中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology,2012,32(8):56 61 甲基营养菌 Methylobacterium spmb200 中 crti 基因的克隆及表达 1,2,3 林琼珊 1,4 唐咸来李 1,2,3 献 1,2,3 蒋承建 1,2,3 李俊芳 1,2,3 申佩弘

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1 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology,2012,32(8):56 61 甲基营养菌 Methylobacterium spmb200 中 crti 基因的克隆及表达林琼珊 1,4 唐咸来李献蒋承建李俊芳申佩弘 (1 广西大学生命科学与技术学院南宁微生物及植物遗传工程教育部重点实验室南宁 ) (3 亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室南宁广西壮族自治区科学技术厅南宁 ) 摘要八氢番茄红素脱氢酶 (CrtI) 催化八氢番茄红素经过 4 次脱氢合成番茄红素, 或者经过 3 次脱氢合成链孢红素, 在类胡萝卜素的生物合成中发挥重要的作用以甲基营养菌 MethylobacteriumspMB200 为原始菌株, 首先采用转座子突变技术构建部分突变体库共株, 筛选得到 33 株颜色发生变化的目的突变体, 随后利用分子克隆技术从目的突变体中获得 crti 基因的完整 ORF, 长为 1539bp, 编码 512 个氨基酸与来自 M.populiBJ001 M.chloromethanicum CM4 和 M.extorquensAM1 的 crti 一致性均为 93% 将 crti 与载体 pcm80 连接得到重组质粒 pcm80 crti, 导入原始菌株中得到重组菌 MB200/pCM80 crti 测定原始菌株与重组菌株的 CrtI 酶活, 结果发现, 重组菌株 CrtI 的酶活与原始菌株相比约提高了 40% 实验结果为完善甲基营养菌中类胡萝卜素的生物合成代谢途径提供了理论参考关键词甲基营养菌 crti 八氢番茄红素克隆表达中图分类号 Q786 类胡萝卜素广泛存在于植物和微生物中, 是类异戊二烯的一个亚科负责许多动植物和微生物的颜色并且在作为光合系统的光收集原件光保护抗氧化剂和细胞膜流动性调控子方面发挥重要的生物学功能商业上更多地被用于食品化妆品保健品医药等各个领域 [1 2] 植物和细菌中类胡萝卜素的生物合成途径已被部分阐释, 如图 1 所示, 类胡萝卜素合成途径的第一步是生成异戊烯焦磷酸 (IPP), 大多数细菌中 IPP 的形成过程由甘油醛三磷酸与丙酮酸反应生成 1 脱氧 D 木酮糖 5 磷酸 (DXP) 开始, 被称为甲羟戊酸独立途径尽管 IPP 转化的完整过程仍未被完全阐明, 但是中间过程的一些基因已经被鉴定出来 [3 4] IPP 和它的同分异构体二甲基丙烯焦磷酸通过不同程度的缩聚形成各种各样的异戊二烯化合物, 其中有一些对于生物生长至关重要接着 4 个 IPP 在 GGPP 合成酶催化下缩收稿日期 : 修回日期 : 国家自然科学基金 ( ) 第四十九批博士后基金 ( ) 资助项目通讯作者, 电子信箱 :sos89@126.com 图 1 细菌类胡萝卜素生物合成途径 [3 9] 及相关基因 Fig.1 Thebacterialcarotenoidbiosynthesis pathwaysandasociatedgenes 合形成? 牛儿基? 牛儿基二磷酸 (GGPP), 两个 GGPP 分子在八氢番茄红素合成酶 (crtb) 作用下缩合形成前

2 2012,32(8) 林琼珊等 : 甲基营养菌 MethylobacteriumspMB200 中 crti 基因的克隆及表达 57 体物八氢番茄红素 [3], 然后由八氢番茄红素脱氢酶 (CrtI) 诱导其发生一系列的脱饱和作用从而产生了分子多态性对于 Rhodobactercapsulatus 来说, 经过 CrtI 的 3 次脱氢形成黄色的链孢红素, 对于许多其他的细菌来说, 则经过 CrtI 的 4 次脱氢作用产生红色化合物番茄红素 [5] 以这些化合物为起点, 通过进一步的分子修饰作用如脱饱和甲基化和羟基化作用形成多种类胡萝卜素, 比如 β 胡萝卜素玉米黄素和虾青素 [3] 本研究采用自身具有类胡萝卜素合成代谢途径的 M.spMB200 作为出发菌株, 构建颜色发生变化的突变体, 得到参与类胡萝卜素合成代谢过程中的八氢番茄红素脱氢酶基因, 并构建表达重组菌 MB200/pCM80 crti, 研究原始菌与重组菌的 CrtI 酶活力关系为完善甲基营养菌的代谢途径提供理论参考, 也为研究在甲基营养菌中生产类胡萝卜素奠定了理论基础 1 材料与方法 1.1 材料实验所用菌株 M.spMB200 和大肠杆菌 DH5α 为本实验室储存, 所用质粒为 prk2013(km r ) [10] ptnmod RKm (Km r ) [11] pgem 3Zf(+) (Amp r, Promega) pmd18 T(Amp r,takara 公司 ) pcm80 (Tc r ) [12] 基本培养基 MMI 的配方见文献 [13] 常用抗生素及使用浓度为氨苄青霉素 (Ampicilin,50μg/ml) 卡那霉素 (Kanamycin,25μg/ml) 四环素 (Tetracyclin, 25μg/ml) 萘啶酮酸 (Nalidixicacid,50μg/ml) Taq Plus 聚合酶购自 Tiangen,T4 DNAligase 购自 TaKaRa 公司, 八氢番茄红素购自加拿大 TRC 公司基因组 DNA 提取试剂盒质粒 DNA 提取试剂盒胶回收试剂盒和 PCR 产物纯化试剂盒等均购自 BioFlux 公司其他生化试剂购自上海生工公司试验所用引物也由该公司合成, 见表 1 表 1 实验所用引物 Table1 Primersusedinthisstudy 引物序列 prkm3 5 CCTTCTTCACGAGGCAGACCTCAGC 3 F prkm3 5 CAGGAACACTTAACGGCTGACATGG 3 crti R 5 ATGAGCCAGGGTTCTTCGGTCGC 3 crti F 5 TCAGGCGCTCTTGCGCAGTT 3 crti PR 5 GTTCTGCAGTATGAGCCAGGGTTCTTCG 3 crti EF 5 GTTGAATTCTCAGGCGCTCTTGCGCAGTTCCGACTC 方法突变体库的构建与突变体的筛选采用三亲本接合的方法 [14], 以 M.spMB200 为受体菌,DH5α/ ptnmod RKm 为供体菌,DH5α/pRK013 为帮助菌, 将 M.spMB200 于 32 液体培养 72h,DH5α/pTnMod RKm DH5α/pRK013 于 37 培养 12~16h 后, 分别取菌体比例为 M.sp MB200 DH5α/pTnMod RKm DH5α/pRK013=4 1 1, 用 0.85% 生理盐水洗涤两次, 第 2 次洗涤时将 3 种菌体混合在一起, 用 40μlMMI ( 含 20% LB) 混合悬浮 3 种亲本菌, 用移液器转移至放在固体 MMI 平板 ( 加 20% LB 培养基, 不加抗生素 ) 上的硝酸纤维素膜, 晾干后于 32 倒置培养 3d 每隔 12 h 用灭菌牙签从滤膜上菌落边缘挑取部分菌落, 置于灭菌 Ep 管中, 取 1mlMMI 液体培养基清洗牙签, 稀释后涂布于固体 MMI[ 含 Nm(500μl/200ml) Km (125μl/200ml)] 的平板上,32 倒置培养 72h 重复筛选培养 3 次从突变体库中挑取颜色变化的单菌落进一步培养突变基因全序列的克隆提取颜色变化突变体的基因组 DNA 后用 BamHI 酶切, 产物经 DNA 纯化后, 与同样处理的 pgem 3Zf(+) 载体相连, 转化至 DH5α 感受态细胞, 涂布到含 Km(pTnMod RKm ) 和 Amp[pGEM 3Zf(+)] 的 X gal 和 IPTG 平板上进行筛选进一步提取质粒并用 BamHI 酶切验证, 使用转座子两端引物 F prkm3 和 prkm3 进行测序, 测序结果拼接进行序列分析克隆载体的构建根据测序序列的完整 ORF 设计引物 crti R 和 crti F, 从 M.spMB200 基因组 DNA 中扩增出目的片段 crti, 与 pmd18 T 载体连接, 构建克隆载体 pmd crti, 转化至 DH5α 感受态细胞后涂布到含 Amp 的 X gal 和 IPTG 平板上进行筛选鉴定表达载体的构建设计两端分别含 PstI 酶切位点和 EcoRI 酶切位点的引物 crti PR 和 crti EF, 从克隆载体 pmd crti 中扩增出 crti 目的片段, 胶回收目的片段并进行双酶切, 与同样酶切处理的 pcm80 表达载体连接, 构建表达载体 pcm80 crti, 转化至 DH5α 感受态细胞中, 筛选阳性重组子命名为 DH5α/pCM80 crti 工程菌的构建以野生菌 M.spMB200 为受体菌,DH5α/pCM80 crti 为供体菌,DH5α/pRK2013 为帮助菌, 通过三亲接合的方法, 将表达重组质粒导入野生菌中, 构建表达工程菌 MB200/pCM80 crti 菌株生长情况分析先在 10ml 指型瓶中活化

3 58 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology Vol.32No 培养野生型 M.spMB200 和重组型 MB200/pCM80 crti 3~4d, 然后以相同的接种量 (1%) 转接于 200ml 培养瓶中, 每隔 6h 测量其在 OD 600 的吸光度, 根据吸光度绘制生长曲线, 以此来衡量野生菌与重组菌的生长情况重组菌株遗传性状稳定性研究分别倒两组 MMI 平板, 命名为 MMI(+) 和 MMI( ) MMI(+) 平板加入抗生素 Tc(pCM80 crti) 和 Nm(MB200),MMI ( ) 平板不加入抗生素将鉴定正确后的重组工程菌 (MB200/pCM80 crti) 适当稀释后涂布平板,32 恒温培养 72h( 为第 1 代 ), 用灭菌牙签挑取 9 个单菌落, 将同一菌落分别接种于 MMI(+) 和 MMI( ),32 恒温培养 72h( 为第 2 代 ) 后进行菌落计数, 将 MMI( ) 生长的菌落分别接种于 MMI(+) 和 MMI( ),32 恒温培养 72h( 为第 3 代 ) 后菌落计数依此方法连续传代 20 次, 观察每一代菌落生长形态, 同时从最后一次传代菌落中任意挑取单菌落, 提取质粒进行 PCR 验证和送交生物公司测序, 确定其遗传性状稳定性粗酶液的制备粗酶液的制备 :M.spMB200 和 MB200/pCM80 crti 经液体培养 3~4d 至 OD=1.0 后取新鲜菌液 15ml, 于 4,6000r/min 离心 10min, 弃去上清, 用 10ml 的 Tris HCl(pH=7.9,0.04mol/L) 洗涤菌体沉淀 2 次, 称取相同的菌体湿重量 (0.195g), 用 10mlTris HCl(pH=7.9,0.04mol/L) 悬浮沉淀, 超声波破碎, 功率为 36%, 总时间 30min( 每隔 10s 停顿 10 s),4,6000r/min 离心 20min, 收集上清保存于指型瓶中, 即为粗酶液酶活的测定酶活测定方法参考文献 [15 16], 稍作修改 0.5ml 反应体系中含有 0.4mol/L 的 Tris HCl,5 mmol/l DTT,0.2mmol/L FAD, 0.01mmol/L 的 ATP,6μmol/L 的 MgCl 2,4μmol/L 的 MnCl 2,1mmol/L 的八氢番茄红素,32 避光反应 30 min, 加入 1.5ml 甲醇终止反应, 沸水煮沸 15min, 以 ddh 2 O 为空白对照, 测定反应前后样品在波长 370nm 的紫外吸收值, 计算体系中 1min 内 FAD 的改变量并计算酶活酶活定义 : 在 32,pH7.9 条件下, 每分钟转化 1 μmol 的 FAD 所需酶量为 1 个酶活单位 1U, 用 U/ml 表示酶活力 (U/ml)=(A V n)/t m A 为样品的吸光光度对应的 FAD 的数值 (μmol), V 为反应溶液的总体积 (ml),n 为粗酶液的稀释倍数,t 为反应时间 (min),m 为酶体积 (ml) FAD 标准曲线的绘制以 FAD 作为辅酶测定八氢番茄红素脱氢酶 (CrtI) 的酶活,FAD 在波长 370 nm 处有明显的光吸收, 因此配制 FAD 标准液, 以 ddh 2 O 为空白对照, 测定其 OD 370 光吸收值, 并绘制 FAD 浓度与 OD 370 光吸收值之间的曲线, 每个样品重复 3 次测定结果如图 2 所示 : 图 2 FAD 标准曲线 Fig.2 ThestandardcurveofFAD 2 结果与分析 2.1 突变体库的构建与突变体的筛选通过转座子突变技术和三亲本接合的方法, 共获得突变体株, 其中发生颜色变化的突变体 33 株, 图 3 为发生颜色变化前后对比结果图 3 野生菌与突变菌颜色对比 Fig.3 ColordiferencebetweenM.spMB200 andmbw31 1:M.spMB200;2:ThemutantMBW 突变基因全序列的克隆提取突变体 MBW31 的基因组 DNA 用 BamHI 酶切后与同样酶切的载体 pgem 3Zf(+) 连接, 转化至 DH5α 中进行重组子的筛选, 提取重组质粒进行酶切鉴定, 酶切后大小为 1.8kbDNA 片段可能含有的转座子

2012,32(8) 林琼珊等 : 甲基营养菌 MethylobacteriumspMB200 中 crti 基因的克隆及表达 59 部分, 也就应该为转座子插入的位置, 将重组质粒分别用引物 prkm3 F prkm3 进行测序, 测序结果显示序列包含一个大小为 1539bp 的 ORF, 该 ORF 编码 512 个氨基酸通过 NCBI 网站上的 Blast

3 重组菌株的构建利用两端分别含 PstI 和 EcoRI 酶切位点的引物 crti PR 和 crti EF 扩增 crti, 双酶切纯化后与同样处理的 pcm80 载体相连, 转化至 DH5α 感受态细胞中, 涂布到含 Tc 的 X gal 和 IPTG 的平板上, 筛选转化子, 提取重组质粒进行酶切鉴定 ( 图 4), 将阳性重组子命名为 DH5α/pCM80 crti 图 5 甲基营养菌

4 2012,32(8) 林琼珊等 : 甲基营养菌 MethylobacteriumspMB200 中 crti 基因的克隆及表达 59 部分, 也就应该为转座子插入的位置, 将重组质粒分别用引物 prkm3 F prkm3 进行测序, 测序结果显示序列包含一个大小为 1539bp 的 ORF, 该 ORF 编码 512 个氨基酸通过 NCBI 网站上的 Blast 软件分析表明该基因的核苷酸序列与来自 M. populibj001 M. chloromethanicumcm4 和 M.extorquensAM1 的 crti 基因一致性均为 93% 2.3 重组菌株的构建利用两端分别含 PstI 和 EcoRI 酶切位点的引物 crti PR 和 crti EF 扩增 crti, 双酶切纯化后与同样处理的 pcm80 载体相连, 转化至 DH5α 感受态细胞中, 涂布到含 Tc 的 X gal 和 IPTG 的平板上, 筛选转化子, 提取重组质粒进行酶切鉴定 ( 图 4), 将阳性重组子命名为 DH5α/pCM80 crti 图 5 甲基营养菌 MB200 和重组菌 MB200/ pcm80 crti 生长情况 Fig.5 ThegrowthsituationofM.spMB200 andmb200/pcm80 crti pcm80 crti 经连续传代培养 20 代后, 在 MMI(+) 和 MMI( ) 固体培养基上的菌落个数均为 9 个, 菌落生长形态特性无明显差异, 如图 6 所示为所提取质粒的 PCR 验证结果, 与预期符合, 目的基因 crti 的测序结果完全正确说明重组菌株具有良好的遗传稳定性图 4 重组质粒 pcm80 crti 酶切验证 Fig4 TheconfirmationofrecombinantpCM80 crti plasmiddigestedbypsti 和 EcoRI 1:λ/Hind IDNA;2:UndigestedpCM80 crti;3:pcm80 crti digestedbypsti,ecori;4:1kbladderdna 以野生菌 M.spMB200 为受体菌,DH5α/pCM80 crti 为供体菌,DH5α/pRK2013 为帮助菌进行三亲本接合, 将重组质粒导入野生菌中, 构建重组菌 MB200/ pcm80 crti 2.4 野生菌与重组菌生长情况分析通过每隔 6h 测定液体培养的 M.spMB200 和 MB200/pCM80 crti 在 OD 600 的吸光度来衡量野生菌与重组菌的生长情况 ( 图 5), 结果表明, 重组菌 MB200/ pcm80 crti 比野生菌 M.spMB200 约晚 14h 到达稳定生长期 2.5 重组菌株遗传性状稳定性研究根据节所述方法, 发现重组工程菌 MB200/ 图 6 重组质粒的 PCR 验证 Fig.6 Confirmationofrecombinantplasmids 1:1kbladderDNA;2:Negativecontrol;3:PCRproducts 2.6 酶活的测定根据节所述方法测定并计算 CrtI 酶活, 计算结果表明, 相同菌体量的情况下, 野生菌株 M.sp MB200 中每分钟转化 1μmol 的 FAD 所需酶量为 U/ml, 重组菌 MB200/pCM80 crti 中每分钟转化 1 μmol 的 FAD 所需酶量为 U/ml, 重组菌比野生菌每分钟转化 1μmol 的 FAD 所需酶量约减少了 40% 3 讨论在国内, 对甲基营养菌类胡萝卜素合成途径的研究鲜见有相关报道, 主要集中于对菌种的筛选分离, 利用甲醇酵母发酵生产单细胞蛋白作为蛋白质饲料以及

5 60 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology Vol.32No 利用固定化细胞降解废水的研究 [17 18] 本实验室多年来也一直致力于对甲基营养菌代谢途径方面的研究, 尤其注重丝氨酸循环对生产 L 丝氨酸方面的研究 [19] [6] 国外在这方面研究也不多,2003 年,Vandien 等在 M. extorquensam1 中克隆得到此基因, 并证明该基因与表型颜色变化密切相关, 同时从 M.extorquensAM1 中初 [20] 步分离得到类胡萝卜素 2006 年,Konovalova 等采用硅胶薄层色谱法分离并鉴定了粉红色兼性甲基营养 [21] 菌属的类胡萝卜素色素 2007 年,Konovalova 等用色谱和分光光度方法定性和定量分析了甲基营养菌属菌株 M.extorquensB 3362 M.fujisawaenseB 3365 和 M.mesophilicumB 3352 的类胡萝卜素, 发现类胡萝卜素存在种间差异另外, 通过 NCBI 网站的遗传搜索发现, 对甲基营养菌中 crti 基因深入研究得不多, 主要为通过全基因组测序得到的序列, 列表对比如下 ( 表 2) 表 2 甲基营养菌中八氢番茄红素脱氢酶基因的研究总结 Table2 Summaryofphytoenedesaturasegene inmethylobacterium Gene OriginalBacterium Length AccesionNumber crti M.spMB bp Thiswork crti M.populiBJ bp CP crti M.chloromethanicum 1539bp CP crti M.extorquensAM1 1539bp CP crti M.extorquensPA1 1539bp CP crti M.extorquensDM4 1539bp FP crti M.sp bp CP crti M.radiotoleransJCM bp CP 国外主要采用分光光度法薄层色谱法等对微生物产的色素包括类胡萝卜素进行分离鉴定, 还未见从分子水平上研究或构建工程菌进行生产本研究从类胡萝卜素生物合成代谢途径中的关键基因着手, 重点研究在类胡萝卜素生物合成代谢途径转折点 ( 图 1) 发挥关键作用的八氢番茄红素脱氢酶基因 (crti), 并从基因表达水平上研究甲基营养菌的类胡萝卜素生物合成代谢途径, 这从另一方面为完善甲基营养菌的代谢途径提供理论参考, 也为研究在甲基营养菌中生产类胡萝卜素奠定了理论基础参考文献 [1] Daisuke Umeno,AlexanderV Tobias,Frances H Arnold. Diversifying carotenoid biosynthetic pathways by directed evolution.microbiologyandmolecularbiologyreviews,2005, 69(1): [2] AnujBhataya,ClaudiaSchmidt Dannert,PyungCheon Lee. Metabolicengineering ofpichia pastorisx 33 forlycopene production.procesbiochemistry,2009,44(10): [3] BarkovichR,LiaoJC.Metabolicengineeringofisoprenoids. MetabolicEngineering,2001,3(1): [4]RohdichF,WungsintaweekulJ,LutgenH,etal.Biosynthesisof terpenoids: 4 diphosphocytidyl 2 C methyl D erythritolkinase fromtomato.proceedingsofthenationalacademyofsciences, USA,2000,97(15): [5]Garcia AsuaG,LangHP,CogdelRJ,etal.Carotenoiddiversity: amodularroleforthephytoenedesaturasestep.trendsinplant Science,1998,3(11): [6] Vandien S J,Marx C J,O Brien B N,etal.Genetic characterization ofthe carotenoid biosynthetic pathway in Methylobacterium extorquensam1andisolationofacolorles mutant.applied and EnvironmentalMicrobiology,2003,69 (12): [7]ArmstrongGA,AlbertiM,LeachF,etal.Nucleotidesequence, organization,andnatureoftheproteinproductsofthecarotenoid biosynthesisgeneclusterofrhodobactercapsulatus.molecular andgeneralgenetics,1989,216(2 3): [8]HundleB,AlbertiM,NievelsteinV,etal.Functionalasignment oferwinia herbicola Eho10 carotenoid genes expresed in Escherichiacoli.Molecularand GeneralGenetics,1994,245 (4): [9]RohmerM.Thediscoveryofamevalonate independentpathwayfor isoprenoidbiosynthesisinbacteria,algaeandhigherplants. NaturalProductReports,1999,16(5): [10]FigurskiDH,HelinskiDR.Replicationofanorigin containing derivativeofplasmidrk2 dependentonaplasmidfunction providedintrans.procnatlacadsciusa,1979,76(4): [11] DennisJJ,Zylstra G J.Plasposons: modularself cloning minitransposonderivativesforrapidgeneticanalysisofgram negative bacterial genomes. Applied and Environmental Microbiology,1998,64(7): [12]MarxCJ,LidstromME.Developmentofimprovedversatilebroad host rangevectorsforuseinmethylotrophsandothergram negativebacteria.microbiology,2001,147(8): [13] GreenP N.Methylobacterium.Protebacteria:AlphaandBeta Subclases.NewYork:SpringerNewYork, [14]TurnerP,BarberC,DanielsM.BehaviourofthetransposonTn5 andtn7inxanthomonascampestrispv.campestris.molecular andgeneralgenetics,1984,195(1 2): [15]FraserPD,MisawaN,LindenH,etal.ExpresioninEscherichia coli,purification,andreactivationoftherecombinantemoiniu uredovora phytoene desaturase.the Journoal of Biolgical Chemistry,1992,267(28):

6 2012,32(8) 林琼珊等 : 甲基营养菌 MethylobacteriumspMB200 中 crti 基因的克隆及表达 61 [16] XuZJ,TianB,SunZT,etal.Identificationandfunctional analysisofaphytoenedesaturasegenefrom theextremely radioresistantbacterium Deinococusradiodurans.Microbiology, 2007,153(5): [17] 宋志文, 陈冠雄, 马放, 等. 甲醇降解菌的分离及性质研究. 生物技术,2001,11(3): SongZW,ChenGX,MaF,etal.Isolationandcharacterizationof bacteriacapableofdegrading.biotechnology,2001,11(3): [18] 宋志文, 陈冠雄, 马放, 等. 固定化生物活性炭处理低浓度甲醇废水. 城市环境与城市生态,2001,14(5): SongZW,ChenG X,MaF,etal.Slightlypolutedmethanol wastewatertreatmentusingimmobilizedbiologicalactivatedcarbon method.urbanenvironmentandurbanecology,2001,14(5): [19] 申佩弘. 甲基营养菌 MethylobacteriumspMB200 中丝氨酸循环相关基因 (glya hpr) 的研究与应用. 南宁 : 广西大学生命科学与技术学院, 博士学位论文,2007. ShenPH.Researchandapplicationofthegenes(hprandglyA) involvedin theserinecycleofmethylobacterium sp MB200. Colege oflife Science and Technology,Nanning:Guangxi University,DoctoralDisertation,2007. [20] KonovalovaA M,Shylin S O,RokytkoP V.Isolation and preliminarycharacterizationofcarotenoidsfrom pink pigmented methylotrophs.journalarticle.2006,78(4): [21] KonovalovaA M,ShylinSO,RokytkoPV.Characteristicsof carotinoids of methylotrophic bacteria of Methylobacterium genus.mikrobiolz,2007,69(1): CloningandExpresioncrtIGeneinMethylobacterium spmb200 LINQiong shan TANGXian lai 1,4 LIXian JIANGCheng jian LIJun fang SHENPei hong (1ColegeofLifeScienceandTechnologyofGuangxiUniversity,Nanning ,China) (2TheKeyLaboratoryofMinistryofEducationforMicrobialandPlantGeneticEngineering,Nanning ,China) (3StateKeyLaboratoryforConservationandUtilizationofAgriculturalBioresourcesintheSubtropics,Nanning ,China) (4TheScienceandTechenologyDepartmentofGuangxi,Nanning ,China) Abstract ThepartialmutantslibraryofM.spMB200wasconstructedbytransposonmutagenesisand 11552mutantswereobtained which could survived in medium with methanolasthesolecarbon source. Rescreeningresultsshowedthat33strainswerecolorlesmutants.ThecrtIgenewasgotfromacolorlesmutant bymolecularcloning techniques. Itshared 93% identity with the crtigene ofm. populibj001, M. chloromethanicumcm4andm.extorquensam1atthenucleotidelevelreportedingenbank.thegenesizeis 1539bp, encoding the phytoene desaturase(crti) thatcatalyzesphytoene to form lycopene with four desaturations,orcatalyzesphytoenetoformneurosporenewiththreedesaturations,thereforeitplaysanimportant roleinthebiosyntheticpathwayofcarotenoid.here,arecombinantplasmidpcm80 crtiwasconstructedby ligatingthecrtitothevectorpcm80,thenimportedintom.spmb200toobtainrecombinantstrainmb200/ pcm80 crti.theactivityofenzymefrom MB200/pCM80 crtiwasmoreby40% thanm.spmb200.the experimentalresultsprovidedatheoreticalreferencetoimprovethebiosyntheticandmetabolicpathwaysof carotenoidinmethylobacterium. Keywords M.sp crti Phytoene Cloning Expresion

材料! 方法! # 基因的扩增及其序列分析

材料! 方法! # 基因的扩增及其序列分析生物技术通报黄艳燕黄靖华卢福芝孙靓彭立新周兴黄日波利用的方法从鼠李糖乳杆菌基因组中扩增到乳酸脱氢酶基因并连接到载体上构建表达质粒将重组质粒转化大肠杆菌重组菌株经诱导表达电泳分析表明在大肠杆菌中实现了表达表达产物的分子量约为同时采用紫外分光光度法测定乳酸脱氢酶的酶活测得重组菌株的乳酸脱氢酶活力为最适反应温度为最适乳酸脱氢酶克隆表达鼠李糖乳杆菌

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