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- 淯烨 裘
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1 药 学 学 报 Acta Pharmaceutica Sinica 2012, 47 (12): 一 测 多 评 中 待 测 成 分 校 正 和 定 位 的 新 方 法 研 究 何 兵 1, 杨 世 艳 2*, 张 燕 3 ( 泸 州 医 学 院 1. 药 物 研 究 中 心, 2. 附 属 中 医 医 院, 3. 附 属 医 院, 四 川 泸 州 ) 摘 要 : 研 究 一 测 多 评 中 待 测 成 分 的 一 种 新 的 校 正 模 式 和 色 谱 峰 定 位 方 法, 以 双 黄 连 口 服 液 为 研 究 对 象, 采 用 3 种 校 正 方 法 ( 多 点 校 正 斜 率 校 正 定 量 因 子 校 正 ) 建 立 双 黄 连 口 服 液 中 绿 原 酸 与 11 个 活 性 成 分 ( 新 绿 原 酸 隐 绿 原 酸 咖 啡 酸 连 翘 酯 苷 A 野 黄 芩 苷 异 绿 原 酸 B 异 绿 原 酸 A 异 绿 原 酸 C 黄 芩 苷 连 翘 苷 及 汉 黄 芩 苷 ) 之 间 的 相 对 校 正 因 子, 同 时 采 用 线 性 回 归 法 定 位 色 谱 峰, 实 现 只 用 一 个 对 照 品 测 定 双 黄 连 口 服 液 中 12 个 成 分 的 含 量 结 果 表 明 在 一 定 线 性 范 围 内, 以 3 种 校 正 方 式 所 得 校 正 因 子 计 算 结 果 与 外 标 法 或 线 性 回 归 法 并 无 显 著 性 差 异, 且 该 法 更 简 便 快 捷 结 果 准 确 可 靠 具 有 良 好 的 重 现 性 而 线 性 回 归 法 定 位 色 谱 峰 比 文 献 采 用 相 对 保 留 时 间 更 准 确 用 斜 率 和 定 量 因 子 校 正 控 制 中 药 质 量 的 方 法 可 行 且 结 果 准 确 关 键 词 : 相 对 校 正 因 子 ; 多 点 校 正 ; 斜 率 校 正 ; 定 量 因 子 校 正 ; 双 黄 连 口 服 液 中 图 分 类 号 : R917 文 献 标 识 码 : A 文 章 编 号 : (2012) A new method of calibration and positioning in quantitative analysis of multicomponents by single marker HE Bing 1, YANG Shi-yan 2*, ZHANG Yan 3 (1. Center of Drug Research, Luzhou Medical College, Luzhou , China; 2. Hospital (T.C.M.) Affiliated to Luzhou Medical College, Luzhou , China; 3. Affiliated Hospital of Luzhou Medical College, Luzhou , China) Abstract: This paper aims to establish a new method of calibration and positioning in quantitative analysis of multicomponents by single marker (), using Shuanghuanglian oral liquid as the research object. Establishing relative correction factors with reference chlorogenic acid to other 11 active components (neochlorogenic acid, cryptochlorogenic acid, cafferic acid, forsythoside A, scutellarin, isochlorogenic acid B, isochlorogenic acid A, isochlorogenic acid C, baicalin and phillyrin wogonoside) in Shuanghuanglian oral liquid by 3 correction methods (multipoint correction, slope correction and quantitative factor correction). At the same time chromatographic peak was positioned by linear regression method. Only one standard uas used to determine the content of 12 components in Shuanghuanglian oral liquid, in stead of needing too many reference substance in quality control. The results showed that within the linear ranges, no significant differences were found in the quantitative results of 12 active constituents in 3 batches of Shuanghuanglian oral liquid determined by 3 correction methods and external standard method (ESM) or standard curve method (SCM). And this method is simpler and quicker than literature methods. The results were accurate and reliable, and had good reproducibility. While the positioning chromatographic peaks by linear regression method was more accurate than relative retention time in literature. The slope and the quantitative factor correction controlling the quality of Chinese traditional medicine is feasible and accurate. Key words: relative correction factor; multipoint correction; slope correction; quantitative factor correction; Shuanghuanglian oral liquid 收 稿 日 期 : ; 修 回 日 期 : 基 金 项 目 : 泸 州 市 重 点 科 技 项 目 ( 泸 市 财 企 [2010]41 号 ); 泸 州 医 学 院 青 年 基 金 资 助 项 目 ( 泸 医 院 [2010]108 号 ). * 通 讯 作 者 Tel: , lyhb2008@126.com
2 1654 药 学 学 报 Acta Pharmaceutica Sinica 2012, 47 (12): 目 前 中 药 质 量 标 准 研 究 逐 渐 向 指 纹 图 谱 和 多 指 标 成 分 同 时 检 测 发 展 [1], 这 也 是 中 药 走 向 国 际 的 必 然 然 而 在 多 指 标 质 量 控 制 模 式 中, 需 要 对 照 品 的 种 类 和 量 比 较 大, 且 部 分 对 照 品 价 格 较 昂 贵 供 应 量 较 [2] 少 王 智 民 等 提 出 了 一 测 多 评 的 多 指 标 质 控 模 式, 即 在 多 指 标 质 量 控 制 时, 利 用 中 药 有 效 成 分 内 在 函 数 关 系 和 比 例 关 系, 以 药 材 中 对 照 品 廉 价 易 得 的 典 型 成 分 为 内 标, 建 立 该 成 分 与 其 他 成 分 间 的 相 对 校 正 因 子, 再 通 过 校 正 因 子 同 步 计 算 出 其 他 成 分 的 含 量 在 方 法 实 施 时, 可 在 只 有 一 个 对 照 品 的 情 况 下, 实 现 这 些 成 分 的 同 步 含 量 测 定, 并 成 功 应 用 于 白 芷 丹 参 三 黄 片 赤 芍 田 基 黄 淫 羊 藿 连 翘 黄 芩 黄 连 人 参 和 三 七 等 药 材 的 质 量 控 制 [3, 4], 其 中 黄 连 药 材 的 一 测 多 评 方 法 被 2010 年 版 中 国 药 典 采 用 [5] [3, 4] 文 献 在 计 算 校 正 因 子 时, 普 遍 采 用 多 点 校 正, 实 验 发 现 采 用 标 准 曲 线 斜 率 校 正, 以 及 由 此 衍 生 出 来 的 定 量 因 子 校 正 将 更 为 快 捷, 其 结 果 并 无 显 著 差 异 由 于 不 同 实 验 室 仪 器 和 色 谱 柱 差 异 较 大, 导 致 保 留 时 间 出 现 漂 移, 文 献 普 遍 采 用 相 对 保 留 时 间 或 保 留 时 间 差 定 位 色 谱 峰, 但 有 些 结 果 可 能 出 现 较 大 偏 差, 实 验 以 线 性 回 归 法 定 位 色 谱 峰, 其 准 确 度 获 得 明 显 改 善 实 验 采 用 双 黄 连 口 服 液 为 研 究 对 象, 以 绿 原 酸 为 参 照 物, 采 用 3 种 校 正 方 法 建 立 其 与 新 绿 原 酸 隐 绿 原 酸 咖 啡 酸 异 绿 原 酸 A 异 绿 原 酸 B 异 绿 原 酸 C 黄 芩 苷 汉 黄 芩 苷 连 翘 苷 及 连 翘 酯 苷 A 之 间 的 相 对 校 正 因 子, 并 计 算 各 成 分 含 量, 同 时 采 用 外 标 法 和 线 性 回 归 法 同 步 测 定, 验 证 一 测 多 评 法 得 到 结 果 的 准 确 性 和 可 靠 性 材 料 与 方 法 仪 器 试 剂 与 药 品 DIONEX 高 效 液 相 色 谱 仪 ( 包 括 P680A 四 元 梯 度 泵, PDA-100 二 极 管 阵 列 检 测 器, TCC-100 柱 温 箱 和 Chromeleon 色 谱 工 作 站 ) Agilent 1100 高 效 液 相 色 谱 仪 ( 包 括 G1311A 四 元 泵 G1313A 自 动 进 样 器 G1315B 二 极 管 阵 列 检 测 器 G1316A 柱 温 箱 和 Agilent ChemStation 工 作 站 ) 色 谱 柱 : AkzoNobel Kromasil C 18, 绿 百 草 Kromasil C 18, 菲 罗 门 Luna C 18 (2), 迪 马 Platisil ODS ( 均 为 250 mm 4.6 mm, 5 µm) 新 绿 原 酸 ( 批 号 , neochlorogenic acid, NCA) 绿 原 酸 ( 批 号 , chlorogenic acid, CA) 隐 绿 原 酸 ( 批 号 , cryptochlorogenic acid, CCA) 咖 啡 酸 ( 批 号 , cafferic acid, CFA) 异 绿 原 酸 A ( 批 号 , isochlorogenic acid A, ICA A) 异 绿 原 酸 B ( 批 号 , isochlorogenic acid B, ICA B) 异 绿 原 酸 C ( 批 号 , isochlorogenic acid C, ICA C) 均 由 成 都 普 瑞 法 有 限 公 司 提 供 黄 芩 苷 ( 批 号 , baicalin, BC) 汉 黄 芩 苷 ( 批 号 , wogonoside, WG) 野 黄 芩 苷 ( 批 号 , scutellarin, ST) 连 翘 苷 ( 批 号 , phillyrin, PR) 连 翘 酯 苷 A ( 批 号 , forsythoside A, FT A) 由 成 都 曼 思 特 生 物 科 技 有 限 公 司 提 供 所 有 对 照 品 经 HPLC 峰 面 积 归 一 化 法 检 测 纯 度 均 在 98% 以 上 双 黄 连 口 服 液 [ 规 格 : 10 ml, 哈 药 集 团 三 精 制 药 股 份 有 限 公 司 生 产 (Sanchine), 批 号 为 ; 南 阳 新 生 制 药 有 限 公 司 生 产 (Xinsheng), 批 号 为 ; 河 南 太 龙 药 业 股 份 有 限 公 司 (Taloph), 批 号 为 ] 混 合 对 照 品 溶 液 的 制 备 分 别 精 密 称 取 新 绿 原 酸 绿 原 酸 隐 绿 原 酸 咖 啡 酸 连 翘 酯 苷 A 野 黄 芩 苷 异 绿 原 酸 B 异 绿 原 酸 A 异 绿 原 酸 C 黄 芩 苷 连 翘 苷 及 汉 黄 芩 苷 对 照 品 适 量, 以 75% 甲 醇 溶 解 并 定 容, 制 成 质 量 浓 度 分 别 为 新 绿 原 酸 mg ml 1 绿 原 酸 mg ml 1 隐 绿 原 酸 mg ml 1 咖 啡 酸 mg ml 1 连 翘 酯 苷 A mg ml 1 野 黄 芩 苷 mg ml 1 异 绿 原 酸 B mg ml 1 异 绿 原 酸 A mg ml 1 异 绿 原 酸 C mg ml 1 黄 芩 苷 mg ml 1 连 翘 苷 mg ml 1 及 汉 黄 芩 苷 mg ml 1 的 混 合 对 照 品 储 备 液, 分 别 精 密 吸 取 和 5 ml, 置 25 ml 量 瓶 中, 以 75% 甲 醇 定 容 得 系 列 混 合 对 照 品 溶 液, 避 光 保 存 供 试 品 溶 液 的 制 备 精 密 吸 取 本 品 1.0 ml, 置 10 ml 棕 色 量 瓶 中, 加 75% 甲 醇 定 容, 以 0.45 µm 微 孔 滤 膜 过 滤 即 得 阴 性 对 照 溶 液 的 制 备 按 双 黄 连 口 服 液 样 品 制 备 方 法, 制 得 不 含 金 银 花 药 材 黄 芩 药 材 和 连 翘 药 材 的 空 白 对 照 品 溶 液, 按 供 试 品 溶 液 的 制 备 方 法 配 制 空 白 对 照 溶 液 色 谱 条 件 色 谱 柱 为 AkzoNobel Kromasil C 18 (250 mm 4.6 mm, 5 µm); 流 动 相 为 乙 腈 (A) 0.1% 磷 酸 水 溶 液 (B), 梯 度 洗 脱 0~30 min, 10%~35% A; 30~40 min, 35% ~80% A; 流 速 1.0 ml min 1 ; 分 段 变 波 长 测 定, 0~22 min 为 326 nm, 22~26 min 为 229 nm, 26~40 min 为 275 nm; 柱 温 30 ; 进 样 量 10 µl 线 性 与 范 围 分 别 精 密 吸 取 系 列 浓 度 的 混 合 对 照 品 溶 液 10 µl, 注 入 液 相 色 谱 仪, 记 录 色 谱 图 以 峰 面 积 (A) 为 纵 坐 标, 对 照 品 质 量 (C, µg) 为 横 坐 标, 绘 制 标 准 曲 线 同 系 列 对 照 品 制 备 方 法 逐 级 稀
3 何 兵 等 : 一 测 多 评 中 待 测 成 分 校 正 和 定 位 的 新 方 法 研 究 1655 释, 分 别 以 信 噪 比 3 和 10 考 察 检 测 限 和 定 量 限 精 密 度 取 同 一 混 合 对 照 品 溶 液, 连 续 进 样 6 次, 记 录 各 组 分 峰 面 积 稳 定 性 取 同 一 供 试 品 溶 液, 分 别 于 制 备 后 和 36 h 注 入 液 相 色 谱 仪, 记 录 各 组 分 峰 面 积 重 复 性 取 批 号 为 的 样 品, 制 备 6 份 供 试 品 溶 液, 进 样 分 析, 计 算 新 绿 原 酸 绿 原 酸 隐 绿 原 酸 咖 啡 酸 连 翘 酯 苷 A 野 黄 芩 苷 异 绿 原 酸 B 异 绿 原 酸 A 异 绿 原 酸 C 黄 芩 苷 连 翘 苷 及 汉 黄 芩 苷 平 均 含 量 及 RSD 回 收 率 精 密 吸 取 批 号 为 已 知 含 量 的 双 黄 连 口 服 液 9 份, 每 份 0.5 ml, 分 成 3 组, 每 组 3 份, 分 别 精 密 添 加 含 新 绿 原 酸 mg ml 1 绿 原 酸 mg ml 1 隐 绿 原 酸 mg ml 1 咖 啡 酸 mg ml 1 连 翘 酯 苷 A mg ml 1 野 黄 芩 苷 mg ml 1 异 绿 原 酸 B mg ml 1 异 绿 原 酸 A mg ml 1 异 绿 原 酸 C mg ml 1 黄 芩 苷 mg ml 1 连 翘 苷 mg ml 1 及 汉 黄 芩 苷 mg ml 1 的 混 合 对 照 品 溶 液 ml, 制 备 供 试 品 溶 液, 进 样 分 析, 并 分 别 计 算 回 收 率 耐 用 性 分 别 考 察 流 动 相 各 梯 度 点 比 例 变 化 ± 5% 水 相 ph 值 变 化 ± 0.2 柱 温 变 化 ± 5 检 测 波 长 变 化 ± 5 nm 流 速 变 化 ± 20% 以 及 采 用 3 根 不 同 色 谱 柱 AkzoNobel Kromasil C 18, 绿 百 草 Kromasil C 18, 菲 罗 门 Luna C 18 ( 均 为 250 mm 4.6 mm, 5 µm) 进 行 测 定 时, 仪 器 色 谱 行 为 的 变 化 检 测 同 一 批 双 黄 连 口 服 液 中 12 种 成 分 的 含 量 及 RSD, 并 考 察 其 分 离 度 拖 尾 因 子 和 理 论 塔 板 数 校 正 因 子 计 算 方 法 多 点 校 正 法 [3, 4] 参 照 文 献 以 多 个 浓 度 点 计 算 所 得 的 校 正 因 子 的 平 均 值 作 为 相 对 校 正 因 子 校 正 因 子 计 算 公 式 为 : f k/s = (C s A k ) / (C k A s ) 待 测 成 分 浓 度 计 算 公 式 为 : C k = (C s A k ) / (f k/s A s ) 两 式 中 f k/s : 校 正 因 子 ; C s : 参 照 物 质 浓 度 ; A s : 参 照 物 质 峰 面 积 ; C k : 其 他 对 照 组 分 浓 度 ; A k : 其 他 对 照 组 分 峰 面 积 ; C k : 待 测 组 分 浓 度 ; A k : 待 测 组 分 峰 面 积 应 用 此 法 需 先 获 得 一 个 参 照 物 的 浓 度 C s 和 峰 面 积 值 A s 斜 率 校 正 法 在 标 准 曲 线 A = ac + b 中, C = (A b) / a = A/a b/a, 由 于 b 值 通 常 为 误 差 引 起, 在 a/b 值 大 于 100 时, b/a 值 可 以 忽 略 不 计, 此 时 可 以 C = A/a 直 接 计 算 含 量 故 校 正 因 子 可 以 二 者 的 斜 率 a 之 比 直 接 计 算, 校 正 因 子 计 算 公 式 为 : f k/s = a k /a s, 即 可 以 参 照 物 快 速 推 算 其 余 待 测 化 学 成 分 的 含 量, 计 算 公 式 为 : C k = A k / (a s f k/s ) 式 中 a s : 参 照 物 斜 率 ; a k : 其 他 对 照 组 分 斜 率 应 用 此 法 需 先 建 立 参 照 物 的 标 准 曲 线 获 得 斜 率 a s 定 量 因 子 校 正 法 在 公 式 C k = A k / (a s f k/s ) 中, 当 在 同 一 实 验 室, 同 一 仪 器, 同 一 色 谱 条 件 时, 特 别 是 大 量 样 品 短 期 内 复 检 时, 由 于 a s 基 本 一 致, f k/s 也 是 固 定 值, 故 可 先 以 公 式 a k = a s f k/s 推 算 出 定 量 因 子 QF: a k, 直 接 以 待 测 样 品 峰 面 积 A k 即 可 快 速 推 测 其 含 量 计 算 公 式 为 : C k = A k / a k 应 用 此 法 需 先 获 得 a s 值, 并 保 证 a s 值 恒 定 定 量 因 子 a k 仅 对 同 一 仪 器 在 相 同 色 谱 条 件 短 期 内 保 持 恒 定, 不 同 仪 器 应 分 别 建 立 另 外 定 量 因 子 计 算 所 用 校 正 因 子 为 斜 率 校 正 法 所 得, 故 其 计 算 结 果 与 斜 率 校 正 法 一 致 色 谱 峰 定 位 方 法 [6] 王 龙 星 等 通 过 色 谱 热 力 学 分 析 发 现, 在 相 同 的 分 析 条 件 下, 即 使 采 用 不 同 的 液 相 色 谱 系 统 或 不 同 的 色 谱 柱, 组 分 的 保 留 时 间 存 在 简 单 的 线 性 关 系 采 用 已 有 的 5 个 对 照 品 做 内 标, 并 计 算 其 线 性 方 程 参 考 其 原 理, 假 设 5 个 点 均 落 在 线 性 方 程 上, 那 么 用 2 个 点 的 结 果 与 5 个 点 基 本 一 致 采 用 绿 原 酸 和 黄 芩 苷 两 点 校 正, 推 导 其 校 正 方 程, 利 用 该 校 正 方 程 可 以 快 速 推 测 各 成 分 理 论 出 峰 时 间, 快 速 定 位 色 谱 峰 通 过 该 法 计 算 出 理 论 出 峰 时 间 后, 若 该 色 谱 峰 临 近 还 有 其 他 色 谱 峰, 再 根 据 紫 外 吸 收 光 谱 整 体 峰 形 或 峰 面 积 百 分 比, 即 能 够 在 一 定 程 度 上 准 确 定 位 色 谱 峰 统 计 学 分 析 方 法 一 测 多 评 法 与 常 规 法 的 结 果 比 较, Pearson 相 关 系 数 方 差 分 析 及 t 检 验 结 果 1 分 析 方 法 验 证 1.1 系 统 适 应 性 及 专 属 性 实 验 新 绿 原 酸 绿 原 酸 隐 绿 原 酸 咖 啡 酸 连 翘 酯 苷 A 野 黄 芩 苷 异 绿 原 酸 B 异 绿 原 酸 A 异 绿 原 酸 C 黄 芩 苷 连 翘 苷 及 汉 黄 芩 苷 与 其 相 邻 色 谱 峰 的 分 离 度 均 大 于 1.5, 拖 尾 因 子 在 0.97~1.10 之 间, 理 论 塔 板 数 以 各 色 谱 峰 计 均 在 以 上 阴 性 对 照 在 相 应 位 置 处 未 见 色 谱 峰, 方 法 专 属 性 良 好 对 照 品 样 品 及 阴 性 对 照 HPLC 图 见 图 线 性 与 范 围 12 个 对 照 品 质 量 (C, μg) 与 对 应 的 色 谱 峰 面 积 (A) 线 性 回 归 方 程, 线 性 范 围 检 测 限 和 定 量 限 见 表 精 密 度 实 验 新 绿 原 酸 绿 原 酸 隐 绿 原 酸 咖 啡 酸 连 翘 酯 苷 A 野 黄 芩 苷 异 绿 原 酸 B 异 绿
4 1656 药 学 学 报 Acta Pharmaceutica Sinica 2012, 47 (12): Figure 1 HPLC chromatograms of Shuanghuanglian oral liquid. A: Mixed reference substances; B: Sample; C: Negative sample without HoneySuchle Flowers; D: Negative sample without Radix Scutellariae; E: Negative sample without Fructus Forsythiae; 1: Neochlorogenic acid (NCA); 2: Chlorogenic acid (CA); 3: Cryptochlorogenic acid (CCA); 4: Cafferic acid (CFA); 5: Forsythiaside A (FT A); 6: Scutellarin (ST); 7: Isochlorogenic acid B (ICA B); 8: Isochlorogenic acid A (ICA A); 9: Isochlorogenic acid C (ICA C); 10: Baicalin (BC); 11: Phillyrin (PR); 12: Wogonoside (WG) Table 1 Results of linear equations of 12 components Analyte Regression equation R Linear range/µg LOD/ng LOQ/ng NCA A = C CA A = C CCA A = C CFA A = C FT A A = C ST A = C ICA B A = C ICA A A = C ICA C A = C BC A = C PR A = C WG A = C
5 何 兵 等 : 一 测 多 评 中 待 测 成 分 校 正 和 定 位 的 新 方 法 研 究 1657 原 酸 A 异 绿 原 酸 C 黄 芩 苷 连 翘 苷 及 汉 黄 芩 苷 峰 面 积 RSD 分 别 为 0.32% 0.21% 0.39% 0.45% 0.35% 0.46% 0.41% 0.49% 0.33% 0.19% 0.37% 和 0.43% (n = 6), 表 明 仪 器 精 密 度 良 好 1.4 稳 定 性 实 验 新 绿 原 酸 绿 原 酸 隐 绿 原 酸 咖 啡 酸 连 翘 酯 苷 A 野 黄 芩 苷 异 绿 原 酸 B 异 绿 原 酸 A 异 绿 原 酸 C 黄 芩 苷 连 翘 苷 及 汉 黄 芩 苷 峰 面 积 RSD 分 别 为 0.96% 0.83% 0.89% 1.13% 1.02% 1.47% 1.19% 1.23% 1.07% 0.93% 1.39% 1.65% (n = 6), 表 明 供 试 品 溶 液 在 36 h 内 稳 定 1.5 重 复 性 实 验 新 绿 原 酸 绿 原 酸 隐 绿 原 酸 咖 啡 酸 连 翘 酯 苷 A 野 黄 芩 苷 异 绿 原 酸 B 异 绿 原 酸 A 异 绿 原 酸 C 黄 芩 苷 连 翘 苷 及 汉 黄 芩 苷 平 均 含 量 (n = 6) 分 别 为 mg ml 1, RSD 分 别 为 0.76% 0.63% 0.69% 0.97% 0.88% 1.15% 0.93% 1.06% 0.98% 0.59% 0.75% 0.99% (n = 6), 表 明 本 法 重 复 性 良 好 1.6 回 收 率 实 验 新 绿 原 酸 绿 原 酸 隐 绿 原 酸 咖 啡 酸 连 翘 酯 苷 A 野 黄 芩 苷 异 绿 原 酸 B 异 绿 原 酸 A 异 绿 原 酸 C 黄 芩 苷 连 翘 苷 及 汉 黄 芩 苷 回 收 率 分 别 为 98.45% 99.33% 98.89% 98.25% 98.57% 97.90% 98.44% 97.72% 98.34% 99.10% 98.68% 98.02% RSD 分 别 为 1.03% 0.96% 0.92% 1.05% 1.26% 1.21% 1.17% 1.28% 1.09% 0.94% 0.93% 1.05% (n = 9) 表 明 本 法 具 有 良 好 的 回 收 率 1.7 耐 用 性 实 验 各 条 件 下 所 测 含 量 的 RSD < 1.83%, 分 离 效 果 理 想 因 此, 双 黄 连 口 服 液 中 的 12 个 活 性 成 分 含 量 测 定 条 件 较 宽, 具 有 较 好 的 耐 用 性 2 校 正 因 子 的 计 算 2.1 多 点 校 正 法 结 果 见 表 斜 率 校 正 法 及 定 量 因 子 校 正 法 结 果 见 表 3 标 准 曲 线 中 各 成 分 的 斜 率 值 实 际 上 就 是 其 定 量 因 子, 而 斜 率 值 实 际 上 也 是 其 紫 外 吸 收 系 数, 或 在 1 mg ml 1 浓 度 下, 进 样 量 为 10 µl 的 峰 面 积 值 如 绿 原 酸 的 标 准 曲 线 为 A = C , 将 C 单 位 由 µg 改 为 mg ml 1, 则 标 准 曲 线 为 A = C , 而 绿 原 酸 的 紫 外 吸 收 系 数 为 既 是 1 mg ml 1 下 进 样 10 µl 的 峰 面 积 值, 也 是 其 紫 外 吸 收 系 数 3 校 正 因 子 重 现 性 考 察 实 验 考 察 了 不 同 实 验 室 的 两 套 色 谱 系 统 (Dionex P680 和 Agilent 1100) 及 不 同 的 色 谱 柱 (Kromasil C 18, Luna C 18, Platisil, 均 为 250 mm 4.6 mm, 5 μm) 对 校 正 因 子 的 影 响, 结 果 其 RSD < 2.89% 表 明 相 对 校 正 因 子 在 不 同 实 验 室 不 同 色 谱 系 统 和 不 同 色 谱 柱 下 具 有 良 好 的 重 现 性 4 待 测 组 分 色 谱 峰 的 定 位 文 献 在 色 谱 峰 的 定 位 中, 普 遍 采 用 相 对 保 留 时 间 定 位 的 方 法 实 验 发 现, 在 相 同 色 谱 条 件 下, 不 同 类 型 色 谱 柱, 其 相 对 保 留 时 间 有 的 差 异 较 小, 但 有 些 差 异 较 大, 特 别 是 距 参 照 峰 绿 原 酸 较 远 的 汉 黄 芩 苷, 采 用 绿 百 草 Kromasil 菲 罗 门 Luna 及 迪 马 Platisil 与 AkzoNobel Kromasil 分 离 其 相 对 保 留 时 间 RSD 分 别 为 6.11% 6.54% 和 19.51% 在 这 种 情 况 下, 利 用 相 对 保 留 时 间 很 难 准 确 定 位 可 见 该 法 仅 用 于 相 同 填 料 或 色 谱 行 为 极 为 相 似 的 色 谱 柱 Table 2 Relative correction factors with reference to chlorogenic acid at different wavelengths by multi-point correction Volume/µL NCA CA CCA CFA FT A ST ICA B ICA A ICA C BC PR WG x RSD/% Table 3 Relative correction factors and relative quantitative factors with reference to chlorogenic acid at different wavelengths by slope correction Analyte NCA CA CCA CFA FT A ST ICA B ICA A ICA C BC PR WG λ/nm RCF QF
6 1658 药 学 学 报 Acta Pharmaceutica Sinica 2012, 47 (12): 采 用 王 龙 星 提 出 的 方 法, 建 立 各 待 测 成 分 保 留 时 间 校 正 方 程, 计 算 其 理 论 保 留 时 间, 并 考 察 不 同 实 验 室 不 同 仪 器 不 同 色 谱 柱 之 间 的 差 异, 结 果 除 新 绿 原 酸 稍 大 外 ( 新 绿 原 酸 各 条 件 下 相 对 保 留 时 间 均 为 0.73), 其 余 保 留 时 间 RSD 普 遍 在 2% 以 内, 上 述 汉 黄 芩 苷 的 保 留 时 间 RSD 分 别 为 0.11% 0.01% 0.06%, 最 大 的 为 Platisil 分 离 的 异 绿 原 酸 A, 为 3.36% 而 在 不 同 实 验 室, 汉 黄 芩 苷 保 留 时 间 的 RSD 仍 能 保 持 在 0.08% 左 右, 而 随 着 线 性 方 程 选 点 数 的 增 加, 所 有 保 留 时 间 RSD 均 能 降 到 2% 以 内 通 过 理 论 保 留 时 间 和 实 测 保 留 时 间 的 比 较, 再 根 据 紫 外 吸 收 光 谱 整 体 峰 形 或 峰 面 积 百 分 比, 即 能 够 在 一 定 程 度 上 准 确 定 位 色 谱 峰 5 一 测 多 评 法 与 常 规 法 结 果 的 比 较 研 究 分 别 精 密 吸 取 对 照 品 溶 液 和 供 试 品 溶 液 进 样 分 析, 记 录 新 绿 原 酸 绿 原 酸 隐 绿 原 酸 咖 啡 酸 连 翘 酯 苷 A 野 黄 芩 苷 异 绿 原 酸 B 异 绿 原 酸 A 异 绿 原 酸 C 黄 芩 苷 连 翘 苷 及 汉 黄 芩 苷 的 峰 面 积, 分 别 用 线 性 回 归 法 外 标 法 和 3 种 一 测 多 评 法 计 算 其 含 量, 结 果 见 表 4 为 确 认 一 测 多 评 的 准 确 性, 将 5 种 方 法 计 算 结 果 经 Pearson 相 关 系 数 分 析, 结 果 5 种 方 法 之 间 及 5 种 方 法 与 其 平 均 值 之 间 的 相 关 系 数 均 大 于 , 说 明 5 种 方 法 得 到 的 含 量 相 似 性 极 高 再 从 含 量 之 间 的 相 对 误 差 来 看, 均 在 3% 以 内 同 时 经 方 差 分 析 或 两 两 之 间 t 检 验, P 值 远 大 于 0.05, 说 明 5 种 方 法 计 算 结 果 并 无 显 著 性 差 异 可 见 斜 率 校 正 和 定 量 因 子 校 正 在 中 药 多 指 标 成 分 质 量 评 价 中 的 应 用 是 可 行 的 讨 论 对 于 校 正 因 子 的 计 算, 文 献 普 遍 采 用 多 点 校 正, 求 平 均 值 的 方 法, 但 其 有 个 弊 端, 如 果 有 一 两 个 点 有 较 大 偏 差 ( 特 别 是 第 一 个 和 最 后 一 个 点 ), 其 会 影 响 整 个 平 均 值, 从 而 导 致 计 算 值 有 一 定 偏 差 而 采 用 标 准 曲 线 斜 率 之 比 计 算 校 正 因 子, 即 使 有 几 个 点 有 较 大 偏 差, 其 对 整 个 标 准 曲 线 斜 率 影 响 不 大, 相 对 多 点 校 正 更 科 学 合 理 另 外 斜 率 校 正 无 需 逐 个 浓 度 计 算 校 正 因 子 求 平 均 值, 直 接 以 标 准 曲 线 斜 率 计 算, 相 对 更 快 捷 而 从 表 4 可 见, 二 者 所 计 算 的 结 果 并 无 显 著 差 异 定 量 因 子 计 算 所 用 校 正 因 子 为 斜 率 校 正 法 所 得, 故 其 计 算 结 果 与 斜 率 校 正 法 一 致 由 于 相 同 浓 度 参 照 物 于 不 同 实 验 室 不 同 仪 器 其 峰 面 积 有 一 定 差 异, 特 别 是 不 同 仪 器 峰 面 积 计 算 方 式 不 一 致, 从 而 导 致 定 量 因 子 出 现 一 定 差 异, 故 定 量 因 子 每 台 仪 器 需 单 独 建 立 但 在 同 一 实 验 室, 同 一 仪 器, 同 一 色 谱 条 件, 特 别 是 大 量 样 品 短 期 内 复 检 时, 由 于 a s 基 本 恒 定, 定 量 因 子 计 算 含 量 非 常 快 捷 有 效 HPLC 定 量 方 法 中 一 般 以 线 性 回 归 法 计 算 结 果 最 为 准 确, 当 标 准 曲 线 的 a/b 值 大 于 100 时, 可 采 用 外 标 一 点 法 计 算 含 量, 外 标 法 也 是 应 用 最 为 普 遍 的 定 量 方 法 当 外 标 法 所 选 的 浓 度 点 越 接 近 标 准 曲 线, 则 二 者 含 量 计 算 结 果 越 接 近 而 一 测 多 评 法 ( 斜 率 校 正 及 定 量 因 子 校 正 ) 实 际 上 是 舍 弃 标 准 曲 线 中 截 距 的 计 算 结 果, 只 要 a/b 值 越 大, 则 二 者 含 量 计 算 结 果 越 接 近 一 测 多 评 法 ( 多 点 校 正 ) 则 要 求 每 个 浓 度 点 均 尽 量 落 在 标 准 曲 线 附 近, 特 别 是 最 低 和 最 高 浓 度 点, 即 所 得 校 正 因 子 不 宜 相 差 太 大, 不 然 会 导 致 平 均 Table 4 Determination results of 12 components in Shuanghuanglian oral liquid (n = 3, RSD < 3%, mg ml 1 ) Analyte ESM Sanchine ( ) Xinsheng (100604) Taloph ( ) SCM (MPC) (SC) (QFC) ESM SCM (MPC) (SC) (QFC) ESM SCM (MPC) NCA CA CCA CFA FT A ST ICA B ICA A ICA C BC PR WG (SC) (QFC)
7 何 兵 等 : 一 测 多 评 中 待 测 成 分 校 正 和 定 位 的 新 方 法 研 究 1659 值 出 现 较 大 偏 差, 从 而 影 响 计 算 结 果 一 测 多 评 中 色 谱 峰 的 定 位, 文 献 均 采 用 相 对 保 留 时 间 或 保 留 时 间 差 定 位 的 方 法, 但 在 实 验 中 发 现, 随 着 各 色 谱 峰 保 留 时 间 远 离 参 照 峰 绿 原 酸, 其 相 对 保 留 时 间 RSD 逐 渐 增 大, 甚 至 超 过 5%, 而 保 留 时 间 差 波 动 更 大 在 这 种 情 况 下, 利 用 相 对 保 留 时 间 很 难 准 确 定 位 实 验 采 用 线 性 回 归 法, 以 参 照 峰 绿 原 酸 和 另 一 易 辨 认 色 谱 高 峰 黄 芩 苷 的 保 留 时 间 推 导 校 正 方 程, 采 用 该 法 可 快 速 准 确 定 位 色 谱 峰, 经 校 正 后, 理 论 保 留 时 间 和 实 测 保 留 时 间 无 明 显 差 异, 其 RSD 除 新 绿 原 酸 稍 大 外, 其 余 均 低 于 5%, 得 到 明 显 改 善 如 原 装 Kromasil 和 Platisil 分 离 的 汉 黄 芩 苷, 校 正 前 其 相 对 保 留 时 间 RSD 为 19.51%, 校 正 后 为 0.06% 对 于 新 绿 原 酸, 由 于 其 出 峰 时 间 短, 反 而 不 适 合 该 法 未 校 正 前, 其 相 对 保 留 时 间 均 为 0.73, 故 新 绿 原 酸 可 单 独 采 用 相 对 保 留 时 间 校 正 在 一 测 多 评 的 应 用 中, 应 注 意 只 有 当 每 个 色 谱 峰 的 测 定 都 免 除 了 干 扰 的 情 况 下 本 方 法 才 能 适 用, 不 然 会 导 致 计 算 结 果 出 现 误 差 以 斜 率 校 正 的 一 测 多 评 法 在 中 药 多 指 标 成 分 检 测 中 可 进 一 步 推 广 应 用, 从 文 中 可 见, 只 要 获 得 对 照 品 斜 率 之 比, 即 可 以 一 现 有 成 分 斜 率 快 速 推 算 其 余 成 分 的 含 量, 而 对 照 品 的 斜 率 ( 吸 收 系 数 ) 之 比 往 往 可 以 从 文 献 中 快 速 查 得 但 此 时 应 尽 量 保 证 色 谱 条 件 与 文 献 尽 量 一 致, 特 别 是 测 定 波 长 另 外 需 注 意 所 参 照 文 献 数 据 具 有 可 靠 性 实 验 中 发 现, 虽 采 用 近 似 色 谱 条 件, 但 某 些 成 分 斜 率 之 比 往 往 同 部 分 文 献 有 一 定 差 异, 这 主 要 由 以 下 原 因 造 成 : 对 照 品 生 产 厂 商 与 批 次 不 一 致, 导 致 其 纯 度 不 一 致 ; 对 照 品 放 置 时 间 不 一 致, 降 解 不 一 致, 导 致 其 纯 度 不 一 致 ( 应 注 意 某 些 对 照 品 即 使 降 解 了 也 不 一 定 会 多 出 色 谱 峰 ); 不 同 实 验 室 天 平 精 度 不 一 致, 以 及 人 为 的 称 量 误 差 导 致 单 位 浓 度 峰 面 积 不 一 致 ; 色 谱 条 件 特 别 是 测 定 波 长 不 一 致, 导 致 峰 面 积 不 一 致 ; 每 台 仪 器 自 身 的 精 度 氘 灯 能 量 等 不 尽 相 同 均 会 导 致 斜 率 之 比 不 一 致 故 若 以 参 照 文 献 斜 率 之 比 推 算 含 量, 可 获 得 粗 略 估 算 结 果, 在 尽 量 排 除 上 述 误 差 的 情 况 下 可 获 得 较 准 确 的 计 算 结 果, 若 以 自 身 建 立 的 斜 率 之 比 则 可 获 得 精 确 计 算 结 果 可 见 斜 率 校 正 的 一 测 多 评 法 在 中 药 多 指 标 成 分 检 测 中 具 有 广 阔 的 适 用 性 和 应 用 前 景 References [1] Zhang P, Yang Y, Yan D, et al. Application of multi-target ingredients determination and fingerprint analysis in preparation and quality control of Chinese medicine [J]. China J Tradit Chin Med Pharm ( 中 华 中 医 药 杂 志 ), 2010, 25: [2] Wang ZM, Gao HM, Fu XT, et al. Multi-components quantitation by one marker new method for quality evaluation of Chinese herbal medicine [J]. China J Chin Mater Med ( 中 国 中 药 杂 志 ), 2006, 31: [3] He FC, Li SX, Zhao ZQ, et al. Simultaneous quantitative analysis of four lignanoids in Schisandra chinensis by quantitative analysis of multi-components by single marker [J]. Acta Pharm Sin ( 药 学 学 报 ), 2012, 47: [4] Zhu JJ, Wang ZM, Kuang YH, et al. A quantitative method using one marker for simultaneous assay of ginsenosides in Panax ginseng and P. notoginseng [J]. Acta Pharm Sin ( 药 学 学 报 ), 2008, 43: [5] State Pharmacopoeia Commission of the People s Republic of China. Pharmacopoeia of the People s Republic of China ( 中 华 人 民 共 和 国 药 典 ) [S]. Vol I. Beijing: China Medicinal Science and Technology Press, 2010: 285. [6] Wang LX, Xiao HB, Liang XM. A new method to improve the reproducibility of retention time on reversed phase C 18 columns in different laboratories [J]. Chin J Anal Chem ( 分 析 化 学 ), 2003, 31:
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