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拒紧洪
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1 第 29 卷第 5 期大连海洋大学学报 Vol 郾 29 No 郾年 1 0 月 JOURNAL OF DALIAN OCEAN UNIVERSITY Oct 郾 DOI: / J. ISSN 文章编号 : (2014) 仿刺参 3 个地理群体 ITS1 序列变异及系统发生分析姬南京, 常亚青, 高银雪, 赵冲, 宋坚 ( 大连海洋大学农业部北方海水增养殖重点实验室, 辽宁大连 ) 摘要 : 利用核糖体 DNA 第一内转录间隔区 (Internal transcribed spacer 1, ITS1) 序列, 对中国大连 ( CD) 朝鲜罗津 (KN) 和俄罗斯海参崴 (RV) 仿刺参 Apostichopus japonicus 3 个群体的遗传结构进行分析结果表明 : 经 PCR 扩增克隆测序, 获得长度为 517 ~ 519 bp 524 bp 两种类型的 ITS1 核苷酸序列, 平均 G+C 含量 (64 郾 5% ) 显著高于 A+T 含量 (35 郾 5% ); 在仿刺参 30 个个体 61 条序列中共检测到 49 个变异位点, 多态位点比例为 9 郾 33%, 其中有 4 个简约信息位点, 共有 40 种基因型, 群体共享基因型为 2 个 ; 遗传多样性分析表明, 3 个群体的遗传多样性丰富 ; 分子方差分析显示, 88 郾 65% 的变异来自于群体内部, 群体间遗传分化较弱或中度分化 ; 根据群体间遗传距离进行的聚类分析发现, KN 群体与 RV 群体的亲缘关系较近, CD 群体与 KN RV 群体的亲缘关系较远关键词 : 仿刺参 ; ITS1 序列 ; 遗传多样性 ; 遗传分化中图分类号 : Q347; S917 郾 4 摇摇摇摇文献标志码 : A 摇摇仿刺参 Apostichopus japonicus ( Selenka) 隶属于棘皮动物门游移亚门海参纲楯手目刺参科仿刺参属, 主要分布于中国日本俄罗斯和韩国沿海, 在中国主要分布于辽宁河北山东等北方沿海, 具有较高的营养和药用价值 [1] 近年来, 仿刺参养殖规模迅速扩大, 由于长期近亲繁殖高密度养殖等原因, 导致了养殖仿刺参个体出现抗病力下降和生长缓慢等问题, 影响了仿刺参养殖业的持续发展 [2] 国家级仿刺参新品种水院 1 号冶的成功培育, 证明了杂交育种是获得仿刺参优良品种的有效途径之一通常情况下, 杂交亲本间遗传距离越大, 杂种优势就越明显 ; 物种的遗传多样性越丰富, 其对环境的适应能力就越强因此, 分析仿刺参不同地理群体间的进化关系和遗传多样性, 是进行仿刺参种质资源管理和保护的前提之一, 也是杂种优势预测工作的突破口真核生物核糖体 RNA 基因 (18S rrna 5 郾 8S rrna 和 28S rrna) 以串联重复方式组成一个转录单元 (rdna) 而核糖体内转录间隔区 ( Internal transcribed spacer, ITS) 是 rdna 内部的间隔区域, 最终不加入成熟的核糖体中, 因此, 受到的选择压力较小, 进化速度快, 很短的序列就能够提供比较丰富的遗传信息 [3], 其在海洋动物遗传多样性系统进化等方面具有广泛的应用性 [4-6] 近年来, 关于仿刺参群体遗传多样性研究主要采用同工酶 [7] ISSR [8] [9] 微卫星等技术, 但利用 ITS1 序列对其进行遗传学分析的研究尚未见报道本研究中, 利用 ITS1 的多态性, 对仿刺参 3 个地理群体进行遗传结构分析, 以期从基因组水平上了解仿刺参资源的遗传背景, 为仿刺参的杂交育种和种群资源管理提供参考依据 1 摇材料与方法 1 郾 1 摇材料试验用仿刺参样品分别采自中国大连 ( CD) 朝鲜罗津 (KN) 俄罗斯海参崴 (RV), 每个群体 10 个样本摇收稿日期 : 摇基金项目 : 国家自然科学基金资助项目 ( ); 国家 863 冶计划项目 (2012AA10A412) 摇作者简介 : 姬南京 (1988 ), 男, 硕士研究生 jinanjing@ 126 郾 com 摇通信作者 : 常亚青 (1967 ), 男, 博士生导师 yqchang@ dlou 郾 edu 郾 cn

2 450 大连海洋大学学报摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇第 29 卷 1 郾 2 摇方法 1 郾 2 郾 1 摇基因组 DNA 的提取摇取活体仿刺参的管足 6 ~ 7 根, 采用 TIANamp Marine Animals DNA Kit 试剂盒, 提取仿刺参基因组总 DNA, 经 10 g / L 琼脂糖凝胶电泳检测后, 作为 PCR 模板 1 郾 2 郾 2 摇 ITS1 序列的扩增及克隆测序摇根据 Gen 鄄 Bank 中仿刺参 (AB593815) 的 18 S 和 5 郾 8 S 保守区设计特异性引物, 扩增 ITS1 全序列扩增引物序列为摇摇 ITS1-F: 5 忆 AAAGCCGTCACAGAGAGACA 3 忆, 摇摇 ITS1-R: 5 忆 CATCTAACTGCGTTCTTCATC 3 忆 PCR 体系 ( 共 50 滋 L): 模板 DNA 50 ~ 100 ng, 25 滋 mol / L 上下游引物各 1 滋 L, 10 伊 Buffer 5 滋 L, 25 mmol / L Mg 2+ 4 滋 L, 2 郾 5 mmol / L dntp 4 滋 L, 5 U / 滋 L Taq 酶 (TaKaRa 公司 ) 0 郾 4 滋 L, 用去离子水补至 50 滋 L PCR 反应条件 : 94 益下预变性 5 min; 94 益下变性 40 s, 58 益下退火 40 s, 72 益下延伸 1 min, 共进行 30 个循环 ; 最后在 72 益下再延伸 10 min 用 10 g / L 琼脂糖凝胶电泳检测, 采用 UNIQ-10 柱式 DNA 胶回收试剂盒 ( 上海生工有限公司 ) 回收目的条带, 与 pmd-19t 载体 (TaKaRa 公司 ) 连接后转化到 DH5 琢感受态细胞中, 采用蓝白斑挑选阳性克隆, 每个个体挑选 3 个阳性克隆子, 委托上海英潍捷基生物技术有限公司进行测序 1 郾 3 摇数据处理利用 DNAStar 软件包进行序列编辑和校正, 用 Tab 郾 1 摇表 1 摇 Clustal X (1 郾 83) 软件进行多重比较, 确定序列的边界长度采用 DnaSp 5 郾 0 软件统计单倍型数单倍型多样性平均核苷酸差异数核苷酸多样性指 [10] 数采用 Arlequin 3 郾 0 软件中的分子变异分析 (AMOVA) 统计遗传变异来源及群体间分化程度 [11] 采用 Mega 4 郾 0 软件进行核苷酸组成分析, 统计变异位点数转换 / 颠换, 利用 Kitmura 双参数模型计算群体间遗传距离, 再根据群体间的遗传距离, 采用邻接法 (NJ) 构建系统进化树 2 摇结果 2 郾 1 摇 ITS1 序列特征 PCR 产物经克隆测序后, 去掉两侧的 18 S (33 bp) 5 郾 8 S (57 bp) 序列, 经 Mega 4 郾 0 软件分析表明, ITS1 基因长度分成 A B 两种类型 : A 型为 517 ~ 519 bp, B 型为 524 bp 大部分序列为 A 型, 而 B 型由 6 碱基 (TCGAAG) 插入造成, 仅存在于 KN 群体的少数个体中碱基组成分析表明, ITS1 的平均 G+C 含量 (64 郾 5% ) 显著高于 A+ T 含量 (35 郾 5% ), 3 个群体之间的 G+C 含量没有差异在 525 个比对位点中检测到 49 个变异位点, 包括 4 个简约信息位点, 多态位点比例为 9 郾 33%, 转换 / 颠换值为 2 郾 94 用 DnaSp 5 郾 0 软件计算群体遗传多样性参数 ( 表 1), 在 3 个群体 61 条序列中, 共检出 40 种基因型, 基因型变异位点如表 2 所示从表 2 可见, 基因型 4 和 30 为群体共享, 其余基因型为群体所特有仿刺参 3 个群体 ITS1 序列遗传多样性参数 Genetic diversity parameters of ITS1 sequences in the 3 populations of sea cucumber Apostichopus japonicus 群体样本数序列数单倍型多态性平均核苷酸差异数核苷酸多样性指数 stock sample number number of sequence haplotype diversity average number of nucleotide differences nucleotide diversity 中国大连 CD 郾郾郾朝鲜罗津 KN 郾郾郾俄罗斯海参崴 RV 郾郾郾总计 total 郾郾郾郾 2 摇基于 ITS1 群体的遗传变异将每个群体作为一组, 利用 Arlequin 3 郾 0 软件进行 AMOVA 分析, 估算 3 个群体间的遗传变异结构及变异来源, 具体结果如表 3 所示 AMOVA 分析结果显示, 群体间的分子变异显著 ( F ST = 0 郾 1135, P<0 郾 05), 表明种群间的变异占总变异的 11 郾 35%, 88 郾 65% 的变异来自于群体内部仿刺参 3 个群体的遗传分化系数见表 4, CD 群体与 RV 群体之间遗传分化系数最高, 为 0 郾 192 7, 其次为 CD 群体与 KN 群体之间的遗传分化系数, 为 0 郾 109 6, RV 群体与 KN 群体之间的遗传分化系数最低, 为 0 郾基于 ITS1 基因遗传距离构建 3 个群体的 NJ 聚类树, 结果如图 1 所示

3 第 5 期摇摇摇摇摇摇姬南京, 等 : 仿刺参 3 个地理群体 ITS1 序列变异及系统发生分析 451 Tab 郾 2 摇表 2 摇 ITS1 序列多态点及各单倍型在群体中的分布 Polymorphic sites of ITS1 sequences and haplotype profiles in the populations 核苷酸多态位点 nucelotide 群体单倍型数分布 distribution of haplotypes polymorphism CD KN RV Hap_1 AATTCAAAAA GAGTTCGACT ACCCTTCAAG CGAGATTTAA CGTTCTACG Hap_ T Hap_ G.... C T Hap_ C T Hap_ G C T Hap_ G C T Hap_ A C T Hap_ A. C T Hap_ CG T Hap_ T C T Hap_ T C T Hap_ C C T Hap_ T.. C T Hap_ A C T Hap_15.. C C T Hap_ G C T Hap_ G... G C T Hap_18... C C T Hap_ T C C. T Hap_ GG..... C T Hap_ G.. A... C T Hap_ G C T Hap_23 C C T Hap_ GC T Hap_ C C..... G.... T... A Hap_ T C. C TC Hap_ C C... C T Hap_ C C T Hap_ C C T Hap_ T Hap_ G..... T Hap_ C T Hap_ A.. T Hap_ T. G Hap_ CT Hap_ A T Hap_ T.. A Hap_ T T Hap_39. G G T Hap_ C.... T T... T Tab 郾 3 摇表 3 摇仿刺参群体遗传变异的分子方差分析 (AMOVA) Molecular AMOVA analysis of genetic variation in the populations of sea cucumber Apostichopus japonicus 变异来源自由度平方和遗传变异元素占总变异的百分比 / % sources of variation degree of freedom sum of squares variance components percent of variation 群体间 2 9 郾郾 Va 11 郾 35 群体内郾郾 Vb 88 郾 65 总计 total 郾郾 41783

4 452 大连海洋大学学报摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇第 29 卷表 4 摇群体间的相对遗传距离 ( 右上 ) 和遗传分化系数 ( 左下 ) Tab 郾 4 摇 Genetic distance of each population ( upper right) and F ST among the populations (lower left) 群体 stock 中国大连 CD 朝鲜罗津 KN 俄罗斯海参崴 RV 中国大连 CD 0 郾郾 0044 朝鲜罗津 KN 0 郾郾 0040 俄罗斯海参崴 RV 0 郾郾 0423 图 1 摇基于 ITS1 基因遗传距离构建 3 个群体 NJ 聚类树 Fig 郾 1 摇 NJ tree from genetic distance based on ITS1 se 鄄 quences 3 摇讨论 3 郾 1 摇 ITS1 序列特征与遗传多样性分析一般研究认为, 如果一个基因的转换 / 颠换值小于 2 郾 0, 则认为其突变已达到饱和, 易受进化噪音的影响, 在系统进化分析时需进行加权分析 [12] 本研究中, ITS1 序列转换 / 颠换值为 2 郾 94, 表明 ITS1 序列的位点突变未达到饱和, 可以用作仿刺参系统进化分析另外, 本研究中对仿刺参每个个体都进行了多克隆测序, 发现其 ITS1 序列在个体内存在多态, 造成有的个体内存在 3 种基因型因此, 笔者建议今后对仿刺参 ITS1 序列进行分析时, 应考虑对单个个体进行多克隆测序遗传多样性是生物多样性的基础, 指种内不同种群间或一个种群内部不同个体间的遗传变异, 是生物进化和适应的基础, 一个物种的遗传多样性越丰富, 该物种对环境的适应能力就越强本研究中, 仿刺参 3 个群体核苷酸多样性指数为 0 郾 , 大于海蜇 Rhopilema esculentum 野生群体 (0 郾 ) [13] 硬壳蛤 Mercenaria mercenaria 养殖群体 (0 郾 ) [14], 说明本研究中的仿刺参 3 个群体遗传多样性较为丰富 3 郾 2 摇群体遗传分化与系统发生分析根据群体遗传学理论, F ST 值可以表示群体间的分化程度, F ST 值为 0 ~ 0 郾 05 时表示分化较弱, F ST 为 0 郾 05 ~ 0 郾 15 时表示遗传分化中等, F ST 为 0 郾 25 以上时表示遗传分化极大 [15] 本研究中, CD 群体与 RV KN 群体之间中度遗传分化, RV 群体 [16] 与 KN 群体之间分化较弱 Uthicke 等采用同工酶技术对新喀里多尼亚沿岸的糙海参进行遗传分析, 发现距离 150 km 的地理群体之间形成基因流, 遗传分化也不显著有研究者认为, 形成这一现象的主要原因是海洋无脊椎动物在幼虫时期长时间处于浮游状态, 群体之间形成基因流, 造成地理距离较远的群体之间遗传分化较弱 [17] 本研究中, 基于 ITS1 序列分析仿刺参 3 个群体间的遗传距离为 0 郾 ~ 0 郾 004 7, 其中 CD 群体与其他两个群体之间遗传距离最远, RV 群体与 [8] KN 群体遗传距离最近 Yao 等采用 ISSR 技术分析青岛与蓬莱仿刺参之间的遗传距离为 0 郾 079 6; [18] Sun 等采用线粒体 DNA 标记技术分析体色不同的仿刺参之间遗传距离为 0 郾 ~ 0 郾笔者认为, 造成遗传距离明显差异的原因主要是由不同的分子标记和不同的地理群体造成的牛东红 [19] 等曾对缢蛏 8 个群体分别采用微卫星和 CO 玉标记进行分析, 群体间遗传距离分别为 0 郾 ~ 0 郾郾 ~ 0 郾本研究中, 根据群体间的遗传距离, 构建的 NJ 树发现, RV 群体与 KN 群体聚为一支, CD 群体为独立一支, 聚类结果与它们的地理位置分布一致, 聚类关系符合地理隔离模式, 这种现象在海洋动物中已多次被发现 [20-21] 综上所述, 本研究中的仿刺参 3 个群体具有较高的遗传多样性, 种质资源丰富但长期人工育苗增加了个体间的基因交流, 可引起群体遗传多样性降低因此, 为了仿刺参资源的可持续发展, 应加强仿刺参的遗传多样性检测参考文献 : [1] 摇常亚青, 丁君, 宋坚, 等. 海参海胆生物学研究与养殖 [ M]. 北京 : 海洋出版社,2004:3-4. [2] 摇谭杰, 孙慧玲, 刘萍, 等. 仿刺参自然群体和养殖群体间遗传变异的微卫星标记研究 [J]. 海洋水产研究,2007,28(3): [3] 摇 Hillis D M,Dixon M T. Ribosomal DNA:molecular evolution and phylogenetic inference[ J]. Q Rev Biol,1991,66(4): [4] 摇孟学平, 高如承, 申欣, 等. 西施舌 5 个地理群体 ITS1 序列变异及系统发生分析 [J]. 生态学报,2011,30(20): [5] 摇马朋, 刘萍, 李健. 脊尾白虾 3 个野生群体 ITS1 序列分析及其亲缘关系分析 [J]. 水产学报,2012,36(8): [6] 摇李远宁, 马朋, 刘萍, 等. 三疣梭子蟹 ( Portunus trituberculatus)4 个野生群体 ITS1 序列分析及系统进化分析 [J]. 海洋与湖沼, 2012,43(4):

5 第 5 期摇摇摇摇摇摇姬南京, 等 : 仿刺参 3 个地理群体 ITS1 序列变异及系统发生分析 453 [7] 摇高悦勉, 孙静波. 刺参种群同工酶的生化遗传分析 [ J]. 大连水产学院学报,2004,19(1): [8] 摇 Yao B,Hu X L,Bao Z M,et al. Genetic variation in two sea cu 鄄 cumber ( Apostichopus japonicus) stocks revealed by ISSR markers [ J]. Chin J Oceanol Limnol,2007,25(1): [9] 摇 Chang Y Q,Feng Z G,Yu J P,et al. Genetic variability analysis in five populations of the sea cucumber Stichopus ( Apostichopus) ja 鄄 ponicus from China,Russia,South Korea and Japan as revealed by microsatellite markers[ J]. Mar Ecol,2009,30(4): [10] 摇 Excoffier L,Laval G,Schneider S. Arlequin ver 3. 0:an integrated software package for population genetics data analysis[ J]. Evol Bioinform Online,2005(1): [11] 摇 Tamura K,Dudley J,Nei M,et al. MEGA4:molecular evolutionary genetics analysis ( MEGA) software version 4. 0 [ J]. Mol Biol Evol,2007,24(8): [12] 摇 Knight A,Mindell D P. Substitution bias,weighting of DNA se 鄄 quence evolution, and the phylogenetic position of Fea 蒺 s viper [ J]. Syst Biol,1993,42(1): [13] 摇孙国华, 刘相全, 杨建敏, 等. 海蜇养殖群体及自然捕获群体 ITS 序列遗传分析 [J]. 海洋科学,2010,34(10): [14] 摇吴琪, 潘鹤婷, 潘宝平. 帘蛤科两种经济贝类种群的 ITS-1 序列遗传多样性分析 [J]. 天津师范大学学报,2007,27(1): [15] 摇袁媛, 高玮玮, 吴琪, 等. 黄渤海地区青蛤 (Cyclina sinensis) 种群的 ITS 序列遗传变异与遗传结构分析 [ J]. 海洋与湖沼, 2008,39(6): [16] 摇 Uthicke S,Purcell S. Preservation of genetic diversity in restoc 鄄 king of the sea cucumber Holothuria scabra investigated by alloz 鄄 yme electrophoresis[ J]. Can J Fish Aquat Sci,2004,61 ( 4 ): [17] 摇谭杰, 孙慧玲, 刘萍, 等. 3 个仿刺参地理种群遗传变异的微卫星 DNA 分析 [J]. 水产学报,2007,31(4): [18] 摇 Sun X J,Li Q,Kong L F. Comparative mitochondrial genomics within sea cucumber ( Apostichopus japonicus): provide new in 鄄 sights into relationships among color variants [ J]. Aquaculture, 2010,309(1 / 4): [19] 摇牛东红, 冯冰冰, 刘达博, 等. 浙闽沿海缢蛏群体遗传结构的微卫星和线粒体 COI 序列分析 [J]. 水产学报,2012,35(12): [20] 摇吕振明, 李焕, 吴常文, 等. 中国沿海六个地理群体短蛸的遗传变异研究 [J]. 海洋学报,2010,32(1): [21] 摇 Arnaud S,Monteforte M,Galtier N,et al. Population structure and genetic variability of pearl oyster Pinctada mazatlanica along Pa 鄄 cific coasts from Mexico to Panama[ J]. Conservation Genetics, 2000,1(4): Variation in ITS1 sequences and phylogenetic analysis of three geographical stocks of sea cucumber Apostichopus japonicus JI Nan-jing, CHANG Ya-qing, GAO Yin-xue, ZHAO Chong, SONG Jian (Key Laboratory of Mariculture & Stock Enhancement in North China 蒺 s Sea, Ministry of Agriculture, Dalian Ocean University, Dalian , China) Abstract: The genetic diversity and genetic differentiation were studied in three wild populations of sea cucumber Apostichopus japonicus from Dalian China ( CD),Rajin North Korea ( KN) and Vladivostok Russia( RV) by internal transcribed spacer 1( ITS1). Two different length of ITS1 sequence ( bp and 524 bp) were obtained via cloning and sequencing of PCR products, with higher mean contents of G + C ( 64. 5% ) than those of A + T (35. 5% ). There were 49 variation sites from 61 sequences in the 3 populations, with polymorphic sites of 9. 33%, and 4 parisimony informative among 40 genotypes including 2 shared genotypes. Genetic diversity parame 鄄 ters showed high genetic diversity among populations. The fixation indices (F ST ) of analysis of molecular variance (AMOVA) within populations was found to be %,indicating that the three populations had weak or only moderately genetic differentiation. The molecular phylogenetic tree constructed with NJ method based on genetic distance revealed that there was closer linkage between KN population and RV population than between them and CD population. Key words: Apostichopus japonicus; ITS1 sequences; genetic diversity; genetic differentiation

48 5 ( Pinctada) ( P. fucata ), 3 [ 7 ] ( P. maxima ) ( P. albina), ( P. margaritifera) ( P. nigra) RAPD, ( P. chemnitzi), ( Pteria penguin) [ 1-2 ] [

48 5 ( Pinctada) ( P. fucata ), 3 [ 7 ] ( P. maxima ) ( P. albina), ( P. margaritifera) ( P. nigra) RAPD, ( P. chemnitzi), ( Pteria penguin) [ 1-2 ] [ 5 6 2 00 9 1 2 South China Fisheries Science Vol. 5, No. 6 Dec., 2009 doi: 10. 3969/ j. issn. 1673-2227. 2009. 06. 009 16S rrna,,, (, 510300) : PCR ( Pinctada fucata) ( P. chemnitzi) ( Pteria penguin)