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1 学校编码 :10384 分类号密级 学号 : UDC 博士学位论文 三丁基锡对雄性小鼠精子发生和成熟的影响 Effects of tributyltin on spermatogenesis and sperm maturation in mice 鄢绯寰 指导教师姓名 : 陈奕欣教授 专业名称 : 动物学 论文提交日期 :2008 年 10 月论文答辩时间 :2008 年 11 月学位授予日期 : 答辩委员会主席 : 郑微云教授评阅人 : 2008 年 11 月

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3 厦门大学学位论文原创性声明 本人呈交的学位论文是本人在导师指导下, 独立完成的研究成 果 本人在论文写作中参考其他个人或集体已经发表的研究成果, 均 在文中以适当方式明确标明, 并符合法律规范和 厦门大学研究生学 术活动规范 ( 试行 ) 另外, 该学位论文为 ( ) 课题 ( 组 ) 的研究成果, 获得 ( ) 课题 ( 组 ) 经费或实验室的 资助, 在 ( ) 实验室完成 ( 请在以上括号内填写课 题或课题组负责人或实验室名称, 未有此项声明内容的, 可以不作特 别声明 ) 声明人 ( 签名 ): 年 月 日

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5 厦门大学学位论文著作权使用声明 本人同意厦门大学根据 中华人民共和国学位条例暂行实施办 法 等规定保留和使用此学位论文, 并向主管部门或其指定机构送交 学位论文 ( 包括纸质版和电子版 ), 允许学位论文进入厦门大学图书馆及其数据库被查阅 借阅 本人同意厦门大学将学位论文加入全国博士 硕士学位论文共建单位数据库进行检索, 将学位论文的标题和摘要汇编出版, 采用影印 缩印或者其它方式合理复制学位论文 本学位论文属于 : ( )1. 经厦门大学保密委员会审查核定的保密学位论文, 于年月日解密, 解密后适用上述授权 ( )2. 不保密, 适用上述授权 ( 请在以上相应括号内打 或填上相应内容 保密学位论文应是已经厦门大学保密委员会审定过的学位论文, 未经厦门大学保密委员会审定的学位论文均为公开学位论文 此声明栏不填写的, 默认 为公开学位论文, 均适用上述授权 ) 声明人 ( 签名 ): 年月日

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7 目 录 中文摘要 Ⅰ 英文摘要 Ⅲ 第一章前言 1 一 有机锡化合物的来源及理化特性 1 二 三丁基锡污染现状及其生物毒性 1 三 高等动物生殖内分泌调控机制 5 四 精子发生的场所及过程 6 五 精子发生的激素调节 7 1 下丘脑 垂体 性腺轴 7 2 甲状腺激素对精子发生的影响 10 六 精子发生的其他调控方式 12 七 精子成熟 13 八 有机锡对哺乳动物精子发生和精子成熟影响的研究现状 14 九 研究的主要内容 目的和意义 15 第二章材料和方法 16 一 实验动物 16 二 仪器和试剂 16 1 实验仪器 16 2 常用试剂 16 三 实验动物处理 17 四 取样及样品处理 17 五 睾丸组织学 17 1 H.E. 染色 18 2 组织学分析 18 3 免疫组织化学 18 六 TUNEL 检测细胞凋亡 19 1 主要试剂 19

8 2 操作步骤 19 七 SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳与 Western bolt 20 1 样品预处理 20 2 SDS- 聚丙烯酰胺凝胶电泳与 Western boltting 试剂配方 20 3 SDS- 聚丙烯酰胺凝胶电泳与 Western boltting 分析 21 八 血清及性腺性激素水平的测定 21 1 性腺预处理 21 2 测定方法 22 九 睾丸组织基因差异表达验证 22 1 睾丸组织总 RNA 的提取和沉淀 22 2 第一链 cdna 合成 23 3 实时荧光定量 PCR 体系建立 24 十 附睾组织学 25 1 H.E. 染色 25 2 组织学分析 25 十一 精子质量检测方法 25 1 精子密度 25 2 存活率 26 3 形态染色 26 十二 附睾生化指标检测 26 1 附睾组织匀浆液的制备 26 2 中性 α- 葡萄糖苷酶活性测定 26 3 附睾酸性磷酸酶测定 27 4 精子顶体酶活性测定 28 5 精子乳酸脱氢酶同工酶 -X 活性测定 29 十三 附睾组织原位杂交 30 1 基因探针制备 31 2 冰冻切片方法 31 3 原位杂交试剂及溶液 31 4 原位杂交流程 32

9 5 附睾组织总 RNA 的提取和沉淀 32 十四 数据处理 33 第三章结果 34 一 TBT 对小鼠体重 睾丸和附睾重量及其指数的影响 34 二 TBT 对睾丸组织形态结构的影响 36 三 TBT 对生殖相关激素水平的影响 41 1 TBT 对促黄体生成素 LH 和卵泡刺激素 FSH 分泌水平的影响 41 2 TBT 对睾酮 (T) 雌二醇(E 2 ) 分泌水平的影响 42 3 TBT 对三碘甲腺原氨酸 T3 和甲状腺素 T4 分泌水平的影响 43 四 TBT 对小鼠睾丸细胞凋亡的影响 45 五 TBT 对生精细胞 PCNA 表达的影响 47 1 组织学观察 47 2 western blotting 分析 49 六 TBT 对睾丸甲状腺激素受体 TR 基因转录水平的影响 50 1 RT-PCR 结果 50 2 实时荧光定量 PCR 结果 50 七 TBT 对小鼠精液参数的影响 51 八 TBT 对附睾组织形态的影响 52 九 TBT 对附睾生化指标的影响 54 1 附睾组织中性 α- 葡萄糖苷酶和酸性磷酸酶活性的变化 54 2 精子顶体酶和乳酸脱氢酶同工酶 -X 活性的变化 55 十 TBT 对附睾 MMP7 和 TDO2 表达的影响 56 1 MMP7 的原位杂交和实时荧光定量 56 2 TDO2 的原位杂交和实时荧光定量 58 第四章讨论 60 一 TBT 对小鼠睾丸精子发生的影响 60 二 TBT 对小鼠生殖激素水平的影响 61 三 TBT 对小鼠睾丸细胞增殖的影响 62 四 TBT 对小鼠睾丸细胞凋亡的影响 63

10 五 TBT 对小鼠甲状腺激素及其受体的影响 64 六 TBT 对小鼠精子质量参数的影响 67 七 TBT 对小鼠附睾组织形态的影响 68 八 TBT 对附睾生化指标的影响 68 九 TBT 对附睾 MMP7 和 TDO2 基因表达的影响 70 结语与展望 73 参考文献 75 攻读博士阶段发表的论文和参加的课题 107 致谢 108

11 Catalogue Abstract Ⅰ Chapter 1 Introduction Ⅲ Ⅰ Source of organotin compounds and its physical and chemical properties 1 Ⅱ Pollution of tributyltin 1 Ⅲ Reproductiv-endocrine regulation in higher animal 5 Ⅳ Spermatogenesis process 6 Ⅴ Hormonal regulation of spermatogenesis 7 Hypothalamo-pituitary-testis axis 7 Thyroid hormones impact on spermatogenesis 10 Ⅵ Other regulative modes of spermatogenesis 12 Ⅶ Sperm maturation 13 Ⅷ Current research status about organotin-induced disorder of Spermatogenesis and sperm maturation in mammal 14 Ⅸ Research objectives 15 Chapter 2 Materials and Methods 16 Ⅰ Materials 16 Ⅱ Instruments and reagents 16 Experiment instruments 16 Common reagents 16 Ⅲ TBT exposure 17 Ⅳ Sampling and preservation 17 Ⅴ Testicular Histology 17 H.E.Staining. 18 Histological analysis. 18 Immunohistochemistry 18 Ⅵ Cell apoptosis detection by TUNEL 19 Reagents. 19

12 Manipulation 19 Ⅶ SDS-PAGE and Western blotting analysis 20 Tissue preparation 20 Reagents 20 Procedure 21 Ⅷ Sex hormone analysis 21 Sampling and tissue preparation 21 Methods 22 Ⅸ Gene expression profile in the testes of mice 22 Total RNA extraction and precipitation 22 First strand cdna synthesis 23 real-time quantitative reverse-transcription PCR system 24 Ⅹ Epididymal histology 25 H.E.Staining. 25 Histological analysis. 25 Ⅺ Sperm parameters 25 Sperm density 25 Sperm viability 26 Sperm morphology 26 Ⅻ Biochemical assays in epididymides 26 Tissue homogenization 26 Epididymal Neutral α-glucosidase activity 26 Epididymal acid phosphatase activity 27 Sperm Acrosin activity 28 Sperm LDH-X activity 29 ⅩⅢ In situ hybridization in the epididymides 30 Nucleic acid probe preparation 31 Cryo-sectioning Method 31 Reagents 31 Procedure 32

13 Total RNA extraction and precipitation 32 ⅩⅣ Data processing 33 Chapter 3 Results 34 Ⅰ Effects of TBT on the bodyweight,testicular and epididymal weight and tissue indices in male mice 34 Ⅱ Effects of TBT on the histology of testes in mice 36 Ⅲ Effects of TBT on the reproductive-related hormone of serum in male mice 41 Effects of TBT on the serum LH and FSH level 41 Effects of TBT on the testicular T and E 2 level 42 Effects of TBT on the serum T3 and T4 level 43 Ⅳ Effects of TBT on the testicular cell apoptosis in mice 45 Ⅴ Effects of TBT on the testicular PCNA expression in mice 47 Histological observation 47 Western blotting assay 49 Ⅵ Effects of TBT on the testicular TR transcription 50 RT-PCR 50 Real-time quantitative reverse-transcription PCR 50 Ⅶ Effects of TBT on the sperm parameters 51 Ⅷ Effects of TBT on histopathology of epididymis in mice 52 Ⅸ Effects of TBT on biochemical indices in epididymis 54 Epididymal Neutral α-glucosidase and acid phosphatase activity 54 Sperm Acrosin and LDH-X activity 55 Ⅹ Effects of TBT on MMP7 and TDO2 expression 56 In situ hybridization and real-time quantitative detection of MMP7 56 In situ hybridization and real-time quantitative detection of TDO2 58 Chapter 4 Discussion 60 ⅠEffects of TBT on the spermatogenesis 60 ⅡEffects of TBT on the reproductive hormone 61 Ⅲ Effects of TBT on the testicular cell proliferation 62

14 Ⅳ Effects of TBT on the testicular cell apoptosis 63 Ⅴ Effects of TBT on the serum thyroid hormone level and testicular TR transcription 64 Ⅵ Effects of TBT on the sperm parameters 67 Ⅶ Effects of TBT on the histology of epididymis in mice 68 Ⅷ Effects of TBT on the epididymal biochemical indices 68 Ⅸ Effects of TBT on the MMP7 and TDO2 expression 70 Conclusions and future work 73 References 75 The papers published and the subjects attend in the period of study of Ph.D 107 Acknowledgements 108

15 中文摘要 中文摘要 本实验以青春期昆明雄鼠为研究对象, 通过较低浓度的氯化三丁基锡 (Tributyltin chloride,tbtcl)(0.5, 5, and 50 μg/kg) 灌胃实验, 染毒 45 d 后, 观察 TBT 对生殖系统的毒性效应, 探讨其对精子发生及精子成熟损伤的 机理和途径 有关精子发生方面的检测指标包括睾丸的组织形态学, 睾丸成熟情 况 血清促性腺激素和睾丸性激素水平 睾丸细胞凋亡和细胞增殖情况, 血清甲 状腺激素 (T3 T4) 水平和睾丸甲状腺激素受体 (TRs) 表达量 (mrna 水平 ); 有 关精子成熟方面的检测指标包括附睾组织形态, 精液质量参数 附睾功能标志物活性 ( 中性 α- 葡萄糖苷酶和附睾酸性磷酸酶 ) 精子功能指标以及附睾内特异性表达基因 (MMP7 和 TDO2) 的表达量 (mrna 水平 ) 1 TBT 对睾丸精子发生的影响 TBT 处理后雄性小鼠性体比指数没有显著变化, 但睾丸组织结构发生明显改变, 而且损伤程度随 TBT 剂量增加而加重, 在 50 μg/kg 剂量组, 生精细胞排列杂乱 无序, 各级生精细胞间出现大量的间隙, 大量生精细胞异常脱落进入生精小管管腔 和对照组比较, 处理组睾丸睾酮水平呈现出 TBT 剂量依赖性显著升高, 雌激素水平呈现剂量依赖性下降趋势, 而血清黄体生成素水平以及卵泡刺激素水平较对照组有所下降 运用免疫组织化学和 western-blotting 的方法对睾丸内增殖细胞核抗原 (PCNA) 表达水平进行研究, 发现随着 TBT 浓度的增加, 睾丸内 PCNA 表达量有下降趋势, 但与对照组相比较, 没有显著性变化 运用 TUNEL 技术检测 TBT 染毒 45 d 对小鼠睾丸生殖细胞凋亡的影响, 发现各处理组凋亡阳性细胞数与对照组相比有所升高, 但差异不显著 TBT 处理后小鼠血清三碘甲腺原氨酸 (T3) 水平以及三碘甲腺原氨酸 (T3) 与甲状腺 素 (T4) 比率呈现剂量依赖性显著下降, 睾丸 TRα mrna 表达量下调 2 TBT 对附睾功能以及精子成熟的影响 TBT 处理组小鼠精子密度 存活率和畸形率呈现剂量依赖性显著下降 组织形态学观察显示附睾头部未见明显变化, 而体部和尾部可见不同程度的损伤, 附睾损伤程度随着处理剂量的增加而逐渐加剧, 呈现剂量依赖效应 : 体部附睾管上皮细胞逐渐稀少, 排列疏松, 管间间隙变大, 腔内精子减少, 中浓度组和高浓度组附睾管腔内可见大量精子凝聚 ; 附睾尾部上皮细胞排列疏松, 管间间隙逐渐变大, 管腔内精子减少, 管间结缔组织逐渐减少 TBT 处理使附睾上皮特异性分泌物中性 α- 葡萄糖苷酶 (NAG) 活性有 I

16 中文摘要 所下降, 但与对照组相比, 差异不显著 ; 附睾酸性磷酸酶 (ACP) 活性随处理剂量的升高呈下降趋势, 但与对照组相比无统计学差异 处理组精子顶体酶活性呈现剂量依赖性显著下降 ; 精子乳酸脱氢酶同工酶 -X 活性在高浓度组受到显著抑制 与对照组相比较,5 和 50 μg/kg TBT 浓度组 MMP7 mrna 表达量显著下降, TDO2 表达量呈现剂量依赖性显著下降 综上所述, 本实验结果表明 TBT 能干扰青春期小鼠精子发生 组织学观察以 及睾丸成熟度检查结果表明 TBT 能破坏睾丸组织的正常结构, 抑制睾丸发育 TBT 处理能够显著诱导睾丸睾酮水平上升,17-β 雌二醇水平下降, 血清 LH 和 FSH 水平有所下降, 造成生殖内分泌系统紊乱, 进而干扰睾丸精子发生 TBT 处理显著降低血清 T3 含量, T3/T4 比率显著下降,TRα 表达水平下调, 说明 TBT 能干扰甲状腺正常生理机能, 进而诱发睾丸生精机能障碍 另外, 处理组凋亡细胞数目的增加以及 PCNA 蛋白表达量的降低, 提示 TBT 可在一定程度诱导睾丸生精细胞凋亡, 抑制其增殖, 这可能是 TBT 抑制精子发生的潜在机制之一 TBT 干扰精子发生应该是多条途径共同作用的结果 本实验结果还显示 TBT 能干扰青春期小鼠精子成熟 组织形态学观察结果表明 TBT 对附睾组织结构造成损伤 精液常规检测结果显示处理组附睾精子密度下降, 畸形率上升, 同时精子存活率下降, 提示 TBT 可影响哺乳动物精子质量 附睾酸性磷酸酶活性下降很可能与精子畸形率上升有一定关系 精子顶体酶以及乳酸脱氢酶同工酶 -X 活性的显著降低, 提示精子成熟受到影响, 这些精子质量功能指标的变化情况与精液常规检测结果一致, 进一步证实 TBT 具有精子毒性 MMP7 和 TDO2 mrna 表达量的显著下降, 提示 TBT 可影响附睾内一些基因的表达, 而这些基因很可能与附睾的功能或精子成熟有关 以上结果说明 TBT 具有附睾毒 性以及精子毒性 TBT 引起的精子数量和质量下降能影响动物的生殖 关键词 : 三丁基锡 ; 昆明雄鼠 ; 睾丸 ; 附睾 ; 精子发生 ; 附睾功能 ; 精子成熟 II

17 Degree papers are in the Xiamen University Electronic Theses and Dissertations Database. Full texts are available in the following ways: 1. If your library is a CALIS member libraries, please log on and submit requests online, or consult the interlibrary loan department in your library. 2. For users of non-calis member libraries, please mail to etd@xmu.edu.cn for delivery details.

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