342 学报 JournalofChinaPharmaceuticalUniversity 第 45 卷 [6-7] 面研究较少, 多用于大鼠多囊卵巢综合征模型的建立以及雌激素 (estrogens) 实验研究的阳性对照用药, 而其长期给药对雌激素低下的去卵巢大鼠的生殖靶器官子宫阴道乳腺的形态

Size: px

Start display at page:

Download "342 学报 JournalofChinaPharmaceuticalUniversity 第 45 卷 [6-7] 面研究较少, 多用于大鼠多囊卵巢综合征模型的建立以及雌激素 (estrogens) 实验研究的阳性对照用药, 而其长期给药对雌激素低下的去卵巢大鼠的生殖靶器官子宫阴道乳腺的形态"

抵谢
7 years ago
Views:

1 学报 JournalofChinaPharmaceuticalUniversity 2014,45(3): 戊酸雌二醇对去卵巢大鼠子宫阴道乳腺雌激素受体表达的影响 1, 马晓萍, 徐颖, 丁婕, 林娜 ( 1 广州中医药大学, 广州 ; 2 中国中医科学院中药研究所, 北京 ) 摘要以去卵巢大鼠为研究模型, 观察戊酸雌二醇对去卵巢大鼠子宫阴道乳腺组织病理变化及雌激素受体 α (ERα) 和雌激素受体 β(erβ) 表达的影响, 探讨其雌激素样作用机制采用 HE 染色法观察去卵巢大鼠组织的病理改变 ; 采用免疫组织化学和 Westernblot 技术检测子宫阴道乳腺 ERα 和 ERβ 蛋白的表达水平结果显示, 戊酸雌二醇可明显拮抗去卵巢大鼠靶器官的萎缩, 其机制可能与上调靶器官雌激素受体 (ERs) 表达有关关键词戊酸雌二醇 ; 去卵巢 ; 靶器官 ; 雌激素受体中图分类号 R965 文献标志码 A 文章编号 (2014) doi: /j.isn Efectsofestradiolvalerateontheestrogenreceptorexpressioninuterus 牞 vaginaandmammaryglandofovariectomizedrats MAXiaoping 1 牞 2 牞 XUYing 2 牞 DINGJie 2 牞 LINNa 2 1 GuangzhouUniversityofChineseMedicine 牞 Guangzhou 牷 2 InstituteofChineseMateriaMedica 牞 ChinaAcademyofChineseMedicalSciences 牞 Beijing 牞 China Abstract Theobjectiveofthisstudywastoevaluatetheefectsofestradiolvalerate 牗 EV 牘 ontheestrogenrecep torexpresionandthepathologicalchangesoftisuesinuterus 牞 vaginaandbreastofovariectomizedrats 牞 and investigatetheestrogen likemechanism HEmethodwasusedtodeterminethetisuepathologicalchanges 牷 the proteinexpresionlevelsofestrogenreceptoralpha 牗 ERα 牘 andestrogenreceptorbeta 牗 ERβ 牘 inmammarygland 牞 uterusandvaginaweredetectedbyimmunohistochemistryandwesternblot Theresultsindicatedthatestradiol valeratecouldobviouslyantagonizetheatrophyofthetargetorgansinovariectomizedrats 牞 andtheup regulated expresionoftheestrogenreceptorsintargetorgansistheposiblemechanismofevinducedestrogenicactivity Keywords estradiolvalerate 牷 ovariectomized 牷 targetorgan 牷 estrogenreceptor ThisstudywassupportedbytheNationalNaturalScienceFoundationofChina 牗 No 牘牷 thejointinnovationresearchproject forvisitingfelowinchinaacademyofchinesemedicalsciences 牗 No z 牘牷 thenationalbasicresearchprogram ofchina 牗 973Program 牘牗 No 2011CB 牞 2011CB 牘戊酸雌二醇 (estradiolvalerate,ev), 属于 17 戊酰基酯类化合物, 作为前体药物在小肠及首次通过肝脏吸收后被快速代谢成 17 β 雌二醇和戊酸 [1] 临床上, 戊酸雌二醇作为激素补充治疗 (hormonereplacementtherapy,hrt) 的主要用药, 用来缓解绝经后血中激素含量下降引发的潮热盗汗情绪波动和阴道干燥瘙痒及骨质疏松症等围绝经期综合征诸症 [2-3] 近年来, 戊酸雌二醇在功能 [4] [5] 失调性子宫出血及复合口服避孕药抑制排卵方面的作用也得到了广泛的关注, 而实验药理学方收稿日期通信作者 Tel: E mail:xu_ying1978@163 com Tel: E mail:linna888@163 com 基金项目国家自然科学基金资助项目 (No ); 中国中医科学院客座研究员联合创新研究资助项目 (No z070826); 国家重点基础研究发展计划 (973 计划 ) 资助项目 (No 2011CB505300,2011CB505305)

2 342 学报 JournalofChinaPharmaceuticalUniversity 第 45 卷 [6-7] 面研究较少, 多用于大鼠多囊卵巢综合征模型的建立以及雌激素 (estrogens) 实验研究的阳性对照用药, 而其长期给药对雌激素低下的去卵巢大鼠的生殖靶器官子宫阴道乳腺的形态及其上雌激素受体亚型的分布及含量影响的系统报道较少本实验通过建立经典的去卵巢大鼠模型, 观察戊酸雌二醇对雌激素低下动物的子宫阴道乳腺形态学及雌激素受体 (ERα 和 ERβ) 的作用, 并探讨相关机制材料 1 1 药品与试剂戊酸雌二醇 ( 法国拜耳公司, 批号 : J ); 伊红染液 ( 批号 :120926) 苏木素染液 ( 批号 :121220) 均购自北京中衫金桥生物技术有限公司 ; 两步法免疫组化试剂盒 ( 批号 : 07K29C) 二氨基联苯胺 (DAB) 显色试剂盒 ( 批号 :AR1022) 均购自武汉博士德生物工程有限公司 ; 兔抗鼠 ERα( 批号 :GR ) ERβ( 批号 : GR ) 多克隆抗体购自北京盛世中方生物技术有限公司 ;ECL 发光剂 ( 批号 :P1010) 购自北京普利莱基因技术有限公司 ; 其他试剂均为国产分析纯 1 2 仪器 BMJ 1 生物组织包埋机 QPJ 1C 石蜡切片机 QPJ 轮转式切片机 ZPJ 1A 展片机 KPJ 1A 烤片机均为天津天利航空机电有限公司产品 ;Olympus BX60 光学显微镜,VILBERFUSIONFX7Spectra 化学发光多色荧光及活体成像系统 1 3 动物健康 2 月龄 (200±10)gSD 雌性大鼠 30 只, 清洁级, 购自军事医学科学院, 合格证号 SYXK ( 军 ) 方法 2 1 造模分组及给药取健康成熟 SD 雌性大鼠 30 只, 随机分为去卵巢 (OVX) 组假手术 (Sham) 组戊酸雌二醇 (EV) 组, 每组 10 只 10% 水合氯醛 (300mg/kg, ip) 麻醉,OVX 组 EV 组行双侧卵巢摘除术,Sham 组仅切除卵巢附近脂肪术后第 2 天进行阴道涂片, 美蓝染色观察阴道上皮细胞, 连续 5d 处于间情期, 证明去势成功术后 1 周, 按文献 [8-9] 采用 Meeh Rubner 氏公式推算大鼠的体表面积, 再和人的戊酸雌二醇临床剂量进行换算 EV 组 0 11mg/kg 戊酸雌二醇混悬液灌胃给药, 其余两组给予等量的生理盐水灌胃, 每天 1 次, 连续 8 周每周按照体重调整给药量, 处死前禁食 12h 2 2 取材大鼠末次给药后 24h, 称重, 麻醉, 分离摘取子宫阴道及乳腺左侧子宫角宫颈近端阴道部分左侧乳腺放入 4% 多聚甲醛溶液中固定待作病理形态学观察和免疫组织化学检测 ; 右侧子宫角宫颈远端阴道部分右侧乳腺立即于 -80 冷藏待 Westernblot 检测 2 3 组织病理学观察子宫阴道及乳腺组织经 4% 多聚甲醛固定 48 h 后, 常规脱水, 石蜡包埋切片, 行苏木精伊红染色在光学显微镜下进行组织病理学检查 2 4 免疫组织化学染色按 2 3 项方法制备组织切片, 常规脱蜡至水,3% 双氧水封闭内源性过氧化物酶,PBS 洗涤, 0 01mol/L 柠檬酸钠缓冲液 (ph6 0) 修复抗原, 暴露抗原决定簇 PBS 洗涤, 羊血清室温封闭 30min, 滴加兔抗鼠 ERα/ERβ 多克隆抗体 (1 30 稀释 ), 用两步法免疫组化试剂盒 DAB 显色试剂盒进行 ERα/ERβ 免疫组织化学染色显微镜下观察显色效果, 至棕黄色时用蒸馏水中止显色, 脱水, 二甲苯透明, 树脂封片在光学显微镜下进行免疫组织化学检查 2 5 Westernblot 检测 ERs 蛋白子宫阴道及乳腺组织用 RIPA 试剂 (50~ 100mg 组织, 加裂解液 500~1000μL) 抽提可溶性蛋白, 制备 SDS 聚丙烯酰胺凝胶, 电泳后湿转至 PVDF 膜上 5%(TBST 稀释 ) 脱脂奶粉室温振荡封闭 2h 后 TBST 洗膜, 一抗 ERα(1 100) 或 ERβ (1 1000) 或 GAPDH(1 1000)4 过夜 TBST 洗膜, 辣根酶标记山羊抗兔 IgG(1 5000) 室温孵育 2h, 洗膜后加入 ECL 反应 1min, 采用凝胶成像系统观察印迹结果 2 6 统计方法数据用 x±s 珋表示, 组间比较用单因素方差分析, 采用 SPPS16 0 软件进行统计分析,P<0 05 表示有显著性差异

3 第３期 ( 结马晓萍等戊酸雌二醇对去卵巢大鼠子宫阴道乳腺雌激素受体表达的影响果３４３腺上皮细胞表达增强且核表达明显３１戊酸雌二醇对去卵巢大鼠靶器官组织病理学ＥＲα ＥＲβ在大鼠阴道表达分布无明显差异在阴道鳞状上皮细胞基质纤维细胞平滑肌细胞的影响核及胞浆中均有表达都以鳞状上皮细胞中表达最病理切片图１显示Ｓｈｍ组宫腔大子宫内ｈｍ组鳞状上皮表达明显部分黏膜上皮也强Ｓ膜上皮见透亮细胞内膜基质细胞呈梭型腺体丰见阳性表达与Ｓｈｍ组比ＯＶＸ组上皮细胞表达富与ｍ组比较ＯＶＸ组子宫体积变小宫腔变显著降低药物干预后鳞状上皮细胞较ＯＶＸ组明窄子宫内膜变薄内膜上皮细胞多为单细胞紧密显增强排列腺体数目明显减少给予戊酸雌二醇治疗８ｍ组ＥＲα ＥＲβ在大鼠乳腺导管上皮细胞周后子宫内膜增厚内膜上皮细胞呈低柱状宫腔的胞质和胞核内都有表达与ｍ组比较去卵增大固有层疏松腺体数目明显增多巢后上皮细胞表达明显降低给予戊酸雌二醇后表达量比ＯＶＸ组有明显升高切片结果如图２所示Ｆｕ１ＥｆｆｆｄｖＥＶｈｈｙｆｕｕｖｄｍｍｍｙｄｈｖｍｚｄＯＶＸｍ组阴道上皮角化明显与ｍ相比较ＯＶＸ组阴道明显萎缩阴道壁变薄角化程度降低ＥＶ组阴道上皮出现增生和多层鳞状细胞表层高度及细胞角化程度比ＯＶＸ组都有明显增高偶见空泡细胞ｍ组乳腺上皮细胞厚腺腔大与Ｓｈｍ组比较ＯＶＸ组的乳腺萎缩明显给予戊酸雌二醇后Ｆｕ２ＥｆｆｆｅｖｍｐＥＲｘｐｈｕｕｖｄｍｍｍｙｄ３３戊酸雌二醇对去卵巢大鼠靶器官ＥＲ亚型表达的影响腺导管腔扩张上皮厚度显著增加且含有分泌物Ｗｂ结果显示子宫阴道及乳腺的３２戊酸雌二醇对去卵巢大鼠靶器官ＥＲ亚型分ＥＲα表达均高于ＥＲβ 与ｍ组相比去卵巢后布的影响子宫阴道及乳腺ＥＲα ＥＲβ表达均明显下降其ｍ组ＥＲα ＥＲβ在大鼠子宫内膜上皮和腺中子宫ＥＲ表达相似与ＯＶＸ组相比ＥＶ组子上皮细胞内膜间质细胞中阳性表达明显与ｍ宫阴道及乳腺ＥＲα ＥＲβ蛋白表达均显著上升组比较ＯＶＸ组子宫ＥＲα腔上皮及腺上皮阳性少内膜间质中基本无阳性表达ＥＲβ阳性表达其中对ＥＲα上调最为显著Ｐ０００１Ｐ０００１弱腺上皮细胞表达不明显给药后腔上皮细胞和子宫ＥＲα与ＥＲβ的比值结果如图３所示Ｐ００５各靶器官ＥＲβ表达上调次之并上调

4 344 学报 JournalofChinaPharmaceuticalUniversity 第 45 卷 Figure3 EfectsofEVonexpresionsofERαandERβatproteinlevelsinuterus(A),vagina(B),andmammarygland(C)inOVXrats( 珋 x±s, n=3) P<0 05, P<0 01, P<0 001vsShamgroup; # P<0 05, ## P<0 01, ### P<0 001vsOVXgroup 讨论雌激素是一种女性激素, 主要由卵巢分泌产生, 胎盘肾上腺皮质也能产生少量的雌激素雌激素效应不仅与雌激素含量有关, 还和靶器官上雌激素受体 (ERs) 的数目亚型及分布密切相关, 也与靶细胞内同 ERs 效应基因表达过程相关的调控因子的种类和作用有关 ERs 广泛分布于中枢和外周组织, 包括泌尿生殖系统中枢神经系统和骨骼系统中研究结果表明, 在生殖系统中,ERα 主要表达于子宫乳腺睾丸中,ERβ 主要表达于前列腺和卵巢中 [10-11] 目前, 戊酸雌二醇作为一种广泛应用的合成雌激素, 其长期给药对生殖相关靶器官雌激素受体影响作用的报道较少, 尤其是对乳腺的雌激素受体的影响更鲜见报道故本研究选取子宫阴道乳腺作为研究对象, 使用临床等效剂量的戊酸雌二醇连续给药 8 周, 观察其对靶器官的雌激素样作用, 并探讨其作用机制本研究采用去卵巢大鼠模型, 通过 HE 染色法观察到大鼠去卵巢后子宫阴道和乳腺出现了一系列的组织病理学改变, 跟以前的研究报道相符 [12] 给予戊酸雌二醇后, 明显拮抗了雌激素下降所引起的子宫萎缩, 能使子宫内膜明显增厚, 腺体密集分布同时, 还能使阴道黏膜上皮明显增厚, 甚至出现空泡细胞, 大大提高了上皮细胞的质核比, 乳腺组织密度增加, 出现分泌物, 提示戊酸雌二醇对子宫阴道上皮及乳腺具有较好的正性作用在本实验中, 免疫组化结果显示去卵巢大鼠靶器官内膜上皮及腺上皮阳性表达降低, 经戊酸雌二醇干预后,ERs 在大鼠子宫阴道乳腺内膜上皮细胞核及胞浆表达均增强, 但具体定位不同,ERβ 主要定位于核膜及胞质, 而 ERα 主要定位于核内, 胞质中仅微弱表达此外,Westernblot 结果显示给药后靶器官 ERs 的表达水平也各有不同, 子宫 ERs 表达最强, 阴道次之, 而所有靶器官中 ERα 表达均高于 ERβ, 提示戊酸雌二醇对靶器官细胞的增殖分化作用可能由 ERα 所介导, 且主要作用于子宫本实验研究结果表明, 口服戊酸雌二醇对去卵巢大鼠子宫阴道及乳腺萎缩具有明显的拮抗效应且对靶器官下降的 ERs 具有上调作用, 推测 ERs 途径是其发挥雌激素样作用的机制之一从围绝经期开始到绝经早期, 是激素补充治疗的时间窗,2011 年国际绝经学会和各国的专家都提出在围绝经期有症状的中年妇女中开始使用激素补充治疗, 可以形成一个长期的对心血管和神经系统的有益的保护作用, 因此, 在围绝经期开始到绝经早期, 建议在临床上使用戊酸雌二醇或与孕激素联合用药, 以缓解围绝经期综合征诸症参考文献 [1] TeichmannA.Pharmacologyofestradiolvalerate/dienogest[J]. Climacteric,2003,6(Suppl2):17-23 [2] BlodeH,ZeunS,ParkeS,etal.Evaluationoftheefectsofrifam

5 第 3 期马晓萍等 : 戊酸雌二醇对去卵巢大鼠子宫阴道乳腺雌激素受体表达的影响 345 picin,ketoconazoleanderythromycinonthesteady statepharma cokineticsofthecomponentsofanoveloralcontraceptivecontai ningestradiolvalerateanddienogestinhealthypostmenopausal women[j].contraception,2012,86(4): [3] NoorafshanA,AhmadiM,MesbahSF,etal.Stereologicalstudyof theefectsofletrozoleandestradiolvaleratetreatmentontheova ryofrats[j].clinexpreprodmed,2013,40(3): [4] RafieS,BorgeltL,KoepfER,etal.Noveloralcontraceptivefor heavymenstrualbleeding:estradiolvalerateanddienogest[j]. IntJWomensHealth,2013,5: [5] WiegratzI,LeeJH,KutscheraE,etal.Efectoffouroralcontra ceptivesonhemostaticparameters[j].contraception,2004,70 (2): [6] BrawerJR,MunozM,FarookhiR.Developmentofthepolycystic ovariancondition(pco) intheestradiolvalerate treatedrat [J].BiolReprod,1986,35(3): [7] ShiD,VineDF.Animalmodelsofpolycysticovarysyndrome:a focusedreviewofrodentmodelsinrelationshiptoclinicalpheno typesandcardiometabolicrisk[j].fertilsteril,2012,98(1): [8] YuanBJ,WangQZ.PreclinicalSafetyEvaluationofNewDrugs andpractice[m].beijing:militarymedicalsciencepres,1997: [9] LinH,ZangW,ZhengYL,etal.Earlypregnancysupplementfor maleofspringratsestradiolvalerateafectthereproductivesys temdevelopment[j].natljandrol( 中华男科学杂志 ),2009, 15(9): [10] CouseJF,KorachKS.Reproductivephenotypesintheestrogen receptor alphaknockoutmouse[j].annendocrinol(paris), 1999,60(2): [11] HewitSC,KorachKS.Oestrogenreceptorknockoutmice:roles foroestrogenreceptorsalphaandbetainreproductivetisues [J].Reproduction,2003,125(2): [12] RimoldiG,ChristofelJ.Efectsofchronicgenisteintreatmentin mammarygland,uterus,andvagina[j].environhealthperspect, 2007,115(Suppl1):62-68 新动态 2014 年全球在研新药情况分析 (1) 随着新药开发难度和投入成本的增加以及仿制药市场的蓬勃发展, 选择何种产品开发模式以及投入哪些疾病治疗领域和适应证可以最大限度地降低新药研发风险, 提高产品盈收回报, 成为全球药企关注的焦点通过对国际知名咨询机构 Citeline 公司 Pharmaprojects/Pipeline 数据库的近期数据进行分析, 帮助人们了解全球在研新药的一些新变化, 发现药物研发的新趋势研发规模增加显着最新数据显示, 截至 2014 年 1 月, 全球在研药物数量为个, 与 2013 年的个相比, 同比增幅达 7.9% 各研发阶段新药数量均增加 2014 年各研发阶段中处于活跃研发状态的在研药物数量较 2013 年更多, 并呈现出不同的特点据统计,2014 年处于 Ⅰ 期 Ⅱ 期和 Ⅲ 期临床阶段的药物数量分别为 1541 个 2011 个和 744 个, 同比增幅分别为 6.6% 6.5% 和 7.4%, 处于临床前研究阶段的药物数量为 5484 个, 同比增幅达 7.4% 在这些研发阶段中, 增幅最为明显的是已上市但为增加适应证而处于研发状态的药物,2014 年该类在研药物数量增幅达到了 16.7% 这表明, 越来越多的企业试图通过对已上市产品的后续研发等方式, 来挖掘其品牌产品的潜在价值通常认为, 最具价值的数据应该是处于临床研究阶段的在研药物情况, 因为从这些数据中也可以了解未来几年行业整体发展水平观察 2007~2014 年的数据后不难发现, 在 2013 年的数据统计中, 处于 Ⅰ 期临床研究阶段的在研药物数量首次出现下滑然而庆幸的是,2014 年处于 Ⅰ 期临床研究阶段的在研药物数量已出现恢复性增长数据显示, 与 2007 年相比,2004 年处于 Ⅰ Ⅱ 和 Ⅲ 期临床研究阶段的在研药物数量, 分别增长了 45.3% 47.9% 和 66.9%, 增势明显 ( 中国医药报, 本刊有删改 )

, 2015, 21, (, ), [3-5],,,, (, ), ,,, 1 ( ) ( ),. 0.3% 1 /100 ( 30 / ), 10-15, 3-4, 80 /,,, 2-2.5,,,,,,,,,,,,,, 5,,,. 3,

, 2015, 21, (, ), [3-5],,,, (, ), ,,, 1 ( ) ( ),. 0.3% 1 /100 ( 30 / ), 10-15, 3-4, 80 /,,, 2-2.5,,,,,,,,,,,,,, 5,,,. 3, 774 2015 7 21 7, 2015, 21,.7... :10.3969 /..1006-7108.2015.07.002 *, 723000 : 274.39 : : 1006-7108(2015) 07-0774-06 : 40 3,20,20 3 7,, (