畜 牧 兽 医 学 报 卷 中 基因位于线粒体 %%!" 处 与 紧密连接 构成 脱氢酶的一个亚基 并且部分核苷酸与另一个亚基共用 现有马 的研究多数集中在.." 区 细胞色素! % 及限制性分析方面 本研究通过对西南马 脱氢酶 亚基序列变异进行测定和分析 从分子水平上研究其遗传多样性 以期为中国西

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1 畜牧兽医学报 中国西南马 基因遗传多样性研究 杨 虹 赛 娜 芒 来 内蒙古农业大学动物科学与医学学院 呼和浩特 摘 要 本研究旨在分析 基因在中国西南马的遗传多样性 对中国西南马 个品种 类群 个个体的线粒体 基因部分序列进行 和序列分析 结果表明 拼接后的西南马 基因序列大小为!"#$ 含量 %%&' 高于 # 含量 &' 共检测到 个核苷酸变异位点 这些变异位点可归纳为 种单倍型 核苷酸平均多样度为 &' 表明受试西南马 遗传多样性并不十分丰富 对各单倍型进行聚类分析 结果提示中国西南马起源于 个母系祖先 关键词 西南马 线粒体 基因 单倍型 遗传多样性中图分类号 & 文献标识码 文章编号 %!"#""$%&'!$$%!$'#""!(")"$ *!$ 1.+,(!"#"$#%$ &&' +%$-(2"3(+((0.+)*4 (./-.+03(),+,+(/".)*.3 "-( (+-(+&"3()53,+.5(./-.+03(),+7 86+/0+0+)*40!*5.3(+0(9(06) !30(+-(+& $-36)-.70--")(/086+/.5, !"+0-/.++.5#$%%&'7-(, # &'& 6(.+) (730/0+0).5-86+/".)*.3"-(/(73.30(+.-").*"&$- 93,+6/).(00(93(* 7&'+0-,+(/".)*.3"-( !6+0+&$-/)63+)*(.5--").*"6,, (+-(+.3(,( )+/.3&,"( (./-.+03(),+-").*",+(/".)*.3"-( 中国西南马是在自然状态下保种 且没有进行过专门矮化育种而形成的矮马品种 它与设特兰矮马共同构成世界矮马的两大源流 西南马体型外貌匀称优美 具有体质健壮 繁殖性能好 适应能力强等特点 成为我国独特的马品种资源 由于表型特性 培育条件 地理间隔等方面的不同 西南马形成 了若干个不同的地方类群 高等动物线粒体 (./-.+03() 作为核外遗传物质 具有分子量小 拷贝数多 进化速度快 遗传自主 无组织特异性和严格遵循母系遗传等特点 的变异主要来源于突 变而非重组 能更直观的保存群体突变的发生 其多态性已广泛应用于分子进化 生物分类 群体遗传结构分析 亲缘关系鉴定 法医学鉴定 衰老 疾病诊断以及家畜经济性状等方面的研究 马 约为!" 包括 个编码蛋白质的基因 其 收稿日期 基金项目 国家自然科学基金 作者简介 杨 虹 女 天津人 博士生 主要从事分子数量遗传学与马科学的研究 ()*+,-.+, *-..&/.&/+ 通讯作者 芒 来 ()0+,)(*-..&/.&/+

2 畜 牧 兽 医 学 报 卷 中 基因位于线粒体 %%!" 处 与 紧密连接 构成 脱氢酶的一个亚基 并且部分核苷酸与另一个亚基共用 现有马 的研究多数集中在.." 区 细胞色素! % 及限制性分析方面 本研究通过对西南马 脱氢酶 亚基序列变异进行测定和分析 从分子水平上研究其遗传多样性 以期为中国西南马品种资源的保护 利用和开发提供科学依据 材料与方法 - 试验材料本研究共采集西南马样本 个 包括 个马品种 类群 表 颈静脉采血 加 抗凝 : ; 保存 表 样品信息.+'"'$/$$ 马匹品种.3!30 贵州马 6( 德保马!.-.3 丘北马 (6!(-.3 文山马 大理马 )(-.3 宁强马 (+,8(+,-.3 采样地点.)/(.+)./(.+ 贵州亨县 +,/.6+*6( (+/ 广西德保!./.6+*6+,2(3.9(+/ 云南丘北 (6!(/.6+* (+/ 云南文山 (+/ 云南大理 )( (+/ 陕西宁强 (+,8(+,/.6+*-+2(3.9(+/ 样本数量 匹 6!3 &%0$&,) &% 正反向引物 ".) 各 聚合酶 < 模板 +, &% 加灭菌双蒸水至 % 反应条件 ; 预变性 %(+ ; % ;%% ; ; 个循环 ; (+ ; 保存 产物用 ' 琼脂糖凝胶电泳检测 -&*01*& 分析移取 产物和 的变性上样缓冲液 ' 去离子甲酰胺 &%' 溴酚蓝 &%' 二甲苯青.) $' 甘油 混合 ; 变性 (+ 冰浴 (+ 变性后的 产物进行非变性聚丙烯酰胺凝胶 '/3(= > 恒压电泳 - 电泳结束后银染显色 - 测序选取代表不同单倍型的个体各 个进行纯化后送宝生物工程 大连 有限公司进行双向测序 结 果 -&*0 扩增与 &*01*& 扩增产物经 &' 琼脂糖凝胶电泳检测 均得到一条特异性条带 并且与预期结果基本一致 图 图 可以看出扩增的目的片段明亮 特异性好 可用于后续分析 - 基因组 的提取 采用 -+ 等的方法提取基因组 -&*0 扩增西南马 和 特异性引物是根据 ++ 发表的马 全序列 % 用 3(3%& 软件设计而成 引物由宝生物工程 大连 有限公司合成 正向引物 %$$$ $$ 反向引物 %$$ $ 正向引物 %$$$ $$$$ 反向引物 %$ $$$$ 扩增反应体系为 % 其中 653 & 扩增产物 & 相对分子质量标准 &"3.06/.5 & 33 图 &*0 扩增产物电泳图 $/""%$ &*0% 利用聚丙烯酰胺凝胶检测西南马 片段的多态性 结果表明在所检测的 个个体中 发现 和 种单倍型 图 聚丙烯酰胺凝胶检测马 片段的多态性 结果显示在所检测的 个个体中 共发现 和 种单倍型 图

3 期 杨 虹等 中国西南马 基因遗传多样性研究 % & 扩增产物 & 相对分子质量标准 &"3.06/.5 & 33 图 &*0 扩增产物电泳图 $/""%$ &*0% 图 片段 &*01*& 检测结果 $/.!"" &*01*& 蛋白质为 $3*3, 和 33. 通过 分析 个中国西南马品种 类群 扩增片段 共发现 和 种单倍型 其中在丘北马中没有发现单倍型 在文山马 宁强马中没有发现单倍型 在大理马中没有发现单倍型 通过对 片段 种单倍型测序 并与 ++ 发表的马 全序列 % 进行比对 共发现个碱基替换或缺失位点 即!"!"$!"!"$!"$!" %!"%%!"%!" 其中 % 和 %%!" 处的碱基替换导致了编码氨基酸的改变 - 遗传多样性根据 基因 和 个片段的序列分析 用 3 软件对这 个片段序列进行拼接 并反复测序进行校正后 用 )6) 软件进行比对 未发现有插入缺失 合并后序列长度为!" 在 个马品种 类群 中共检测到 种单倍型 表 表 基因合并表.+'"%$ /"" 图 片段 &*01*& 检测结果 $/.!"" &*01*& - 核苷酸分析 片段序列经测序分析后显示 $ 种核苷酸的含量分别为 &%'&' &%'&' 说明 #$ 含量 %&' 高于 # 含量 &' 并且 的含量约为 的 &% 倍 片段测序结果显示 $ 种核苷酸的含量分别为 &'&'&' &' 说明 # $ 含量 %&' 略高于 # 含量 %' 的含量约为 的 倍 本研究中 个中国西南马品种 类群 片段上共发现 和 种单倍型 通过进一步测序分析 并将测序结果与 ++ 发表的马 全序列 % 进行比对 发现单倍型 与 % 序列完全一致 而单倍型 与 之间存在 处差异 即 $!" 和 $!" 所编码 位点 ( 单倍型类型 $*".5-").*" 所属单倍型 ").*"!).+,. 所属单倍型 ").*"!).+,. 合并单倍型.!(+0-").*" 基因部分序列单倍型合并后所得 种单倍型 在各品种 类群 中的频率有所不同 仅单倍型 为丘北马所特有 中国西南马的 个地方品种 类群 在 基因存在种内核苷酸多态现象 其中大理马种内核苷酸多样度最小 为 & 核苷酸平均差异数只有 其它西南马类群核苷酸多态性基本相当 表 - 遗传距离与聚类分析 用 +6/).(0?(63"33 模型计算各单倍型间的距离 运用!..3" 方法估计标准差 结果见表 从?(63 双参数距离可以看出 种单倍型间的遗传距离变异范围为 &&

4 畜 牧 兽 医 学 报 卷 表 种西南马的遗传多样性.+'".!"/""$%$"$$2!("!" 项目 核苷酸平均差异数 +0(53+/.5+6/).(0 核苷酸多样度 (93(*.5+6/).(0 贵州马 6( 德保马!.-.3 丘北马 (6!(-.3 文山马 大理马 宁强马 )(-.3 (+,8(+,-.3 & & %& &% & &% & & & & & & 表 单倍型间的,$1"" 距离.+'",$1""$($"$%"/$"1 "!'" & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & 对角线上方为标准差 对角线下方为?(63 双参数距离 ((.+!.90(,.+)+0?(63"33 0(+/!).70(,.+) 以亲缘关系较远的驴相应序列 作为外群 用最大简约法 法 对西南马 基因中的 种单倍型进行聚类分析并构建聚类关系图 图 % 图 种单倍型的聚类分析 $/*'"'$$2!'" 从图 % 可以看出 单倍型 和 聚在一起 而单倍型 和 聚在一起 从母系遗传来讲 单倍型 和 的亲缘关系较近 单倍型 和 的亲缘关系较近 讨 论 动物 多态性已成为当今 研究的热点问题之一 已被广泛应用于遗传学 动物分类 学 系统发生学等多个学科 多态性的研究方法主要有 法 直 接测序法以及微阵列杂交法等 本研究所采用的 技术是检测 突变最直观最精确的试验技术手段之一 该方法对于小片段 变异检测的灵敏度较高 结合测序 可以对大批量样品 片段进行分析 本研究中拼接后的西南马 基因序列为!" # $ 含量 %%' 高于 # 含量 &' 与其它报道结 果一致 分析西南马 基因部分序列 发现在变异位点中它发生颠换的位点只有 个而发生转换的位点有 个 这符合线粒体基因组 进化过程中 通常发生转换的频率远高于颠换 的频率这一规律 一般用于衡量种群 遗传变异程度的指标有 个 单倍型间的平均遗传距离和核苷酸多样度 由于核苷酸多样度涉及各种 单倍型在群体中所占的比例 反映一个群体 的多态程度时比单纯的遗传距离要精确 核苷酸多样度值越高说明群体遗传多样性越高 据 (,) 等统计 同种哺乳动物个体间平均核苷酸变异值在 &' ' 之间 本研究中 基因的核苷酸平均多样度为 &' 表明我国西南马的遗传多态性并不是十分丰富 其遗传关系接近 这一认识 % 与侯文通等对西南马血液蛋白的研究结果一致 这样的结果与西南马长期生存的自然环境密不可 分 西南马产区自古山川险阻 交通梗塞 与外界的遗传信息交流少 因此这一产区的马匹品种具有相对较近的遗传关系 对本研究中 个西南马个体 基因部分序列进行分析共发现 处核苷酸突变 这样的结果符合线粒体的进化特征 进化速度较快 具 有良好的种系发生信息 与 6 等的研究结果相符 这些核苷酸变异共形成 种单倍型 其中仅有 型为丘北马所特有 可以作为类群的特征差别 聚类分析将 种单倍型分成 组 表明其中有雌性

5 期 杨 虹等 中国西南马 基因遗传多样性研究 介导的基因流的存在 由此推测所研究的西南马 个品种 类群 起源于 个母系祖先 此结果与解德 文等通过血液蛋白多态性以及相关史料分析结果相一致 然而 本研究中的 种单倍型个体在生产性能 生活力 繁殖性能等重要经济性状上的差异尚需要进行大量的相关性研究 家畜遗传多样性是生物多样性的重要组成部分 是畜牧业生产的基础 年农业部公布的中 国畜禽遗传资源状况中宁强马被列为濒危资源 本研究对中国西南马 个品种 类群 基因部分序列进行扩增 发现其线粒体多态性并不十分丰富 但核基因多态性水平还有待选用其他核 标记进行深入探讨 B A31 B &(./-.+03() 9.)6(.+(+-,+6866A&$&- #.&%%%& < 1)&6)("),+. *".5(./-.+03() 7(-(+-.3"."6)(.+ 53.)3,(.+( (+/.5-(+A& -", & +)*(.5(./-.+03() ( )"/(/)-"+0,.A&") -"#/ 0/--" 1 $&- % & 熊 庆 刘作易 喻子牛 & 线粒体 的研究与应用 A& 西南农业学报 %%& 杨 隽 & 线粒体 多态性与家畜遗传育种 A& 四 川畜牧兽医 & 结 论 本研究中 个中国西南马品种 类群 片段上共发现 种单倍型 存在 处核苷酸序列改变 并且均造成编码蛋白质的改变 在 片段上发现 种单倍型 共有个碱基替换或缺失位点 其中 处造成编码蛋白质的改变 中国西南马的 个地方品种 类群 在 基因存在种内核苷酸多态现象 核苷酸平均多样度为 &' 表明我国西南马的遗传关系接近 基因的核苷酸变异共形成 种单倍型 其中仅有 型为丘北马所特有 可以作为类群的特征差别 聚类分析将 种单倍型分成 组 提示所研究的西南马 个品种 类群 起源于 个母系祖先 参考文献 王铁权 & 中国的矮马 & 北京 北京农业大学出版社 & <1 &9.)6(.+.5- (./-.+03(),+."3.( /.++/(.+. +( )56+,(+0")+ A&&() $* + %%%& < B <&$-/.") (./-.+03() 86+/ /!)62+ (9-3.")*.5-/.+3.)3,(.+ A&, %& 芒 来 李金莲 石有斐 & 中国蒙古马与国外纯血马.." 高变区序列比较 A& 遗传 % & % 李金莲 石有斐 布仁其其格 等 & 三大不同品种马 *! 分析 A& 遗传 & B1 1B )&."6)(.+93(( (./-.+03() -*"393(!)3,(.++0 (+% 3.(+ (+0(9(06) 0.+30!* (.!()(40 86+/ "/(5(/.)(,.+6/).(0"3.!+)*( A& $#&%& < C $A C )&$-(. /-.+03(),+.36/63.5- /).600)."30!+&A&,"%% %& 李金莲 & 中国蒙古马遗传多样性和分子系统进化研究 & 呼和浩特 内蒙古农业大学 & A>A&"")(/( ).0).,.,3"-(/0(3(!6(.+.5+()(./-.+03() 93((.+ A&, % & % 侯文通 李相运 李勤荣 & 西南马地方类型遗传分化及亲缘关系研究 A& 西北农业学报 & 中国家畜家禽品种志 编委会 中国马驴品种志 编写组 & 中国马驴品种志 & 上海 上海科学技术出版社 & B <&$-/. ")(./-.+03().5-0.+* +0/."3(.+.+,5.63/).)*3)0 )(+"/("(3 A&&! $&.& %& 宿 兵 刘爱华 林世英 等 & 云南普通马矮型马蛋白多态性及其品种分化关系 A& 动物学研究 % & 解德文 & 云南矮马源流初探 A& 云南畜牧兽医 % 增刊 %& 中国畜禽遗传资源状况 编委会 & 中国畜禽遗传资源状况 & 北京 中国农业出版社 &

程汉良 夏德全 吴婷婷 孟学平 吉红九 董志国 陈淑吟 对文蛤 青蛤 硬壳蛤 江户布目蛤 薄片镜蛤 和菲律宾蛤仔 种帘蛤科贝类和 个地理种 群文蛤 大连 连云港 湛江 防城港 的细胞色素 氧化酶亚基 基因片段的核苷酸序列进行了分析 以探讨这一序列在种质鉴定 种群遗传结构和分子系统发生研究中的应用价值 测序结果 表明 所有物种扩增片段长度均为 序列 含量 明显高于 含量 物种间共有变异位点 个 其中简约信息位点

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