246 国际骨科学杂志 2018 年 7 月第 39 卷第 4 期 IntJOrthop,July.25,2018,Vol.39,No.4 freesurvival(pfs)andoveralsurvival (OS)( 犘 >0.05).Thepatientsundergoingneoadjuva

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1 245 骨肉瘤程序性死亡因子配体 1 的表达及临床意义 临床研究 蓝瑞隆傅冷西陈瑞庆王生淋施开 摘要 目的通过检测程序性死亡因子配体 1(PD L1) 在骨肉瘤组织中的表达, 探讨其与骨肉瘤患者临床特征及预后的相关性 方法选取 2006 年 1 月至 2012 年 12 月, 福建医科大学附属第一医院初诊为骨肉瘤并接受手术切除术的 72 例患者为研究对象, 收集经病理确诊的患者骨肉瘤石蜡标本, 采用免疫组织化学 (IHC) 方法检测组织中 PD L1 的表达, 以 PD L1 肿瘤细胞表达超过 5% 为阳性 同时收集患者的临床资料, 进行统计学分析 结果在 72 例骨肉瘤组织样本中,22 例 (30.6%) 呈 PD L1 阳性 PD L1 的表达与患者年龄 性别 肿瘤位置以及肿瘤大小无相关性 ( 犘均 >0.05) 单因素分析结果表明, 患者的年龄 性别 肿瘤位置和肿瘤大小均与无进展生存 (PFS) 和总生存 (OS) 中位时间无关 ( 犘均 >0.05); 接受新辅助化疗患者的 PFS 中位时间 (68.0 个月,95% 犆犐 33.8~102.2 个月 ) 和 OS 中位时间 (68.0 个月,95% 犆犐 34.6~101.4 个月 ) 均长于未接受新辅助化疗患者 (22.0 个月,95% 犆犐 16.8~27.2 个月 ;30.0 个月,95% 犆犐 20.6~39.4 个月 )( 犘均 <0.05);PD L1 阳性骨肉瘤患者 PFS 中位时间 (10.0 个月,95% 犆犐 0.0~20.7 个月 ) 和 OS 中位时间 (28.0 个月,95% 犆犐 11.1~45.0 个月 ) 均短于 PD L1 阴性患者 (44.0 个月,95% 犆犐 21.0~67.0 个月 ;52.0 个月,95% 犆犐 31.4~72.6 个月 )( 犘均 <0.05) 多因素分析结果显示 : 肿瘤大小是骨肉瘤患者 PFS 期的独立影响因子 ( 犘 <0.05); 是否接受新辅助化疗以及肿瘤是否为 PD L1 阳性均是骨肉瘤患者 PFS 期和 OS 期的独立影响因子 ( 犘均 <0.05) 结论骨肉瘤患者中部分肿瘤呈 PD L1 阳性, 是否接受新辅助化疗以及 PD L1 是否阳性均是骨肉瘤患者预后不良的独立影响因子 阻断程序性死亡因子 (PD 1)/PD L1 的免疫疗法可能是 PD L1 阳性骨肉瘤患者可选择的新型治疗方式 关键词 程序性死亡因子配体 1; 免疫组织化学 ; 骨肉瘤 ; 预后犇犗犐 : /j.issn ,2 1,2 犘犇 犔 1 犲狓狆狉犲狊狊犻狅狀犻狀犺狌犿犪狀狅狊狋犲狅狊犪狉犮狅犿犪犪狀犱犻狋狊犮犾犻狀犻犮犪犾狊犻犵狀犻犳犻犮犪狀犮犲犔犃犖犚狌犻犾狅狀犵, 犉犝犔犲狀犵狓犻, 犆犎犈犖 1,2 犚狌犻狇犻狀犵, 犠犃犖犌犛犺犲狀犵犾犻狀 3, 犛犎犐犓犪犻 3. 犆犲狀狋狉犪犾犔犪犫狅狉犪狋狅狉狔, 狋犺犲犉犻狉狊狋犃犳犳犻犾犻犪狋犲犱犎狅狊狆犻狋犪犾狅犳犉狌犼犻犪狀犕犲犱犻犮犪犾 1 犝狀犻狏犲狉狊犻狋狔, 犉狌狕犺狅狌 , 犆犺犻狀犪 ; 犉狌犼犻犪狀犓犲狔犔犪犫狅狉犪狋狅狉狔狅犳犐狀犱犻狏犻犱狌犪犾犻狕犲犱犃犮狋犻狏犲犐犿犿狌狀狅狋犺犲狉犪狆狔, 犉狌犼犻犪狀犕犲犱犻犮犪犾 2 犝狀犻狏犲狉狊犻狋狔, 犉狌狕犺狅狌 , 犆犺犻狀犪 ; 犇犲狆犪狉狋犿犲狀狋狊狅犳犗狉狋犺狅狆犪犲犱犻犮狊, 狋犺犲犉犻狉狊狋犃犳犳犻犾犻犪狋犲犱犎狅狊狆犻狋犪犾狅犳犉狌犼犻犪狀犕犲犱犻犮犪犾 3 犝狀犻狏犲狉狊犻狋狔, 犉狌狕犺狅狌 , 犆犺犻狀犪犆狅狉狉犲狊狆狅狀犱犻狀犵犪狌狋犺狅狉 : 犛犎犐犓犪犻犈 犿犪犻犾 : 犮狅犿 犃犫狊狋狉犪犮狋 犗犫犼犲犮狋犻狏犲 Toinvestigatetheexpressionofprogrammeddeathreceptor ligand1 (PD L1)inosteosarcomatissuesandto exploreitscorrelationwithclinicalfeaturesandprognosis. 犕犲狋犺狅犱狊 Atotalof72patientsinitialydiagnosedasosteosarcomaandundergoing surgicalresectionininthefirstafiliatedhospitaloffujian MedicalUniversity (fromjanuary2006todecember2012)wereenroledinthis study.pathologicalyconfirmedosteosarcomaparafinspecimenswerecolected.immunohistochemicalmethodwasusedtodetecttheexpression ofpd L1in72osteosarcomacases.Casesshowingmorethan5% ofneoplasticcelsstainingpd L1wereconsideredpositive.Theclinicaldata werecolectedandanalyzed. 犚犲狊狌犾狋狊 Twenty twocaseshadpd L1positivestaining (approximately30.6%).there werenosignificant correlationsbetweenthepd L1expressionandtheclinicopathologicalvariablesincludingage,gender,tumorlocationortumorsize (al 犘 > 0.05).Theunivariateanalysisshowedthatage,gender,tumorlocation,andtumorsizeofthepatientswerenotassociatedwithprogression 基金项目 :2016 年福建医大启航基金 (2016QH042); 福建省卫生计 生委青年课题 ( ) 作者单位 : 福州, 福建医科大学附属第一医院中心实验 室 ( 蓝瑞隆 傅冷西 陈瑞庆 ); 福州, 福建省个体化主动免疫 治疗重点实验室 ( 蓝瑞隆 傅冷西 陈瑞庆 ); 福州, 福建医科 大学附属第一医院骨科 ( 王生淋 施开 ) 通讯作者 : 施开 E mail:victorshik@163.com

2 246 国际骨科学杂志 2018 年 7 月第 39 卷第 4 期 IntJOrthop,July.25,2018,Vol.39,No.4 freesurvival(pfs)andoveralsurvival (OS)( 犘 >0.05).Thepatientsundergoingneoadjuvantchemotherapyhadabeter medianpfs (median:68.0 months,95% 犆犐 : )and OS median:(68.0 months,95% 犆犐 : )thanthose whodidnotreceive neoadjuvantchemotherapy(pfs,median:22.0months,95% 犆犐 : ;OS,median:30.0months,95% 犆犐 : )(al 犘 >0.05); PD L1positivecaseshadaworsePFS(median:10.0months,95% 犆犐 : )andOS(median:28.0months,95% 犆犐 : )than PD L1negativecases(PFS,median:44.0months,95% 犆犐 : ;OS,median:52.0 months,95% 犆犐 : )(al 犘 <0.05). Multivariateanalysisshowedthattumorsize wasanindependentfactorforpfsinosteosarcomapatients ( 犘 < 0.05);bothneoadjuvant chemotherapyandpd L1positivestainingwereindependentfactorsforPFSandOSinosteosarcomapatients (both 犘 < 0.05). 犆狅狀犮犾狌狊犻狅狀 SomeosteosarcomatissueswerePD L1positive.BothneoadjuvantchemotherapyandPD L1stainingpositivewereindependentindicatorsof poorprognosisinosteosarcomapatients.blockingpd 1/PD L1immunotherapymaybeanalternativeforPD L1positiveosteosarcomapatients. 犓犲狔狑狅狉犱狊 Programmedceldeathligand1;Immunohistochemistry;Osteosarcoma;Prognosis 骨肉瘤是最常见的恶性骨肿瘤, 儿童和青少年 [1] 好发 新辅助化疗和保肢术虽大大提高了骨肉瘤 [2] 患者的生存期, 但该病预后仍不理想, 其 5 年生存率仅为 60%~70%, 而发生转移患者的 5 年生存率只有约 20% 因此, 探索新型诊疗手段对改善骨肉瘤预后具有重要意义 肿瘤免疫治疗是继手术 放疗和化疗之后的第 4 大治疗手段 近些年, 以阻断程序性死亡因子 1 (PD 1) 及其配体 (PD L1) 为代表的肿瘤免疫治疗发展迅猛, 在许多实体肿瘤治疗中已经取得较好的临床疗效 PD 1 是一种免疫抑制性受体, 主要在活化的 T 细胞 NK 细胞和 B 细胞上表达, 它能够与其 2 个配体即 PD L1 和 PD L2 相互作用 PD L1 在许多人实体肿瘤 ( 肾癌 非小细胞肺癌 黑色素瘤以及乳腺癌等 ) 中均呈过表达, 并且往往伴随预后不 [3 9] 良 正常情况下,PD 1/PD L1 是负免疫共刺激分子, 在维持机体免疫反应稳态方面起着至关重要的作用 然而, 这种稳态在肿瘤微环境中被破坏 PD 1 在肿瘤浸润淋巴细胞中过表达, 而肿瘤细胞则高表达 PD L1, 这将不可避免地导致 PD 1/PD L1 信号转导通路持续激活, 从而使肿瘤浸润性 PD 1 阳性的 CD4 + 和 CD8 + T 淋巴细胞失活, 导致淋巴细胞功能障碍, 降低淋巴细胞的抗肿瘤作用 文献报道, 肿瘤组织 PD L1 阳性是预判患者对 PD 1/PD L1 靶向治疗反应较好的重要依据 [3,10 11] 近些年, 许多大型医药公司均加入靶向 PD 1 或 PD L1 单克隆抗体药物的开发, 并率先在晚期黑色素瘤 胃癌 头颈部癌等实体瘤患者中开展临床试验 迄今的研究结果表明, 阻断 PD 1/PD L1 信号转导通路已经在许多实体瘤中显示出较好的抗肿瘤作 [3 9] [12] 用 另据 Zheng 等报道,PD 1 在骨肉瘤患者的外周 CD4 + 和 CD8 + T 细胞上均显著上调 但是, PD L1 在骨肉瘤中表达的相关研究十分有限 因此, 本研究将采用免疫组织化学 (IHC) 方法检测人骨肉瘤组织 PD L1 的表达, 收集临床资料并行统计 学分析, 判断 PD L1 与患者临床特征的关系, 并探讨其与骨肉瘤预后的相关性, 以期为针对骨肉瘤患者的靶向 PD 1/PD L1 免疫治疗提供依据 1 材料和方法 1.1 实验材料 主要试剂 : 兔抗人 PD L1 单克隆抗体 (ab174838) 购自英国 Abcam 公司,IHC 方法涉及的其他试剂均购自福州迈新公司 1.2 骨肉瘤组织蜡块及临床资料收集选取 2006 年 1 月至 2012 年 12 月福建医科大学附属第一医院初诊为骨肉瘤并接受手术切除术的 72 例患者为研究对象, 手术切除的 72 例骨肉瘤石蜡包埋组织块用于 IHC 检测 通过查阅病历和电话回访收集研究对象的临床资料, 包括年龄 性别 肿瘤位置 肿瘤大小以及是否接受新辅助化疗等 随访截止时间为 2014 年 12 月 31 日 本研究已获得福建医科大学附属第一医院伦理委员会批准, 并取得研究对象或其家属的知情同意 1.3 IHC 检测 [13] IHC 检测按照已有研究报道的方法进行, 操作简述如下 : 组织切片机将骨肉瘤石蜡包埋组织块切成 4μm 切片, 将切片脱蜡并在 3% 过氧化氢 (H 2O 2 ) 中孵育 12min, 后用 PBS 洗涤 5min/ 次 3 次 ; 将切片与兔抗人 PD L1 单抗 (1 100 稀释 ) 于 4 孵育过夜 ; 用 PBS 洗涤 5min/ 次 3 次, 再用带辣根过氧化物酶的羊抗兔 IgG 室温孵育 1h,PBS 洗涤 5min/ 次 3 次 根据说明书使用 DAB 底物显色试剂盒进行底物显色 将切片用苏木精复染 1 min, 然后将玻片脱水并盖上盖玻片 采用二分法鉴定 PD L1 的表达 ( 由 2 位病理科医师独立盲法完成 ), 显微镜下随机挑选 5 个视野,PD L1 肿瘤细胞表达超过 5% 的病例被认为是阳性, 否则为阴性 1.4 评估指标评估指标包括 : 无进展生存 (PFS) 时间, 表示患者初诊时无转移, 从诊断之日起至复发或死亡发生

3 247 之日为止 ; 总生存 (OS) 时间, 表示从患者初诊日至死亡日止 1.5 统计分析 采用 SPSS 统计软件 22.0 版行统计学分析 χ 2 检验用于确定 PD L1 的表达与各临床特征的相关性, 采用 Kaplan Meier 及 Log rank 法行单因素生存分析,Cox 比例风险模型行多因素分析 犘 < 0.05 为差异具有统计学意义 2 结果 2.1 研究对象基本情况研究对象共 72 人, 年龄 11~75 岁 ( 中位年龄 20 岁 ),<18 岁者为 37.5%(27 例 ),41.7%(30 例 ) 为女性 ;66.7% 的肿瘤 (48 例 ) 位于股骨或胫骨, 其他部位 ( 股骨 肱骨 颌骨等 ) 占 33.3%(24 例 ); 肿瘤直径 <5cm 者占 22.2%(16 例 ), 5cm 者为 77.8% (44 例 );61.1% 的患者 (44 例 ) 接受过新辅助化疗 ; OS 中位时间为 45.0 个月 (95% 犆犐 31.6~58.4 个月 ) 2.2 IHC 检测 PD L1 IHC 检测骨肉瘤组织中 PD L1 表达结果显示, 部分骨肉瘤组织的细胞膜和细胞质呈棕色 (DAB 底物在辣根过氧化物酶的催化作用下呈棕色 ), 见图 1 本研究 72 个样本中,22 例 (30.6%)PD L1 阳性 图 1 IHC 检测 PD L1 表达情况 a.pd L1 阴性 b.pd L1 阳性 ( 400) 2.3 PD L1 表达与骨肉瘤患者临床特征的相关性患者的年龄 性别 肿瘤位置及肿瘤大小与 PD L1 表达均无相关性 ( 犘均 >0.05), 见表 1 表 1 PD L1 表达与骨肉瘤患者临床特征的相关性 [ 例 (%)] PD-L1 阴性 PD-L1 阳性 犘 年龄 <18 岁 21(42.0) 6(27.3) 18 岁 29(58.0) 16(72.7) 性别 男 28(56.0) 14(63.6) 女 22(44.0) 8(36.4) 肿瘤位置 股骨或胫骨 34(68.0) 14(63.6) 其它 16(32.0) 8(36.4) 肿瘤大小 ( 直径 ) <5cm 11(22.0) 5(22.7) 5cm 39(78.0) 17(77.3) 2.4 骨肉瘤患者预后的单因素和多因素分析研究对象的 PFS 中位时间 42.0 个月 (95% 犆犐 24.8~59.2 个月 ),OS 中位时间 45.0 个月 (95% 犆犐 31.6~58.4 个月 ) 单因素生存分析结果显示 : 患者的年龄 性别 肿瘤位置和肿瘤大小均与 PFS 和 OS 中位时间无相关性 ( 犘均 >0.05); 与未接受新辅助化疗患者相比, 接受新辅助化疗患者的 PFS 中位时间和 OS 中位时间均更长 ( 犘均 <0.05); 与 PD L1 阴性患者相比, PD L1 阳性患者的 PFS 中位时间和 OS 中位时间均明显缩短 ( 犘均 <0.05), 见图 2 下页图 3 及下页表 2 图 2 骨肉瘤患者使用 / 未用新辅助化疗的生存曲线 多因素分析结果显示 : 肿瘤大小是骨肉瘤患者 PFS 的独立影响因子 ( 犘 <0.05); 是否接受新辅助化 疗以及肿瘤是否为 PD L1 阳性均是骨肉瘤患者 PFS 和 OS 的独立影响因子 ( 犘均 <0.05), 见下页表 3

4 248 国际骨科学杂志 2018 年 7 月第 39 卷第 4 期 IntJOrthop,July.25,2018,Vol.39,No.4 图 3 骨肉瘤患者 PD L1 阳性 / 阴性表达的生存曲线 表 2 骨肉瘤患者预后的单因素分析 ( 月 ) PFS 中位时间 95% 犆犐犘 OS 中位时间 95% 犆犐犘 年龄 <18 岁 ~ ~ 岁 ~ ~56.8 性别 男性 ~ ~50.9 女性 ~ ~57.7 肿瘤位置 股骨或胫骨 ~ ~63.7 其它 ~ ~101.1 肿瘤大小 ( 直径 ) <5cm ~ ~72.9 5cm ~ ~49.7 使用新辅助化疗 是 ~ ~101.4 否 ~ ~39.4 PD-L1 表达 阳性 ~ ~45.0 阴性 ~ ~72.6 表 3 骨肉瘤患者预后的多因素分析 肿瘤大小 PFS 犎犚 95% 犆犐犘 OS 犎犚 95% 犆犐犘 <5cm ~ ~ cm 使用新辅助化疗是 ~ ~ 否 PD-L1 表达阳性 ~ ~ 阴性注 : 犎犚风险比

5 249 3 讨论骨肉瘤是较常见的恶性骨肿瘤, 近年来骨肉瘤患者的生存率和生活质量均取得较大进步, 但仍不 [14 15] 能令人满意 骨肉瘤的肿瘤大小与疾病进展呈一定相关性, 但本研究多因素分析结果显示, 肿瘤大小只与 PFS 时间相关, 而与 OS 时间无相关性 该结果可能与本研究的样本量有关, 有待加大样本量进行进一步的研究证实 使用新辅助化疗对骨肉瘤患者的预后有较大程度改善 本研究也表明, 接收新辅助化疗能显著提高骨肉瘤患者的生存期, 而如何优化新辅助化疗方案可能也是改善骨肉瘤患者预后的关键 IHC 技术已广泛用于检测许多实体肿瘤 PD L1 的表达,PD L1 是否阳性是评判 PD 1/PD L1 靶向 [8] 免疫治疗是否有效的重要依据 有研究表明, PD L1 在胸腺上皮癌 胃癌和肾上腺皮质癌等肿瘤 [8,16 17] 细胞的细胞膜和细胞质中呈阳性 我们的研究结果显示, 部分骨肉瘤组织中 (30.6%) 可以检测 [18] 到 PD L1 表达, 这与 Shen 等的报道相似 我们发现,PD L1 的表达与患者年龄 性别以及肿瘤位置等无相关性 ;Cox 回归行生存分析表明,PD L1 阳性是骨肉瘤患者预后的独立影响因子 综上, 阻断 PD 1/PD L1 信号转导通路可能是 PD L1 阳性骨肉瘤患者可选择的新型治疗方式 在本研究中, 我们发现 PD L1 阳性可作为预测骨肉瘤患者预后不良的独立指标, 这为 PD L1 阳性骨肉瘤患者行 PD 1/PD L1 靶向免疫治疗提供了依据 但也有证据表明, 缺乏 PD L1 表达的部分肿瘤患者 [19] 仍然可受益于这种免疫治疗, 因此需要进行较大样本的检测, 并进行相关的临床试验才能得出更为严谨的结论 参考文献 [1] GelerDS,MorrisJ,RevskayaE,etal.Targetedtherapyof osteosarcoma withradiolabeled monoclonalantibodyto an insulin likegrowthfactor 2receptor(IGF2R)[J].NuclMed Biol,2016,43(12): [2] Bishop MW,Janeway KA,Gorlick R.Futuredirectionsin thetreatmentofosteosarcoma[j].curropinpediatr,2016, 28(1): [3] McDermotDF,Atkins MB.PD 1asapotentialtargetin cancertherapy[j].cancermed,2013,2(5): [4] ZhangY,HuangS,Gong D,etal.Programmeddeath 1 upregulation is correlated with dysfunction of tumor infiltrating CD 8 + Tlymphocytesinhumannon smalcel lungcancer[j].celmolimmunol,2010,7(5): [5] ShiF,ShiM,ZengZ,etal.PD 1andPD L1upregulation promotes CD8(+)T cel apoptosis and postoperative recurrencein hepatocelularcarcinoma patients[j].intj Cancer,2011,128(4): [6] Zou W,Chen L.Inhibitory B7 family moleculesin the tumourmicroenvironment[j].natrevimmunol,2008,8 (6): [7] HinoR,KabashimaK,KatoY,etal.Tumorcelexpression ofprogrammedceldeath 1ligand1isaprognosticfactorfor malignantmelanoma[j].cancer,2010,116(7): [8] PaddaSK,RiessJW,Schwartz EJ,etal.Difuse high intensitypd L1staininginthymicepithelialtumors[J].J ThoracOncol,2015,10(3): [9] BrahmerJR,TykodiSS,ChowLQ,etal.Safetyandactivity ofanti PD L1antibodyinpatientswithadvancedcancer[J]. NEnglJMed,2012,366(26): [10] TykodiSS.PD 1asanemergingtherapeutictargetinrenal celcarcinoma:currentevidence[j].onco Targets Ther, 2014,7: [11] TopalianSL,HodiFS,BrahmerJR,etal.Safety,activity, andimmunecorrelatesofanti PD 1antibodyincancer[J].N EnglJMed,2012,366(26): [12] Zheng W,XiaoH,LiuH,etal.Expressionofprogrammed death1iscorrelated withprogressionofosteosarcoma[j]. APMIS,2015,123(2): [13] Shi K,Lan RL,Tao X,etal.Vitronectin significantly influencesprognosisin osteosarcoma[j].intj Clin Exp Pathol,2015,8(9): [14] Boter SM, Neri D, Fuchs B. Recent advances in osteosarcoma[j].curropinpharmacol,2014,16: [15] MisaghiA,Goldin A,Awad M,etal.Osteosarcoma:a comprehensivereview[j].sicotj,2018,4:12. [16] QingY,LiQ,Ren T,etal.UpregulationofPD L1and APE1isassociatedwithtumorigenesisandpoorprognosisof gastriccancer[j].drugdesdevelther,2015,9: [17] FayAP,SignoretiS,Calea M,etal.Programmeddeath ligand 1 expression in adrenocortical carcinoma: an exploratory biomarkerstudy[j].jimmunother Cancer, 2015,3:3. [18] ShenJK,CoteGM,ChoyE,etal.Programmedceldeath ligand1 expressionin osteosarcoma[j].cancerimmunol Res,2014,2(7): [19] MomtazP,Postow MA.Immunologiccheckpointsincancer therapy:focusontheprogrammeddeath 1 (PD 1)receptor pathway[j].pharmgenomicspersmed,2014,7: ( 收稿 : ) ( 本文编辑 : 杨晓娟 )

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