2011,31(2) 宋修鹏等 : 甲基营养菌 Methylobacteriumsp.MB200 中部分一碳代谢相关基因的定位及 mtda 51 剂盒和 PCR 产物纯化试剂盒等均购自 BioFlux 公司. 其他生化试剂购自上海生工公司表 1 菌株及质粒 Table1 Bacterialstra

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1 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology,2011,31(2):50?55 甲基营养菌 Methylobacterium sp.mb200 中部分一碳代谢相关基因的定位及 mtda 和 mtdb 基因的克隆研究宋修鹏武波申佩弘蒋承建田丹丹 1,4 唐咸来 (1 广西大学生命科学与技术学院南宁微生物及植物遗传工程教育部重点实验室南宁 ) (3 广西亚热带生物资源保护利用重点实验室南宁广西壮族自治区科学技术厅南宁 ) 摘要以甲基营养细菌 Methylobacteriumsp.MB200 为出发菌株, 首先利用质粒转座子 (ptnmod RKm ) 构建了目的菌株 MB200 的部分突变体库, 获得能够在双抗性 MMI 板上生长的突变体共株, 然后在双抗性 MMI 板上复筛获得不能够利用甲醇的突变体 333 株 ( 初步认为是一碳代谢途径被破坏的突变株 ), 为一碳代谢相关基因的克隆研究奠定了基础随后利用 TAIL PCR 技术快速准确地从突变体库中定位了部分与一碳代谢相关的基因, 并根据 ptnmod RKm 具有复制起始位点能够快速克隆插入位点侧翼序列的特性克隆到 mtda 和 mtdb 基因的全序列并进行了初步分析关键词甲基营养菌突变体库 ptnmod RKm TAIL PCR mtda mtdb 中图分类号 Q785 甲基营养菌即是一类能够利用甲醇甲胺等甲基化合物 ( 即不含 C C 键的复合物 ) 作为唯一的能源和碳源生长的微生物 [1] 在甲基杆菌的 C 1 代谢过程中, 共有 100 多个基因参与, 它们属于一系列特殊的代谢模式, 包括甲醇氧化甲胺氧化甲醛氧化甲酸氧化和丝氨酸循环等此类菌具有广泛的商业价值, 目前已有研究利用其生产氨基酸胞外多糖单细胞蛋白聚 β 羟基丙酮酸类胡萝卜素维生素和辅酶等物质 [2] 研究发现甲基营养菌的代谢途径已经成为一种新的代谢模式由于甲醇价格低廉, 因此研究利用甲基营养菌的一碳代谢途径提高利用单碳化合物的能力即生物转化力具有重要的意义 [3 4] Shen 等从 MB200 中成功克隆了一碳代谢相关的丝氨酸乙醛酸氨基转移酶基因 (sga) 羟基丙酮酸还原酶基因 (hpr) 和丝氨酸羟甲基转移酶基因 (glya) 等, 并进行了功能的鉴定分析, 成功构建了 glya 基因过量表达的重组菌株, 发现利用其发酵生产 L 丝氨酸时可收稿日期 : 修回日期 : 通讯作者, 电子信箱 :xltang163@1623.com 提高甲醇的转化率且产量较原始菌株提高了 5 倍本研究旨在利用质粒转座子 (ptnmod RKm ) 构建目的菌株 MB200 的部分突变体库, 筛选获得一碳代谢途径被破坏的突变株, 为一碳代谢相关基因的克隆研究奠定基础 [5 6] 通过 TAIL PCR 对部分突变基因进行了初步定位, 并根据 ptnmod RKm 转座子自身特点克隆到编码亚甲基四氢叶酸脱氢酶的基因 mtda 和编码亚甲基四氢甲烷蝶呤脱氢酶基因的 mtdb, 为进一步深入研究一碳代谢及 L 丝氨酸的生成打下基础 1 材料与方法 1.1 材料实验所用菌株和质粒见表 1, 基本培养基 MMI 的配方见文献 [7], 选择培养基 MMI 与 MMI 的区别是将培养基的唯一碳源甲醇换成了丁二酸实验使用抗生素为 Amp(50μg/ml) Km(25μg/ml) 和 Nm(50μg/ml) 试验所用的引物序列见表 2, 由上海生工合成 Ex Taq 聚合酶和 T4 DNAligase 购自大连 TaKaRa 公司基因组 DNA 提取试剂盒质粒 DNA 提取试剂盒胶回收试

2011,31(2) 宋修鹏等 : 甲基营养菌 Methylobacteriumsp.MB200 中部分一碳代谢相关基因的定位及 mtda 51 剂盒和 PCR 产物纯化试剂盒等均购自 BioFlux 公司. 其他生化试剂购自上海生工公司表 1 菌株及质粒 Table1 Bacterialstrainsandplasmids 菌株 / 质粒特性来源 Methylobacteriumsp.

2 2011,31(2) 宋修鹏等 : 甲基营养菌 Methylobacteriumsp.MB200 中部分一碳代谢相关基因的定位及 mtda 51 剂盒和 PCR 产物纯化试剂盒等均购自 BioFlux 公司. 其他生化试剂购自上海生工公司表 1 菌株及质粒 Table1 Bacterialstrainsandplasmids 菌株 / 质粒特性来源 Methylobacteriumsp.MB200 wildtypestrain,nm r laboratorystock E.coliDH5α SupE44,ΔlacU169(ψ80lacZΔM15)hsdR17RecA1endA1gyrA96thi 1relA1 [8] prk2013 helperplasmid,mob +,ColE1,Km r,tra + [9] ptnmod RKm Suicideplasmid,Nm r [10] pmd18 T CloneVector,Amp r TaKaRa 公司表 2 试验所用引物 Table2 Primersusedinthisstudy 引物序列来源 prkm1 5 AGATCACGCATCTTCCCGACAACGC 3 Thiswork prkm2 5 ACGCAGACCGTTCCGTGGCAAAGC 3 Thiswork prkm3 5 CCTTCTTCACGAGGCAGACCTCAGC 3 Thiswork F prkm1 5 CAGGAACACTTAACGGCTGACATGG 3 Thiswork F prkm2 5 AACGCACTGAGAAGCCCTTAGAGCC 3 Thiswork F prkm3 5 CAGGAACACTTAACGGCTGACATGG 3 Thiswork AD1: 5 NTCGAW TSTWGSGTT 3 [11 12] AD2: 5 NGTCGAWSGANASGAA 3 [11 12] AD3: 5 TGSGNAGWANCAWAGA 3 [13] AD4 5 AGSGNAGSANCASAGG 3 [13] Note:N:A/G/CorT;W:G/C;S:A/T;O:A/G 1.2 方法 TAIL PCR 法定位转座子插入位点首先根据转座子的已知序列设计了表 2 中的 6 条特异性引物 ( 其中 prkm2 和 prkm3 相距 137bp;F prkm2 和 F prkm3 相距 48bp) 以及 4 条兼并引物然后利用 TAIL PCR 的方法大量快速地克隆转座子插入位点两侧的序列 [12 14] PCR 产物测序后经 NCBI 数据库比对筛选出有研究价值的突变菌株突变基因全序列的克隆提取突变菌株的总 DNA 后用相应的限制性内切酶 (BamHI 或 Hind I) 过夜酶切, 产物经 PCR 产物纯化试剂盒纯化后, 加入 DNA ligase 后 16 过夜自连 ( 或与用相应的限制性内切酶酶切纯化后的 PMD18 T 载体相连 ), 将连接产物转化已制备好的 CC118λpir 感受态细胞 ( 或 DH5α 感受态细胞 ) 后涂布到双抗性 Km 和 Rif( 或 Km 和 Amp) 的平板上,37 培养 12h 后挑取平板上的菌落提取质粒对质粒进行初步酶切验证无误后, 将质粒送上海生工公司测序, 分别使用引物 F prkm3 和 prkm3, 最后将测序结果拼接后找出完整 ORF 并进行相关的生物信息学分析 2 结果与分析 2.1 目的突变菌株的获得将通过三亲本结合方法获得的能够在双抗性的 MMI 中生长的株突变菌株, 全部一一对应地转点到双抗性的 MMI 平板中, 筛选出不能够在 MMI 中生长的突变菌株即为我们的目的菌株, 如图 1 所示 : 图 1 目的突变株的筛选 Fig.1 Mutantsscreeningtest 2.2 突变菌株基因组 DNA 的提取将目的菌株养到对数生长期, 约 72h(OD=0.6~ 1.0), 然后按照 BioFlux 公司基因组 DNA 提取试剂盒的提取说明提取突变体的基因组 DNA, 提取后取 1μl 电泳定量 ( 图 2)

52 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology Vol.31No.22011 2.4.

2 GenomicDNAextractedfrom mutants M:LambdaDNA/HindⅢ;1~14:Mutants genomicdna 2.

4 DigestionthegenomicDNAofIand Ⅵ mutants M:λHind IDNA;1:DigestionthegenomicDNAofImutantby Hind I;2:DigestionthegenomicDNAofⅥ mutantbybamhi 图 3 部分 TAIL PCR 二级和三级反应对应点样 Fig.

3 52 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology Vol.31No 基因组 DNA 和 PMD18 T 质粒的酶切分别用 BamHI 和 Hind I 将 mtda 基因被突变 (6 号菌 ) 和 mtdb 基因被突变 (2 号菌 ) 的突变体基因组 DNA 完全酶切, 并用相应的限制性内切酶将 PMD18 T 质粒酶切 ( 图 4 图 5) 图 2 突变体基因组 DNA 提取 Fig.2 GenomicDNAextractedfrom mutants M:LambdaDNA/HindⅢ;1~14:Mutants genomicdna 2.3 TAIL PCR 法定位转座子插入的基因利用 TAIL PCR 的方法大量快速地定位转座子插入基因将二级产物做大体系扩增, 胶回收后送测序, 测序结果经 NCBI 数据库 Blast 后筛选出有研究价值的突变株图 3 为部分突变菌株的 TAIL PCR 结果图 4 完全酶切 2 号菌和 6 号菌基因组 DNA Fig.4 DigestionthegenomicDNAofIand Ⅵ mutants M:λHind IDNA;1:DigestionthegenomicDNAofImutantby Hind I;2:DigestionthegenomicDNAofⅥ mutantbybamhi 图 3 部分 TAIL PCR 二级和三级反应对应点样 Fig.3 Correspondingpoint likeoftail PCR s secondaryandtertiaryresponse M:1kbladderDNA;I:Secondaryreaction products; I:Tertiaryreactionproducts 经分析发现本次试验共定位 9 株目的突变菌的转座子突变基因, 其中 2 号和 6 号目的突变菌株突变的基因分别为亚甲基四氢甲烷蝶呤脱氢酶基因 (mtdb) 和亚甲基四氢叶酸脱氢酶基因 (mtda) 2.4 基因 mtda 和 mtdb 的完整 ORF 的克隆与序列分析以 2 号菌和 6 号菌为研究对象, 成功克隆了两个基因的完整 ORF 图 5 质粒 PMD18 T 酶切前后电泳图 Fig.5 VeryficationoftheplasmidPMD18 Tby digesting M:1kbladderDNA;1:PMD18 Tplasmid; 2:PMD18 Tplasmiddigested 重组子质粒的提取和酶切验证将用相应的限制性内切酶酶切后的基因组 DNA 和 PMD18 T 质粒进行连接反应后, 转化 DH5α 感受态细胞后涂布在 Amp 和 Km 的双抗性 LB 平板上进行筛选挑取白色菌株并提取质粒进行酶切验证 ( 图 6 图 7) mtda 和 mtdb 基因的初步生物信息学分析将

30, 通过 NCBI 数据库 Blast 比对分析发现其与 Methylobacterium extorquensdm4 的 mtdb 基因的一致性最高, 达到 94% ( 图 9) 分别利用 TMHMM 程序和 TMPRED 程序分析 mtdb 编码的蛋白质的跨膜区域和亲疏水性, 结果表明其没有跨膜结构也没有明显的疏水区域 3 讨论图 6 含 mtda 基因的重组菌株的质粒提取及酶切验证

4 2011,31(2) 宋修鹏等 : 甲基营养菌 Methylobacteriumsp.MB200 中部分一碳代谢相关基因的定位及 mtda 53 高, 达到 95%( 图 8) 通过 TMHMM 程序和 TMPRED 程序分析 mtda 编码的蛋白质的跨膜区域和亲疏水性, 结果表明其没有跨膜结构也没有明显的疏水区域 mtdb 基因全长 894bp, 编码 297 个氨基酸, 计算相对分子质量约为 31.11kDa, 其等电点 PI 为 5.30, 通过 NCBI 数据库 Blast 比对分析发现其与 Methylobacterium extorquensdm4 的 mtdb 基因的一致性最高, 达到 94% ( 图 9) 分别利用 TMHMM 程序和 TMPRED 程序分析 mtdb 编码的蛋白质的跨膜区域和亲疏水性, 结果表明其没有跨膜结构也没有明显的疏水区域 3 讨论图 6 含 mtda 基因的重组菌株的质粒提取及酶切验证 Fig.6 Extractionandveryficationofplasmid ofcontainingmtda srecombinantstrain M:1kb ladderdna 1: The plasmid ofcontaining mtda s recombinantstrain2:therecombinantstrain splasmiddigested withhind I 图 7 含 mtdb 基因的重组菌株的质粒提取及酶切验证 Fig.7 Extractionandveryficationofplasmidof containingmtdb srecombinantstrain M:1kb ladderdna;1:the plasmid ofcontaining mtdb s recombinantstrain;2:therecombinantstrain splasmiddigested withbamhi 提取的重组质粒分别用引物 prkm3 F prkm3 以及通用引物 M13 47 和 RV M 测序 ( 北京诺赛公司 ), 测序结果去除载体后用 NTI 软件拼接结果表明 mtda 基因全长 867bp, 编码 288 个氨基酸, 计算相对分子质量约为 29.78kDa, 其等电点 PI 为 7.65, 通过 NCBI 数据库 Blast 比对分析发现其与 MethylobacteriumpopuliBJ001 的 mtda 基因的一致性最 TAIL PCR 法具有高效快速和大批量克隆等优点, 但此法每次仅能获得 250bp 左右的转座子插入位点的侧翼序列 [15], 如需获得全序列需要重新设计特异性引物进行 PCR 反应, 这样获得一个完整的基因序列可能需要进行 5~6 次的引物设计 PCR 扩增和测序, 不论从时间和花费上都是不划算的因此我们采取了利用此法对突变体库中突变基因进行大批量的定位分析, 然后根据质粒转座子 ptnmod RKm 自身含有复制起始位点和细菌基因组中稀有的限制性酶切位点, 来快速克隆插入位点侧翼的大片段序列甚至是完整的 ORF 利用这两种方法的优势互补, 可以快速准确地从突变体库中克隆目的基因除 mtda 和 mtdb 基因外, 本研究还定位了目的突变体库另外 7 株转座子突变基因, 它们分别为 1 号突变菌株的丝氨酸乙醛酸氨基转移酶基因 3 号突变菌株的丁烯酰辅酶 A 还原酶基因 4 号突变菌株的乙醇脱氢酶基因 7 号突变菌株的亚甲基四氢甲烷蝶呤脱氢酶基因 51 号突变菌株的血管性假性血友病因子蛋白 A 型 MxaA 基因 54 号突变菌株的苹果酸硫激酶基因和 55 号突变菌株的假定有机溶剂性蛋白基因相关基因全序列及功能的研究正在进行在含丝氨酸循环途径的甲基营养菌中, 一碳化合物经过一系列的甲基营养代谢后首先合成亚甲基四氢叶酸, 然后才能进入丝氨酸循环通过甲醛合成亚甲基四氢叶酸两条途径分别是由甲醛和四氢叶酸直接缩合, 另一途径则是甲醛先经一系列的亚甲基四氢甲烷蝶呤依赖型酶的酶促反应转变成甲酸后再经四氢叶酸依赖型的酶促反应生成亚甲基四氢叶酸通过动力学模型试验的生理参数研究发现甲酸是甲基营养代谢的主要途径而不是甲醛, 虽然从能量消耗的角度来看这一途径是不划算

54 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology Vol.31No.22011 图 8 MB200 BJ001 和 AM1 的 mtda 基因演绎的氨基酸序列的同源比较 Fig.

5 54 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology Vol.31No 图 8 MB200 BJ001 和 AM1 的 mtda 基因演绎的氨基酸序列的同源比较 Fig.8 ThecomparisonofmtdAgenetranslatedtheaminoacidsequences homologyofmb200,bj001,am1 图 9 MB200 DM4 AM1 的 mtdb 基因演绎的氨基酸序列的同源比较 Fig.9 ThecomparisonofmtdBgenetranslatedtheaminoacidsequences homologyofmb200,dm4,am1 的 [16] mtda 和 mtdb 基因正是甲醛氧化生成甲酸过程中的关键基因, 因此克隆这两个基因的完整序列对进一步研究甲基营养菌 MB200 的一碳代谢途径工程菌株的构建及 L 丝氨酸的生产奠定了基础参考文献 [1]TansonR S,HansonTE.Methanutrophichacteria.Microbiol Rev,1996,60(2): [2]ChisteserdovaL,ChenSW,LapidusA,eta1.Methylotrophyin MethylobacteriumextorquensAM1fromagenomicpointofview.J Bacteriol,2003,185(10): [3]ShenPH.WuB.Over expresionofahydroxypyvavatereductase inmethylobacteriummb200enhancesglyoxylateaccumulation.j IndMicrobiolBiotehnol,2007,34(10): [4]ShenPH,ChaoHJ,JiangCJ,eta1.Enhancingproductionof

6 2011,31(2) 宋修鹏等 : 甲基营养菌 Methylobacteriumsp.MB200 中部分一碳代谢相关基因的定位及 mtda 55 L serine by increasing the glya gene expresion in Methylobacteriumsp.MB200.ApplBiochemBiotechnol,2009, 160(3): [5] Vandien S J, MarxC J, O Brlen B N, eta1. Genetic characterization of the carotenoid biosynthetic pathway in Methylobacterium extorquensam1 and isolation ofacolorles mutant.applenvironmicrobiol,2003,69(12): [6]MarxCJ,O BfienBN,BreezceJ,eta1.Novelmethylotrophy genesofmethylobacterium extorquensam1 identifiedbyusing transposonmutagenesisincludingaputativedihydromethanopterin reductase.jbacteriol,2003,185(2): [7] DennisJJ, ZylstraG J. Plasposons: modularself cloning minitransposonderivativesforrapid geneticanalysisofgram negativebacterialgenomes.applenvironmicrobiol,1998,64 (7): [8] Kalyuzhnaya M G, Lidstrom M E. QscR mediated transcriptionalactivationofserinecyclegenesinmethylobacterium extorquensam1.jbacteriol,2005,187(21): [9]HanahanD.StudiesontransformationofEscherichiacoliwith plasmid,jmolbid,1983,166:557. [10]FigurskiD,HelinskiD R.Replicationofanorigin containing derivativeofplasmid RK2 dependenton aplasmid function providedintrans.pnas,1979,76: [11] GreenPN.Methylobacterium.Protebacteria:AlphaandBeta Subclases.NewYork:SpringerNewYork, [12]LiuY G,WhitierR F.ThermalasymmetricinterlacedPCR: automatableamplificationandsequencingofinsertendflagments fromp1andyacclonesforchromosomalwalking.genomics, 1995,25(3): [13]LiuYG,ChenY,ZhangQ.Amplificationofgenomicsequences flankingt DNA insertionsby thermalasymmetric interlaced polymerasechainreaction.methodsmolbiol,2005,286: [14]HongDF,WanLL,YangGS,TheevaluationoftheFlanking sequence scloningmethod.molecularplantbreeding.2006,4 (2): [15] 罗丽娟, 施季森, 一种 DNA 侧翼序列分离技术 TAIL PCR. 南京林业大学学报 ( 自然科学版 ),2003,27(4): LuoLJ,ShiJS.JournalofNanjingForestryUniversity(nature scienceedition),2003,27(4): [16]CrowtherGJ,KosalyG.Formateasthemainbranchpointfor methylotrophicmetabolisminmethylobacteriumextorquensam1,j Bacteriol,2008,190(14): LocationofSomeGenesRelatedtoOneCarbonMetabolism in Methylobacterium sp.mb200andcloningofmtdaandmtdbgenes SONGXiu peng WUBo SHENPei hong JIANGCheng jian TIANDan dan TANGXian lai 1,4 (1TheColegeofIifeScienceandTechnology,GuangxiUniversity,Nanning ,China) (2KeylaboratoryofMicrobialandPlantGeneticEngineeringofMinistryofEducation,Nanning ,China) (3KeyLaboratoryofSubtropicalBioresourceConservationandUtilizationofGuangxi,Nanning ,China) (4TheScienceandTechnologyDepartmentofGuangxi,Nanning ,China) Abstract ThepartialmutantslibraryofMethylobacterium sp.mb200wasconstructedbyusingplasmid ptnmod RKm and11554mutantswereobtainedwhichcouldsurviveinmmicontainingtwoantibiotics(nm andkm).rescreeningresultsshowedthat333strainscouldnotusemethanolasthesolecarbonsource,these strainswerepreliminarilyconsideredthattheironecarbonmetabolism wayhadbeendestroyed.thislaidthe foundationforcloninggenesrelatedtoonecarbonmetabolism.thelocationanalysiswascariedoutbytail PCR,basedonthecharactersofpTnMod RKm andthefulsequenceofmtdaandmtdbgeneswerecloned. Keywords Methylobacterium Mutantslibrary ptnmod RKm TAIL PCR mtda mtdb

材料! 方法! # 基因的扩增及其序列分析

材料! 方法! # 基因的扩增及其序列分析生物技术通报黄艳燕黄靖华卢福芝孙靓彭立新周兴黄日波利用的方法从鼠李糖乳杆菌基因组中扩增到乳酸脱氢酶基因并连接到载体上构建表达质粒将重组质粒转化大肠杆菌重组菌株经诱导表达电泳分析表明在大肠杆菌中实现了表达表达产物的分子量约为同时采用紫外分光光度法测定乳酸脱氢酶的酶活测得重组菌株的乳酸脱氢酶活力为最适反应温度为最适乳酸脱氢酶克隆表达鼠李糖乳杆菌

2011,31(2) 宋修鹏等 : 甲基营养菌 Methylobacteriumsp.MB200 中部分一碳代谢相关基因的定位及 mtda 51 剂盒和 PCR 产物纯化试剂盒等均购自 BioFlux 公司. 其他生化试剂购自上海生工公司 表 1 菌株及质粒 Table1 Bacterialstra

2011,31(2) 宋修鹏等 : 甲基营养菌 Methylobacteriumsp.MB200 中部分一碳代谢相关基因的定位及 mtda 51 剂盒和 PCR 产物纯化试剂盒等均购自 BioFlux 公司. 其他生化试剂购自上海生工公司表 1 菌株及质粒 Table1 Bacterialstra