00 中国寄生虫学与寄生虫病杂志年月第卷第期! "#$ % & $ % '$ 了解寄生线虫的流行方式抗药性等位基因的扩散以及疾病的防控有着重要的意义寄生线虫遗传多样性的分子研究方法遗传多样性的研究方法从传统的形态学标记染色体标记和生化标记逐步发展到!' 分子标记!' 是遗传物质的载体

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歆务蔺
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1 中国寄生虫学与寄生虫病杂志年月第卷第期! "#$ % & $ % '$ ); 文章编号 0;0); 综述!"#$ 0% 0% 0 0 动物寄生线虫分子遗传标记的发展对兽医寄生虫学中的基础和应用研究领域有着重要意义通过对线虫种群遗传多样性的研究不仅能够为抗药性等位基因的扩散提供理论依据而且对线虫病防治策略的制定具有指导作用因此本文就分子遗传标记! (( (( 和线粒体!' 在寄生线虫遗传多样性研究中的应用进行综述中图分类号 )$* 文献标识码!" #!$,' -./ 0% %, # 0% % 1" / - 0 % 0 %! " # $%!&%" '% %" % &' #%( ) * $%, " -%.% * %/. 0" 1% % %" #)" 1% '&" #% #/ -# # 52-6# 54 # 6/ # &. -.$ # / # : 6 / /-# % :/ 3 54 # # -$ 39 2#/ 44 # 6 5 #/ -# 57 %!% ((% % (( 2 5#2!' 52$ ( )$ # -# #!" #$ % & (/442 :. (4# /2 6 -(#6# # /: #, '$ 0; 42- / 5 5/5 $/$2/$# 生物多样性包括遗传多样性物种多样性生态系统多样性和景观多样性在生物多样性这四个层次中遗传多样性是核心内容和生物进化的基础遗传多样性是指同一物种内不同种群间或同一种群内不同个体间的遗传变异的总和在种群间或种群内主要表现为分子细胞和个体三个水平上的遗传变异通常来说遗传变异程度的高低是反映遗传多样性大小的最直接表达形式在自然界中种群是生物进化的基本单位种群遗传结构的基金项目公益性行业农业科研专项经费资助 '$ 0; 作者单位 0 华中农业大学农业微生物学国家重点实验室动物医学院武汉 ; 中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室甘肃省动物寄生虫病重点实验室兰州 ; 通讯作者 5 5/5 $/$2/$# 差异也反映着遗传多样性的程度所以遗传变异的大小和种群遗传结构的差异同时决定着一个物种的进化潜力和对不良环境的抵抗能力遗传多样性的研究有着重要的价值可以为物种的进化提供理论支持加深人们对生物起源的认识同时为保护现有资源提供背景资料对于寄生线虫来说每年由寄生线虫引起的疾病给家畜的健康和畜牧业的发展带来严重的危害这使得人们的研究不断深入从最初对寄生线虫的形态学系统分类学和生态学特征等方面的描述逐渐发展到遗传特性分子进化以及基因功能等方面的研究寄生线虫种群遗传学的研究可以在种群间或种群内进行遗传多样性依赖于碱基的突变率种群的有效大小和种群的迁移率等遗传多样性的研究对

2 00 中国寄生虫学与寄生虫病杂志年月第卷第期! "#$ % & $ % '$ 了解寄生线虫的流行方式抗药性等位基因的扩散以及疾病的防控有着重要的意义寄生线虫遗传多样性的分子研究方法遗传多样性的研究方法从传统的形态学标记染色体标记和生化标记逐步发展到!' 分子标记!' 是遗传物质的载体遗传信息就是!' 的碱基排序直接对!' 碱基序列的分析和比较是揭示遗传多样性的最理想方法与其他标记相比!' 分子标记不受发育阶段和组织特异性的影响多态信息含量丰富现已被广泛应用到系统发育基因定位和遗传育种等研究中此外!' 分子标记应用于研究种群遗传多样性时不需要大量的表型遗传基础作为背景资料为加快寄生线虫的分子生物学研究诊断分析和潜在疫苗的特征描述提供了技术保障 $ 限制性片段长度多态性 # ( ) *()(%,-,- 标记是以分子杂交为核心的第代分子标记技术其基本原理是基因组!' 上的特定核苷酸序列可被限制性内切酶识别并切割然后与探针结合进行./ 杂交通过放射显影的方法观察所获得的特异性,- 图 0 谱这种分子标记的出现使得种群遗传学的发展向前跨越了一大步但是同位素标记的使用存在一定的放射性污染对于不同发育阶段的个体差异分析敏感性不高随着技术的建立,- 常与技术相结合应用于种群遗传多样性的分析中既克服了上述方法的局限性也省去了酶切和杂交等繁琐的操作 1 过程并且仅需少量的!' 模板,- 的原理是将扩增的产物使用特异性的限制性内切酶切割成大小不同的片段再利用凝胶电泳分辨其差异性 $ 随机扩增多态性!' ( () ) *()#!'!! 技术最早出现于世纪 1 年代是以为核心的第代分子标记技术使用该分子标记时不需要了解研究对象的!' 序列信息利用个核苷酸的随机寡核苷酸序列作为引物对基因组!' 进行扩增根据凝胶电泳显示的若干大小不一片段分析该物种的多态 % 性应用! 分子标记时所需!' 的量少操作简易检测速度快可以检测出,- 标记不能检测的重复序列区填补,- 图谱的空缺但是该分子标记重复性和特异性比较差 $ 聚合酶链式反应单链构象多态性 ) *( # # #( ) *()(%.... 标记是将和!' 单链构象多态性结合的第代分子标记技术其原理是将扩增得到的!' 双链产物变性处理成单链的!' 在非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳中根据电泳迁移率的不同观察单链!' 构象的差异反映出物种的多态性传统的.. 分析采用平板凝胶电泳这不仅费时费力还不能满足大量筛选突变基因的需要有研究者将毛细管电泳与.. 结合替代了平板凝胶电泳.. 标记具有分离效率高分析速度快样品用量少等特点世纪 0 年代.. 标记得到广泛应用 $ 扩增性长度片段多态性 () ( ) *()(%,-,- 标记也是第代分子标记技术的一种与,- 标记不同的是该标记需要两种限制性内切酶切割基因组!' 酶切片段的端在连接酶的作用下与带有两种内切酶黏性末端的接头序列连接接头序列是由核心序列和内切酶识别序列两部分组成接头序列与引物端选择性碱基识别对特异性片段进行预扩增和选择性扩增在变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳上检测产物寻找多态性片段,- 标记兼具了,- 和! 两种标记的优点但是操作比较复杂花费较高 $ 微卫星!' (#!'.. 微卫星!' 又被称为简单重复序列 () /# )%.. 或者短串联重复序列 ( )%. 广泛且随机地分布在真核生物的基 2 因组中是由 2 个核苷酸为重复单元组成的串联重复序列微卫星!' 呈现出的高度多态性以自身重复单位数的差异为基础在!' 复制过程中出现滑链现象使重复序列之间发生了插入和缺失等变化出现了大量的不同的等位基因从而引起了微 %0 卫星!' 的高度多态性微卫星!' 是由核心序列与其两端的侧翼序列组成的根据两端保守的侧翼序列设计反应的引物扩增出微卫星片段用于遗传多样性的分析目前微卫星!' 被广泛应用于种群遗传结构分析构建遗传图谱亲子鉴定和 3- 定位等研究中 $2 线粒体!' (#!' 寄生线虫的线粒体基因组与后生动物的线粒体基因组相似也呈环形基因组大小在 2 45 目前大约有种线虫的线粒体基因组全部完成测序和分析线粒体基因组包括个编码基因分别是烟酰胺脱氢酶亚单位 2 和 - 基因细胞色素氧化酶亚

3 中国寄生虫学与寄生虫病杂志年月第卷第期! "#$ % & $ % '$./ 单位 * 和基因, 酶亚单位 - 或. 基因除旋毛虫外大部分线虫的线粒体基因组不包括, 酶亚单位. 基因还包括 ' / 基因和 ' 基因线粒体基因组独立存在于细胞核外与核基因组相比进化速率快有母系遗传特征并且能够稳定遗传常被应用在种群遗传学的研究中尤其是相对保守的和基因应用广泛 $0!' 分子标记方法特征的比较!' 分子标记可以分为两大类型 ( 型是与分子标记相关联的基因的功能是已知的 (( 型是与分子标记相关联的基因功能是未知的!' 分子标记被广泛应用于种群的遗传学分析中每种标记都有自身的优点和局限性常用的分子标记特点见表表分子标记特点的比较分子标记!!' 多态性序列信息遗传特征标记类型核心技术核遗传特性基因座位数等位基因数低需要共显性 ( 型 )(( 型杂交是单个中度不需要显性 (( 型是多重高不需要显性 (( 型是多重高需要共显性 (( 型是单个多重高需要母系遗传 ( 型不是多重单倍体寄生线虫遗传多样性的研究现状 $ 捻转血矛线虫!" ##" 线粒体!' 属于核外基因并且具有进化速率快母系遗传等优点因此常被选作遗传标记应用于捻转血矛线虫遗传多样性的研究中国内外均有报道以线粒体 $ 基因作为遗传标记对寄生在牛羊体内的捻转血矛线虫的种群遗传结构进行分析包括美国希腊德国瑞典澳大利亚印度尼西亚柬埔寨马来西亚也门巴西中国和巴基 0 斯坦等地区这些研究均表明捻转血矛线虫的遗传变异大部分来自种群内部其次从全球范围来看来自距离相近的国家或同域的种群种群间基因流动高导致种群间遗传分化程度不高而对于不同地理起源的种群来说受地理隔离的影响种群间基因流动有一定的阻碍使得种群间的遗传分化程度相对较高而以同样基因作为遗传标记分析寄生在野生动物体内的捻转血矛线虫的种群遗传结构时发现种群内部也表现出较高的遗传. 变异国外研究者对捻转血矛线虫的微卫星!' 的结构特点也进行了研究结果发现捻转血矛线虫的微卫星位点不属于完美型但捻转血矛线虫的微卫星标记的多态性比较丰富可作为遗传标记用于种群 /% 遗传结构分析利用. 个微卫星位点分析捻转血矛线虫成虫和期幼虫的遗传多样性结果表明在对大量的幼虫!' 样品进行遗传学研究以及实验室株和野生株之间的遗传关系分析上微卫星标记是一种简便而又快速的手段以个微卫星位点作为遗传标记分析澳大利亚不同气候和地理位置的捻转血矛线虫的种群遗传结构结果表明来自澳大利亚不同地理位置的种群表现出明显的遗传差异同时也观察到虫体表型上的差异 $ 毛圆线虫 1 等在 // 年借助分子杂交技术使用简单非重复性的探针对蛇形毛圆线虫 #%&" "'! 的种群间和种群内的遗传关系进行了分析同时比较了蛇形毛圆线虫的实验室株和野生株之间的遗传差异研究发现实验室株的多态性并不少于野生株说明在相对规模小的种群内也能维持足够的多态性标记也可应用于寄生线虫种类的鉴定利用该技术鉴别来自山羊绵羊牛和猪体内的种毛圆线虫对核糖体!' 内转录间隔区 (, 的分析结果表明 (, 和 (, 是鉴别寄生线虫种类的特异性遗传标记以! 作为种类特异性的标记对毛圆线虫进行鉴定但是这些寄生线虫的种内高度变异使得鉴定结果不可靠需要同时结合生态学和形态学一起进行种类上的鉴别 $ 肺线虫利用线粒体基因分析瑞典胎生肺线虫 #&"" " 的种群遗传结构数据分析后共得到个单倍体单倍型多态性和核苷酸多态性分别是 $- 和 $ 不同地理起源的个单倍体聚类分析没有发现明显的遗传结构分析结果表明牛肺线虫的种群内部遗传差异较小并 - 且种群间的基因流动也较低利用标记对来自瑞典的胎生肺线虫的. 个野生株和个实验室株的种群遗传结构进行分析结果显示种群内的杂合体较少这可能与种群的突变率和迁移率保持平衡有关从图谱上可发现实验室株与野生株的种群遗传结构有所不同将野生株和实验室株作为一个整体时分析结果显示有的变异发生在种群内部而. 个野生株单独

4 . 中国寄生虫学与寄生虫病杂志年月第卷第期! "#$ % & $ % '$ 分析时发现有的变异发生在种群内部应用!' 和 ( 两种分子标记对同样的 ) 个野生株和 * 个实验室株进行种群遗传结构研究发现这 ) 个野生株中至少存在个亚种群结构其中有 * 个占主导地位在这个占主导地位的种群中又分化出两个较小的遗传组群该分析结果意味着这些牛肺线虫有着多重的 ) 来源 $ 环背带线虫! 使用线粒体 " 基因研究来自法国和摩洛哥的 ** 个环背带线虫种群的遗传结构结果显示所有的种群都呈现高度的核苷酸多态性在小规模的地理范围内小于, 种群没有发生遗传亚分化在大规模的地理范围内 # $- 值比较显著但种群之间的遗. 传差异不明显由于环背带线虫的种群遗传学信息较少限制了对药物抗药性的研究 / 等在年通过环背带线虫的 01- 数据库筛选了个多态性丰富稳定性好扩增效率高的微卫星位点用于种群遗传学的研究以对微卫星标记分析环背带线虫的. 个野生株和个实验室株的种群内和种群间的遗传关系结果显示所有的种群均在种群内部表现出了高度的遗传变异对于来自英国不同地理起源的野生株和实验室株的种群没有检测到遗传差异而来自法国野生株的个种群和来自新西兰实验室株的个种群在种群间表现出明显的遗传差异最后分析结果表明寄生在山羊体内的环背带线虫不是单一的虫种有可能存在隐藏种 $ 钩虫将 11 标记与!' 测序相结合研究犬钩虫 %&!! 十二指肠钩虫 %&! 和美洲钩虫 '! 的群体遗传结构结果表明在犬钩虫和十二指肠钩虫中存在着亚种结构来自中国和多哥的美洲钩虫有个不同的核苷酸固定位点变异暗示美洲钩虫是一个复杂的种群这些发现说明钩虫的种群遗传学研究有着重要的流行病学意义以线粒体基因为遗传标记对寄生在人狗和猫体内的钩虫的遗传特征进行研究系统发育分析发现不同宿主体内的钩虫分成两个聚类群其中一簇包括寄生在人体内的个隔离株另一簇由寄生在人和动物体内的. 个隔离株组成进一步分析发现两个聚类群的钩虫的核苷酸序列有个碱基的差异这些发现意味着不同宿主体内的钩虫可能存在相似的单倍型以同样的遗传标记对寄生在澳洲海狮 ' 体内的钩虫进行种群遗传结构分析研究发现种群间基因流动高遗传分化程度较低反驳了由于地理隔离阻碍了钩虫基因流动的假设 $ 鼠类圆线虫利用 ( 标记对来自英国和德国的鼠类圆线虫 $& 寄生在野生鼠体内种群遗传结构进行分析分析表明来自宿主体内不同个体间的差异为 $ 同一采样地点不同种群间的差异为 $ 不同采样地点之间的样品遗传差异很小为 $ 得到的数据说明鼠类圆线虫的种群间存在着一定的基因流 $ 其它线虫! 等在.. 年应用线粒体标记分析奥斯特线虫的种群遗传多样性发现来自不同地理位置的种群间存在很高的基因流利用! 标记技术选择条随机性引物扩增异小杆线虫的基因组!' 分析噬菌异小杆线虫 )) 和 0 夏威夷异小杆线虫 ( ) / ( 2 3 ( 01* 和 4 大异小杆线虫 (! 1 和 "* ( * 和 (! "* 等种异小杆线虫和不同隔离株之间的遗传相似度及差异关系 ( ) /* ( 和 ( * 这种线虫来自哥伦比亚 01* 隔离株来自埃及 ( 来自加利福尼亚 (! 来自美国结果表明同一种个体间平均相似百分比为.$ 比较异小杆线虫的个种时发现隔离株之间的平均相似百分比为 )$) 不同种之间的平均相似百分比为 *$ 应用 11 标记和对线粒体基因的部分片段测序两种方法有学者分析了来自欧洲和亚洲不同地理起源寄生在猫狗和狐狸体内的结膜吸允线虫 * 的种群遗传结构对欧洲个个体寄生在狗狐狸和猫体内的基因序列进行分析发现有个核苷酸位点没有发生突变而对亚洲的 * 个个体寄生在狗体内的基因序列进行分析发现这个核苷酸位点中个位点发生了 / 转换 * 个位点发生了 - 转换 11 标记的分析结果与线粒体基因测序分析结果一致说明 11 对于结膜吸允线 ) 虫的种群遗传学研究是一个很好的分子遗传标记利用 11 标记分析寄生在有袋类和啮齿类动物体内的毛细线虫的种群遗传结构结果表明来自同一宿主体内的毛细线虫没有表现出明显的遗传差异并且在同一宿主体内此类线虫会寄生在 *5 个不同的组织器官中但

5 中国寄生虫学与寄生虫病杂志年月第卷第期! "#$ % & $ % '$ 是来自不同宿主体内的毛细线虫则存在较明显的遗传差异提示可能由寄生宿主种类的特异性引起毛细线虫的种群遗传差异结语随着分子生物学技术突飞猛进的发展对寄生线虫的分子分类学分子进化学和种群遗传学等方面取得了一些研究进展但对于寄生线虫这个庞大的生物群体而言还存在很多的科学空白近些年来国内开展了关于捻转血矛线虫旋毛虫美洲钩虫和弓首蛔虫等寄生线虫种群遗传学的研究这些研究将为进一步了解寄生线虫的种群遗传学特征提供良好的理论支持分子遗传标记技术的发展对寄生线虫新虫种的分子鉴定和系统进化的研究起到了巨大的推动作用然而对于大多数寄生线虫而言基因组和遗传进化信息尚且未知这些资料的匮乏使得对寄生线虫的宿主群的形成过程宿主的防御和选择压力以及寄生虫药物抗药性形成的研究捉襟见肘不断丰富寄生线虫在基因组转录组蛋白组以及代谢组等方面的资料将会对研究其分子分类学群体遗传学分子流行病学和寄生虫病的防治提供重要的帮助参考文献马克平 $ 试论生物多样性的概念 $ 生物多样性 $ (!$ )#* ),# $ -*.). -*) $ / /00 1$ -)) #) # ##..*# *.).)). )#) $ ') 23 "4. 5) ) 6$ 沈浩刘登义 $ 遗传多样性概述 $ 生物学杂志 7 6$ 8) 9: ') -;$ 8),#. ))# ))# 0*) ),.) ##), #. )# $ $ #. 9$ 8))# 0 ) )# ),# $ ). 6 $ 6 张晨昊杨毅梅 $ 分子标记技术在寄生虫分类鉴定中的应用 $ 中国寄生虫学与寄生虫病杂志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

6 中国寄生虫学与寄生虫病杂志年月第卷第期! "#$ % & $ % '$ ( ) ( * $ #, -#. - / # -$ #. $ " ) $ # 2/,, -#. $ #. 3$. # 4 & $ # / 2. 0#,, 51 5/ -2 - /., 0#,0-0$ 6 $ 7 8 9:.5 ( $ 4# -/-#,,# 51, )7 $ 6 $ 4 8' 80 4$ :2!') - / ,! $ 6 ; ; $ ; '1 ) ' 20 6 $ 4#., 0/., 2#, 5/ 5 # /, -#!') $ )# - 3 $ 7.5 ( 5 $,..-, - /.-#!'),,#, 7. #0/. $ $ ' $ 7 #0 /,.# #/#. # : , $ #- 3$ )!) $ 4# 2/ 5/.-,, /.-. /, -#. " ##$ 701., # $ 6 ; ;; ;;;$ 0 7!) 4 $ -7 0#, 52# 701. " ##$ 5.!') )(. #7$ 0/ 3 $ 0 & 7.5 ( $ #!') #-5 --7, % $ 3 3$ ; 4 & # ( 4 $ #, %.# #. $ #. 3 ; $ ; 4 & # ( 5 $ -7 0# /, 2 -#. % 2#, #/-# -# $ 6 ; ;;;$ ; 7 ' <7 = $ 0 #,. - /.-.5 /,.# #/#. # : ,# 757# $ #- ;$ ; '07 / ) 7 9 $ 4# ##, -.# #/#. : # &' 0, # -#., # $ )# - ;$ ;; / #7 )! 00! $ :-# 5#, 0# -, 0 / 2 --7, 1.,. 00-# / $ 6,# 4 2 ; $ ; ( &/ $ --7 0# 7#7,,#7 2 / :7 -#. % 1 $ # # 3 $ ;3!. 7 7/ $ 4# 7#7, --7, $ & ;3; 3$ ; $ 4# 2/ #-#. 55 $ 625 $ ; "! 4! 7# ( $ ) /, 0# 25 / 1 $% '.,. 7- ) 5/ 7#0.7 #0,.# #/#. # : $ 5 3 $ ; <7 => -! 20 6 $ ) /, 0# #, $,. )7.7-5/ 0 #,. - /.-.,.#!' )$ 6 $ 李莉牛安欧刘蓉等 $ 用和 )! 技术研究中国不同地域旋毛虫株的遗传变异 $ 中国人兽共患病杂志 ; 3$? 李铁华郭湘荣胡玲等 $ 我国五省美洲钩虫 "6 基因序列多态性分析?$ 中国寄生虫学与寄生虫病杂志 ; $? 李明伟林瑞庆曹湛等 $ 弓首蛔虫及狮弓蛔虫线粒体基因组 ; 基因多态性研究?$ 热带医学杂志 3 3 3$ 收稿日期 3 编辑衣凤芸张争艳

7 北京大学学报医学版 # +94* 4 ' % 论著!! "# $ #% %"&!%'!! $ "( )& * $ +,-.)/ ) 01 " * ). " 2")3 )01 ( /" 433% /1 " 0 "51 " -.)/$ 6',)") 4.))%) 0

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