吉林农业大学学报 2011,12 Journal of Jilin Agricultural University 枯草芽孢杆菌凝乳酶的酶学性质的研究 * 高岩 1, 王景会 1,2, 李玉秋

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1 2011,12 枯草芽孢杆菌凝乳酶的酶学性质的研究 * 高岩 1, 王景会 1,2, 李玉秋 2, 马颖辉 3 2**, 杨贞耐 1. 吉林农业大学食品科学与工程学院, 长春 ;2. 吉林省农业科学院农产品加工中心, 长春 : 3. 黑龙江八一农垦大学, 大庆摘要 : 对枯草芽孢杆菌凝乳酶的酶学性质进行了研究结果表明 : 枯草芽孢杆菌凝乳酶的最适反应温度为 55, 最适 ph 值为 5.0, 在 ph 值为 6.0 时最稳定, 在 65 保温 60 min 酶活基本丧失,Mn 2+ Li + Fe 2+ Na + K + Mg 2+ Ca 2+ 对该凝乳酶有促进作用,Mg 2+ Ca 2+ 促进作用较为明显, 而 Cu 2+ 对该酶有明显的抑制作用 ; 酶修饰剂中 β- 巯基乙醇对凝乳酶的活力影响较小,EDTA 可抑制该凝乳酶的活力 ; 蛋白酶抑制剂 σ-phenantroline 可以明显抑制酶活性, 证实该酶为金属蛋白酶类在与商品酶对比中发现枯草芽孢杆菌凝乳酶与商品酶的酶学性质相近关键词 : 枯草芽孢杆菌 ; 凝乳酶 ; 酶学性质中图分类号 :TS201.3 文献标识码 :A 文章编号 : (2011) DOI: CNKI: /S 网络出版地址 : Study on Enzymological Characteristics of Chymosin Produced by Bacillus subtilis GAO Yan 1, WANG Jing-hui 1,2, LI Yu-qiu 2, MA Ying-hui 3, YANG Zhen-nai 2 1.College of Food Science and Engineering, Jilin Agricultural University0Changchun China; 2. Rsearch Center of Agro-Product Processing, Jilin Academy of Agricultural Sciences, Changchun , China; 3. Heilongjiang Bayi Agricultural Univercity, Daqing , China Abstract: Enzymological characteristics of chymosin produced by Bacillus subtilis were studied.the results showed that the optimal temperature of chymosin was 55, and the optimal coagulating ph was 5.0. The clotting activity was more stable at ph 6.0. The enzyme almost lost activity by retaining after 60 min at 65. The metal ions Mn 2+, Li +, Fe 2+, Na +, K +, Mg 2+ and Ca 2+ increased the clotting activity and Mg 2+ and Ca 2+ showed the greatest effect while Cu 2+ inhibited the clotting activity. As enzyme modifiers, β-mercaptoethanol had no clear effect on milk-clotting activity while EDTA inhibited the clotting activity. As protein inhibitors, σ-phenantroline strongly inhibited the clotting activity, so the enzyme is a metalloproteinase. Experimental results showed that chymosin produced by Bacillus subtilis had the similar characteristics to the commercial chymosin. Key words:bacillus subtilis;chymosin;enzymological characteristic 凝乳酶是干酪生产中的关键酶传统凝乳酶的来源主要是小牛皱胃, 但是随着干酪消费量的不断增长, 小牛皱胃酶难以满足干酪生产的需求 [1-2] 因此牛凝乳酶代用品的研究对干酪产业的发展有重要意义 [3,4] 凝乳酶分布广泛, 植物动物和微生物都可以作为凝乳酶的来源尤其是微生物的生长特性使得微生物凝乳酶具有广阔的发展前景 [5] 目前, 对产凝乳酶微生物的研究主要集中在真菌, 特别是毛霉类, 如微小毛霉总状毛霉米黑毛霉米曲霉寄生内座壳菌等 [6-7] 然而丝状真菌的产酶周期较长, 一般需要 5~7d, 多数需要固体发酵, 不利于工业化生产而且, 此类微生物酶在用于商品时, 还需要进行毒性致癌性以及皮肤过敏性测试 [8] 本试验所选枯草芽孢杆菌菌株, 为一种细菌, 是从传统食品纳豆中分离纯化, 长期应用在生产纳豆的发酵工艺中, 具有较高的食品安全性, 也是美国 FDA * 基金项目 : 现代农业产业技术体系建设专项资金项目 (CARS-37) 作者简介 : 高岩, 女, 在读硕士, 研究方向 : 发酵微生物的选育与代谢调控收稿日期 : 网络出版时间 : :00 ** 通讯作者

2 2011 年 12 月公布的 40 种益生菌之一 [9] 生产周期比上述真菌明显缩短, 可利用的原料丰富, 发酵成本较低, 有利于工业化生产本文主要就枯草芽孢杆菌凝乳酶的酶学性质进行研究, 为该菌所产凝乳酶在干酪生产中的应用奠定理论基础, 探寻一种小牛皱胃酶的代用品 1 材料与方法 1.1 材料枯草芽孢杆菌 JAASB( 吉林省农业科学院农产品加工研究中心筛选保存 ), 商品凝乳酶 ( 牛凝乳酶, 科汉森公司 ), 脱脂乳粉 ( 新西兰进口乳粉 ), 蛋白酶抑制剂 PMSF Pepstatin A Aprotinin Leupeptin σ-phenantroline(bio Basic Inc 公司 ), 所有药品及试剂均为分析纯 1.2 方法发酵培养基配方蛋白胨 10 g/l, 酵母浸粉 5 g/l, 氯化钠 10 g/l,kh 2 PO 4 2 g/l,na 2 HPO 4 2 g/l, MgSO 4 7H 2 O 4 g/l,ph 值自然凝乳酶制剂的制备枯草芽孢杆菌 JAASB 活化后, 以 5 % 的接种量接种于含 200 ml 培养基的 500 ml 三角瓶中进行发酵,37,240r/min 培养 24 h 后, 8000 r/min 离心 10 min, 收集上清液加入硫酸铵使其饱和度达到 80 %,4 静止过夜 1 万 r/min 离心 20 min, 收集蛋白沉淀, 并用 ph 值为 5.8 的磷酸盐缓冲液悬起混匀, 所得液体即为枯草芽孢杆菌凝乳酶制剂酶活力的测定凝乳酶活性测定采用 Arima [10] 方法用 0.01 mol /L CaC1 2 液配制 10% 脱脂乳液此溶液配制后在室温放置 40 min 后使用取 5 ml 10 % 脱脂奶粉液于 35 保温 10 min, 加 0.5 ml 适当稀释的酶液 ( 酶液 35 保温 ), 立即摇匀, 开始计时准确记录从开始到乳液凝固的时间 (s), 把 40 min 凝结 1 ml 10% 脱脂乳的酶量定义为一个索氏单位 (Soxhlet unit) 奶样体积 (ml) 凝乳酶活性 (U)= 凝乳酶体系 (ml) 2400/t D, 式中 :t 为凝乳时间 (S),D 为稀释倍数图 1 温度对酶凝乳活性的影响 Fig. 1. Effect of temperature on the milk-clotting activity of rennet 由 1 可见, 枯草芽孢杆菌凝乳酶和商品凝乳酶最适反应温度分别为 55 和 50 温度过高或过低 [3] 凝乳活性都会降低这与韦薇报道的小牛凝乳酶的最适反应温度为 50 一致 2.2 凝乳酶的热稳定性将 2 种酶液分别放在温度为 35 ~60 的水浴中保温, 分别在 5 ~60 min 时取样, 冰水浴中迅速冷却后, 测定残余的酶活, 以未处理的酶液为对照 ( 图 2, 图 3) 图 2 枯草芽孢杆菌凝乳酶的热稳定性 Fig.2.Thermostability of Bacillus subtilis chymosin s milk-clotting activity 相对凝乳酶活力 (%)= A A 100, 0 式中 :A 为所测的凝乳酶活力 (U/mL);A 0 为对照的凝乳酶活力 (U/mL) 2 结果与讨论 2.1 凝乳酶作用的最适温度将本试验制备的枯草芽孢杆菌凝乳酶与商品凝乳酶分别在 20~70 下测定酶的凝乳活性, 研究酶作用的最适温度, 以最高酶活项为对照, 测定相对凝乳酶活力 ( 图 1) 图 3 商品凝乳酶的热稳定性 Fig.3. Thermostability of commercial chymosin s milk-clotting activity 2011,December

3 由图 2, 图 3 可见,2 种酶在 35,40 时, 均能保持良好的稳定性, 枯草芽孢杆菌杆菌凝乳酶在 60 温浴 60 min 后, 凝乳活力下降至 20 % 左右, 商品凝乳酶在 55 温浴 60 min, 凝乳活力下降至 7 % 左右而在 65 的条件下, 枯草芽孢杆菌凝乳酶温浴 60 min 基本完全失活, 商品凝乳酶需要在 60 温浴 10 min 完全失活可见枯草芽孢杆菌产的凝乳酶具有稍高的热稳定性 2.3. ph 值对凝乳活力的影响用浓度为 0.1 mol/l 的 NaOH 及 0.1 mol/l 的盐酸将脱脂乳的 ph 值分别调到 5.0~8.0, 测其凝乳酶活力, 以研究酶作用的最适 ph 值 ( 图 4) 高岩等 : 枯草芽孢杆菌凝乳酶的酶学性质的研究低, 引起酪蛋白疏水性增加, 胶束易发生解离, 从而促进酪蛋白聚集产生凝乳 [11] 2.4 酶的 ph 稳定性用浓度为 0.1 mol/l 的 HCl 和 NaOH 将酶液的 ph 值调到 2.0~9.0, 在室温下放置 20h 后再分别用浓度为 0.1 mol/l 的 HCl 和 NaOH 将酶液的 ph 值调回到 6.0, 测定枯草芽孢杆菌凝乳酶与商品凝乳酶的残余酶活力 ( 图 5) 图 4 ph 值对凝乳活力的影响 Fig.4. Effect of ph on the milk-clotting activity of rennet 由图 4 可见,2 种凝乳酶都是在酸性条件下具有较高的活力, 在试验条件下, 当 ph<5.0 时, 脱脂乳呈现出凝乳状态, 因此无法测出凝乳活力随着 ph 的增加, 枯草芽孢杆菌凝乳酶和商品凝乳酶均呈下降趋势, 枯草芽孢杆菌凝乳酶活性下降较缓慢, 当 ph 值为 8.0 还残余 17 % 的活性, 商品凝乳酶在 ph>6.0 后迅速下降, 直到 ph 为 7.5 时完全丧失活性有研究推测, 酸性环境对凝乳酶起促进作用是由于 ph 值的降图 5 酶的 ph 稳定性 Fig.5. Stability of the enzyme at different ph value 由图 5 可见, 枯草芽孢杆菌凝乳酶在 ph 值为 6.0 时最稳定, 商品凝乳酶在 ph 值为 5.0 时最稳定过酸或过碱都会影响这两种凝乳酶的稳定性过酸可能是由于自动降解的原因, 引起酶的活性丧失, 过碱可能是由于一个不可逆转的构象变化 [12], 使这 2 种凝乳酶失去了凝乳活力 2.5 金属离子对凝乳活力的影响在脱脂乳中分别加入不同的金属离子, 使脱脂乳中的 Mn 2+ Li + Na + K + Mg 2+ Ca 2+ Fe 2+ Cu 2+ 离子的浓度分别为 1 mmol/l 和 5 mmol/l, 室温下静置 40 min, 然后测定其凝乳活性 ( 表 1) 表 1 金属离子对凝乳活力的影响 Table 1. Effect of various metal ions on the milk-clotting enzyme activitity 金属离子 Metal ion 浓度 (mmol/l) Concentration 枯草芽孢杆菌凝乳酶相对凝乳酶活力 /% Relative activity of milk-clotting enzyme produced by Bacillus subtilis 商品凝乳酶相对凝乳酶活力 /% Relative activity of commercial milk-clotting enzyme None Mn ± ± ± ±0.2 Li ± ± ± ±0.6 Fe ± ± ± ±3.6 Mg ± ± ± ±0.9

4 2011 年 12 月 Ca ± ± ± ±1.1 Na ± ± ± ±2.0 K ± ± ± ±2.8 Zn ± ± ± ±2.1 Cu ± ± ± ±3.2 由表 1 可知, 金属离子对这两种酶的影响基本类似 Mn 2+ Mg 2+ Ca 2+ 对这 2 种凝乳酶均有明显促进作用, 尤其对商品凝乳酶促进作用更明显 Li + Fe 2+ Na + K + 对这 2 种酶的均有轻微促进作用 Zn 2+ 均对这两种酶有轻微的抑制作用,Cu 2+ 对商品酶的抑制作用 [13] 更明显本研究的结果和其他献报道有差异, 孙超报道 Mg 2 对微生物凝乳酶和小牛皱胃酶基本无影响, Megada [14] 试验表明 Mg 2+ 对埃及球形杆菌凝乳酶基本无影响. 而腾国新等报道 [16] Mg 2+ 对根霉凝乳酶有促 [17] 进作用 LI Jing 等试验表明 Mg 2+ 对含梅奇酵母基因的大肠杆菌重组凝乳酶有微弱的抑制作用金属离子对不同来源的凝乳酶影响不同, 其中反应体系的浓度图 7 EDTA 对凝乳活力的影响不同也可能是造成这种差异的原因 Fig. 7. Effect of EDTA on enzyme activity 2.6 酶修饰剂对凝乳活力的影响由图 6 可见,β- 巯基乙醇对 2 种凝乳酶的活力脱脂乳中分别加入 β- 巯基乙醇, 乙二胺四乙酸影响较小, 巯基在许多酶中充当活性催化基团的中 (EDTA), 使其浓度分别为 1,5,10 mmol/l, 测其心, 可与另一巯基形成二硫键, 从而稳定酶的结构, 凝乳活性 ( 图 6, 图 7) 对酶的特性或功能起显著影响本试验表明, 巯基在枯草芽孢杆菌凝乳酶中并没有充当活性中心的催化基团由图 7 可见,EDTA 可抑制枯草芽孢杆菌凝乳酶的活力, 并且随着 EDTA 浓度增大, 抑制能力明显增强 EDTA 是一种金属螯合剂, 能与酶分子中的金属离子形成螯合物, 使酶成为无活性状态本试验结果表明枯草芽孢杆菌凝乳酶可能是一种以金属离子作为辅酶因子的酶 2.7 蛋白酶抑制剂对酶活性的影响研究蛋白酶抑制剂苯甲基磺酰氟 (PMSF) 胃蛋白酶抑制剂 (Pepstatin A) 抑肽酶(Aprotinin) 亮异酶肽 (Leupeptin) 1,10- 菲咯啉 (σ-phenantroline) 图 6β- 巯基乙醇对凝乳活力的影响对凝乳活力的影响, 将蛋白酶抑制剂配置成相应的浓 Fig. 6. Effect of β-mercaptoethanol on enzyme activity 度后分别与 2 种酶液混合 [14,18-19],37 保温 30min 后测定凝乳活力 ( 表 2) 表 2 蛋白酶抑制剂对酶活性的影响 Table 2. Effect of protein inhibitors on milk-clotting enzyme activity 枯草芽孢杆菌凝乳酶相对商品凝乳酶相对凝乳活性 /% 蛋白酶抑制剂目标蛋白终浓度 /(μmol L -1 ) 凝乳活性 /% Relative activity of commercial Protease inhibitor Target protein Terminal concentration Relative activity of Bacillus milk-clotting enzyme subtilis milk-clotting enzyme 2011,December

5 高岩等 : 枯草芽孢杆菌凝乳酶的酶学性质的研究 None PMSF 丝氨酸蛋白酶 ± ± ± ±1.8 Pepstatin A 天冬氨酸蛋白酶 ± ± ±1.2 0±0 Aprotinin 胱氨酸蛋白酶 ± ± ± ±1.7 Leupeptin 胱氨酸蛋白酶和丝氨酸蛋白酶 ± ± ± ±2.0 σ-phenantroline 金属蛋白酶 ± ± ±0 83.5±1.8 选用了不同的蛋白酶抑制剂来鉴定枯草芽孢杆菌凝乳酶的活性基团, 由表 2 可知, 添加 PMSF Aprotinin Leupeptin 蛋白抑制剂对两种凝乳酶的影响不大, 而 σ-phenantroline 蛋白抑制剂在高浓度使枯草芽孢杆菌凝乳酶完全失活,Pepstatin A 蛋白抑制剂在高浓度下可使商品凝乳酶完全失活说明枯草芽孢杆菌凝乳酶为金属蛋白酶类, 商品凝乳酶为天冬氨酸蛋白酶类, 而 Megada [14] 试验表明埃及球形杆菌凝乳酶 [15] 的活性基团为丝氨酸, 王景会等人试验表明重组微小毛霉凝乳酶属于天冬氨酸凝乳酶这也说明不同来源的凝乳酶分属于不同的蛋白酶类 3 结论枯草芽孢杆菌凝乳酶属于金属蛋白酶家族, 最适反应温度为 55, 在 65 作用 60 min 基本失去活性枯草芽孢杆菌凝乳酶反应的最适 ph 值为 5.0, 在 ph 值为 6.0 时最稳定 Mn 2+ Mg 2+ Ca 2+ 对该酶有明显促进作用, 而 Zn 2+ Cu 2+ 对其有抑制作用金属螯合剂 EDTA 对枯草芽孢杆菌凝乳酶有抑制作用, 同时也进一步证实了该酶为金属蛋白酶类并且通过对枯草芽孢杆菌凝乳酶和商品凝乳酶的酶学性质进行比较, 结果表明枯草芽孢杆菌凝乳酶和商品凝乳酶二者的酶学性质基本相似, 因此可以用于干酪生产就目前而言, 能用于工业生产的微生物凝乳酶只有微小毛霉和米黑曲霉 2 种真菌, 枯草芽孢杆菌较丝状真菌, 具有生长周期短生产成本低易于控制生长条件等优点, 如能用于工业化生产, 它将大大降低其生产成本在后续工作中, 我们将对该酶进行分离提纯, 研究其分子量, 并且尝试利用发酵罐进行生产, 和工业化接轨, 此外, 该酶在干酪生产中的应用也将进行进一步研究参考文献 : [1] 张红梅, 刘钟滨. 凝乳酶的研究进展 [J]. 同济大学学报,2004,25 (3): [2] LOPES A, TEIXEIRA G, LIBERATO M C, et a1. New vegeta1sources for milk-clotting enzymes[j]. Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic,1998, 5(1): [3] 韦薇, 韩刚, 徐凤彩. 小牛凝乳酶的分离及部分特性研究 [J]. 中国乳品工业, 1997,25(4): [4] 顾瑞霞, 申戈. 凝乳酶及其用品 [J]. 中国乳品工业.1991,19 ( 1): [5] 周俊清, 林亲录, 赵谋明. 微生物源凝乳酶的研究进展 [J]. 中国食品添加剂 2004(2): 6-9. [6] SHIEH C H, PHAN THI L A, SHIH I L, Milk-clotting enzymes produced by culture of Bacillus subtilis natto[j]. Biochemical Engineering Journal,2009,43: [7] 王明强, 张惟广. 发酵法生产凝乳酶的概述 [J]. 四川食品与发酵, (2): [8] BARFORD H C. Production of enzymes by fermentation[j]. In Essays in Applied Microbiology, 1981, [9] 王旭冰, 娄永江. 纳豆芽孢杆菌的开发与利用 [J]. 中国调味品,2010,4(35): [10] ARIMA K, SHINITER I,GAKUZO T. Milk-clotting enzymes from microorganism. part I :Screening test and identification of potent fungus [J]. Agricultural and Biological Chemistry, 1967, 31(5): [11] 薛璐, 陈历俊, 姜铁民, 等江米酒凝乳酶酶学特性的研究 [J]. 食品科学,2008,29(04): [12] CHITPINITYOL S,CRABBE M,Chymosin and aspartic proteinases[j]. Food Chemistry,1998,61(4): [13] 孙超. 微生物酶和小牛皱胃酶凝乳特性的研究 [J]. 家畜生态, 2004,25(3):7-9 [14] MAGADA A, BENDARY E L, MAYSA E M, et al. Purification and characterization of milk clotting enzyme produced by Bacillus sphaericus[j]. Journal of Applied Sciences Research, 2007, 3(8): [15] 王景会, 李玉秋, 郑丽, 等. 微小毛霉凝乳酶的分泌表达产物纯化及鉴定 [J].,2011,33(4): ,417. [16] 滕国新. 酒曲中根霉凝乳酶性质及对扣碗酪凝乳质地影响的研究 [D]. 北京 : 中国农业大学,2005. [17] LI J, CHI Z M,WANG X H.Cloning of the SAP6 gene of Metschnikowia Reukaufii and Its Heterologous Expression and Characterization in Escherichia Coli [J]. Microbiological Research 2008, 19(3): 8-9, 10. [18] 姜媛媛, 张莉, 张健, 等. 重组凝乳酶的酶学特性的研究 [J]. 中国乳品工业,2009,37(10):4-6. [19] RAPOSO S, DOMINGOS A. Purification and Characterization Milk -Clotting Aspartic Proteinases from Centaurea Calcitrapa Cell Suspension Cultures [J]. Process Biochemistry 2008, 43(2):

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