第 17 卷第 2 期年 3 月中国水产科学 Journal of Fishery Sciences of China Vol.17 No.2 March 2010 研究简报文蛤肠外套膜和肝胰脏组织 cdna 文库构建及其 ESTs 序列分析高祥刚 1, 李云峰 1, 宋文

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织丁
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1 第 17 卷第 2 期年 3 月中国水产科学 Journal of Fishery Sciences of China Vol.17 No.2 March 2010 研究简报文蛤肠外套膜和肝胰脏组织 cdna 文库构建及其 ESTs 序列分析高祥刚 1, 李云峰 1, 宋文涛 1,2, 王健 1,2, 傅立元 1,2, 刘卫东 1, 鲍相渤 1, 赫崇波 (1. 辽宁省海洋水产科学研究院, 辽宁省海洋水产分子生物学重点实验室, 辽宁大连 ;2. 辽宁师范大学生命科学学院, 辽宁大连 ) 1 摘要 : 利用 SMART cdna 文库构建试剂盒构建了文蛤 (Meretrix meretrix) 肠外套膜和肝胰脏组织的 cdna 文库经测定原始文库滴度分别为和 , 重组率高于 95%, 肠组织文库插入片段长度均大于 bp, 外套膜和肝胰脏组织文库的插入片段长度大于 1 kb 的占 87.5%, 文库质量符合标准要求随机选取文库的个克隆进行 5 端测序, 获得高质量表达序列标签 (Expressed Sequence Tags,ESTs)3 029 个 ( 肠 :1 005, 外套膜 :1 019, 肝胰脏 : 1 005), 测序成功率 95.58% 经质量控制和拼接得到个单基因簇 (Unigene), 其中 306 个叠联群 (Contigs),1 490 个单一序列 (Singletons) 通过 Blastx 搜索比对查询和注释分析, 共得到已知基因 696 个 ( 肠 :216, 外套膜 :235 个 ; 肝胰脏 :245 个 ), 占总数 38.75% 在个单基因簇 (Unigene) 发现微卫星序列 55 条, 这些存在微卫星位点的序列占整个 ESTs 数据库的 3.1% [ 中国水产科学,2010,17(2): ] 关键词 : 文蛤 ;cdna 文库 ; 表达序列标签 ; 微卫星标记中图分类号 :S959 文献标识码 :A 文章编号 : (2010) 文蛤 (Meretrix meretrix) 在中国是一种资源丰富的天然滩涂贝类, 也是重要的海水增养殖优良品种, 并且是主要的出口鲜活水产品之一伴随着养殖规模的逐年扩大, 影响产业发展的瓶颈问题不断出现, 其中养殖病害频发 [1] 种质下降 [2] 等问题已经引起业内诸多学者的关注目前, 文蛤的研究大多是关于常规育种养殖及遗传多样性分析 [3-4] 等方面, 关于其功能基因方面的研究鲜有报道自 20 世纪 70 年代成功构建了第一个 cdna 文库以来, 构建 cdna 文库已成为研究功能基因的基本手段之一通过构建 cdna 文库, 进行表达序列标签 (EST) 分析, 利用不断扩大的公共数据库信息, 对其功能进行推断 [5], 进行新基因的鉴定已经得到广泛的应用针对文蛤产业发展存在的制约因素, 本研究采用 SMART 技术构建文蛤 cdna 文库, 旨在利用所获得的文蛤, 建立全长 cdna 的文库, 不仅可以保存文蛤相关的遗传信息, 也为进一步克隆文蛤生长免疫和抗逆等相关基因奠定基础, 同时还通过构建文库筛选用于构建遗传连锁图谱的遗传标记, 如 EST 微卫星序列, 为文蛤种群遗传多态性分子辅助选择育种和遗传图谱构建等提供参考资料 1 材料与方法 1.1 材料实验所用的样品是 2 ~ 3 龄野生文蛤, 壳长 4.5 ~ 5.5 cm, 活体质量 27.1 ~ 39.7 g, 于 2008 年 10 月采自辽宁省盘山县双台子河口滩涂将文蛤于水族箱中暂养 2 d 后, 选取 10 个文蛤, 分别取其肠外套膜和肝胰脏组织, 各组织分别混合后放入液氮中保存收稿日期 : ; 修订日期 : 基金项目 : 辽宁省科学技术计划重大重点项目 ( ); 辽宁省海洋与渔业科研计划项目 (200801); 国家海洋公益性行业科技专项 ( ). 作者简介 : 高祥刚 (1980-), 男, 硕士, 助理研究员, 研究方向 : 水产生物技术. xiangganggao@163.com 通讯作者 : 赫崇波 (1961-), 男, 博士, 研究员, 研究方向 : 水产分子遗传学. Tel: ; hechongbo@hotmail.com

2 第 2 期高祥刚等 : 文蛤肠外套膜和肝胰脏组织 cdna 文库构建及其 ESTs 序列分析方法总 RNA 的提取将每种组织在液氮中充分研磨, 加入适量 TaKaRa RNAiso Reagent, 按照说明书的步骤提取总 RNA 将所提取的总 RNA 进行电泳, 检测总 RNA 的完整性用 Oligotex TM -dt30<super>mrna 纯化试剂盒 (Takara), 进行 mrna 的分离纯化 cdna 文库的构建根据 Creator TM SMART cdna 文库构建试剂盒 (Clontech) 说明书, 以纯化后的 3 种组织的 RNApoly (A) + mrna 为模板, 带有 Sfi I 酶切位点的 SMART IV TM Oligonucleotide 和 CDSIII/3 PCR Primer 为引物, 在反转录酶作用下转录合成 cdna 第 1 链确定最佳循环数后在 Advan-tage 2 PCR Kit(Clontech) 作用下合成 cdna 第 2 链双链 cdna 经 Sfi I 酶切及片段纯化后, 连接到 pdnr- LIB 载体上将含有 cdna 的质粒载体转化感受态细胞 DH10B 检测文库质量合格后, 向转化细胞中加入 50 % 的甘油, 混匀后放入冰箱 -80 保存 cdna 文库的鉴定库容量测定 : 取 1 ml 转化细胞的 LB 培养液,37 预热 1 h, 取 1 μl 转化细胞将其分别稀释 10 倍 100 倍倍后, 各取 10 μl 稀释过的菌液涂布到含有 30 μg/ml 氯霉素的 LB 平板上,37 培养过夜, 计算每个平板上的克隆数库容量 = 菌落数稀释倍数转化细胞总数体积 / 涂布菌体体积插入片段检测 : 用灭菌处理过的牙签在 30 μg/ml 的氯霉素 LB 平板上随意挑取 50 个克隆至 1 ml LB 液体培养基中,37 培养过夜, 用 M13 引物 PCR 扩增后凝胶电泳检测 PCR 结果重组率计算 : 对随机挑取的 50 个单克隆 PCR 扩增后, 计算重组克隆和非重组克隆的比值, 确定重组率 ESTs 序列测定和初步分析使用 Cross-match 软件去掉 EST 中的低质量序列载体序列重复序列等 [6-7], 使用 Phrap 序列拼接软件将测序得到的 EST 拼接成重叠群并使用 Consed 软件做人工检查和校正 [8-9], 用 BlastX 程序将 EST 序列与 NCBI 的非冗余蛋白序列数据库 (NR) 进行比对利用 Blast2GO 软件对所有 ESTs 进行基因功能分析及序列长度 E 值的统计, 并对单基因簇 (Unigene) 按分子功能进行分类 [10] 利用网络工具( gramene.org/db/markers/ssrtool) 和 SSR Hunter 软件, 筛选多态性微卫星标记 2 结果与分析 2.1 总 RNA 的提取高质量总 RNA 的提取以及 mrna 的纯化是 cdna 文库构建成败的关键文蛤 3 种组织总 RNA 提取液进行 1% 琼脂糖凝胶电泳, 从阴极到阳极依次呈现 3 条带, 分别为 28S 18S 和 5S rrna 这 3 个条带清晰, 表明提取的总 RNA 完整, 所提 RNA 完整性好, 未发生降解 ( 图略 ) 2.2 cdna 的合成合成的双链 cdna 经 1% 琼脂糖凝胶电泳检测显示 ( 图略 ):cdna 大小分布在 200 ~ bp 之间, 大部分集中在 500 ~ bp 之间, 符合 cdna 合成的分布规律, 证明 cdna 已成功合成 2.3 cdna 文库的鉴定取 1 μl 细胞转化液稀释一定倍数后, 各取 10 μl 稀释过的菌液涂布,37 培养过夜后, 计算克隆总数, 测得肠外套膜和肝胰脏 3 种组织的 cdna 文库的原始库容分别为和随机选取单克隆菌落以 M13 引物进行扩增, 根据 PCR 扩增结果计算得到重组率超过 95 %, 且插入片段大部分均大于 500 bp, 肠组织文库插入片段长度均大于 bp, 外套膜和肝胰脏组织文库的插入片段长度大于 1 kb 占 87.5% ( 图略 ) 2.4 ESTs 测序及初步分析 ESTs 测序拼接和注释随机选取文库的个克隆进行 5 端测序, 获得高质量 EST 序列个 ( 肠个, 外套膜个, 肝胰脏个 ), 测序成功率 95.58% 经质量控制和拼接得到个单基因簇 (Unigene), 其中 306 个叠联群 (Contigs),1 490 个单一序列 (Singletons) 通过 Blastx 搜索比对查询和注释分析, 共得到已知基因 696 个 ( 肠 216 个, 外套膜 235 个, 肝胰脏 245 个 ) 占总数 38.75%, 详见表 1

3 346 中国水产科学第 17 卷表 1 文蛤各组织 cdna 文库 ESTs 统计 Tab. 1 Summary of ESTs of cdna in different tissues of M. meretrix 描述项 Descriptive category ESTs 总数 Total number of ESTs 高质量 EST 数 High-quality ESTs 叠联群 Contigs 重叠群包含的 ESTs 数目 ESTs covered by contigs 单一序列 /% Singletons 推测功能的 ESTs Hypothetical genes 单基因簇 Unique sequences 平均大小 /bp Average size 肠 Intestine 外套膜 Mantle 肝胰脏 Hepatopancreas 获得基因注释 ESTs 功能分类通过 Gene Ontology 法分类, 对获得注释的 696 个 ESTs 按功能进行分类 ( 表 2), 发现仅有预测功能方面基因数量最多 (General function prediction only) 为 119 个, 翻译后修饰蛋白质折叠及伴侣蛋白 (Posttranslational modification,protein turnover,chaperones) 及能量产生和转换 (Energy production and conversion) 相关基因次之, 分别为 103 个和 91 个防御机理 (Defense mechanisms) RNA 加工修饰 (RNA processing and modification) 基因和细胞运动及分泌 (Cell motility and secretion) 基因数量较少, 分别为 4 个 3 个 3 个 3 个文库之间功能基因的种类略有不同, 其中细胞运动及分泌 (Cell motility and secretion) 基因只存在于外套膜组织中,RNA 加工修饰 (RNA processing and modification) 基因在肝胰脏中没有发现所得到的单基因序列已经提交到 GenBank ESTs 库中, 登录号为 GR GR 和 GR GR 个文库之间功能基因的数量也有一定差异 ( 图 1), 有 187 个基因是在 3 个文库中共有的 ;90 个基因是在肠和外套膜 2 个文库中共有的 ;80 个基因是在肠和肝胰脏 2 个文库中共有的 ;88 个基因是在肝胰脏和外套膜 2 个文库中共有的 ; 还有大量的组织特异性的基因单独分布在肠外套膜和肝胰脏这 3 个文库中 ( 分别含有 223 个 205 个和 291 个 ) 肠 Intestine 外套膜 Mantle 肝胰脏 Hepatopancreas 图 1 文蛤肠外套膜和肝胰脏中基因在 3 个文库中的分布 Fig. 1 Diagram showing the overlap of significant hits among the three libraries 微卫星序列的筛选通过构建文蛤的 cdna 文库和进行较大规模的 EST 测序, 筛选多态性微卫星标记, 经过人工筛选, 在个 Unigene 中发现微卫星序列 55 条, 设计引物 22 对 ( 表 3),( 筛选标准是 :7 次以上重复的双碱基序列或 5 次以上重复的三四碱基重复序列 ) 这些存在微卫星位点的序列占整个 ESTs 数据库的 3.1% 证明在文蛤中存在着 EST 来源的微卫星序列

4 第 2 期高祥刚等 : 文蛤肠外套膜和肝胰脏组织 cdna 文库构建及其 ESTs 序列分析 347 表 2 GO 分类预测的文蛤各组织 Unigene 功能和数量 Tab. 2 Summary statistics of function and number of unigene in different tissues of M. meretrix by GO (Gene Ontology)analysis 推定功能 Putative function 氨基酸转运与代谢 Amino acid transport and metabolism 糖类转运与代谢 Carbohydrate transport and metabolism 细胞分裂与染色体分离 Cell division and chromosome partitioning 细胞膜包膜合成, 外膜 Cell envelope biogenesis,outer membrane 细胞运动与分泌 Cell motility and secretion 染色质结构和动力学 Chromatin structure and dynamics 辅酶代谢 Coenzyme metabolism 细胞骨架 Cytoskeleton 防御机制 Defense mechanisms DNA 复制重组与修复 DNA replication,recombination and repair 能量产生与转化 Energy production and conversion 功能未知 Function unknown 仅有预测功能 General function prediction only 无机离子转运与代谢 Inorganic ion transport and metabolism 细胞内转运和内分泌 Intracellular trafficking and secretion 脂代谢 Lipid metabolism 核苷转运与代谢 Nucleotide transport and metabolism 转录后修饰蛋白质折叠伴侣 Posttranslational modification,protein turnover,chaperones RNA 加工修饰 RNA processing and modification 次级代谢产物生物合成转运及分解 Secondary metabolites biosynthesis,transport and catabolism 信号传导 Signal transduction mechanisms 转录 Transcription 翻译核糖体结构和生物发育 Translation,ribosomal structure and biogenesis 肠 Intestine 外套膜 Mantle 肝胰脏 Hepatopancreas

5 348 中国水产科学第 17 卷表 3 部分微卫星引物序列及其参数 Tab. 3 Characters and sequences of some screened microsatellite primer 单基因簇 Unisequence 重复单元 Repeat motif 片段大小 /bp Size L10_CDNA_01_41.T7_A06 (TA) 7 (TG) L10_CDNA_02_03.T7_C01 (TGT) L10_CDNA_02_35.T7_C05 (GAT) L10_CDNA_02_92.T7_D12 (GTT) L10_CDNA_03_21.T7_E03 (ACA) L10_CDNA_04_31.T7_G04 (TTG) L10_CDNA_04_50.T7_B07 (GT) 4 GC(GT) L10_CDNA_07_23.T7_G03 (AAC) L10_CDNA_08_04.T7_D01 (AT) L10_Contig85 (TGG) L11_CDNA_01_09.T7_A02 (TAG) 3 (TGA) L11_CDNA_01_78.T7_F10 (TTC) L11_CDNA_03_49.T7_A07 (GAA) L11_CDNA_05_08.T7_H01 (GT) L11_CDNA_10_47.T7_G06 (TGA) L11_CDNA_10_55.T7_G071 (CAA) L11_CDNA_11_46.T7_F06 (CAA) L11-Contig76 (GAC) 2 (GAT) L11-Contig98 (AG) L11-Contig100 (GTCC) 引物序列 (5-3 ) Primer sequence (5-3 ) F:gtgatactggcattactag R:aattcaattctctctggc F:actcgctgttgtagatcat R:tcccagtgtagaagtcag F:ggagatgttacctggaatc R:gatgatcaaagtgctctagt F:taatagagaaatggcagctc R:aagtactccaacttacctct F:tgtgctcggctgtctcata R:atggactggtgtcctgtga F:gcaagagttaagcaggatg R:ctttggttccagaggctat F:taggcacatagtgttaccc R:cttgcacaagactcattgtc F:aatgcaaactggactcag R:ctggttattgttgtggtagt F:gtgttattgacattctaggc R:acaaatacaactctgcct F:gtagtgtttgcagaattcac R:gaagaaagcagacaatgc F:ccagaaccaattgtcgta R:agatgacctttgacagatc F:cactgattaggatcgaggtgac R:caatgcaaggtgcatcgag F:cgaccaagaattgtctgct R:tgcctttactatcagctgtg F:cattggtgaaagatgacct R:gttctaaagaatatcgcgga F:tagtgttgtggtggtcaa R:ataggctttgtatgccga F:ggaacggaatgagagttt R:ccttctctaactggaactc F:gaccatcgacttcaacagc R:tggcattgtaaccgttatgc F:tgaagacagatttgacgatg R:accaatcatttctatcgcg F:ggagtagttgtgtctttga R:cacaaactcaccataaacc F:gcatacacatatcaagaactg R:agttgcgttcacaagatt 3 讨论辽东湾是中国北方文蛤的重要自然产区之一, 是世界最大的天然文蛤繁殖地, 曾一直栖息着大量的文蛤, 并且成为国内最大文蛤天然苗种场 [11] 但是, 由于病害过度采捕和环境生态等原因, 导致滩涂文蛤大量死亡, 滩涂文蛤资源蕴藏量急剧下降, 天然苗种场的附苗量随之减少, 严重影响滩涂文蛤产业健康持续发展 [12] 本实验材料采自盘山县双台子河口滩涂, 具有代表性 SMART cdna 文库构建试剂盒是利用逆转录酶内源的末端转移酶活性, 不需要额外的 cdna 抽提纯化, 只需要少至 25 ng 的 mrna 或 50 ng 的总 RNA 就可以得到高质量高产量的 cdna 库, 最重要的是得到的 cdna 能够代表原有样品中的 mrna 的丰度, 可以应用于直接扩增基因构建 cdna 文库已知序列扩增全长 cdna(race) 等 RNA 的质量最终决定了 cdna 文库的质量, 因此成功构建一个 cdna 文库, 高质量和高纯度 RNA 的获得是一个至关重要的先决条件 RNA 的提取

6 第 2 期高祥刚等 : 文蛤肠外套膜和肝胰脏组织 cdna 文库构建及其 ESTs 序列分析 349 方法很多, 例如异硫氰酸肌 - 酚法盐酸肌 - 有机溶剂法等在提取 RNA 的过程中最关键的一点是必须抑制内源和外源的 RNA 酶的活力因为 RNA 酶具有耐高温, 不易变性, 活性不易被抑制的特点, 很难除去本研究采用 TRIZOL 试剂盒, 使用 RNAiso Reagent(TaKaRa) 试剂, 在液氮中充分研磨文蛤组织, 按照说明书的步骤提取总 RNA TRIZOL 试剂是强烈的蛋白质变性剂, 在溶解细胞组分的同时还具有强烈的抑制 RNase 的作用本实验构建了文蛤肠外套膜和肝胰脏全长 cdna 文库库容量重组率插入片段检测均表明所建 cdna 文库的质量符合要求通过 Blastx 搜索比对查询和注释分析, 只得到已知基因 696 个, 仅占总数 38.75%, 已知基因比例较低究其原因可能是由于贝类等无脊椎动物的 cdna 文库构建较少, 已知功能基因少, 而且贝类与其他脊椎动物的亲缘关系较远, 从而导致了 Blast 搜索的已知基因较少通过对随机挑选的部分克隆的测序及 ESTs 分析结果表明, 单基因簇中存在大量的新基因, 并且不同组织中功能基因的种类数量存在一定差异本研究之所以选择肠外套膜和肝胰脏作为 cdna 文库的构建组织, 是因为这些组织中存在着大量与生长发育抗逆免疫等密切相关的基因 [13-15] ; 本研究结果发现组织特异表达的有 719 个基因, 占 1796 个单基因簇的 40% 因此, 构建不同组织的 cdna 文库, 是查找文蛤相关功能基因的重要途径之一此外, 在个 Unigene 发现微卫星序列 55 条, 占整个 ESTs 序列的 3.1%, 证明在文蛤中存在着大量 EST 来源的微卫星序列,EST 微卫星序列的进一步验证和开发, 为文蛤种群遗传多态性分子辅助选择育种和遗传图谱构建等提供参考资料参考文献 : [ 1 ] 刘连生, 闫茂仓, 林志华. 引起文蛤暴发性死亡病原菌的分离和鉴定 [J]. 微生物学通报,2009,36(1): [ 2 ] 陈大鹏, 沈怀舜, 丁亚平, 等. 文蛤青蛤和四角蛤蜊的随机扩增多态性 DNA(RAPD) 的比较分析 [J]. 海洋通报,2004,23(6): [ 3 ] 张安国, 李太武, 苏秀榕, 等. 文蛤养殖现状及展望 [J]. 水产科学,2005,24(2): [ 4 ] 赫崇波, 丛林林, 葛陇利, 等. 文蛤养殖群体和野生群体遗传多样性的 AFLP 分析 [J]. 中国水产科学,2008,15(2): [ 5 ] Adams M D,Kelley J M,Gocayne J D,et al. Complementary DNA sequencing:expressed sequence tags and human genome project [J]. Science,1991,252 (5013): [ 6 ] Ewing B,Hillier L,Wendl MC,et a1. Base-calling of automated sequencer traces using Phred. I. Auracy assessment[j]. Genome Res,l998,8:l [ 7 ] Ewing B,Green P. Base-calling of automated sequencer traces using Phred. II. Error probabilities [J]. Genome Res,1998,8:l [ 8 ] Gordon D,Desmarais C,Green P. Automated finishing with autofinish [J]. Genome Res,2001,l1: [ 9 ] Gordon D. Viewing and editing assembled sequences using Consed [M]. Current protocols in bioinformatics,new York:John Wiley & Co [10] Ashburner M,Ball C A,Blake J A,et al. Gene ontology:tool for the unification of biology [J]. Nature Genetics,2000,25: [11] 罗有声. 辽河口文蛤苗场特点的研究 [J]. 水产科学,1983,(4): [12] 刘连生, 闫茂仓, 赵海泉, 等. 文蛤疾病学研究进展 [J]. 水产科学,2009,28(4): [13] 张学俊, 屈刚, 朱文漓, 等. 草鱼肠道 cdna 文库构建及部分 ESTs 分析 [J]. 水生生物学报,2007,31(2): [14] 李静, 张文兵, 麦康森, 等. 皱纹盘鲍外套膜 cdna 表达文库的构建 [J]. 中国海洋大学学报 : 自然科学版,2008,38(5): [15] 郑明刚, 孙修勤, 张进兴. 皱纹盘鲍肝和肾 cdna 文库的构建及免疫相关基因的初步研究 [J]. 高技术通讯,2007,17(3):

7 350 中国水产科学第 17 卷 Construction of cdna libraries from intestine,mantle and hepatopancreas of hard clam (Meretrix meretrix)and ESTs analysis GAO Xianggang 1,LI Yunfeng 1,SONG Wentao 1,2,WANG Jian 1,2,FU Liyuan 1,2,LIU Weidong 1,BAO Xiangbo 1, HE Chongbo 1 (1. Liaoning Ocean and Fishery Science Institute,Liaoning Key Laboratory of Marine Fishery Molecular Biology,Dalian , China;2. College of Life Sciences,Liaoning Normal University,Dalian ,China) Abstract:The cdna libraries of intestine,mantle and hepatopancreas of hard clam (Meretrix meretrix)were constructed with SMART cdna Library Construction Kit. The libraries have a high titer of , and ,respectively. The recombined efficiency of each cdna library exceeded 95 %. The all insert sizes of intestine library were over 1 kb,and the insert sizes over 1 kb in the mantle and hepatopancreas libraries were over 87.5%. Atotal of clones of the libraries were randomly picked and sequenced from the 5 end of the cdnas using a M13 universal primer,and raw sequences of the ESTs were processed and then assembled into unigene involving 306 contigs and singletons. Blastx analysis showed that 696 unigenes (216 for intestine,235 for mantle and 245 for hepatopancreas) (38.75%)had significant homology (EvalueG10-5 )to genes with known or putative functions in GenBank.The sequences containing microsatellite DNA (SSR)accounted for 3.1% of all ESTs indicating that SSR sequences were rich in the ESTs of hard clam. [Journal of Fishery Sciences of China,2010,17 (2): ] Key words:meretrix meretrix;cdna Library;expressed sequence tags;est-ssr Corresponding author:he Chongbo. hechongbo@hotmail.com

材料方法

材料方法生物技术通报张发洲杨慧兰为了构建单纯疱疹病毒型感染细胞多肽真核表达质粒应用技术从株的基因组中扩增基因并连接至真核表达载体对阳性克隆进行菌落酶切和测序鉴定后成功构建了重组质粒用转染试剂盒将重组质粒转染至细胞中并用及检测其表达情况结果显示基因在细胞中得到正确表达真核表达质粒的构建成功为进一步研究对宿主细胞的影响奠定了基础单纯疱疹病毒型感染细胞多肽

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