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1 DFS 染色の検討 愛臨技精度管理事業報告会病理検査研究班 平成 21 年 4 月 18 日 ( 土 ) 株式会社カーク本社

2 DFS 染色について コンゴーレッドに比べ皮膚に沈着したアミロイドがよく染まるので近年広く使用されつつある Dylon 染色は1977 年 森 柳原らがDylon 社の市販する家庭用木綿染料 pagoda red を用いてamyloid のためのダイロン染色として発表した 発表当初は良好な染色結果を得ていたが 数年の間にその染色性は著しく低下したため 1981 年に添加する塩化ナトリウムの量を1/10に減ずることで改良を行った pagoda red はもともと木綿染料であって アミロイドを染色する染料ではない 従って pagoda red 中にはアミロイドに染まる色素以外にも無機塩類 分散剤 安定剤 不純物 などが含まれている これらの成分がアミロイドの染色性を不安定にする原因にもなっていた Dylon 社にpagoda red 中のアミロイド染色に有効な成分を依頼したところ benzo fast scarlet 4BS が有効成分である事が判明した

3 検討項目 1 硫酸銅の効果について 2 加温の有効性について 3 塩の種類による染色性の違い 4 塩の添加量による染色性の違い 5 DFSの量による染色性の違い 6 切片の厚さによる染色性の違い 7 過マンガン酸処理について

4 1 硫酸銅の効果について 染色方法 1. 脱パラ 水洗 2.Direct Fast Scarlet 4BS 分 3. 軽く水洗 4.3% 硫酸銅水溶液に 0 分 3 分 30 分 5. 核染色 3 分 6. 流水水洗 1 分 分 7. 脱水 透徹 封入 DFS 組成 DFS 0.2g 蒸留水 40ml ドライゾール 10ml 硫酸ナトリウム 0.8g

5 1 硫酸銅の効果について 硫酸銅反応時間 なし 3 分 30 分 流水時間 1 分 30 分

6 1 硫酸銅の効果について 硫酸銅の効果は不明 線維染色では 媒染 ( 染色後の水洗で落ちにくくする ) の効果があるとネット上で確認できたが 検討では効果を確認できなかった

7 2 加温の有効性について 染色方法 1. 脱パラ 水洗 2.Direct Fast Scarlet 4BS 50 1 時間 3. 軽く水洗 4.3% 硫酸銅水溶液に 3 分 5. 核染色 3 分 6. 脱水 透徹 封入 試薬の調整 1Direct Fast Scarlet 4BS 1g を 100mlの蒸留水に加温溶解 ( 沸騰禁 ) 2 溶解後塩化ナトリウム10gを加え攪拌する 小豆色の混濁液となったら室温にて冷却し濾過 3 使用時には濾液 4に対して無水アルコール1を加える

8 精度管理調査で使用した検体 ( 剖検材料の腎臓 ) DFS 染色 3μ 加温あり弱拡大 DFS 染色 3μ 加温あり強拡大 DFS 染色 3μ 加温なし弱拡大 DFS 染色 3μ 加温なし強拡大

9 アミロイド陽性の腎生検 DFS 染色 3μ 加温あり弱拡大 DFS 染色 3μ 加温あり強拡大 DFS 染色 3μ 加温なし弱拡大 DFS 染色 3μ 加温なし強拡大

10 アミロイド陽性の皮膚生検 DFS 染色 3μ 加温あり弱拡大 DFS 染色 3μ 加温あり強拡大 DFS 染色 3μ 加温なし弱拡大 DFS 染色 3μ 加温なし強拡大

11 アミロイド陽性の大腸生検 DFS 染色 3μ 加温あり弱拡大 DFS 染色 3μ 加温あり強拡大 DFS 染色 3μ 加温なし弱拡大 DFS 染色 3μ 加温なし強拡大

12 2 加温の有効性について DFS 染色では50 60 分の加温により加温を行わなかった場合と比較して強い染色性を示した 加温を行って染色することは染色性を向上させる効果がある事が示された しかし 背景に若干の共染も伴っていた

13 3 塩の種類による染色性の違い Na2SO4 Na2CO3 NaCl NaNO3 CaCl2 染色方法 1. 脱パラ 水洗 2.Direct Fast Scarlet 4BS 50 1 時間 3. 軽く水洗 4.3% 硫酸銅水溶液に 3 分 5. 核染色 3 分 6. 流水水洗 7. 脱水 透徹 封入 DFS 組成 DFS 0.4g 蒸留水 40ml ドライゾール 10ml 1~0.5% 塩

14 3 塩の種類による染色性の違い 塩無 Na 2 SO 4 Na 2 CO 3 NaCl

15 3 塩の種類による染色性の違い 塩無 NaNO3 CaCl 2

16 3 塩の種類による染色性の違い 塩の種類で定時間での染色強度は違いが出る 塩化カルシウムでも増強作用があること 塩を加えなくても染色され偏光も見られることから ナトリウムが必須でもない感じを受けた また DFS 自体のpHはアルカリ性であるが 酸性域の硫酸ナトリウム アルカリ性域の炭酸ナトリウム共に増強を見ることから DFS 使用液の染色増強効果はpHに依存しない結果となった

17 4 塩の添加量による染色性の違い (1) Na2SO4 Na2CO3 NaCl をそれぞれ 0.4g 0.8g 8.0g 染色方法 1. 脱パラ 水洗 2.Direct Fast Scarlet 4BS 50 1 時間 3. 軽く水洗 4.3% 硫酸銅水溶液に 3 分 5. 核染色 5 分 6. 流水水洗 7. 脱水 透徹 封入 DFS 組成 DFS 0.4g 0.8g 蒸留水 40ml ドライゾール10ml

18 4 塩の添加量による染色性の違い (1) 0.4g 0.8g 8.0g Na 2 CO 3 Na 2 SO 4 NaCl 0.8%DFS20% ドライゾール溶液

19 4 塩の添加量による染色性の違い (1) 0g 0.4g 0.8g 8.0g Na 2 CO 3 Na 2 SO 4 NaCl 0.4%DFS20% ドライゾール溶液

20 4 塩の添加量による染色性の違い (1) (2 週間後の染色液 ) 0g 0.4g 0.8g 8.0g Na 2 SO 4 NaCl 0.4%DFS20% ドライゾール溶液

21 4 塩の添加量による染色性の違い (2) NaClの量を添加無し (0g) 1/5 量 (2g) 1/2 量 (5g) 通常量(10g) 2 倍量 (20g) 3 倍量 (30g) で検討染色方法 1. 脱パラ 水洗 2.Direct Fast Scarlet 4BS 50 1 時間 3. 軽く水洗 4.3% 硫酸銅水溶液に 3 分 5. 核染色 3 分 6. 脱水 透徹 封入 試薬の調整 1Direct Fast Scarlet 4BS 1g を 100mlの蒸留水に加温溶解 ( 沸騰禁 ) 2 溶解後塩化ナトリウム10gを加え攪拌する 小豆色の混濁液となったら室温にて冷却し濾過 3 使用時には濾液 4に対して無水アルコール1を加える

22 4 塩の添加量による染色性の違い (2) NaCl の添加量と DFS の染色性 0g 2.5g 5g 10g 20g 30g

23 4 塩の添加量による染色性の違い ある文献では 塩の濃度が上げると共染は抑えられたが染色性が落ちるとの検討報告であったが 今回の検討では逆に染色性が上がった DFS 濃度に比例し 塩を加えたときの染色性増強効果が上がった 光学顕微鏡では塩の濃度 DFS 濃度に染色性は左右されたが 偏光顕微鏡観察では 濃度に大きな差は見られなかった 0.4% に調整した DFS 使用液を 2 週間ほど密栓放置し 染めてみたところ 全体的に多少の染色性の劣化が見られたが 特に塩の濃度に比例して劣化が強かった NaCl の量を添加無し (0g)1/5 量 (2g) 1/2 量 (5g) 通常量 (10g) 2 倍量 (20g) 3 倍量 (30g) で検討した結果 0g もアミロイドは染色されるが他の異なりその染色性は弱かった また 1/5 量 (2g) 1/2 量 (5g) 通常量 (10g) 2 倍量 (20g) ではその染色性に大差は認めなかったが 3 倍量 (3 0g) では逆に染色性が低下した

24 5DFS の量による染色性の違い DFSの量を1/10 量 (0.1g) 1/2 量 (0.5g) 通常量(1g) 2 倍量 (2g) 3 倍量 (3g) で検討染色方法 1. 脱パラ 水洗 2.Direct Fast Scarlet 4BS 50 1 時間 3. 軽く水洗 4.3% 硫酸銅水溶液に 3 分 5. 核染色 3 分 6. 脱水 透徹 封入 試薬の調整 1Direct Fast Scarlet 4BS 1g を 100mlの蒸留水に加温溶解 ( 沸騰禁 ) 2 溶解後塩化ナトリウム10gを加え攪拌する 小豆色の混濁液となったら室温にて冷却し濾過 3 使用時には濾液 4に対して無水アルコール1を加える

25 5DFS の量による染色性の違い DFS 量と染色性 0.1g 0.5g 1g 2g 3g

26 5DFS の量による染色性の違い DFS1/10(0.1g) での染色性 DFS 0.1g 腎生検 DFS 0.1g 皮膚生検 DFS 1.0g 腎生検 DFS 1.0g 皮膚生検

27 5DFS の量による染色性の違い DFSの量を1/10 量 (0.1g) 1/2 量 (0.5g) 通常量(1g) 2 倍量 (2g) 3 倍量 (3g) で検討を行ったが いずれの量に対しても良好な染色結果が得られた 精度管理で使用した以外の生検材料 ( 腎生検 皮膚生検 ) においても良好な染色結果が得られた 数症例での検討であるためすべての症例で良好な染色性が得られるかは疑問であるが 少なくとも今回検討した症例においては1/10 量 (0.1g) でも診断に支障のない結果が得られた

28 6 切片の厚さによる染色性の違い (1) 染色方法 1. 脱パラ 水洗 2.Direct Fast Scarlet 4BS 50 1 時間 3. 軽く水洗 4.3% 硫酸銅水溶液に 3 分 5. 核染色 5 分 6. 色だし 分 6. 脱水 透徹 封入 DFS 濃度 0.8% ドライゾール 10% NaCl0.4% になるように染色液を作成 切片厚 1~9μm で薄切し それぞれを同一条件にて染色した

29 6 切片の厚さによる染色性の違い (1) 1µm 2µm 3µm 4µm 5µm 6µm 7µm 8µm 9µm

30 6 切片の厚さによる染色性の違い (2) 染色方法 1. 脱パラ 水洗 2.Direct Fast Scarlet 4BS 50 1 時間 3. 軽く水洗 4.3% 硫酸銅水溶液に 3 分 5. 核染色 3 分 6. 脱水 透徹 封入 試薬の調整 1Direct Fast Scarlet 4BS 1g を 100mlの蒸留水に加温溶解 ( 沸騰禁 ) 2 溶解後塩化ナトリウム10gを加え攪拌する 小豆色の混濁液となったら室温にて冷却し濾過 3 使用時には濾液 4に対して無水アルコール1を加える

31 6 切片の厚さによる染色性の違い (2) 1μm 3μm 5μm 7μm

32 6 切片の厚さによる染色性の違い 染色が多少でも判別できる程度であったら 偏光はみられた 切片の厚さに比例して アミロイドの染色強度も上昇した 厚さが増すに従い 一定の厚さの中に含まれる核の数も増加するためヘマトキシリンに染色される核の存在が目立ちはじめるためコントラストの高い標本になりがちである アミロイドの存在を証明するには5μm 程度の厚さが必要であると思われる

33 7 過マンガン酸処理について Na 2 CO 3 0.5% 過マンガン酸カリウムと 0.3% 硫酸水溶液の等量混合液 3 分 未処理 処理 非 AA 非 AA AA

34 7 過マンガン酸処理について Na 2 SO 4 0.5% 過マンガン酸カリウムと 0.3% 硫酸水溶液の等量混合液 3 分 未処理 処理 非 AA 非 AA AA

35 7 過マンガン酸処理について NaCl 0.5% 過マンガン酸カリウムと 0.3% 硫酸水溶液の等量混合液 3 分 未処理 処理 非 AA 非 AA AA

36 7 過マンガン酸処理について 3 回ほど再検をおこなったが 全てにおいて 炭酸ナトリウムを使用した場合 切片の剥がれや捲れが起こった また 染まるはずの非 AA の検体でも偏光がみられなかった

37 まとめ 硫酸銅の効果については 証明出来なかった DFS 染色では50 60 分の加温により加温を行わなかった場合と比較して強い染色性を示した 加温を行って染色することは染色性を向上させる効果がある事が示された 塩の種類の違いでは 定時間での染色強度には違いが出る 塩の濃度に比例し染色性がやや増強傾向にあった しかし 濃度を上げすぎると逆に染色性が下がることがある DFSの量の検討では いずれの量に対しても良好な染色結果が得られた 切片の厚さに比例して アミロイドの染色強度も上昇したが 切片の厚さは 4~6μm 程度が安定すると思われた 炭酸ナトリウムを使用する場合 非 AA 検体でも過マンガン酸処理を行う条件を検討する必要があると思われた

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