 cdna 探针探针浓度约 30 ng/μl 组织冰冻切片的制备大鼠断头处死后迅速取出睾丸, 经液氮速冻后, 于 -20 恒冷箱切片机中切片, 片厚 8~10 μm, 用新鲜配制的 4% 多聚甲醛固定,PBS 冲洗, 待切片晾干

2 后 -20 保存备用相邻的两张切片中一片用于原位杂交, 另一片进行 PAS 染色, 在光镜下确定每个曲细精管属哪一期, 以此为依据, 确认原位杂交切片中各曲细精管的分期, 本实验分曲细精管为 Ⅰ Ⅱ-Ⅳ Ⅴ Ⅵ Ⅶ-Ⅷ Ⅸ-Ⅺ Ⅹ Ⅱ-Ⅹ Ⅳ 期 7 个阶段原位杂交参照文献 [5] 的方法, 室温下用含 5 mmol/l MgCl2 的 PBS 和 2 SSC 洗切片, 预杂交液 37 预杂交 1 h, 杂交液 ( 含新变性的探针约 2 ng/μl) 于 37 杂交 16 h[ 以杂交液中除去探针作阴性对照, 以标记的细胞内视黄酸结合蛋白 -Ⅰ(cellular retinoic acid binding protein -Ⅰ,CRABP-Ⅰ) 作阳性对照, 公认它位于睾丸生精细胞内 ] 用 2 SSC 1 SSC 0.5 SSC 于室温下依次清洗切片, 于封闭液中封闭 30 min, 于抗体溶液中孵育 2 h, 加入新鲜配制的显色液, 暗处显色满意后,TE 终止显色梯度酒精脱水, 二甲苯透明, 树脂封片, 镜检并摄影原位杂交结果的定量及统计学处理采用 Pharmacia LKB Ultroscan XL 激光密度扫描系统对原位杂交结果进行灰度扫描, 以其平均相对灰度值作为 ABP mrna 量的参数, 数据以均数 ± 标准误 (X±sX) 表示, 对灰度扫描数据进行方差分析和 SNK 检验结果制备的质粒 DNA 的限制性内切酶酶切分析用质粒转化大肠杆菌, 小量制备质粒 DNA 后用 EcoR Ⅰ 消化, 经琼脂糖凝胶电泳后可见有 650 和 750 bp 目的 cdna 片段 ( 图 1) 图 1 含 ABP cdna 重组质粒酶切电泳分析图 fig 1 Restriction endonuclease analysis of recombinant plasmid containing rat ABP cdna a:rat ABP plasmid/ecor I;B:marker pbr322/bstnⅠ 原位杂交的结果分析光镜下可见 SC 中有蓝色颗粒状阳性杂交信号, 生精细胞中无阳性信号阳性信号 Ⅶ-Ⅷ 期最强,Ⅰ-

3 Ⅵ 期较弱, 且 Ⅶ-Ⅷ 期以近管腔处较密集, 主要分布在长形精子细胞周围, 基底部比较稀疏 ( 图 2); 阴性对照未见阳性杂交信号 ( 图 3), 阳性对照可见阳性杂交信号位于生精细胞 ( 图 4) 生精过程中大鼠睾丸 ABP mrna 水平的变化情况如图 5 所示 :Ⅰ-Ⅵ 期轻度增加, 但仍维持在低水平 ; 至 Ⅶ-Ⅷ 期迅速升高, 达到高峰, 增长幅度达 170%;Ⅸ-Ⅺ 期骤然下降, 但仍高于 Ⅰ-Ⅵ 期水平 ; 至 Ⅹ Ⅱ-Ⅹ Ⅳ 期又略有回升 ; 随后迅速下降至 Ⅰ-Ⅳ 期水平方差分析显示各个阶段之间差异有显著性意义 (P<0.01), 进一步做 SNK 检验显示其中 Ⅶ-Ⅷ 期分别与 Ⅰ Ⅱ-Ⅳ Ⅴ Ⅵ Ⅸ-Ⅺ 期之间差异有显著性意义 (P<0.05) 图 5 大鼠睾丸曲细精管上皮周期中 ABP mrna 相对平均灰度值的变化 fig 5 Variation of the relative average gray level of the specific hybridizable ABP mrna in the SC of the seminiferous tubule of rat testis during the epithelial cycle*p<0.05 compared with stage Ⅶ-Ⅷ;AU:arbitrary densitometric units 讨论大鼠 ABP(rABP) 是一相对分子质量为的糖蛋白二聚体, 含相对分子质量为和两个以非共价键相连的多肽亚单位, 分别被命名为 rabp(h) 和 rabp(l), 两者比例为 3 1, 两者有相似的多肽链及相似的甾酮结合位点, 不同之处在于糖基化程度 rabp 基因全长约 5.5 kb,rabp mrna 长 1.7 kb [ 6 ] 在体和离体研究均表明 SC 是睾丸中唯一合成 ABP 的细胞, 本实验也观察到生精细胞中不表达 ABP ABP mrna 位于 SC, 其水平有明显的周期性改变,Ⅰ-Ⅵ 期维持在低水平,Ⅶ-Ⅷ 期迅速升高, 达高峰,Ⅸ-Ⅺ 期骤降, 但仍高于 Ⅰ- Ⅵ 期水平, 至 Ⅹ Ⅰ Ⅰ- Ⅹ Ⅰ Ⅴ 期又略有回升, 随后迅速下降至 Ⅰ-Ⅵ 期水平这与等 [ 7 ] 采用微细解剖法和 Northern blot 检测的结果稍有不同, 他们发现 ABP mrna Ⅳ-Ⅵ 期最低,Ⅵ-Ⅶ 期升高,Ⅶ 期较 Ⅷ 期略低,Ⅷ-Ⅺ 期最高, 随后降低这可能是实验方法不同而造成的差异通常认为, 分泌细胞的转录水平与其分泌水平一致,Parvinen 等 [ 8 ] 观察到 ABP 分泌水平 Ⅰ-Ⅵ 期最低,Ⅶ 期升高,Ⅷ 期达到最大,Ⅸ- Ⅹ Ⅰ Ⅴ 期下降, 本实验的结果与 ABP 分泌水平的变化更为符合

4 大量的 ABP 沿管腔运至附睾, 而后逐渐从管腔液中消失免疫组化方法证实大量的 ABP 被附睾头部近端上皮降解, 而精子在附睾转运过程中逐渐获得功能上的成熟, 故有人认为生精细胞不是 ABP 功能的靶细胞,ABP 的功能可能是提高整个男性生殖管道的雄激素浓度 [9 ] 但是, 人们又观察到环绕长形精子的 SC 突起中存在着有免疫活性的 ABP, 本实验也观察到 ABP mrna 的分布 Ⅶ-Ⅷ 期以管腔周围较密集, 基底部较稀疏, 而管腔周围聚集的是后期精子细胞, 提示 ABP 在精子发生的后期更为重要 1984 年 Steinberger 等 [ 10 ] 发现精母细胞膜上有 rabp 的特异结合位点, 也存在于生活状态的生精细胞及生精细胞膜富集片段上 [ 11 ] ; 另外,Pellinimi 等 [ 12 ] 利用抗 ABP 抗体发现在精母细胞膜和精母细胞质内存在 ABP 这些结果均提示 SC 分泌的 ABP 是生精过程中某几步所必需的, 通过自身或作为性激素跨膜载体作用于生精细胞总之,SC 周期性分泌的 ABP 可能是它调节周期性精子发生的重要因素, 其确切的作用机制有待进一步的研究图 2 ABRMRNA 在大鼠睾丸曲细精管各期的分布 fig2 Distridution of ABP mrna Signaling in the seminiferous tubule of testis in the rat as detected dy in siu\tu hybridization with ABP cdna probe 200 图 3 睾丸组织原位杂交的阴性对照结果 fig3 Negative control of in situ hybridization on testicular tissue 200

5 图 4 大鼠睾丸曲细精管生精细胞 CRABP-I mrna 阳性对照结果 fig 4 Postitive control,distribution of CRABP-I mrna signaling in the germ cells of the seminiferous tubule of testis in the rat,as detected by in situ hybridization with CRABP-I cdna Probe 200 bl:basal lamina;tl:tubular lumen 国家自然科学基金 ( ) 资助陈咏梅 ( 中国医学科学院中国协和医科大学基础医学研究所组织胚胎教研室, 北京叶世隽 ( 中国医学科学院中国协和医科大学基础医学研究所组织胚胎教研室, 北京黄玉苓 ( 中国医学科学院中国协和医科大学基础医学研究所组织胚胎教研室, 北京郑文利 ( 中国医学科学院中国协和医科大学基础医学研究所组织胚胎教研室, 北京参考文献 [1]Russel LD,Ettlin RA,Sinhahikim AP, et al.histological and histopathological evaluation of the testis. Clearwater:Cache River Press, [2]Griswold MD.Protein secretions of Sertoli cells.int Rev Cytol,1988,110: [3] 李尹雄. 核酸的分离和纯化. 见 : 卢圣栋主编. 现代分子生物学实验技术. 北京 : 高等教育出版社,

6 [4] 郑文利, 叶世隽, 何星华, 等. 雷公藤多甙对支持细胞分泌蛋白和间质细胞 LH/CG 受体转录水平的影响. 中国医学科学院学报,1996,18: [5] 苏慧慈. 原位杂交. 北京 : 科学技术出版社, [6]Joseph DR,Lawrence W.Mutagenesis of essential functional residues of rat androgen-binding protein/sex hormone binding protein globulin.mol Endocrinol,1993,7: [7]Lönnerberg P,Söder O,Parvinen M, et al.β-nerve growth factor influences the expression of androgen-binding protein messenger ribonucleic acid in the rat testis.biol Reprod,1992,47: [8]Parvinen M,Vihko KK,Toppari J.Cell interactions during the seminiferous epithelial cycle.int Rev Cytol,1986,104: [9]Skinner MK.Cell-cell interactions in the testis.endocrinol Rev,1991,12:45-77 [10]Steinberger A,Dighe RR,Diaz J.Testicular peptides and their endocrine and paracrine functions.arch Biol Med Exp,1984,17: [11]Felden F,Guéant JL,En Nya A, et al.photoaffinity labelled rat androgen binding protein and human sex hormone steroid binding protein bind specifically to rat germ cell.j Mol Endocrinol,1981,108: [12]Pelliniemi LJ,Dym M,Gunsalus GL, et al.immunocytochemical localization of androgen binding protein in the male reproductive tract.endocrinology,1981,108:

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