60 江苏农业科学 2017 年第 45 卷第 20 期三氯甲烷 / 异戊醇抽提除蛋白, 最后用预冷的无水乙醇沉淀 DNA, 烘干后用 TE 溶解所得基因组 DNA 样品用紫外分光光度计测量 DNA 样品的浓度纯度, 同时用琼脂糖凝胶电泳检测基因组 DNA 的完整性并估测分子量, 将 DNA

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态洞历
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1 江苏农业科学 2017 年第 45 卷第 20 期 59 张燕萍, 贺刚, 王生, 等. 基于线粒体 DNAD-loop 序列分析刀鲚与短颌鲚的遗传多样性 [J]. 江苏农业科学,2017,45(20): doi: /j.isn 基于线粒体 DNAD-loop 序列分析刀鲚与短颌鲚的遗传多样性张燕萍, 贺刚, 王生, 吴斌, 周辉明, 傅培峰, 方春林 ( 江西省水产科学研究所, 江西南昌 ) 摘要 : 以线粒体 DNAD-loop 全序列为分子标记, 研究 4 个刀鲚群体 ( 长江口刀鲚鄱阳湖湖口刀鲚鄱阳湖湖区刀鲚鄱阳湖湖口刀鲚幼鱼 ) 及鄱阳湖短颌鲚群体的遗传多样性结果显示 : 刀鲚的 D-loop 序列长 1212~1293bp, 短颌鲚的序列长 1210~1252bp; 在 5 个群体的 55 尾个体中, 共检测到变异位点 72 个, 其中单一多态位点 50 个, 简约信息位点 22 个 ; 共检测到 45 个不同的单倍型, 单倍型多态性为 0.989, 核苷酸多样性为 , 平均核苷酸差异数 (K) 为个群体的遗传多样性丰富程度排序为鄱阳湖刀鲚幼鱼 > 鄱阳湖湖口刀鲚 > 鄱阳湖短颌鲚 > 鄱阳湖刀鲚 > 长江口刀鲚 ; 不同单倍型间的遗传距离为 0.014~0.728, 平均遗传距离为此外, 系统发育树也表明, 刀鲚短颌鲚共同构成 1 个单系群, 为 2 种生态型种群, 尚未达到种或亚种的分化关键词 : 刀鲚 ; 短颌鲚 ; 线粒体 DNA;D-loop 序列 ; 遗传多样性 ; 遗传结构差异中图分类号 :S917 文献标志码 :A 文章编号 : (2017) 鲚属 (Coilia) 隶属于鲱形目 (Cluperiformes) 科 (Engraulidae), 是分布于印度洋 - 太平洋地区具有极高经济价值的中小型鱼类世界上的鲚属鱼类有 13 种, 其中中国分布有 4 种 : 七丝鲚 (Coia.grayi) 凤鲚 (Coia.mystus) 刀鲚 (Coia.nasus) 和短颌鲚 (Coia.brachynathus), 它们主要分布于中国沿海及长江中下游地区刀鲚肉质细嫩鲜美, 被列为长江三鲜之一, 深受广大群众的喜爱, 具有重要的经济价值, 也是主要的捕捞对象之一 [1] 短颌鲚属华中区特有种, 是德国人 Kreyenberg Pappenheim 于 1908 年依据洞庭湖的标本确立的一个物种长期以来, 由于其上颌骨较短与长江中下游及其附属大型湖泊等淡水性分布的特征, 短颌鲚一直被视为有别于刀鲚的有效物种但是随着人们在巢湖太湖等通江湖泊发现刀鲚淡水定居性种群, 短颌鲚与刀鲚在生态学上的差异变得模糊, 两者的鉴别主要依据上颌骨长度等界限不甚清晰的形态特征, 从而引发对短颌鲚物种有效性问题的讨论鲚属鱼类外形十分相似, 该属刀鲚和短颌鲚的分类问题一直存在较大争议短颌鲚在 20 世纪 70 年代也是鄱阳湖的主要捕捞对象近些年来, 由于过度捕捞和生态环境破坏等因素, 自 20 世纪 90 年代起, 其种群数量逐年下降鄱阳湖鲚属鱼类在 1983 年产量约为 1100t,1995 年产量为 1385t,1998 年下降至 550t [2] 从鄱阳湖渔获物种群( 组成 ) 分析看,1974 年鲚属收稿日期 : 基金项目 : 赣鄱英才 555 工程刀鲚调查专项基金 ( 编号 : 赣财教指 [2012]213 号 ); 江西省科技计划 ( 编号 :20141BBF60036) 作者简介 : 张燕萍 (1979 ), 女, 江西吉安人, 博士, 副研究员, 主要从事鱼类育种渔业资源调查与渔业环境监测等研究 zhangyanpingxie@163.com 通信作者 : 方春林, 研究员, 主要从事鱼类营养渔业种质渔业资源研究 chunlinf@163.com 鱼类占鄱阳湖渔获物质量的 10% ~15% [3],1984 年占 0 9%,2001 年占 1.5% 江西省水产科学研究所近 10 年对鄱阳湖调查表明, 鲚属鱼类占鄱阳湖渔获物质量分数不足 1 0% 目前在鄱阳湖鲚属鱼类鱼汛比 20 世纪 70 年代晚 1~ 2 个月, 汛期也由 20d 左右缩减为 3~5d, 其资源状况不容乐观由于每年鄱阳湖野生鲚属鱼类的资源量都有明显下降, 其种群结构是否也在发生变化有待研究, 因此对鲚属幼体的遗传多样性和物种判别研究十分必要线粒体 DNA 具有母系遗传分子结构稳定较快的进化速率等特点 [4], 成为研究物种起源系统进化等的有效分子标记线粒体 DNA 控制区序列, 由于不编码蛋白质, 比线粒体其他部分的基因具有更快的进化速率, 因此广泛应用于亲缘关系近的物种或种群间的遗传结构多样性及种群历史等方面的研究本研究通过对线粒体 DNA 控制区全序列进行分析, 研究长江口鄱阳湖刀鲚群体和短颌鲚群体在遗传结构方面的差异, 以期为长江流域刀鲚和短颌鲚合理的保护管理利用提供科学依据 1 材料与方法 1.1 材料本研究所用的刀鲚样本于 2014 年 4 11 月采集于上海长江口 (13 个样本 ) 鄱阳湖湖口 (10 个样本 ) 及鄱阳湖湖区 (14 个样本 )3 个不同的采样点的 4 个群体 ; 鄱阳湖刀鲚幼鱼 9 尾采自全湖 ; 短颌鲚样本来自鄱阳湖湖区每尾鱼剪取少许肌肉分别放入 Eppendorf 管内, 于 95% 乙醇中保存备用 1.2 方法 DNA 提取取 100mg 乙醇保存肌肉样品剪碎, 分别放入 1.5mLEppendorf 管内, 加入 400LSET 缓冲液, 再依次加入 40μL10% 十二烷基硫酸钠 (SDS) 10μL(20mg/mL) 蛋白酶 K, 混合后在 55 水浴中消化过夜, 再分别用平衡酚

2 60 江苏农业科学 2017 年第 45 卷第 20 期三氯甲烷 / 异戊醇抽提除蛋白, 最后用预冷的无水乙醇沉淀 DNA, 烘干后用 TE 溶解所得基因组 DNA 样品用紫外分光光度计测量 DNA 样品的浓度纯度, 同时用琼脂糖凝胶电泳检测基因组 DNA 的完整性并估测分子量, 将 DNA 原样稀释至 50ng/μL,4 保存备用 PCR 扩增及测序使用 2 个通用引物 DF1 DR2 扩增 D-loop 区段基因, 引物序列 DF1:5 -CTAACTCCCAAA GCTAGAATTCT-3,DR2:5 -ATCTTAGCATCTTCAGTG- 3 [5] 扩增反应混合物总体积 50μL, 包括 2.0μLDNA 模板 5μL10 reactionbufer 2μL2.5mmol/LdNTP 各 2μL 引物 ( 浓度 10mmol/L) 0.25μLTaq 酶 (5U), 用无菌 ddh 2 O 补至 50μL PCR 扩增程序 :94 4min;94 30s,54 45s,72 1min,35 个循环 ;72 10min PCR 产物用 1.0% 琼脂糖凝胶电泳检测, 并拍照记录目标扩增产物用试剂盒回收纯化后, 由上海博尚生物有限公司进行双向测序, 在本研究中, 除用引物 DF1 DR2 由 2 端向中部测序外, 还根据所得序列再设计 1 对引物 (F:5 -GCGGATTCTCCGTAGACAAC- 3,R:5 -GTAAAATTGTCTGGGTCTCC-3 ) 由序列中部向 2 端进行测序, 以提高测序的准确性 1.3 数据分析 [6] 序列用 ClustalW1.83 软件分析比对 ; 利用 DnaSP [7] (version4.0) 软件统计单倍型及变异位点 (S), 计算单倍型多样性 (Hd) 核苷酸多样性 (π) 及平均核苷酸差异数 (K) [8] 采用 MEGA(version4.0) 软件中的 Kimura 双参数法计算各单倍型间的遗传距离 ; 采用邻接 (Neighbor-Joining, 简称 NJ) 法,Bootstrap 置信值估算重复 1000 次, 构建系统发育树 [9] 利用 Ariequin3.11 软件计算两两群体间的分化指数 (Fst), 进行分子变异分析 (analysisofmolecularvariance, 简称 AMOVA) 利用 DnaSP5.10 软件 [10] Arlequin3.11 软件分别进行核甘酸不配对分析和 Fu sfs 中性检验, 来推断 4 个刀鲚群体 1 个短颌鲚群体在进化过程中是否经历过种群扩张 2 结果与分析 2.1 PCR 扩增结果及序列特征分析所有刀鲚短颌鲚的 D-loop 片段均能被清晰稳定地扩增,PCR 产物经琼脂糖凝胶电泳检测显示为 1 条清晰明亮的条带, 大小为 1300bp 左右双向测序后的序列经过拼接, 获得 1210~1293bp 的控制区全序列, 其中长度为 1252bp 的序列最多, 有 41 条, 占 % 刀鲚的 D-loop 序列长 1212~1293bp, 短颌鲚的序列长 1210~1252bp, 在刀鲚和短颌鲚控制区序列中发现了 3~7 个拷贝不等的 38bp 的重复片段, 此外还存在 1~3bp 小片段的插入或缺失序列分析结果 ( 表 1) 表明, 在 4 个刀鲚群体 1 个短颌鲚群体 D-loop 区段基因片段中,A T G C 碱基占比分别为 33 2% 33.2% 19.3% 14.3% 其中,A+T 碱基组成比例为 66 4%, 大于 C+G 的组成比例 33.6% 从表 1 可以看出, D-loop 表现出很强的碱基组成偏向性, 即在 A C G T 这 4 种碱基中,C 的组成比例明显低于其他 3 种碱基 2.2 群体遗传多样性和遗传差异性的分析通过序列比对, 在 5 个群体 55 尾个体中, 共检测到变异表 1 刀鲚 4 个群体和短颌鲚 1 个群体 D-loop 碱基组成比例碱基组成比例 (%) 群体 A G C T P1(CD) P2(HD) P3(RD) P4(DY) P5(DH) 注 :CD 表示长江口刀鲚,HD 表示鄱阳湖湖口刀鲚,RD 表示鄱阳湖刀鲚,DY 表示鄱阳湖刀鲚幼鱼,DH 表示鄱阳湖短颌鲚位点 (S)72 个 ( 图 1), 其中单一多态位点 50 个, 简约信息位点 22 个本研究中共检测到 45 种不同的单倍型, 每种单倍型对应的样本数为 1~5 个不等, 长江口刀鲚鄱阳湖湖口刀鲚鄱阳湖刀鲚鄱阳湖刀鲚幼鱼鄱阳湖短颌鲚群体中单倍型的分布数量分别为种由表 2 可以看出, 在所有 45 种单倍型中, 仅有 Hap9 Hap14 Hap22 Hap35 Hap37 Hap43 在 2 个及 2 个以上的个体中存在, 其他 39 种单倍型仅在 1 个个体中存在,Hap9 含有最多的 5 个个体 Hap9 在长江口刀鲚鄱阳湖湖口刀鲚鄱阳湖刀鲚群体中同时出现,Hap14 同时出现在长江口刀鲚鄱阳湖刀鲚幼鱼群体中,Hap22 同时出现在鄱阳湖湖口刀鲚和鄱阳湖刀鲚群体中,Hap35 同时出现在长江口刀鲚和鄱阳湖湖口刀鲚群体中,Hap37 同时出现在鄱阳湖刀鲚和鄱阳湖刀鲚幼鱼群体中在 45 种单倍型中, 长江口刀鲚群体独有单倍型有 10 个 (Hap1 Hap3 Hap10 Hap20 Hap21 Hap23 Hap26 Hap27 Hap28 Hap30), 鄱阳湖湖口刀鲚群体独有的有 6 个 (Hap5 Hap6 Hap15 Hap16 Hap19 Hap24), 鄱阳湖刀鲚群体独有的有 8 个 (Hap2 Hap4 Hap17 Hap18 Hap25 Hap29 Hap31 Hap33 Hap34), 鄱阳湖刀鲚幼鱼独有单倍型 7 个 (Hap7 Hap8 Hap11 Hap12 Hap13 Hap32 Hap36), 鄱阳湖短颌鲚群体的单倍型均为独有的 (Hap38~Hap45) 由此看出, 各群体间拥有非常少的共享单倍型, 独有的单倍型在群体内占有量非常丰富, 而丰富的独有单倍型的存在说明长江口刀鲚鄱阳湖湖口刀鲚鄱阳湖刀鲚鄱阳湖刀鲚幼鱼及鄱阳湖短颌鲚群体间存在一定程度的分化群体内的遗传多样性可以通过单倍型多样性核苷酸多样性和平均核苷酸差异数等数据来体现由表 3 可见,55 个个体的单倍型多态性 (H) 为 0.989±0.007; 核苷酸多样性 (π) 为 , 平均核苷酸差异数 (K) 为根据单倍型多样性核苷酸多样性和平均核苷酸差异数等数据的大小可以看出, 在 4 个刀鲚群体和 1 个短颌鲚群体中, 遗传多样性丰富程度排序为鄱阳湖刀鲚幼鱼 > 鄱阳湖湖口刀鲚 > 鄱阳湖短颌鲚 > 鄱阳湖刀鲚 > 长江口刀鲚经计算, 各单倍型间的遗传距离在 0.014~0 728, 平均遗传距离为群体间遗传分化与分子系统树根据邻接法构建的单倍型间系统进化树显示 : 来源于鄱阳湖湖区短颌鲚样本的 7 种单倍型明显单独成为 1 系与其他群体单倍型具有显著的分化 ( 图 2) 另外, 采集自长江口刀鲚鄱阳湖湖口刀鲚鄱阳湖湖区刀鲚及鄱阳湖湖区刀鲚幼鱼样本的 38 种单倍型聚为 1 支

3 江苏农业科学 2017 年第 45 卷第 20 期 61 表 2 单倍型在 5 个群体中的分布单倍型 P1(CD)P2(HD)P3(RD)P4(DY)P5(DH) 合计 Hap1 1 1 Hap2 1 1 Hap3 1 1 Hap4 1 1 Hap5 1 1 Hap6 1 1 Hap7 1 1 Hap8 1 1 Hap Hap Hap Hap Hap Hap Hap Hap Hap Hap Hap Hap Hap Hap Hap Hap Hap Hap Hap Hap Hap Hap Hap Hap Hap Hap Hap Hap Hap Hap Hap Hap Hap Hap Hap Hap Hap 从表 4 可看出, 刀鲚群体之间的遗传分化指数较低, 而短颌鲚群体 (DH) 与刀鲚群体之间存在相对较高的分化指数 (0.0399~ ) 对刀鲚短颌鲚群体的 AMOVA 分析结果显示, 将 4 个刀鲚群体分为 1 组 (group1:cd HD RD DY), 短颌鲚群体分为 1 组 (group2:dh) 在组间变异组内群体间变异群体内变异 3 个水平上进行分子变异方差分析, 表 5 显示,65 61% 变异发生在群体内部对不同种类分组上的 AMOVA 分析表明, 群体间组内变异分别占总变异的 60 71% 39.53%(P< 0.001) 2.4 种群历史动态利用 Ailequin3.11 软件对刀鲚短颌鲚群体进行 Tajima sd FuandLi s 中性检验表 3 结果表明 : 所有群体 Tajima sd 均为负值 ( ~ ), 但未达到显著水平 FuandLi s 在所有种群中均为负值 ( ~ ), 未达到显著水平 Tajima sd FuandLi s 检验结果均表明, 历史上刀鲚短颌鲚未经历种群扩张对刀鲚 4 个群体 D-loop 序列的错配分析发现, 碱基歧点分布的期望值呈典型的多峰分布, 说明长江流域刀鲚种群历史上未经历种群扩张 ( 图 3) 4 个群体的 Raggednes 统计量 (Rg) 为 0.45~0.80, 均未达到显著水平, 进一步支持刀鲚和短颌鲚种群未经历过种群扩张, 观测分布和期望分布之间的偏离总方差 (SSD) 在 4 个刀鲚群体和 1 个短颌鲚群体中均未达到显著水平 ( 表 6), 提示刀鲚和短颌鲚种群未经历过扩张时期 3 讨论 3.1 刀鲚和短颌鲚种群控制区序列的碱基组成所测定的 46 尾刀鲚 mtdnad-loop 区序列中, 碱基 A T G C 的平均含量分别为 33.2% 33.2% 19.3% 14.3%;9 尾短颌鲚 mtdnad-loop 区序列的碱基 A T G C 的平均含量分别为 33.1% 33.1% 19.5% 14.2%; 从刀鲚短颌鲚碱基组成可以看出,D-loop 区段表现出很强的碱基组成偏向性, 即在 A T G C4 种碱基中,C 的含量明显低于其他 3 种碱基的含量 ; 此外, 刀鲚和短颌鲚 mtdnad-loop 区中 A+T 碱基的含量 (66.4% 66.2%) 高于 G+C 碱基含量 (33.6% 33 8%), 符合脊椎动物 mtdnad-loop 区碱基组成的特点 [11] 线粒体控制区 (D-loop) 为非编码区, 受进化压力较小, 在 D-loop 处可见较高的突变积累而形成多态性 [12] 核苷酸替换和长度变异在该处很常见 [13-15] 在本研究中, 发现刀鲚和短颌鲚控制区序列中存在 38bp 的重复片段, 拷贝数从 3~7 个不等, 此外还存在 1~3bp 小片段的插入或缺失 3.2 遗传变异及遗传多样性本试验中测定的刀鲚短颌鲚 5 个群体的 D-loop 序列中共检测出 72 个变异位点, 占全部序列的 5.75%, 共定义了 45 个单倍型, 显示出较为丰富的遗传多样性, 与程起群等的研究结果一致 [16-18] 从 D-loop 区序列变异得到的 NJ 系统进化树可以看出, 来源于鄱阳湖的短颌鲚形成 1 个单系, 显示与其他群体单倍型具有一定的分化, 另外, 采自长江口, 鄱阳湖湖口和鄱阳湖湖区样本的 38 个单倍型聚为 1 支, 刀鲚群体没有明显的地理分化格局群体间的遗传分化指数用来表示群体间的遗传分化程度,Fst 值越大, 表明 2 个群体间的分化程度越高 ; 反之, 分化程度越低 [19] 群体间的遗传分化指数 K2-P 遗传距离以及 AMOVA 分子变异分析均表明, 长江流域 4 个刀鲚群体间存在着广泛的基因交流, 没有形成明显的遗传分化, 仍是个随机交配的群体鄱阳湖为通江湖泊, 每年 4 6 月, 长江流域刀鲚洄游至鄱阳湖产卵, 由于不同地理种群的刀鲚可能会进入同一地点或相对较近的区域产卵和受精, 因此增加了群体外

4 62 江苏农业科学 2017 年第 45 卷第 20 期群体样本数 ( 个 ) 单倍型多态位数 ( 个 ) 点数 ( 个 ) 表 3 4 个刀鲚群体与 1 个短颌鲚群体遗传多样性参数 H d π K Kumar 遗传距离 FuandLi s 中性检验 Tajima sd 检验 P1(CD) ± ~ (P 0.10) (ns,P 0.10) P2(RD) ± ~ (P 0.10) (ns,P 0.10) P3(HD) ± ~ (P 0.10) (ns,P 0.10) P4(DY) ± ~ (P 0.10) (ns,P 0.10) P5(DH) ± ~ (P 0.10) (ns,P 0.10) 注 :P>0.1 表示差异不显著表 4 群体间和群体内的 K2-P 遗传距离以及群体间的遗传分化指数 (Fst) 群体 CD HD RD DY DH CD HD RD DY DH 注 : 左下方右上方分别为遗传距离群体间的遗传分化指数表 5 基于刀鲚短颌鲚线粒体控制区的 AMOVA 分析结果组间变异群体内变分组 θ ST θ CT θ SC 比例 (%) 异比例 (%) 所有群体按种类注 : 组表示分组方式 ; 固定系数包括总变异 (θ ST ) 组间变异 (θ CT ) 组内群体间变异 (θ SC ); 表示差异极显著 (P<0.001) 交配的可能性, 同时, 这种繁殖方式增加了长江流域刀鲚各群体之间的基因交流机会, 由此导致长江流域刀鲚群体之间的

5 江苏农业科学 2017 年第 45 卷第 20 期 63 遗传分化程度相对较低, 而群体内个体之间的遗传变异较大短颌鲚与刀鲚存在一定的遗传分化, 唐文乔等过对 mtdna 的 D-loop 区进行分析指出, 短颌鲚和湖鲚是刀鲚的淡水生态型种群, 并非有效种 [5] 许志强等综合分析刀鲚和短颌鲚的颌骨长度和线粒体 Cytb 序列, 得出短颌鲚属于刀鲚的 1 个淡水生态型种群而并非独立物种的结论 [20] 本研究通过对长江口刀鲚鄱阳湖湖口刀鲚鄱阳湖刀鲚鄱阳湖刀鲚幼鱼以及鄱阳湖短颌鲚 5 个群体的遗传多样性及系统发育树研究也表明, 鄱阳湖的刀鲚和短颌鲚共同构成 1 个单系群, 为 2 种生态型种群, 尚未达到种或亚种的分化参考文献 : [1] 袁传宓, 秦安黔, 刘仁华, 等. 关于长江中下游及东南沿海各省的鲚属鱼类种下分类的探讨 [J]. 南京大学学报 ( 自然科学版 ), 1980(3): 表 6 刀鲚和短颌鲚群体错配分布参数 (D-loop) [2] 江西省农业局水产资源调查队, 江西省水产科学研究所. 鄱阳湖水产资源调查报告 [R] 类别参数 CD HD RD DY DH 错配分布 τ θ θ 吻合度检测 SSD 模型 (SSD)P 值 Raggednes 指数 RaggednesP 值 [3] 长江流域刀鲚资源调查协作组. 长江流域刀鲚资源调查报告 [R] [4] 张敏莹, 徐东坡, 刘凯, 等. 长江下游刀鲚生物学及最大持续产量研究 [J]. 长江流域资源与环境,2005,14(6): [5] 唐文乔, 胡雪莲, 杨金权. 从线粒体控制区全序列变异看短颌鲚和湖鲚的物种有效性 [J]. 生物多样性,2007,15(3): [6]ThompsonJD,GibsonTJ,PlewniakF,etal.TheCLUSTAL_X Windowsinterface:flexiblestrategiesformultiplesequencealignment aidedbyqualityanalysistools[j].nucleicacidsresearch,1997,25 (24): [7]RozasJ,Sánchez-DelbarioJC,MeseguerX,etal.DnaSP,DNA polymorphismanalysesbythecoalescentandothermethods[j]. Bioinformatics,2003,19(18): [8]TamuraK,DudleyJ,NeiM andkumars.mega4:molecular EvolutionaryGeneticsAnalysis(MEGA)softwareversion4.0[J]. MolBiolEvol,2007,24(8): [9]ExcofierL,LavalG,SchneiderS.Arlequin(version3.0):an integratedsoftwarepackageforpopulationgeneticsdataanalysis[j]. EvolutionaryBioinformaticsOnline,2005,1(4A): [10]LibradoP,RozasJ.DnaSPv5:asoftwareforcomprehensiveanalysis ofdna polymorphism data[j].bioinformatics,2009,25(11): [11]BroughtonRE,MilamJE,RoeBA.Thecompletesequenceofthe zebrafish(daniorerio) mitochondrialgenomeand evolutionary paternsinvertebratemitochondrialdna[j].genomeresearch, 2001,11(11): [12] 谢振宇, 杜继曾, 陈学群, 等. 线粒体控制区在鱼类种内遗传分化中的意义 [J]. 遗传,2006,28(3): [13]HarisonRG.AnimalmitochondrialDNAasageneticmarkerin populationand evolutionarybiology[j]. Trendsin Ecology& Evolution,1989,4(1):6-11.

6 64 江苏农业科学 2017 年第 45 卷第 20 期方辉, 蒋胜理, 曲俊杰, 等. 基于高通量测序的野生毛葡萄转录组 SSR 信息分析 [J]. 江苏农业科学,2017,45(20): doi: /j.isn 基于高通量测序的野生毛葡萄转录组 SSR 信息分析方辉 1, 蒋胜理 1, 曲俊杰 1, 周思泓 1 1,2, 潘凤英 (1. 广西作物遗传改良生物技术重点开放实验室, 广西南宁 ;2. 广西农业科学院, 广西南宁 ) 摘要 : 利用毛葡萄叶片高通量转录组测序数据进行简单重复序列 (simplesequencerepeat, 简称 SSR) 搜索并对其所在的序列进行注释, 从而为毛葡萄分子标记开发提供有效信息从条质量较高的 unigene 中搜索到 4428 个 SSR 位点, 对这些序列进行基因本体 (geneontology, 简称 GO) 同源蛋白质簇 (clusteroforthologousgroupsofproteins, 简称 COGs) 和京都基因与基因组百科全书 (Kyotoencyslopediaofgenesandgenomes, 简称 KEGG) 分类, 给出功能注释和 Pathway 注释, 共注释了 3197 条 unigene COG 数据库将 SSR 序列分成 25 类, 通过 GO 分类和 KEGG 富集性分析, 将 SSR 序列分别归类于 38 个 GO 类别和 103 条通路这些序列涉及了许多重要的生物功能和代谢途径, 预示着这些潜在的标记可能与重要的生物功能有关, 这些信息为毛葡萄分子标记的开发和应用奠定了基础关键词 : 毛葡萄 ; 转录组 ; 高通量测序 ; 简单重复序列 (SSR) 中图分类号 :S 文献标志码 :A 文章编号 : (2017) 野生毛葡萄 (VitisquinquangularisRehd) 是葡萄科 (Vitaceae) 葡萄属 (Vitis) 真葡萄亚属 (Euvitis) 东亚种群的一个种, 产于中国, 是我国葡萄属东亚种群中分布最广的一个野生种, 主要集中分布在广西的桂中桂北桂西的喀斯特地貌地区 [1] 野生毛葡萄含有各种氨基酸矿物质多种维生素, 还含有丰富的超氧化物歧化酶白藜芦醇和花色素双糖苷, 具有抗衰老防癌软化血管的作用 [2] 大部分野生毛葡萄表现出抗逆性强耐旱耐瘠耐病性好耐高温潮湿天气等优良特性, 是南方石漠化治理生态重建的优良树种, 具有重要的经济价值 [3] 简单重复序列 (simplesequencerepeat, 简称 SSR) 又名微收稿日期 : 基金项目 : 国家博士后基金 ( 编号 :2014M562497XB); 广西八桂学者专项资金 ( 编号 :[2013]3); 广西自然科学基金 ( 编号 : 2015GXNSFBA139078); 广西农业科学院科技发展基金 ( 编号 : 2015JM28) 作者简介 : 方辉 (1984 ), 男, 湖北孝感人, 硕士, 助理研究员, 主要从事植物功能基因组学方面的研究 fanghui2002@ 163.com 通信作者 : 潘凤英, 博士, 助理研究员, 主要从事葡萄抗病基因挖掘研究 panfengying@163.com 卫星 (microsatelites), 是基因组中以少数几个核苷酸 ( 一般为 2~6 个 ) 为重复单元串联重复组成的长度为几十个碱基的核苷酸序列, 其中最常见的是双核苷酸重复 [4] SSR 标记广泛分布于各种生物基因组上, 因其重复单元不同和重复数的差异, 构成了 SSR 序列的多态性 SSR 标记具有多态性丰富保守性高共显性遗传的特点, 成为当前应用较广泛的分子标记之一以往的 SSR 标记开发方法一般利用基因组文库杂交测序, 花费时间长且效率低, 不适于短时间内开发大量的标记用于遗传学应用研究随着高通量测序技术的快速发展, 即使一次性对上百万条 DNA 分子进行序列测定也不再是问题目前 SSR 标记在葡萄遗传多样性遗传图谱品种鉴定和亲缘关系等方面已经得到了广泛的应用目前, 国内外对于高通量测序后检测获得的大量 SSR 序列, 主要分析 SSR 重复基元分布特征和重复序列组成规律, 对 SSR 序列进行功能注释和功能分类的研究较少此外, 对葡萄进行种质资源和亲缘关系分析是利用已知或通用的 SSR, 没有进一步筛选和扩展 SSR 分子标记 [5-6] 本研究数据来源于毛葡萄叶片的转录组数据, 转录组 SSR 源自基因组编码可表达的序列, 直接与功能基因相关, 保守程度更高, 转移概率较大研究含有 SSR 的转录组序列信息, 有利于获得 SSR 序列相关功能注释信息, 从而获得更有针对性的 SSR 分子标记, 以便更有效地为基因定位遗传多样性研究及分子育櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄 [14]BilingtonN,HebertPDN.MitochondrailDNAdiversityinfishes 2008,14(3): anditsimplicationsforintroduetions[j].canjfishaquatsci, [18] 马春艳, 刘敏, 马凌波, 等. 长江口刀鲚遗传多样性的随机扩 1991,48(S1): [15]RandD M.Endotherms,ectotherms,andmitochondrialgenome- sizevariation[j].journalofmolecularevolution,1993,37(3): [16] 程起群, 温俊娥, 王云龙, 等. 刀鲚与湖鲚线粒体细胞色素 b 基因增多态 DNA(RAPD) 分析 [J]. 海洋水产研究,2004,25(5): [19] 杨金权, 胡雪莲, 唐文乔. 长江及其南部邻近水域刀鲚的种群遗传结构及种群历史 [J]. 上海水产大学学报,2008,17(5): 片段多态性及遗传关系 [J]. 湖泊科学,2006,18(4): [20] 许志强, 葛家春, 黄成, 等. 基于颌骨长度和线粒体 Cytb 序列 [17] 葛家春, 曹廷, 陈婵娟, 等. 利用扩增片断长度多态性技术分变异探讨短颌鲚的分类地位 [J]. 大连水产学院学报,2009,24 析长江刀鲚的遗传多样性 [J]. 南京大学学报 ( 自然科学 ), (3):

材料! 方法! # 基因的扩增及其序列分析

材料! 方法! # 基因的扩增及其序列分析生物技术通报黄艳燕黄靖华卢福芝孙靓彭立新周兴黄日波利用的方法从鼠李糖乳杆菌基因组中扩增到乳酸脱氢酶基因并连接到载体上构建表达质粒将重组质粒转化大肠杆菌重组菌株经诱导表达电泳分析表明在大肠杆菌中实现了表达表达产物的分子量约为同时采用紫外分光光度法测定乳酸脱氢酶的酶活测得重组菌株的乳酸脱氢酶活力为最适反应温度为最适乳酸脱氢酶克隆表达鼠李糖乳杆菌