國立宜蘭大學化學工程與材料工程學系

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1 國立宜蘭大學化學工程與材料工程學系碩士論文 Department of Chemical and Materials Engineering ational Ilan University Master Thesis 嗜水氣單胞菌 (Aeromonas hydrophila) 於染料廢水工程處理之應用研究 Study on applications of dye-bearing wastewater treatment using Aeromonas hydrophila 研究生 : 顏嘉儀 Chia-Yi Yen 指導教授 : 陳博彥博士 Adivisor : Bor-Yann Chen Ph. D 中華民國九十九年六月 June, 2010

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4 摘要由於固定化菌體系統 (ICS) 可增加生化反應器之操作效率 穩定性同時使單位生物質量處理容量增加並減少生物污泥之產生, 因此利於非生長相關之生物處理 ( 例如 : 微生物脫色 ) 長久以來微生物固定化雖然被廣泛應用於工業界, 但始終無一簡單可行之量化評估方式供工業現場實際運用 先前研究以染整廢水污泥中篩選出之 Pseudomonas luteola 固定化於永續性天然基材載體上, 並以一 圖形重建 (graphical reconstruction) 之量化評估法來規範出最經濟可行之處理容量 本研究由此觀點延伸應用於自行篩選之本土性染料脫色菌株 Aeromonas hydrophila IU01 進行生物固定化染料廢水處理之最佳生物刺激操作策略評估 由於 A. hydrophila IU01 於批次懸浮式系統中較 P. luteola 具有更良好之脫色活性, 因此本研究試圖在不同基質濃度 ( X LB) 下探討各基質濃度之最大處理極限濃度, 其中 0.3X LB 之處理容量 ( mg L -1 ) 約與 0.5X LB 之處理容量 ( mg L -1 ) 相近, 因此以 0.3X LB 較具經濟可行性, 並於不同進料流速 (30-60 ml hr -1 ) 條件下於固定稀釋倍數基質濃度 (0.5X LB) 進料操作之最大處理極限濃度, 其中以 45 ml hr -1 之流速具最佳處理容量 ( mg L -1 ), 並於固定流速 (60 ml hr -1 ) 下以固定稀釋倍數之基質濃度 (0.2X LB) 進行不同染料之最大處理極限濃度實驗, 以推論 A. hydrophila 應用於固定化系統之較佳流速 最佳基質濃度及於不同染料之最大處理極限次序是否與懸浮式系統具相平行之效果, 並發現無論是何種系統中偶氮鍵數量將直接影響脫色效果, 且不同染料中以萘酚類染料之脫色效果較佳, 因此可推論染料之結構將直接影響其脫色效果 由於 A. hydrophila 為生產聚羥基酯類 (polyhydroxyalkanoates; PHA) 之菌株 ; 因此本研究並試圖在含不同濃度染料或是芳香胺中間物存在條件下進行比較 PHA 生產效能差異, 初步發現添加染料之情況下, 將對菌體產生 PHA 具有刺激效果, 並依整體初步評估染整廢水處理回收再利用之可行性, 以利工業操作之實際運用 關鍵字 : 嗜水氣單胞菌 染料脫色 染料結構 固定化 聚羥基酯類 I

5 Abstract This thesis provided a model study of dye-laden wastewater treatment for recycling and reuse of biomaterials. Considering cost-effectiveness of bioreactror operation, we evaluated threshold operation criteria of biostimulation for optimal decolorization in immobilized-cell systems (ICSs) using Porites corals as packing matrices. For sustainable development, indigenous Aeromonas hydrophila isolated from ortheast Taiwan with a promising capability of color removal was selected for this model study. As the maximal treatment capacity of ICS could only be achieved with the maximal absorbed biomass and optimal color removal capability, maintaining metabolically functioning cells to be stably attached for cost-effective color removal performance was inevitably required and essential nutrients provided from rich media should be supplemented for such a biostimulation. With assumption of efficient cell attachment and maximal dye biodecolorization, our proposed method of graphical reconstruction quantitatively revealed the most economically-feasible strategy of biostimulation for color removal. We pointed out the maximal allowable inlet concentration and treatment capacity via the determination of constant slope isoclines of ICSs at cultures fed with different concentrations of nutrient sources. o matter what operation mode of reactor was used (e.g., suspended batch cultures or ICS), color removal efficiency for A. hydrophila still strongly depended upon intrinsic kinetics and chemical reactivities of azo dyes. Mass transport limitations in ICS might not play the most significant role to restrict dye biodecolorization of A. hydrophila, as relative rankings of color removal rates of various dyes were almost in parallel with cases for ICS and suspended batch cultures. We also found that chemical structure of azo dye strongly control their biodegradability for decolorization. Plus, preliminary study of biodegradable polymers (e.g., polyhydroxyalkanoates; PHA) produced by indigenous A. hydrophila was also mentioned to consider feasibility of biomaterial recycling after dye-containing wastewater treatment. Keywords: Aeromonas hydrophila, decolorization, chemical structure, polyhydroxyalkanoates, immobilized-cell systems (ICSs). II

6 誌謝 碩士班短短兩年的光陰轉眼間就要從指縫間流逝, 兩年來的磨練讓我學習到如何朝自己的夢想前進, 一步步的構築完成這本薄薄的論文 首先感謝我的指導教授陳博彥老師這些年來所投注的關心與教導, 給予我在學習路途中的諸多教導使我受益良多, 這兩年的日子雖然很辛苦, 但是卻相對的富足, 也感謝系上的薛仲娟老師所給予的教導及關心, 多虧了老師的指教才能在論文中有所突破 論文考試期間感謝元智大學魏毓宏老師 吳和生老師 陳姍玗老師的指導並提供諸多寶貴意見, 使論文更臻完美 還要感謝系上的雅芬老師, 謝謝老師在我困頓的時候總是開導我 支持我, 也感謝系上的技工詹先生, 有任何狀況請教詹先生總是馬上可以得到解答 另外也要感謝實驗室的各位學弟妹們, 謝謝你們的鼎力相助, 在我體力不支時永遠慷慨幫忙我的學弟韋德 在我課業忙不過來時總是幫忙我的學弟阿釣 盈誠 威哥 也感謝亦師亦友的同學定宏, 在我壓力大時永遠可以陪我討論聊天 以及碩班的各位夥伴, 大家在考試前總是聚集在一起唸書交換重點, 也謝謝同學智勇在課業上的掩護, 一起度過課業繁重的碩一 也謝謝實驗室助理秉樺學長, 謝謝學長在我補數據時的鼎力幫忙 還有謝謝學弟子昭在我求職上的大力相助, 以及學弟王大還有實驗室的大三學弟妹, 謝謝你們貼心的生日禮物以及平日的熱心幫忙, 也為實驗室凝聚了更 III

7 大的向心力 也謝謝這屆小大二們的貢獻, 有你們在實驗室一點都不無聊永遠都有歡笑 最後, 僅將此論文獻給我的家人, 有你們在背後默默的付出及扶持, 這本論文才能完成, 要感謝的人太多了, 如有疏漏沒寫到的請原諒, 感謝大家 顏嘉儀僅誌於民國九十九年六月 IV

8 目錄 摘要...I Abstract... II 誌謝... III 目錄... V 圖目錄...IX 表目錄...XI 1 前言 研究動機 / 目的 文獻探討及回顧 Aeromonas hydrophila IU01 菌種介紹 染料發色起源及廢水之處理 混合培養 純菌培養 脫色之反應機制 影響生物脫色之因子 氧氣 溫度 ph 值 染料濃度 V

9 2.2.9 染料結構 電子提供者 還原電位 氧化還原介質 固定化生物反應器 以廢水刺激微生物產生生物可分解性高分子之可行性 材料與方法 菌種 染料及芳香胺中間物 載體 珊瑚 不同染料之懸浮式批次實驗 固定化系統之空白實驗 ( 遲滯時間之決定 ) 固定化實驗設計流程 以不同培養液 碳源濃度及染料 / 芳香胺中間物之條件下菌體產生 PHA 之可行性 PHA 檢測方法 分析方法 化學分析及估算方法 固定化研究之空白實驗分析方法 VI

10 3.9.3 固定化實驗分析方法 PHA 之定量分析計算 結果與討論 懸浮式系統對不同染料之脫色比較 萘酚類染料 非萘酚類染料 結論 固定化生物反應器 固定化實驗之停滯時間決定 於不同基質濃度 ( X LB) 之最大極限處理濃度實驗 不同流速於固定染料種類及基質濃度之固定化最大處理容量 固定流速及基質濃度之不同染料固定化最大處理容量實驗 結論 以廢水刺激微生物產生生物可分解性高分子之可行性 含不同濃度刺激碳源條件下對 A. hydrophila IU01 PHA 產量之影響 不同基質對 A. hydrophila IU01 PHA 產量之影響 含高濃度芳香胺中間物條件下對 A. hydrophila IU01PHA 產量之影響 VII

11 4.3.4 含不同濃度染料條件下東西台灣所篩選出之相同菌株 (A. hydrophila) 之 PHA 產量比較 結論 總結與未來展望 參考文獻 附錄 附錄 1 以不同碳源刺激下不同菌株之 PHA 產率 附錄 2 各染料之檢量線 附錄 3 基質濃度對固定化床出流菌體量之影響 附錄 4 標準菌株之乾細胞重 附錄 5 各染料之真色度 (ADMI) 附錄 6 標準菌株之偶氮酵素活性 自述 VIII

12 圖目錄 圖 2.1 Aeromonas hydrophila 親緣鑑定樹狀圖... 6 圖 2.2 偶氮染料之氧化還原機構... 7 圖 2.3 偶氮染料經還原後之羥化 (hydroxylation) 代謝途徑 圖 2.4 菌體於厭氧條件下以氧化還原介質進行偶氮染料還原之反應機構圖示 圖 2.5 醌亞胺 (quinine imine) 之聚合反應 圖 2.6 醌 (quinine) 之還原途徑 圖 2.7 固定化技術一般分類法 圖 3.1 珊瑚表面 SEM 50X 圖 3.2 珊瑚內部 SEM 1000X 圖 3.3 珊瑚內部 SEM 2000X 圖 3.4 固定化系統空白實驗裝置圖 圖 3.5 固定化實驗裝置圖 圖 3.6 固定化循環進料示意圖 圖 3.7 氣相色層分析儀之升溫策略圖 圖 3.5 固定化處理空白校正理論示意圖 圖 3.6 固定化處理效果理論示意圖 圖 3.7 PHB 之 GC 檢量線 IX

13 圖 4.1 各類組 ( 萘酚類 非萘酚類 ) 染料相對生長及脫色曲線圖 圖 4.2 比生長速率 (SGR) 對比脫色速率 (SDR) 之相平面分析曲線圖 圖 4.3-a 萘酚類偶氮染料 (RR198, RB5, RR141, RB171, RG19) 之染料結構圖 圖 4.3-b 非萘酚類偶氮染料 (DY86, RY84) 之染料結構圖 圖 4.4 萘酚類染料之偶氮 - 腙互變異構 (azo- hydrazone tautomerism) 圖 4.5 RR198 模擬共振效應之染料結構變化圖 圖 4.6 各流速 (30, 45, 60 ml hr -1 ) 之空白實驗圖 圖 4.7 不同濃度 (0.5X,0.3X,0.2X,0.1X LB) 基質於 60 ml hr -1 下刺激之固定化脫色處理效果 圖 4.8 不同濃度基質 (0.5X, 0.3X, 0.2X, 0.1X LB) 刺激之固定化最大處理容量 圖 4.9 不同流速 (30, 45, 60 ml hr -1 ) 於固定染料種類 (RR141) 及基質濃度 (0.5X LB) 下之固定化處理效果 圖 4.10 以固定染料 (RR141) 於固定基質濃度 (0.5X LB) 下, 各不同流率 (30, 45, 60 ml h -1 ) 之固定化脫色處理容量 圖 4.11 不同染料於固定流速 (60 ml hr -1 ) 及基質濃度 (0.2X LB) 之固定化最大處理容量及操作極限 圖 4.12 不同濃度之刺激碳源對 PHA 之產量影響 X

14 表目錄 表 2.1 環保署 98 年染整業放流水標準... 9 表 2.2 自然固定化系統及格子型包埋法應用於廢水處理之可行性 表 3.1 不同培養液之成分 表 4.1 Aeromonas hydrophila 於不同染料之脫色比較 表 4.2 三種不同流速之實驗值 表 4.3 三種不同流速之校正比較 表 4.4 不同濃度基質刺激之固定化脫色處理容量 表 4.5 各不同流速 (30, 45, 60 ml L -1 ) 之固定化脫色處理效果 表 4.6 各染料於固定流速及基質濃度之固定化最大極限操作濃度及處理容量 表 4.7 不同培養基質之氮磷比值對 PHA 產量之影響 表 4.8 含高濃度 (2000 mg L -1 ) 芳香胺中間物 (2AP 3AP) 條件下對 PHA 產量之影響 表 4.9 以 MR 培養基於含不同濃度染料條件下東西台灣所篩選出之相同菌株之 PHA 產量比較 XI

15 1 前言 1.1 研究動機 / 目的成千上萬種人工合成染料被研發應用於日常生活中, 由於染整相關工業大量使用生物難分解之偶氮染料之故, 因此所排放出之廢水之染料殘留問題, 像是具有高色度 高鹼度等問題一直是環保上之重點污染物, 含高色度之工業廢水一旦流入環境中, 除了會改變河川外貌外, 亦會影響到水質之透光度, 造成水中植物無法有效行使光合作用, 造成水中溶氧降低, 進而影響環境生態 再者, 研究發現有些合成染料 ( 如偶氮染料 ) 之芳香胺中間物被發現可能具有致癌性及致突變性 (Chung et al., 1981), 因此若未經處理之染整廢水任意排放, 則有可能被環境中微生物所分解而產生具生物毒性之芳香胺中間物, 對人類及生態中之各種生物造成威脅 台灣雖然在能源資源上十分貧瘠, 幾乎完全需仰賴進口, 但是生物資源之豐富度卻極高, 尤其在從未污染之東台灣而言更是寶庫, 本研究即延續先前研究室自行開發篩選之本土性菌株中深入探討工程應用及相關之產程評估 本研究乃是開發台灣本土功能性微生物資源之一案例 : 由台灣本土中可能具高生物多樣性 ( 台灣土地面積僅佔世界 0.025%, 生物多樣性卻高達世界之 2.5%, 比高指標生物多樣性之紐西蘭更高許多 (TaiBET, 2009)) 之蘭陽平原自行分離純化篩選出對偶氮染料具有優勢生態脫色能力之本土菌株 (Chen et al., 2008; 2009) 來作評估 再者, 由本土自然環境生態中篩選 1

16 出優勢功能菌株, 在環境相容之考量上, 即使稍有不慎洩露至自然環境中, 亦應無高度風險存在 此點較自染整廢水處理之活性污泥的工業應用價值度更高, 更符環境生態之友善性, 以利地狹人稠之台灣工業應用的永續發展要求 再者, 綜觀台灣地理環境而言, 中央山脈以地理屏障分隔成東 西台灣兩大部分, 長期以來亦由於地緣上先天造成之發展因素, 使東 西台灣之工商分布發展呈現不均勻對等之情況, 卻也因此使東台灣保有台灣最完整的本土多樣生態, 不因快速之工商發展而迅速消逝 尤其是位於東北台灣之蘭陽平原, 長久以來憑藉著雪山山脈之天然屏障保護下, 雖緊鄰繁華北北基, 卻因獨特之地理屏障及縣治地方政府之阻隔污染工業政策, 因此使能形成並保有獨有多樣化之本土生態 ; 再者, 宜蘭長久以來工作人口外流現象嚴重, 至今仍未受到工業帶來之環境破壞及污染 更重要的是 後山 宜蘭更因地形導致高降雨氣候及在三面環山之地形下具有豐沛雨量, 因此對環境中更有沖刷洗淨之作用, 也因此低污染條件之先天條件下而形成具豐富生物多樣性且獨特之天然微生物資源, 先前研究 (Chen et al., 2008; 2009) 於宜蘭礁溪水源地及冬山河利澤簡橋附近篩選出具優良偶氮染料脫色能力之宜蘭本土菌株 (Aeromonas hydrophila IU01), 評估具有可取代先前 Pseudomonas luteola (Chen, 2007) 菌株以作為工業應用之可行性, 最近更廣泛在台灣本土各地篩選其他染料脫色菌 ( 例如 :Proteus hauseri, Enterobacter cancerogenus, Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter johnsonii; 2

17 Zhang et al., 2010), 本研究則將具高處理脫色活性菌株 IU01 進行生物固定化 (ICSs) 染料廢水模擬處理系統之最佳生物刺激操作策略評估, 由於添加高比例成份營養物 ( 如 LB), 雖可具高度之處理效果, 但其操作經濟可行性卻極低, 因此有必要探討不同比例添加營養成分之可處理極限, 在不同基質成分比例下作經濟可行性操作評估, 以利工業應用 在比較操作效能上, 本研究則同時將懸浮式及固定化系統分別進行脫色實驗以探討二者間之處理差異 在懸浮式系統中, 首先將探討不同偶氮染料對懸浮式系統之脫色速率差異, 並以化學結構之觀點探討其脫色速率差異是否受各染料結構之影響 ( 如 : 官能基差異或是同分異構物 ), 並將結果依最大比脫色速率 (specific decolorization rate; SDR) 作一排序, 將排序結果作為固定化系統之比較對照, 探討於固定化系統中其處理容量是否具有相類似之結果, 並推論出固定化系統之處理是受質傳限制或是反應條件所控制 於固定化系統中將分別於不同流速, 但在固定染料及比例稀釋倍數之基質濃度下來推論出具較佳處理效果之流速為何? 再者, 亦考慮改變水力停留時間是否可有效提升處理之效果? 於不同基質濃度下推論最具經濟可行性之基質濃度及其處理極限為何? 本研究取定雙偶氮染料反應性紅色 141 號染料 (Reactive Red 141) 為固定化床實驗所使用之模式染料 並另於固定流速之固定化系統中, 以相同稀釋倍數之基質濃度研究數種不同種類之偶氮染料進行最大處理極限濃度之評估比較, 探討 IU01 菌株於固定化系 3

18 統中對於其他偶氮染料之脫色能力大小次序是否與懸浮式系統中具有相平行之結果? 並討論於懸浮式系統中具良好脫色效果之菌株 (Chen et al., 2008) 於固定化床中是否仍能維持相平行之良好或更佳脫色能力? 試圖推論瞭解菌株可能在不同官能基存在下破壞化學結構之相對難易程度差異, 以及微生物作偶氮鍵結攻擊之結構阻抑因子 ; 並由懸浮 固定化系統兩者之差異推論出固定化之脫色優劣是否受限於微生物固定化之質量傳送阻抑因素 在染料廢水處理回收再利用之主題, 更探討聚羥基酯類 (polyhydroxyalkanoates; PHA) 在有 無染料或芳香胺中間物之刺激下批式生產 PHA 初步效能之可行性評估分析, 在論文整體架構上, 自上游處理分析至下游回收利用作綠色永續廢水處理之整體評估探討 因此本研究可分三部份進行 :( 一 ) 於不同進料流速條件下, 試圖決定出在固定染料及稀釋倍數基質濃度進料下之最大處理極限濃度 ;( 二 ) 於固定流速及相同染料下進行不同濃度基質之最大處理極限濃度實驗 ; ( 三 ) 於固定流速及定稀釋倍數之基質濃度下, 決定出不同染料之最大處理極限濃度 再與懸浮式系統所得之最大比脫色速率排序相互比較, 以生物固定化操作是否仍能維持其應有之脫色處理效能大小順序, 以評估可能在固定化處理之瓶頸限制條件 再以懸浮系統來模擬在外加碳源條件下, 以染料來刺激分析生產生物可分解性高分子 PHA 之可行性 4

19 2 文獻探討及回顧 2.1 Aeromonas hydrophila IU01 菌種介紹本研究使用之菌株 Aeromonas hydrophila 為本校化學工程與材料工程系 ( 所 ) 生化工程研究室自行由蘭陽平原上礁溪林美水源地之天然水體及土壤當中所篩選出之本土性菌株, 嗜水氣單胞菌 (Aeromonas hydrophila) 為格蘭氏陰性菌, 屬兼性厭氧菌, 在分類上屬 γ-proteobacteria, 在病理學上一般多為水產生物之致病菌, 易導致魚類 蛙類 冷血動物感染, 魚類易發生鰭 尾腐爛 內出血 敗血症 (Rodriguez et al., 1992; Miyazaki et al., 1986; Kou et al., 1975; Krieg, 1984) 等致命疾病 對於人類之感染則有可能導致腸胃炎 腹瀉等症狀, 對於少數病例 ( 免疫力特別差者 ) 可能導致敗血症 蜂窩性組織炎 (cellulitis) 肌壞死(myonecrosis) 壞疽團濃瘡(ecthyma gangrenosum) 等疾病 (Gold et al., 1993; Hong et al., 1988),Aeromonas sp. 為ㄧ般水體屬常見之菌種, 但何因 ( 例如 : 何種演化過程?) 使 Aeromonas sp. 存活於水中目前仍未有一明確之解答 (Krieg, 1984) 雖然本研究使用之標準菌株具上述致病性, 但同種菌株間亦可能有致病能力之差別 ( 如 : 具高致命性之大腸桿菌 E. coli O157:H7 及其他一般腸胃道中之大腸桿菌 ), 本研究所使用之菌株篩選自水源地, 當地居民於自來水普及前, 長久以來當地居民皆是取用該水源維生, 亦未曾爆發過上述疾病, 因此推論本研究所使用菌株之安全性應相對增加 但為更嚴謹之安全考量, 本菌株相關應用上建議在實際應用時應以非 5

20 開放式操作反應器來進行操作為宜 下列圖 2.1 為篩選出之 A. hydrophila 之 16S rra 親緣鑑定樹狀分析圖示 圖 2.1 Aeromonas hydrophila 親緣鑑定樹狀圖 ( 引自 Chen et al., 2008) 井鷹等 (Idaka et al. 1982) 指出偶氮染料可在好氧狀態下被微生物分解, 而於染整廠出流水之下水道中篩選發現具有染料脫色能力之 A. hydrophila (Idaka et al., 1978), 並發現不論在好氧或厭氧條件下皆具有脫除染料特性, 更發現脫色現象在好氧條件下較慢, 但在厭氧條件下脫色速率則較快 其先前文獻 (Idaka et al., 1978) 中雖未直接指出 A. hydrophila 具有胞內偶氮還原酵素來進行脫色, 但間接由化學分析中證明染料之偶氮鍵結已遭受化學分解之事實, 更以 HPLC 及 TLC 證明 A. hydrophila 確實已將 p-aminoazobenzene 分解成 Aniline 及 p-phenylenediamine, 並推測其可能反應機構應如圖 2.2 所示 : 6

21 H 2 HAc H H H 2 HAc H 2 H 2 H 2 圖 2.2 偶氮染料之氧化還原機構 ( 引自 Idaka et al.1978) 而先前在國內清華大學化工系陳國誠教授之研究團隊 (Chen et al., 2003) 也曾在台灣苗栗地區之染整廢水廠污泥中篩選出優勢脫色菌 A. hydrophila, 並以各種不同類型之染料條件下, 試驗 A. hydrophila 之脫色效果, 發現 A. hydrophila 之所以可脫除多種類型之染料, 可能與先前研究之 Psedomonas luteola (Hu 1994; 1998) 之某些為生物生理代謝特性不同,A. hydrophila 除可脫除偶氮 (Azo) 染料外, 如蒽醌 (Anthraquinone) 靛(Indigoid) 之非偶氮染料亦具有較廣泛之脫色能力, 其中更發現 A. hydrophila 在 200 rpm 搖瓶培養條件下, 仍能具有脫色能力 ( 雖效果較靜置脫色為差 ), 最近研究 (Hsueh et al., 2008) 更發現不同類型偶氮染料之化學結構確實會影響 P. luteola 電子攻擊及偶氮鍵之斷裂能力難易 總體而言, 於低溶氧或靜置條件下之脫色速率較快, 於先好氧搖瓶, 而後靜置培養之條件下, 當菌體生長進入對數生長末期或生長停滯初期時, 可利用較高菌體濃度來有效縮短脫色所需時間, 此點與過去研究指出生物脫色為非成長相關程序 (Chen., 2002) 之現象相吻合 一般而言,A. hydrophila 最適生長環境之 ph 值約在 7

22 6~9 之間, 在過酸 (ph<4) 或過鹼 (ph>10) 之環境中容易抑制菌體生長 (Hazen et al., 1978) 而導致脫色效果不佳, 而添加能量基質上, 葡萄糖並不利於菌體生長及脫色, 此點可能是因葡萄糖被 A. hydrophila 分解後產生酸 (Krieg, 1984), 致使 ph 值降低, 因此不利於菌體生長脫色 依上述可知,A. hydrophila 確實具有破壞偶氮鍵結之能力, 且更廣泛具有脫除非偶氮染料之特性, 因此其應用範圍則更為廣泛 於厭氧之環境下亦可緩慢生長且有助於脫色, 但若以先好氧, 後厭氧方式培養, 除了可使菌體濃度增加而提高助於脫色進行容量外, 亦利於弱酸或弱鹼環境下之生長及脫色 而由先前研究 (Chen et al., 2008) 中發現 A. hydrophila IU01 相較於其他菌株 ( 如 :P. luteola (Hu, 1994), A. hydrophila KB23 (Chen et al., 2009), Proteus hauseri, Enterobacter cancerogenus, Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter johnsonii (Zhang et al., 2010)) 具有更佳之脫色活性, 並對染料及芳香胺中間物具有較佳之毒性忍耐能力 (Chen et al., 2009b), 而本菌株之偶氮還原酵素能力可達 2.83 nanokatal( 計算方法詳見附錄 6), 具有工程廢水應用之價值, 因此本研究以 A. hydrophila IU01 作為標準菌株 2.2 染料發色起源及廢水之處理 德國化學家懷特 (O.. Witt) 曾將有機化合物之顏色與其化學結構間之 8

23 相對關係加以歸納, 並指出當有機化合物之分子中含有羰基 (carbonyl group) 偶氮基 (azo group) 硝基 (nitro group) 亞硝基 (nitroso) 等不飽和基團 時可使有機化合物發色, 因此可稱這些不飽和基團為發色團 (chromophor), 而芳香胺化合物分子中若含有此類發色基團即成為色素之母體, 又可稱為 發色體 (chromogen) 依據懷特之理論, 當芳香環之化合物上連結有數個發 色基團及助色基團者, 則可形成染料 而染整過程中所添加之助染劑 各類酸鹼物質及染料本身之色度等問題 對環境之影響甚大, 因此我國環保署於民國 98 年修訂原染整廢水排放標 準, 由於染整廢水之成分將隨製程之改變而有所變動, 造成廢水成份較複 雜且不穩定, 因此環保署依不同類型之染整業訂定不同之放流水標準 ( 如表 2.1) 表 2.1 環保署 98 年染整業放流水標準 生化需氧量 (BOD) 化學需氧量 (COD) 懸浮固體 (SS) 真色度 (AMDI) 印花 梭織布染整者 筒紗 絞紗染色 針織布及不織布染整者 整理 紙印花 刷毛 剪毛 磨毛及非屬前二類者 由於染整廠之廢水成分隨一般工廠生產線上訂單之差異而導致不同廢 水成分之改變, 因此在廢水處理費用上, 勢必增加成本之負擔 目前染整 廢水處理主要是以物理或化學程序為主, 但此兩種處理方式雖處理效果良 9

24 好, 但成本卻高昂且勢必產生大量污泥, 而污泥之後續處理亦是一大難題, 而且由於化學物質之過量使用更會有造成二次污染之疑慮 而其他處理技術, 如 : 臭氧 (O 3 ) 處理或添加芬頓 (Fenton) 試劑 電化學處理 TiO 2 法雖均具脫色效果, 但此類處理程序繁複且會造成處理成本之提高 (Willmott et al., 1998) Kamilaki et al. (2000) 發現以生物或結合生物與非生物處理方法系統可提供低成本需求的大量廢水脫色之經濟可行方法 利用微生物作為觸媒來處理染整廠出流水之色度問題, 事實上提供了一種比物理 / 化學法更具實質意義及環境友善之脫色方法 在代謝產物而言, 文獻 (Idaka et al., 1982) 中指出, 於好氧條件下, 偶氮染料可被特定菌種 ( 如 Bacillus subtilis) 分解代謝 ; 但於厭氧條件下, 許多菌種皆具還原染料之能力, 由於偶氮染料具電子親和力之偶氮鍵與菌體之偶氮還原酵素作用, 因而破壞偶氮鍵結形成脫色之效果, 且由於此類偶氮還原酵素之專一性較低, 因此可廣泛應用於含不同偶氮染料工業廢水處理, 然而偶氮鍵結受破壞後產生無色之芳香胺中間物, 此類芳香胺中間物可能具有致突變性或生物毒性, 且於厭氧狀態下不易受微生物分解礦化, 但在好氧條件下此類芳香胺中間物卻可結合其他系統成為某些微生物之良好基質, 完成分解作用 因此若以厭氧 好氧聯結系統進行廢水處理, 於好氧條件下, 藉由羥化 (hydroxylation) 代謝途徑 ( 如圖 2.3), 芳香胺中間物可再經由開環機制而被礦化分解成甲烷 (CH 4 ) 或二氧化碳 (CO 2 ) 等小分子達到完全分解 10

25 HO COOH SO 3 H anaerobic HO COOH SO 3 H 5AS H 2 H 2 Strain B6 6A2S O 2 aerobic H 2 H 2 O 2 COOH OH O COOH COOH H 2 H 2 H OH OH SO 3 H - HSO 3 OH OH (hydroxylation) O 2 H 2 COOH O COOH H 2 O H 3 H 2 OH COOH O pyruvate OH HO H 2 O COOH O COOH H 2 Strain B6 COOH fumarate + pyruvate Pseudomonas sp. B9 圖 2.3 偶氮染料經還原後之羥化 (hydroxylation) 代謝途徑 ( 引自 Haug et al., 1991) 11

26 事實上, 偶氮染料還原酵素過去早已被分析萃取出來研究, 但由於酵素易失活水解之缺點, 在廢水處理之較為惡劣環境下, 酵素極可能失活水解無法作用, 因此現今多數研究及實際應用仍直接以微生物進行而非直接使用無細胞膜保護之酵素進行, 而微生物之細胞膜則可將各種酵素保護囊括於其中形成保護作用以防止失活水解等情況發生 ; 再者, 酵素之分離萃取成本高, 更造成廢水酵素處理上, 較不具經濟可行性而未被採用之主要原因之一 染料完全分解過程涉及一連串酵素作用才能進行, 且 Cheetham 及 Bucket (1984) 亦發現此種反應機制是不易利用單一酵素來達到完成, 因此酵素處理之方式並不具可行性 混合培養目前大多數研究皆以混菌培養為主軸, 主要因為在混菌條件下, 各菌種間將形成共同代謝互補作用, 如 Knackmuss (1996) 以兩菌種混合培養方式分解萘磺酸鹽, 以 Sphingomonas B6 菌株將偶氮染料之主要結構 napthalene-2-sulphonate 分解成類似水楊酸離子 (salicylate ion) 之成分, 但此成分對 B6 菌體具有生物毒性且無法再被 B6 分解, 因此需在其他菌種協同合作下以代謝水楊酸鹽離子 過去 Chen et al. (2006b) 亦以兩菌人工建構設計混合培養研究顯示出菌種間由競爭不相容之消長行為逐漸演變成互利共同處理染料以謀共存之互惠行為, 這也顯示物種多樣性之演化因素, 其 12

27 中以偶氮染料脫色菌株 Pseudomonas luteola 與幾乎無脫色能力之大腸桿菌 (Escherichia coli DH5α) 混合培養於含偶氮染料之環境中, 若於一般好氧環境下 ( 如 LB 培養基 ) 無論有無染料,DH5α 將取得生長競爭優勢抑制壓抑 P. luteola 之生存空間, 但於含染料之厭氧環境下,DH5α 可能因較不耐染料所造成之抑制作用而分泌胞外代謝產物來協助 P. luteola 加速脫除染料以達到共同生存之互利結果 此例證亦顯示出混合培養確實具有刺激產生有效脫色之互利處理優點 純菌培養雖然於混合菌具許多優勢, 且也較近似於實場操作情況, 但混合培養是以一巨觀之平均觀點來衡量系統內之情況, 由於在實際操作下所產生此消彼長的動態變化, 致使其呈現之結果在再現性上之不穩定亦造成學術研究評估上的困難, 因此多數研究著重於優勢菌或功能性純菌之特性進行探討, 主要是純菌系統之數據再現性佳且易進行結果之解釋, 更可由生物化學或分子生物學之觀點來單純解釋更細節之生物分解機制, 再經由分子生物或生物化學等方法來有效調控菌株之酵素表現機制 ( 如 : 提高胞外代謝物之產生來加速脫色 ), 更可以動力學量化分析操作參數之改變對偶氮染料脫色之結果, 如 Chang et al. (2001) 即以 P. luteola 進行褐藻膠 (CA) 鹿角菜膠 (CG) 及聚丙烯醯胺 (PAA) 之固定化, 探討改變 ph 值 搖瓶速率 ( 溶氧 ) 及溫 13

28 度變化對固定化及懸浮式系統之差異, 並以 Michaelis- Menten 動力學來進行探討脫色速率與染料濃度間之關聯性 結合上述純菌之特性及操作結果分別來判斷及診斷實場操作上可能發生之困難及失敗 ( 例如 : 優勢菌大量淘汰消失或是其他非處理菌之逐漸坐大 ), 以利於整體系統在操作控制及最佳化 脫色之反應機制論及脫色操作最佳化, 不得不對脫色機制有深入之瞭解 微生物之脫色機制有許多種類, 如吸附 氧化還原 分解礦化等, 其中最簡單之脫色機制為吸附作用, 由於染料受微生物吸附後濃縮於菌泥中, 因此吸附會隨時間增加而逐漸達到飽和 ( 註 : 生物吸附又至少分為表面吸附及胞內吸附兩種 ;Chen et al., 2000), 而此種機制與一般其他物理吸附 ( 如活性碳 ) 之脫色機制相類似, 因此並不利於長期操作或連續式之處理 因此染料與菌體間之生物相關性勢必成為偶氮染料生物還原之第一步驟 (Southern, 1995) 某些好氧菌 ( 如 :Phanerochaete chrysosporium) 於有氧之控制條件下, 可將合成具高專一性之偶氮還原酵素以還原之方式來使特定結構之偶氮基斷裂 相反的, 在厭氧條件下菌體之還原酵素, 若較不具專一性則可能具較廣泛之脫色能力, 由於工業偶氮染料廢水含有多種染料成分, 因此這類菌種多被應用於工業偶氮染料廢水脫色上 因此生物分解程序可能為厭氧 14

29 好氧或兩者相結合串聯之處理系統 事實上, 當考慮菌體與偶氮染料間之反應時, 必須同時亦考慮到菌體於好氧及厭氧條件間之生長代謝活性差異 (Stolz et al., 2001) 再者, 由於多數偶氮染料皆具有磺酸取代基及具較大分子量, 因而無法輕易通過細胞膜, 因此論及還原脫色活性, 一般而言並非取決於細胞內之染料脫色作用途徑 Russ et al. (2000) 亦提出含黃素 (flavin) 之共輔因子並無法滲透過菌體胞膜, 因而限制黃素在細胞質內將磺酸化偶氮染料還原之可能性, 因此造成細胞質與細胞外膜間之偶氮還原酵素形成是主要負責還原磺酸偶氮染料之機制 此類反應機制中, 包含在胞外環境中偶氮染料進行電子傳遞相關之還原作用 為達到此目的, 菌體必須建立出胞內細胞電子傳遞系統及大分子量偶氮染料分子間之關聯 欲完成此種關聯, 其電子傳遞元素 ( 如 :cytochrome C) 則必須位於菌體胞外之胞膜上 ( 如格蘭式陰性菌 ), 於此種情形下菌體可使胞膜表面之偶氮染料或氧化還原介質 (redox mediator) 直接接觸 而 Gingell 與 Walker (1971) 亦發現位在外膜之低分子量之氧化還原介質化合物 ( 如 : 外加可溶性黃素 (soluble flavin) 更可作為電子梭 (electron shuttles), 可用來扮演偶氮染料與 ADH 相關偶氮還原酵素之部分角色 事實上, 此種介質更可經由基質之代謝生成或外加方式而得到 而外加合成還原介質 ( 如 anthraquinone sulphonates) 即使在極低的濃度下, 仍可加強胞外環境非酵素相關之偶氮染料還原作用 ; 但若胞外為好氧之環境時, 由於氧氣較此類介質更易得到電子, 因此會由於氧氣的存在勢 15

30 必抑制了染料還原作用 另一方面,Kudlich et al. (1997) 亦支持此類細胞膜相結合之偶氮還原酵素活性, 這不同於在細胞質中可經由胞膜滲透的非磺酸類染料之還原作用, 這顯示在對硫醇具專一性之抑制因子作用下, Sphingomonas sp. 菌體中與胞膜結合之偶氮還原酵素會完全失活, 但與細胞質中相關之偶氮還原酵素則不具影響, 因此可知與細胞膜結合及在細胞質中作用之偶氮還原酵素應分屬兩種不同之酵素系統 圖 2.4 菌體於厭氧條件下以氧化還原介質進行偶氮染料還原之反應機構圖 示 ( 引自 Keck et al., 1997) 上圖 2.4 為菌體於厭氧條件下以氧化還原介質進行偶氮染料還原之反應 機構圖示, 菌體胞外之染料還原主要是依賴化學氧化還原反應, 其氧化還 16

31 原介質則需細胞質之還原酵素所提供之電子, 而此種化學氧化還原反應亦可能伴隨偶氮還原酵素一併發生, 這可能是經由細胞質內合成及胞內所釋放之脫氫酵素所造成 (Bragger et al., 1997) 總結上述文獻可知, 細菌系統之偶氮染料脫色至少涵蓋有兩種機制,(1) 菌體分解有機碳, 再利用 ATP 產生酵素來直接轉移電子至最終電子接受者 ( 偶氮染料 );(2) 不經由 ATP 產生而經由細菌分解基質之最終產物來降解偶氮染料 而有機 ( 如 : 丙酮酸 (pyruvate)) 或無機物質 ( 如 : 硫酸 ) 則可在上述機制中可扮演還原當量及偶氮染料之電子梭 (electron shuttle) 作用 (Yoo et al., 2000) 影響生物脫色之因子生物處理系統之效率受操作變數影響甚鉅, 如 : 系統溶氧 溫度及氧化還原電位必須最佳化, 而且電子供給者及氧化還原介質濃度必須與生物質量及廢水中存在之染料達到反應當量平衡, 方可達到最佳脫色速率 而工業染整廢水成分尤其複雜, 隨著工業訂單及市場需求, 染料製備及種類與數量亦有時節上之變化, 因此廢水本身可能隨日月季節變化極大, 因此可能包含不同種類及濃度之有機物 營養物 鹽類 硫化物 毒性物質及色度等成分, 其中任一種成分皆有可能抑制染料還原程序而且彼此間會產生交互作用之加強抑制影響, 因此需於工業處理前先行評估調查暸解 (Kamilaki., 2000) 17

32 2.2.5 氧氣對細胞生長及染料還原脫色最重要之因素為氧氣 ( 或溶氧 ) 含量, 主要因為氧氣對微生物細胞之生理特性具有顯著之影響 當在染料還原時, 若胞外環境為好氧條件, 氧氣所扮演之強電子接收者自然會抑制染料還原之進行, 這是由於細胞雖然氧化釋放出電子, 但電子將優先釋放給氧氣作為電子接受者, 而非偶氮染料, 並產生水為最終還原產物 (Yoo et al., 2001) 因此, 溶氧之增加勢必不利於脫色之進行, 然而氧氣所產生之抑制作用並非不可逆之效應, 若改通以不含氧氣之氮氣, 則此種還原活性將再重新回復到原厭氧狀態下相似之還原速率 (Bragger et al., 1997) 氧氣對細菌偶氮還原反應之抑制效應可歸納成對厭氧細菌之毒性作用, 或是對偶氮還原酵素之直接抑制, 或是因氧氣較偶氮相關衍生物更易受還原所致 (Semde et al., 1998) 而在厭氧條件下, 原則上偶氮鍵受還原後, 無法再進一步繼續被分解, 若更改為好氧條件, 則反應性偶氮染料分子將會被完全礦化, 這是因為偶氮染料受還原後所產生之芳香族胺化合物可在有氧條件下, 進行羥化及開環作用所致 ( 如圖 2.3) (Meyer., 1981) 因此, 多數染料廢水會採用先厭氧還原偶氮鍵後, 再利用好氧分解芳香胺化合物之兩階段處理程序 但兩階段式處理程序需注意控制其間之平衡, 當對已還原之染料溶液再度曝氣則可能會導致溶液之色度產生加深之作用 ( 或稱為回色作用 ), 這是因為於厭氧條件下受還原芳香胺成芳香胺中間物, 此類中間物在氧氣存在之條件下 18

33 產生自發性不穩定之情況, 這將導致氫氧根及胺根氧化形成醌 (quinones) 及醌亞胺 (quinone imine), 此類化合物可再次雙聚合 (dimerization) 或聚合化 (polymerization) 而形成新的深色發色團 ( 如圖 2.5), 但若以適當控制下之厭氧 / 好氧操作, 則會產生良好之處理效果 (Bromley et al., 2000) OH O OH O O O 2 H 2 O 2 dimerization polymerization H 2 H quinone imine OH O O O n 圖 2.5 醌亞胺 (quinine imine) 之聚合反應 溫度 就許多系統探討溫度範圍對脫色速率之影響來看, 一般脫色速率原則上與溫度呈平行趨勢, 於 為最適生長條件, 且脫色速率亦最大, 高溫條件下, 細胞活性下降或偶氮還原酵素亦可能產生變性 (denaturation) 作用而造成脫色活性將下降 (Chang et al., 2001b), 但在某些全菌體細胞條件下, 由於細胞內調控, 偶氮還原酵素具有相當熱穩定性且可在 60 下仍可於短時間內維持微生物活性 而以固定化條件培養細胞, 載體提供微環境 (microenvironment) 來保護菌體, 則可使最佳脫色容忍溫度再予以提高 ph 值 一般利於脫色之 ph 值通常是在中性或微鹼性條件下, 且在較強之酸 / 19

34 鹼值下其脫色速率會明顯受到抑制 因此染整廢水通常需先加以進行緩衝作用, 來提高生物脫色之效果, 而且由於偶氮鍵受生物還原時所產生之芳香胺代謝物會導致 ph 值上升 (Willmott. 1997) ( 以本研究所使用之指標性染料 Reactive Red 141 以 A. hydrophila IU01 脫色為例, 含 300 mg L -1 RR141 之 LB 培養基下, 脫色前 ph 值約為 6.92, 脫色後 ( 染料濃度低於 10 mg L -1 ) ph 值約為 8.73, 由於苯胺 ( 脫色所造成之中間物 ) 之鹼度並不高, 因此 ph 值之改變可能是因中間物受分解而產生其他胺類或由微生物攝取酵母萃取物後所產生之代謝物所導致 ), 在 ph 值 間對偶氮還原之影響不大 Chang et al. (2001b) 更發現由弱酸調至中性 (ph ) 時, 染料還原速率增加約 2.5 倍, 而在中性至弱鹼性 (ph ) 時, 脫色速率對 ph 值並不敏感 染料濃度染料濃度對脫色效率具直接之影響性, 因高濃度染料或其他共同存在於廢水之污染物具有毒性所導致 一般而言可以酵素催化程序之 Michaelis- Menten (M-M) 動力學來描述其行為 : ν = V max Κ m + [ S] [ S] 其中 ν 表在給定基質濃度 [S] 下之反應速率, 而 V max 為在飽和濃度下之最大 速率, 而 K m 表 Michaelis 常數 M-M 動力學之應用可預測包含生物質量負 荷或維持特定脫色速率之操作溫度 關於脫色動力學而言,Wuhrmann et al. 20

35 (1980) 發現脫色形成之代謝物對菌體產生毒性, 導致起始脫色後脫色速率將比模式預測之一級反應更為減少, 而在高濃度染料下脫色所需時間則更加延長 過去研究亦針對 P. luteola 及 Aeromonas hydrophila 產生生長刺激或抑制性作探討, 發現抑制毒性與化學結構之差異可能有所關聯 (Chen, 2006; Chen et al., 2009b) Sani et al. (1999) 發現於 1-10μM 之染料 ( 如 :Crystal violet, malachite green, pararosaniline, ethyl violet, brilliant green 及 magenta) 濃度較易被脫除, 但當染料濃度高於 30μM 時脫色率將下降 但 Dubin 及 Wright 亦曾提及染料濃度對脫色速率無任何影響之結果, 此種結果與非酵素性還原機制相符, 此種機制之調控機制與染料濃度無關 (Dubin et al., 1975) 染料結構某些偶氮染料結構對細菌細胞具阻抑效果 (Bras et al., 2001), 簡單結構及低分子量之染料通常具較高之脫色速率, 而脫色難度將隨加入染料之分子量增加 (Sani et al., 1999) 於最終非酵素還原機制, 還原速率受偶氮染基周圍之電子密度影響極大, 當苯環上之拉電子基 ( 如 -SO 3 H, -SO 2 H 2 ) 與偶氮鍵呈對位時, 會使還原速率增加 (Walker et al., 1971) igam et al.(1996) 指出具有羥基 (hydroxyl groups) 或胺基 (amino groups) 之偶氮化合物較含有甲基 (methyl groups) 甲氧基(methoxy groups) 磺基(sulpho groups) 硝基(nitro groups) 之偶氮化合物更易被分解, 而脫色亦與染料分子上之偶氮鍵數目有 21

36 關, 單偶氮較雙偶氮易脫色,Hu (2001) 更指出單偶氮染料濃度增加時, 其脫色速率亦隨之增加, 但在雙偶氮及三偶氮染料條件下, 雖然染料濃度增加, 但脫色速率仍維持不變 部分研究 (Greaves et al., 1999) 歸納出染料種類與脫色程度之相關聯性 Hitz et al. (1978) 歸納出數個論點 :(a) 酸性染料由於含有磺酸基而影響脫色效率, 當磺酸基數目增加會降低脫色效率,(b) 直接性染料具良好脫色效率, 其磺酸基數目與脫色效率無關,(c) 反應性染料之脫色效率較低 磺酸基之脫色效率與脫色反應機制有關, 若脫色發生於胞內, 則磺酸基之存在會產生質傳阻抑, 造成染料分子無法穿透細胞膜, 因此隨磺酸基數目增加則脫色速率下降 但是當脫色發生於胞外, 則磺酸基之存在對脫色速率影響較小 Kulla (1981) 發現能以培養條件馴養調控產生對特別染料結構具高專一性之偶氮還原酵素, 其中 Orange I 偶氮還原酵素可還原 Orange I 之偶氮鍵及其對位羥基之衍生物, 另一種 Orange II 偶氮還原酵素則對 Orange II 之偶氮鍵及其鄰位羥基之化合物更具專一性 由於磺酸基為良好拉電子基, 致使偶氮基團之電子雲密度降低, 讓偶氮基更具親電子性, 更利於還原脫色之進行, 因此磺酸化染料 ( 拉電子基 ) 較羧化染料 ( 推電子基 ) 更易還原 Zimmerman et al. (1982) 更歸納出對細菌能還原 Orange II 之結構通則 :(a) 萘環鄰位必須有羥基,(b) 於偶氮鍵之鄰近帶電荷基團會阻礙反應,(c) 染料之次級極性取代基會降低酵素親和力並抑制反應,(d) 苯環上具拉電子基團會增加反應速率 22

37 電子提供者有機電子提供者或氫之氧化結合脫色程序,Bras et al. (2001) 證明添加葡萄糖或乙酸根離子之類之電子供應者會明顯刺激偶氮鍵之還原斷裂 而不同電子供應之半反應熱力學亦不相同 ; 所以, 反應速率受電子供應者的種類影響甚鉅 因此對不同生物脫色系統其生理之電子供應者相當重要, 因為此步驟不僅增加染料還原速率, 亦為還原反應之酵素路徑指標, 例如 : 對染料分子而言, 蟻酸鹽 (formate) 為厭氧還原電子傳遞途徑最有效之電子供應者, 這顯示代謝途徑中蟻酸脫氫酵素必定參與其中, 此輔助基質 ( 原有電子供應者 ) 之濃度更決定還原物質 ( 中間電子供應者 ) 之生成速率 經由有機基質氧化正常電子傳遞之共酵素 (coenzyme) 還原物質亦可扮演偶氮染料還原之電子供應者 (Plumb et al., 2001) 某些化學物, 如硫柳汞 (thiomersal) 及對氯汞基苯甲酸鹽 (p-chloromercuribenzoate) 可抑制 ADH 產生系統乙醇脫氫酵素活性, 而 ADH 為染料還原必須產生之還原物質, 因此 ADH 之產生速率為導致偶氮染料還原抑制之速率決定步驟 還原電位脫色過程取決於電子供應者及接受者之還原電位, 因此其速率決定步驟涉及染料及胞外還原介質之氧化還原平衡 還原電位乃是一分子是否會接受電子 ( 即受還原 ) 之難易度指標, 因此染料脫色速率越高其還原電位越趨負 23

38 (Bromley et al., 2000), Bragger 等人指出偶氮染料降解速率增加其半波還原電位 (half-wave potential) 亦會增加 ( 越正值 ), 而偶氮結構之半波電位與其脫色速率之對數值具一線性之關係 (Bragger et al., 1997) 此種還原速率與染料結構之電化學性質間之關聯性, 並不涉及胞膜滲透及酵素結合等結構相關之現象 於厭氧條件下, 系統欲達到高脫色效率, 需具備低氧化還原電位 (<-400 mv) 之環境 因此當系統之還原電位於最負值時其去色速率最大, 但當還原電位上升則脫色速率產生下降 (Bromley et al., 2000) 氧化還原介質由於具高電荷磺酸基偶氮染料無法穿透細胞膜, 因此染料還原反應必須伴隨額外細胞還原活性, 此活性可藉由氧化還原介質之存在來達到, 如黃素 (flavins) 於細胞中穿梭還原物質以促進胞外偶氮染料之非酵素性還原作用, 極少量氧化還原介質就足以啟動此種電子傳遞 而此類介質之氧化還原電位約在 -200 至 -350 mv, 且添加合成之電子攜帶者 (electron carriers) 可加速細菌細胞之染料還原速率 quinone- hydroquinone 氧化還原對可扮演此類介質之作用,quinone 經由一電子還原成 hydroquinone 自由基, 或由兩個電子還原成 hydroquinones( 如圖 2.6), 對偶氮染料還原而言, 經由一個電子快速轉移還原成陰離子自由基, 而後經第二個較慢的電子轉移形成穩定之二階陰離子 (dianion), 然後 hydroquinone 與染料直接化學反應而受氧化 運用 24

39 天然且生物可分解之 quinone( 如 : 指甲花醌 (lawsone)) 具有可脫色之處理潛力, 因此在無添加任何具環境危害疑慮之物質下可提高環原速率 Lourenco et al. (2000) 發現於高溫殺菌過程細胞發生某些脫色現象, 這說明於不存在微生物活性之情況下仍有可脫色之還原因子之客觀因素存在 因此可知, 染料還原反應之速率決定因子涉及氧化還原介質 介質與染料之電位關係及相對於介質之還原酵素專一性等 O 2H + OH 2e O OH quinone hydroquinone 圖 2.6 醌 (quinine) 之還原途徑 25

40 2.3 固定化生物反應器固定化技術應用於工業早已行之有年, 舉凡食品 醫藥 廢水處理等工業皆早已廣泛應用由來已久, 由於製程成本及經濟效益之考量, 遲至 1990 年初期才有被應用於廢水處理之實廠應用案例 固定化技術最早始於 1970 年代, 由日本科學家千畑 (Dr. Chibata) 博士定義為 利用物理或化學方法將酵素 / 微生物細胞封閉或限制在某特定空間區域內, 而仍能保留其生化活性, 且可反覆連續使用的技術, 然而固定化技術經過多年的應用後發展出幾種典型之應用類型可區分如下圖 2.7 所示 : 固定化酵素或完整菌體細胞 擔體鍵結法 交聯法 包埋法 物理吸附法離子鍵結法共價鍵結法 格子型 微膠囊 圖 2.7 固定化技術一般分類法 ( 引自陳國誠等著 生物固定化技術與應用, 2000) 目前工業應用之固定化方法大致可分成六大類, 分別為物理吸附 (Chen et al., 2007) 共價鍵結(Derwinska et al., 2008, Shriver-Lake et al., 2002) 離子鍵結 交聯 (Zhang et al., 2008) 包埋(Chen et al., 2005) 微膠囊包覆法共六種 物理吸附法 (physical adsorption method) 即是使用物理作用力 (van der 26

41 walls force) 及其他作用力 ( 如 hydrogen bridges, ionic bond) 將細胞固定於擔體上, 此方法由於操作簡便, 因此常被廣泛使用, 但吸附法之最大缺點為吸附結合力很弱, 被吸附固定之細胞易受溫度 離子及基質濃度等變化而脫落 如澱粉 (starch) 活性碳(activated carbon) 矽膠(silica gel) 等材料均為常用之擔體材料 ( 陳,2000), 由於物理性吸附法之製備程序簡便, 且菌體具代謝能力可長期被重複使用, 因此較利於應用至工業廢水處理, 而將微生物以物理性吸附附著於擔體上, 處理工業廢水較其他物理化學方法更為便宜而且效率高, 且不易造成二次污染等問題 共價鍵結法 (covalent binding method) 係指生物觸媒之間的結合或是生物觸媒與擔體之直接結合, 此方法鍵結結合堅固, 固定化後酵素及菌體細胞不易從擔體上脫落, 且可提升基質與酵素或菌體細胞 產物的接觸性及移動性等優點 但在進行固定化程序時, 易造成酵素結構改變而導致活性喪失及擔體通常無法再生使用等缺點 ( 陳,2000) 離子鍵結法 (Ionic binding) 則是藉由擔體與生物觸媒間因相反電荷所形成之靜電吸引力 (electrostatic attraction) 來達固定化之目的, 離子鍵結法之固定化程序與物理性吸附法同樣操作簡易, 但較物理性吸附更為牢固, 且擔體也可連續再生利用且固定化前不需修飾酵素, 為良好之固定化方式之一 雖然離子鍵結較物理吸附牢固, 但仍具部分缺點, 為防止菌體細胞或酵素自載體上脫落, 因此必須維持系統之離子強度 (ionic strength) ph 值 27

42 溫度及適當之緩衝液等操作條件, 以維持良好的操作成效 ( 陳,2000) 交聯法 (Cross-linking) 主要是利用多官能基反應劑 (multi-functional regents) 與酵素或菌體細胞相互交聯結合, 形成不溶性巨大分子凝聚物 (insoluble aggregates), 交聯法之固定化程序相當簡易, 若需以膠體聚合物作為擔體則需注意, 由於膠體聚合物並非十分堅固, 並不太適合將其應用於填充床 (packed beds) 反應器 而且由於擴散阻力, 將使基質無法進入聚合物內部, 而對生物觸媒活性造成影響, 且交聯劑與菌體細胞之比例與反應溶液之 ph 值等操作條件將對固定化之生化活性會造成影響 ( 陳,2000) 包埋法 (Entrapment) 亦為另一常用之固定化方法, 包埋法係將細胞包埋於天然或合成之高分子載體基材 (matrix) 格子內部, 為了確定被包埋的細胞之正常生化功能, 必須確保基質與產物能自由進出通過載體, 但載體之空隙又不可過大以防止細胞流失 利用此方法進行固定化時, 可避免細胞從擔體內部漏失之缺點, 可說是目前最有效之細胞固定化方法之一 但細胞固定於膠體中, 因此不具有新陳代謝能力造成細胞活性降低, 因而無法再次循環使用, 且所需之製備時間較長而實際操作時間較短, 基於經濟可行性考量不利大量使用在廢水工業 ( 陳,2000) 如陳(Chen et al., 2005) 則以褐藻膠 (calcium alginate, CA) 與聚丙烯醯胺 (polyacrylamide, PAA) 作為載體 (matrix) 包埋固定偶氮染料脫色菌株 (Pseudomonas luteola), 並將載體填充於管柱中以固定化連續流方式探討於不同管柱長度 進料流速以及不同染料濃度模 28

43 擬應用於實廠整治時對處理效果之影響 微膠囊包覆法 (Microencapsulation) 又可分為界面聚合法 (Interfacial polymerization) 及液體乾燥法 (liquid drying method) 兩種類型 ( 陳,2000) 而一般應用於廢水處理之微生物系統通常可分為懸浮式生長系統及固定化生長系統兩大類, 懸浮式系統為一般最常見的廢水生物處理系統, 利用懸浮式之微生物菌群以不同的操作方式進行廢水處理 而將固定化系統應用於廢水處理中, 亦是將工業固定化之六大類方法 ( 圖 2.7) 衍伸應用之例子 ; 延續工業固定化之觀念, 將微生物限制在固定的空間內使微生物附著於擔體表面形成生物膜 (biofilm) 形式 ( 類似於物理性吸附 ), 或將微生物包埋於擔體內形成生化觸媒 (biocatalysts) 之形式 ( 類似於格子型包埋法 ), 而固定化之過程又可分為自然發生之自然固定化及人為產生之人工固定化兩類, 自然固定化是指在人為提供的適當環境下 ( 如本研究所使用之珊瑚擔體及 LB 基質 ), 微生物自然附著 (attachment) 或凝集 (aggregation) 於擔體表面或多孔性擔體內部成長而形成生物膜, 這類生物膜可應用於好氧系統 ( 如旋轉生物圓盤法 流體化床等 ) 中, 亦常見於厭氧系統中 ( 如上流式厭氧污泥床等 ) 人工固定化系統是指利用人工方式將具活性之微生物固定於擔體表面或內部而形成的生化觸媒, 如前述之包埋法 ( 圖 2.7) 即為人工固定化系統中最常使用之方法 而綜合上述各項固定化方式, 可歸納出下列幾項優點 : 29

44 顯著提高生物質量濃度, 亦即於有限空間內具良好之處理效果 增加程序穩定性, 可減少環境些微擾動 ( 如 : 溫度 ) 所造成之效能差異 對抗環境衝擊之容忍力, 有利於工業處理效能之穩定性 ( 如 : 抵抗 shock loading 之容忍力 ) 承受較高處理能力, 可歸因於良好之程序穩定性以促成較高處理能力 可再次利用, 可持續循環進料, 免去工業處理之洗槽清理不便 利於低生長相關性之產程而本研究主要為模擬實廠應用之可能性, 因此使用之固定化方式為自然固定化系統 ( 近似於物理性吸附法 ), 將以天然基材 珊瑚石 (Porites corals) 作為載體, 利用珊瑚石天然形成之高密度孔洞提高微生物自然附著或凝集效果, 以提高固定化床之穩定度 若將陳 (Chen et al., 2005) 所使用之固定化包埋法與本研究所使用之自然固定化系統相比較優缺點 ( 表 2.2), 則可發現由於包埋法不具新陳代謝之能力, 因此菌體活性及再次使用之可能性較低, 但包埋法之製備時間較短, 因此菌體受污染之可能性較低, 且菌體固定效果較佳, 但亦由於包埋法不具新陳代謝能力, 因此導致操作時間減少, 而自然固定化系統雖製備時間較長且菌體固定效果較不穩定, 因此未來應用在於河塘工程或工廠現地或現場廢水生物處理上之可能性則較高 30

45 表 2.2 自然固定化系統及格子型包埋法應用於廢水處理之可行性 自然固定化格子型包埋 經濟效益 菌體活性 製備時間 污染風險 河塘工程 再次使用 固定效果 操作時間 優高長普可可普較長 優普短較低否否優較短 31

46 2.4 以廢水刺激微生物產生生物可分解性高分子之可行性在環境中許多微生物 (Lee, 1996) 先天上具合成之聚羥基酯類 (polyhydroxyalkanoates; PHA) 聚合物之能力, 且所產生之聚合物具有生物相容性 (biocompatibility) 生物可分解性(biodegradability) 等特性 (Zhao et al., 2002), 且有可能發展為取代石油合成之高分子材料 (Lee, 1996), 因而成為目前最熱門的塑膠取代者 而文獻 (Lee et al., 1999, Chen et al., 2001) 亦明確指出 A. hydrophila 為具有合成 PHA 之優異能力菌株, 因此本研究基於永續發展之理念, 以本土性 A. hydrophila IU 01 作為指標菌株以探討於含有染料或芳香胺中間物之懸浮式系統中菌體胞內之 PHA 含量及比例上會有何差異, 推論於含有染料或芳香胺中間物之環境中是否能刺激菌體產生 PHA, 並了解菌體於染料脫色前後胞內之 PHA 組成及濃度變化 一般而言,PHA 乃是由超過 150 種不同單體 (monomer) 所組成聚羥基酯類之統稱, 藉由這些不同組成可使 PHA 具有不同之物理 ( 如 : 延展性 熱穩定性 ) 及化學性質 (Chen et al., 2005), 自然界中雖然大多數微生物皆具有生產 PHA 之能力, 但通常在微生物處於碳源充足, 但缺乏某些成分基質 ( 如 : 氮 磷 硫等 ) 養份之環境下, 微生物才會開始於胞內造成 PHA 累積以作為其能量儲存材料 (Chen et al., 2001b) 一般可將 PHA 以單體結構分為三大主要基本類型 :short-chain-length PHA (SCL-PHA) medium-chain-length PHA (MCL-PHA) 以及由 SCL-PHA 及 32

47 MCL-PHA 所組成之共聚合物 ( 如 :3-hydroxybutyrate (3HB) 為 SCL-PHA, 3-hydroxyhexanoate (3HHx) 為 MCL-PHA, 而 3HB 及 3HHx 共聚合成之單體 PHBHHx 即為 SCL-PHA 及 MCL-PHA 之共聚合物 ) 而 SCL-PHA 為 3-5 個碳原子所組成之單體,MCL-PHA 為 6-14 個碳原子所組成之單體,( 如圖 2.8 及附錄 ), 藉由控制這些不同長度之單體組成, 可有效改變 PHA 之機械性質, 例如 : 增加 PHA 中 3HA (3-hydroxyalkanoate) 單體含量可較 3HV(3-hydroxyvalerate) 單體具較低之熔點 (T m ) 玻璃轉化點(T g ) 及結晶度 (akamura., et al 1991), 或增加 PHA 中之 4HB 含量可有效增加拉伸至破裂之伸長率 (elongation)(saito et al., 1996) 圖 2.8 各類 PHA 之單體組成 因此, 如何以代謝生理調控微生物胞內累積之 PHA 組成以達改變物 33

48 性 化性等目的則成為另一重點, 一般調控 PHA 之組成可由基因改造及不同碳源基質添加方式 ( 如 :glucose, acetic acid, butyric acid, myristic acid, octanoic acid, lauric acid 等 (Chen et al., 2001b)) 而達到, 目前已知 A. hydrophila 中具有三段調控 PHA 組成之基因, 分別為調控基因轉譯胺基酸 (PhaP) PHA 合成 (PhaC) (R)-specific enoyl-coa hydratese (PhaJ), 以基因工程方式改變基因序列中之表現基因 (lac Z) 序列進而達到改變 PHA 組成之目的 (Qin et al., 2007) 另一方式則為添加不同碳源基質刺激微生物於胞內累積不同組成之 PHA(Chen et al., 2001b, Xie et al., 2008), 例如 : 添加月桂酸 (lauric acid) 可刺激 A. hydrophila 累積含有 3HB 及 3HHx 之 PHA 單體, 而添加 1,4 丁二醇 (1,4-butanediol) 可刺激微生物累積含有 4HB 之 PHA 單體, 除外加不同之碳源基質可刺激微生物累積不同之 PHA 外, 亦可研究於不同生長相位及時間 ( 如 : 不同年齡之菌體 ( 對數生長期早期 中期或生長遲滯期初期 )) 添加固定之碳源基質以推論最佳之添加時間, 以及研究於該時間下添加不同濃度之碳源基質對 PHA 組成產量之影響 (Xie et al., 2008), 透過這些不同的操作條件及策略, 可以有效控制所需之 PHA 種類, 因此若能將 PHA 之生產與廢水處理相結合, 不僅自廢水處理過程中萃取出剩餘價值, 亦可創造更具有環保訴求之綠色科技 因此本研究首先將進行以懸浮式系統以先好氧搖瓶, 後靜置厭氧之方式進行 7 種不同染料之脫色效率分析, 並以化學結構分類, 將所得之結果 34

49 予以比對, 加以分析最大比脫色速率之排序, 並且將以懸浮式系統所得之最大比脫色速率排序為微生物脫色之基礎, 與生物固定床操作結果相互比較是否仍能維持其應有之處理效能順序, 以了解菌株在不同官能基存在下破壞化學結構之相對難易程度以及微生物作偶氮鍵結攻擊之結構瓶頸是否會受到固定化系統 (ICS) 質量傳送阻抑等因素之影響, 並推論各染料在 ICS 之最大處理極限 ; 作為推論被實際應用於工業廢水處理之可能性, 以固定流速及相同染料條件下進行不同基質濃度之最大處理極限濃度之決定, 以推論何種濃度之基質條件下, 其操作經濟可行性最高 ; 再者, 依流出對照曲線分析 (Breakthrough Curve Analysis) 於無活菌條件下來決定出各種不同條件流速下, 在考慮擴散作用前提下, 管柱水力停留時間之差異進行修正, 以利後續決定出正確處理容量 再分別於不同流速下之修正停留時間依定染料及稀釋倍數之基質濃度下, 來決定出何種流速具最大之極限處理容量 ; 並由懸浮 固定化系統兩者之間的差異, 再推論出固定化之脫色優劣是否主要受限於微生物固定化之質量傳送阻抑因素, 以對 ICS 系統作操作之最可行之容量條件及結果進行評估, 由本研究評估方法, 可利於染整廢水廠實際操作, 對東台灣本土微生物資源應用開發極具正面之可行性意義 ; 並且評估於不同氮磷比例之培養基質以及不同濃度之染料或芳香胺中間物之條件下, 進行 PHA 生產效能差異之比較, 依整體初步評估染整廢水處理回收再利用之可行性, 以利於工業操作之實際運用 35

50 3 材料與方法 3.1 菌種本研究採用自行由宜蘭礁溪附近水源地中優勢篩選純化鑑定具偶氮染料脫色活性之菌株 A. hydrophila IU01 為標準菌株 (Chen et al., 2008, 2009), 於 PHA 相關研究中使用 A. hydrophila IU01 為標準菌株並與南台灣篩選出之 A. hydrophila YTl1 為對照菌株 3.2 染料及芳香胺中間物本研究所使用取定之染料分別為反應性紅色 141 號 (RR141) 反應性黑色 5 號 (RB5) 反應性藍色 171 號 (RB171) 反應性黃色 84 號 (RY84) 直接性黃色 86 號 (DY86) 反應性紅色 198 號 (RR198) 反應性綠色 19 號 (RG19)( 各染料之化學結構於結果與討論中詳述 ), 分別購自台灣永光化學公司及明太企業 濃度測量則以分光度計 (HITACHI spectrophotometer, UV-2001) 其最大吸收峰波長分別為 544,600,609,411,393,522,631 nm 來進行檢量校正分析, 所使用之芳香胺中間物分別為 2-Aminophenol (2AP), 3-Aminophenol (3AP) 皆購自 Sigma R 再者, 由於染料之化學結構可能會於高溫溼熱滅菌過程中, 因熱不穩定而產生分解, 因此皆 γ- 射線以滅菌過之微過濾濾頭 (Millipore Millex -GS 0.22 μm) 除菌後, 再行實驗使用 36

51 3.3 載體 珊瑚珊瑚 (Porites corals; 例如 :Porites lobata 及 P. lutea) 多產於溫暖海域, 屬腔腸動物, 其最小生存單位是 珊瑚蟲, 珊瑚蟲具有觸手 口 腔腸 體壁等構造 單一的珊瑚蟲可以分裂或出芽方式形成更多的新珊瑚蟲, 眾多珊瑚蟲聚集在一起就稱之為 珊瑚群體, 珊瑚生長時會分泌碳酸鈣, 形成鈣質骨骼, 且生長速率緩慢, 構成高孔隙度, 因此當珊瑚白化死亡後, 適合應用於固定化載體, 珊瑚之主要化學成分為碳酸鈣 (CaCO 3 ), 以微晶方解石集合體形式存在, 其折光率為 , 硬度 3.5-4, 密度 g/cm 3 圖 為珊瑚石之內部段截面圖, 由圖中可見到珊瑚石內部相當粗糙, 且表面之孔隙度相當高, 相對適合作為固定化之載體 37

52 圖 3.1 珊瑚表面 SEM 50X 圖 3.2 珊瑚內部 SEM 1000X 38

53 圖 3.3 珊瑚內部 SEM 2000X 3.4 不同染料之懸浮式批次實驗於 LB 瓊脂平板中勾取 A. hydrophila IU01 之單一菌落於 50 ml LB 培養基 (( 單位 :g L -1 ) casein peptone 10, yeast extract 5, sodium chloride 10) 中, 以 30,125 rpm 培養 12 hr, 以確保菌株完全活化達同步對數生長 培養後殖種 1 %(v/v) 菌液分別加入含有先行過濾除菌之 300 mg L -1 染料之 100 ml YE 培養液 (( 單位 :g L -1 ); Yeast extract 5, sodium chloride 10 ) 中, 並以 30, 125 rpm 搖瓶方式進行培養 ( 此時 t=-6 h)( 即前六小時以好氧方式培養 ), 並同步監測菌體及染料濃度, 於 t=0 時開始靜置脫色 ( 即於第六小時採靜置 ( 缺氧 ) 方式培養 ), 亦持續紀錄菌體 39

54 及染料濃度之時間變化 3.5 固定化系統之空白實驗 ( 遲滯時間之決定 ) 圖 3.4 固定化系統空白實驗裝置圖,(I) 為去離子水流洗方向,(II) 空 白實驗之染料流向 由於管柱中填入之載體為隨機堆積排列, 可能造成管柱中流動為非理想狀態, 因此以此空白實驗中吸附及脫附流出曲線決定所需時間作為校正值, 校正各種不同流速之實驗值 首先將不含活菌之管柱 ( 經無營養物補充條件下於密閉之 ICS 經 60 天以上而形成不含活菌之狀態 ), 以去離子水於 60 ml hr -1 之流速流洗 24 hr ( 圖 3.4 (I)), 以確保管柱中菌床所殘餘之物質洗淨, 待流洗完成後再以高濃度之染料 ( 約 4000 mg L -1 ) 進行各流速 (30, 45, 60 ml hr -1 ) 之空白實驗 ( 圖 3.4 (II)), 並於固定時間測量出流水樣之染料濃度 40

55 3.6 固定化實驗設計流程 圖 3.5 固定化實驗裝置圖,(I) 為固定化方向 (down flow),(ii) 為流洗 過氧化氫滅菌, 染料適應期, 正式進料上流向 (up flow) 將珊瑚以去離子水洗淨至水體澄清 ( 如 : 水體以 OD 600nm 測量以接近檢測極限為佳 ), 烘乾至恆重後秤取約 630 g (±3 %) 之珊瑚, 滅菌後置於反應管柱中, 並以上流方式 ( 圖 3.5 步驟 (II)) 通入 3 % 之過氧化氫溶液, 以快速全迴流 (50 ml min -1 ) 進行 24 hr 模擬廢水廠現場滅菌, 而後將過氧化氫溶液漏淨後, 通入滅菌蒸餾水進行快速全迴流 24 hr, 並反覆此洗淨步驟二次以確保無過氧化氫溶液殘留於管柱中 ( 經平板塗抹確認為無菌狀態 ) 於 LB 瓊脂平板中勾取標準菌株之單一菌落於 50 ml LB 培養液中進行前培養 12 hr, 前培養完成後取 1 %(v/v) 菌液殖種於 600 ml LB 已 41

56 滅菌之新鮮培養基中, 以 30, 125 rpm 方式培養 24 hr, 以確保菌株完全活化達同步進入對數生長 將培養完成之菌液以下流方式 ( 圖 3.5(I)) 通入已滅菌之反應槽中迴流 (60 ml min -1 ), 進行為期約兩星期之固定化吸附及增生, 並每三天更換新鮮 300 ml LB 培養液, 維持管柱中養分不致耗盡, 以確保菌體之微生物代謝生長活性及固定化所需能量基質 固定化完成後, 則進入為期兩星期之染料適應期 ( 圖 3.5(II)), 目的為讓菌體在接近穩態操作條件下, 染料濃度逐步改變而適應含染料之環境, 以避免在實際操作下環境遽變使菌體漸次喪失容忍力而流失應有之穩定生物活性 再者, 本研究中並以含 MgSO g L -1, 甘油 10 ml L -1, 並以不同濃度之各種染料以階梯循環方式入料 ( 見圖 3.6), 流率則視各實驗所需進行調整 2500 Phase I Phase II 2000 Dye in (mg L -1 ) Time (h) 圖 3.6 固定化循環進料示意圖, 操作第一相位 (Phase I) 為染料適應 期 ; 操作第二相位 (Phase II) 為正式階梯式進料期 42

57 於 ICSs 固定化馴養期及操作程式 ( 如圖 3.6 所示 ), 首先進料染料濃度之改變將以 24 hr 為單位, 每隔 24 hr 更換進料之染料濃度 ( 即 100 mg L -1 day -1 變化量 ), 並於染料適應期 (Phase I) 中採循環之方式改變進料染料濃度 注意於染料適應期結束後,ICSs 分別以固定濃度基質 ( 含 MgSO g L -1 甘油 10ml L -1 之 X LB( 依各實驗所需調整 )) 進入正式階梯式進料 (Phase II) 本研究以階梯式濃度逐次上升之策略 ( 每天上升 100 mg L -1 ) 進行, 其中假設在此濃度緩慢上升過程視為近似穩態操作 (Quasi-Steady State), 而表現生物行為於近似適應操作下所表現出穩定生物活性 (Chen, 2007) 並於不同時間取出流水水樣監測分析菌體及染料濃度 而為求最適化之固定化處理效率, 本研究亦會同時探討於何種流速下可具有最佳之處理效率, 以及於各種基質濃度下所得之最大處理處理容量, 並於固定流速下, 決定於不同染料及固定基質濃度之生物刺激下, 各種不同染料脫色之最大極限處理濃度為何? 因此本研究分別以 30, 45, 60 ml hr -1 三種流速下以染料 (RR141) 比較進行最佳化流速實驗, 為求顯著之處理效果呈現, 因此於以 0.5X LB 基質濃度下進行最佳化流速實驗, 並分別以 X LB 之基質濃度於固定染料種類及流速之條件下推論各基質濃度之最大極限處理濃度, 並比較在各種染料於固定流速 (60 ml hr -1 ) 及基質濃度 (0.2X LB) 刺激下, 其最大極限處理濃度是否與懸浮式系統具相平行之結果, 以 43

58 瞭解菌體於懸浮式及固定化系統中其脫色活性是否有所差異, 並試圖 推測可能之反應機構及影響操作阻抑條件 3.7 以不同培養液 碳源濃度及染料 / 芳香胺中間物之條件下菌體產生 PHA 之可行性由 LB 瓊脂平板中勾取菌株之單一菌落於 50 ml LB 培養液中進行前培養 12 小時, 前培養完成後取 5 % (v/v) 菌液殖種於含有 100 ml MR medium( 成分詳見表 3.1), Phosphorus limited MR medium( 成分詳見表 3.1), itrogen limited MR medium( 成分詳見表 3.1) (Lee et al., 1999) 之 500 ml 錐形瓶中, 並添加 1 ml L -1 之微量元素 ( 成分詳見表 3.1) 及適量碳源 (Lauric acid), 以 30, 125 rpm 水浴 (JIUEE, BT-350R) 培養 72 hr, 培養完成後將菌液離心, 並以去離子水清洗三次後將菌餅烘乾 表 3.1 不同培養液之成分 MR 培養液 (Lee et al., 1999) 成分 含量 (g L -1 ) 廠商 KH 2 PO Sigma, American (H 4 ) 2 HPO Sigma, American MgSO 4 7H 2 O 0.80 Sigma, American citric acid 0.80 Sigma, American 44

59 MR 培養液 ( 磷源限制 ) (Lee et al., 1999) KH 2 PO Sigma, American (H 4 ) 2 HPO Sigma, American KCl 2.37 Sigma, American H 4 Cl 2.17 Sigma, American MgSO 4 7H 2 O 0.80 Sigma, American citric acid 0.80 Sigma, American MR 培養液 ( 氮源限制 ) (Lee et al., 1999) a 2 HPO 4 12H 2 O 0.90 Sigma, American KH 2 PO Sigma, American H 4 Cl 0.05 Sigma, American MgSO 4 7H 2 O 0.02 Sigma, American 微量元素 (Gong et al., 2008) 成份 含量 ( mg L -1 ) (per liter of 1 HCl) 廠商 ZnSO 4 7H 2 O 100 Sigma, American MnCl 2 4H 2 O 30 Sigma, American H 3 BO Sigma, American CoCl 2 6H 2 O 200 Sigma, American 45

60 CuSO 4 5H 2 O 10 Sigma, American icl 2 6H 2 O 20 Sigma, American amoo 4 2H 2 O 30 Sigma, American 3.8 PHA 檢測方法 (Lo et al., 2009) 取約 0.02 g 之乾菌至於 50 ml 螺蓋試管中, 加入 2 ml 之 1 %(w/w) 酸甲醇及 2 ml chloroform 以止洩帶封口後將螺蓋旋緊防止液體揮發, 並置於 100 烘箱反應 6 小時, 待反應完成後冷卻至室溫, 並加入 1 ml 1 之 acl 後記錄重量 ( 精秤至小數點四位 ), 而後加入 350 μl 之內標物 (1 %(w/w) benzoic acid in chloroform) 並秤重, 將液體震盪混合後靜置至分層並取下層液 500 μl 為測量樣本 以氣相色層分析儀 (SRI 8610C, USA, Restek Stabilwax column; detector: FID) 分析檢測各待測樣品,GC 分析操作條件 :Injection temperature: 250 ; Carrier Flow: 3 ml/min; Detector temperature: 300 ; Oven temperature: Initial temperature: 75 holding 1 min, rate temperature: 25 /min, Final temperature: 200 holding 10 mins 46

61 Temperatuure ( o C) Time (min) 圖 3.7 氣相色層分析儀之升溫策略圖 3.9 分析方法 化學分析及估算方法經由分光度計, 染料 ( 各染料之最大吸收峰 λ max ) 和菌體 (λ max=600nm) 濃度之測量可以下列方式決定: 假設未經離心之原含菌液樣品之量測值為 X Dye Dye OD = OD + OD X 600nm nm nm (1) 經離心後 (12000 rpm; Xg) 取上層液 ( 假設只含染料 ) 所測得值為 sup OD = OD 600 Dye 600 nm nm (2) 經離心後 (12000 rpm; Xg) 取上層液 ( 假設只含染料 ) 所測得值 為 47

62 OD λmax sup = OD λmax Dye (3) 將此三式聯立即可決定出染料濃度 (OD Dye λmax ) 及 OD X 600nm (1)-(2) 再取定適當稀釋倍數於線性範圍內 ( 約 O. D.<1), 經濃度校正曲線分別計算出實際濃度 估算公式 : 操作參數 ( 比生長速率 (SGR 或 μ) 及比脫色速率 (SGR)) 可由下列各式來定義 : d ln X dt X = μ(1- ) (4) Logistic equation. X 0 [ X ] 1 d SGR = (5) Specific growth rate (h -1 ) X dt 1 d[ dye] SDR = - (6) Specific decolorization rate (mg L -1 h -1 ODU -1 ) X dt μ 為生長速率,X 為菌體濃度,X 0 為起始菌體濃度,[dye] 為染料濃度 (mg L -1 ),t 為時間 (h) 固定化研究之空白實驗分析方法本研究使用天然珊瑚作為載體, 而由於載體之孔洞大小不一, 因此當入流進料由於非理想堆積及質傳之擴散阻抑現象造成非理想層流流動之情況發生 因此為校正此誤差而以含 死菌 ( 經無營養物補充條件下於密閉之 ICS 經 60 天以上而形成不含活菌之狀態 ) 之空白 48

63 實驗來進行解析 如圖 3.5 所示, 理論上當 Area a=area b; Area a =Area b 之時間, 則可表為所需之平均水力停滯時間 a a t 0 t u t 0 t d 4000 t u t d Dye Concentration (mg L -1 ) b b 50 Time (hr) 圖 3.5 固定化處理空白校正理論示意圖, 其中於入流進料濃度作瞬間單階梯改變, 圖中於 t=t 0 進料染料由 0 改為約 mg L -1 之上升變化 (shift-up) 而其理想狀態出口濃度變化時間為 t u '; 於 t=t 0 濃度陡降 (shift-down) 由高濃度 ( 約 mg L -1 ) 瞬間改為 0, 其理想狀態出口濃度瞬間變化時間為 t d, 實驗變化時間為 t d 49

64 3.9.3 固定化實驗分析方法 % absorbed biomass Dye concentration (mg L -1 ) (I) (II) (III) Time (days) P a M 1 Output response (I) Staircase input b M 2 Output response (II) τd Time (days) 圖 3.6 固定化處理效果理論示意圖 Staircase input 表階梯式進料入料濃度操作線 Output response (I) 為無菌管柱出料濃度, 與 Staircase input 平行,τd 為延遲時間 Output response (II) 為含菌管柱出料濃度, 理論上亦與 Staircase input 平行 P 點為管柱內染料濃度開始累積, M1 M2 分別為過渡期之平行線切點 50

65 本研究中之基本假設是 假設菌體於攝取能量基質以穩定生長及附著 於載體, 並誘導產生容忍抵抗染料抑制毒性之能力並同時進行脫色 ( 如圖 3.6 所示 ) 過程如下所示 : (I) 為入料初期, 所供給之養分足以支撐菌體完全附著及完全脫色, 管柱 內為一平衡狀態 (II) 而在入料濃度漸增中期, 所供給之養分仍可足夠維持菌體完全附著, 但不足以達到完全脫色, 導致管柱內開始累積染料 (III) 為入料濃度增加末期, 所供給之養分完全不足夠菌體附著及脫色, 因此菌體遭受洗出導致出料菌體濃度大增, 而染料濃度亦由於脫色活性下降而急遽上升至與 Output response(i) 相同 基於此, 並依據微積分中之均值定理 (Mean Value Theorem (Chen 2007)) 推論決定存在與 Output Response (I) 平行之切線作圖, 可得假想平行四邊形而漸近出一簡單之鉛直線 (a, b) 計算在各實驗條件下不同染料之最大極限處理濃度量 ( 註 :a, b 線段之存在乃是實驗中菌體吸脫附及脫色活性動態結果 ), 假設由於入流染料濃度之漸次上升, 菌體無法即時完全處理染料而導致染料累積濃度逐漸上升之不可逆現象, 意表當管柱內開始累積染料則逐漸無法回復到先前之穩定平衡狀態 ( 即 P 點 ), 因此可由管柱出流濃度 (Output response II) 作一圓弧曲線與 Output response (I) 平行之平行區域相切 ( 紅色虛線過渡區 ), 由於各菌株對染料毒性容忍力不同, 容忍力較佳之菌株較不易 51

66 操作失敗, 造成處理容量相對不穩定 ( 過渡區 ), 因此由出流濃度 (Output response (II)) 之切點 (M1, M2) 作一鉛直線垂直於 Output response (I), 而兩者 間之長度 (a, b) 即為在該基質濃度刺激下菌體可能產生所處理掉之最大脫色 容量, 而切點產生之時間其 Output response (I) 之濃度即為最大容許起始濃 度 (MAIC) PHA 之定量分析計算 PHB 含量與濃度計算 : 以 5, 10, 15, 20, 25 mg PHB 標準品並加入相同濃 PHB圖譜面積度與體積之 I. S. PHB 重量 = I. S. 於注入液之重量, 每次以 GC 測 I.S. 圖譜面積定樣品時皆需以測定一已知重量之 PHB 標準品, 以確定 GC 與 PHB 檢量線 之穩定度與準確度 PHB 含量 : 檢量線之 x 為樣品 I. S. 重量比值與 GC 圖 譜面積比值相除後的數值, 帶入檢量線公式計算後可得 y 值, 即可得知 PHB 重量, 再除以原乾菌重, 則可計算出樣品 PHB 含量 (wt %);PHB 濃度 : 發 酵總菌液量乘以 PHB 含量, 最後以 g L -1 表示 PHB 濃度 52

67 7 6 Rate of weight (W HB /W I.S ) Y=2.0857X R 2 = Rate of area (A HB /A I.S. ) 圖 3.7 PHB 之 GC 檢量線 53

68 4 結果與討論 4.1 懸浮式系統對不同染料之脫色比較本菌株 (A. hydrophila) 對 7 種不同偶氮染料之生物脫色難易程度, 依最大脫色順序排列為 :(μm L -1 h -1 ODU -1 ) RR198 ( 單偶氮染料 ; 264.2)>RB5 (81.6)>RR141 (37.5)> DY86 (29.0)>RB171 (25.4)> RY84 (20.7)>RG19 (16.4) ( 如圖 4.1 跟表 4.1), 而如相平面分析圖 ( 圖 4.2) 所示, 除 RB5 外, 其餘偶氮染料之脫色皆為非生長相關, 這代表當生長抑制時生物脫色能力可達最佳情況 而與過去清大陳國誠教授等人 (Chen et al., 2003) 於苗栗染整廢水場污泥中所發現之 A. hydrophila DEC 菌株相比較, 對同樣 7 種染料之脫色次序大致上相類似 ( 見表 4.1), 具有相平行次序之脫色效果, 皆為單偶氮染料之 RR198 脫除容量最高, 其次為 RB5, 而 RG19 之脫色容量最差 ; 兩種菌於不同區域 (IU01 於宜蘭 ;DEC 於苗栗 ) 及環境 (IU01 於水源地 ;DEC 於染整污泥 ) 所篩選出之相同菌株, 對相同染料具有相類似的脫色次序, 這顯示 A. hydrophila 的脫色能力是其基因典型 (genotypically) 特徵 54

69 表 4.1 Aeromonas hydrophila 於不同染料之脫色比較 染料類型 (C. I. number) Decolorization rate a Decolorization b,c IU01 d IU01 e DEC2 f DEC3 f DEC4 f Reactive Red 198 (18221) ±2 86±3 82±3 Reactive Black 5 (20505) ±3 62±1 66±3 Reactive Red 141 (-) ±2 13±1 10±2 Direct Yellow 86 (-) ±2 20±1 20±1 Reactive Blue 171 (-) ±2 13±1 15±2 Reactive Yellow 84 (-) ±2 15±2 14±2 Reactive Green 19 (-) ±2 10±3 7±2 a 起始染料濃度為 300 mg L -1 b 起始染料濃度為 100 mg L -1 c 單位 :% d 單位 :mg L -1 h -1 ODU -1 e 單位 :μm L -1 h -1 ODU -1 f 數據取自 Chen et al. (2003) 55

70 Static incubation starts Time = Specific growth rate (h -1 ) Time (h) SDR (mg L -1 h -1 ODU -1 ) Specific decolorization rate (SDR) (mg L -1 h -1 ODU -1 ) OD 600nm RR 141 RY 84 DY 86 RB 5 RG 19 RB 171 RR Time (h) Dye concentration (mg L -1 ) 圖 4.1 各類組 ( 萘酚類 非萘酚類 ) 染料於起始濃度約 300 mg L -1 下相對生長及脫色曲線比較 ( 箭號所指為最大比脫色速率分別為 :RR 198(260.2); RB 5(80.9); RR141(66.5); RB171(36.0); RY 84(33.7); DY 86(30.9); RG 19(22.5) mg L -1 h -1 ODU -1 ) 56

71 100 Specific decolorization rate (mg L -1 h -1 ODU -1 ) SDR (mg L -1 h -1 ODU -1 ) SGR (h -1 ) RY 84 RR141 DY 86 RB 5 RG 19 RB171 RR Specific growth rate (h -1 ) 圖 4.2 比生長速率 (SGR) 對比脫色速率 (SDR) 之相平面分析曲線圖 萘酚類染料 大致上 5 種萘酚類偶氮染料 (RR198, RB5, RR141, RB171, RG19; 圖 4.3-a) 除 RG19 外, 均較非萘酚類 (DY86, RY84; 圖 4.3-b) 偶氮染料容易脫 色, 由於這些萘酚類染料均為 H 酸 ( 結構如圖 4.3-a) 所合成之偶氮染料, 因 此均具有一羥基 ( OH, hydroxyl group) 與偶氮鍵呈鄰位 (ortho)( 見圖 4.3-a), 但非萘酚類偶氮染料則因無此結構特性 ( 見圖 4.3-b) 而降低其生物脫 色速率 而 Zimmermann et al. (1982) 之研究以 Xenophilus azovorans KF46 菌 株進行萘酚類偶氮染料之脫色研究, 亦發現萘酚類偶氮染料可被快速脫色 的相同現象, 並指出於偶氮染料之萘酚環上第二個碳有羥基者 ( 如 : 1-(4 -sulfophenylazo)-2-naphthol); Orange II) 較快脫色 由於羥基位於萘酚環 57

72 的第二個碳上, 可能發生偶氮 - 腙互變異構 (azo- hydrazone tautomerism) ( 如 :-=- =-H ), 因此羥基 ( 即為一推電子基 ) 經結構異構化將成為羰基 (carbonyl group)( 是一拉電子基 ), 如圖 4.4 所示 (Libra et al., 2004; Pearcea et al., 2003) 由於羰基為陰電性強的拉電子基, 因此有利於偶氮染料進行生物脫色還原反應時穩定負電荷, 因此萘酚類偶氮染料之異構化 (tautomerism) 有利於 A. hydrophila 進行脫色 萘酚類偶氮染料於偶氮鍵之鄰位 (ortho) 位置具有磺酸基 (sulfo group) ( 如 : 圖 4.5, RR198), 雖對偶氮染料之生物還原降解造成立體阻礙效應 (steric hinderance effect), 但因磺酸基為陰電性強之官能基, 電子將受感應 (inductive) 和共振效應 (resonance effect) 之吸引, 是以會穩定偶氮染料還原時之負電荷, 因為磺酸基穩定還原染料所產生之負電荷, 使偶氮鍵變的更具親電性, 因此較有利於還原 若拉電子基與偶氮鍵呈對位 (para) 仍具有共振效應, 且無立體阻礙效應, 因此較鄰位更有助於脫色 (Hsueh et al., 2008), 而 Walker et al. (1971) 亦指出苯環上之拉電子基 ( 如 SO 3 H, SO 2 H 2 ) 與偶氮鍵呈對位時將使還原速率增加 將磺酸基位於非萘酚類染料之間位與萘酚類染料之鄰位及對位相比較, 其拉電子基之感應效應能力較弱 位於偶氮鍵相對位置 ( 如 : 鄰 間 對位 ) 之拉電子基, 其拉電子能力將對 A. hydrophila 之生物脫色能力有極大影響 ; 反之, 偶氮染料之苯環上若無拉電子基, 會降低偶氮染料之脫色效率 (Hsueh et al., 2008) 58

73 五種萘酚類染料中以 RR198 脫色效率最佳, 由於 RR198 其偶氮鍵之鄰位有磺酸基以感應效應和共振效應來穩定電子, 並且在對位有 -SO 2 (CH 2 ) 2 SO - 4 ( 以共振效應穩定電子 ), 兩者皆為陰電性強之拉電子基, 可藉由共振效應來拉電子, 使偶氮鍵更具電子親和力, 因此最易還原脫色 此外, 單偶氮染料 ( 如 RR198), 較多偶氮染料更易脫色 (Hsueh et al., 2007, Chen et al., 2003, Hu 2001) 而萘酚類染料之生物脫色速率其次為 RB5, 而 RB5 亦為 H 酸所合成之雙偶氮染料, 其苯環上具兩個拉電子基 (-SO 2 (CH 2 ) 2 SO 3 a) 均與偶氮鍵呈對位, 依共振效應對偶氮鍵具有拉電子效應, 而降低偶氮鍵之電子密度, 有利於還原脫色, 且可穩定偶氮染料還原反應之負電荷, 其效應如同 RR198( 圖 4.5), 由於 RB5 為雙偶氮染料, 因此其脫色速率略遜 RR198 而 RR141 是一結構對稱之雙偶氮染料 ( 如圖 4.3-a), 四個萘環上均具有磺酸基並與偶氮鍵呈鄰位, 有立體阻礙效應, 但由於磺酸基為拉電子基, 藉著感應效應及共振效應對偶氮鍵具有拉電子效果, 使偶氮鍵之電子雲密度降低, 有利於偶氮鍵之斷裂脫色, 且可穩定偶氮染料還原時之負電荷, 其效應如同 RR198( 圖 4.5), 由於位於偶氮鍵鄰位之磺酸基造成較大之立體阻礙效應, 因此脫色速率不如 RB5 RB171 與 RG19 為雙偶氮染料之異構物, 皆以 H 酸與一推電子基 (-H-triazyl) 所合成之偶氮染料, 而此推電子基位於 RB171 偶氮鍵之間位, 59

74 在 RG19 之對位 ( 見圖 4.3-a), 依共振效應而言, 對位之 RG19 受共振效應之影響較間位之 RB171 大, 因此造成對位之 RG19 其偶氮鍵電子雲密度增加, 而不利於 RG19 還原脫色, 且在還原時無法穩定負電荷, 因而其脫色速率甚至低於無羥基之非萘酚類染料 ( 如圖 4.3-b 之 RY84, DY86), 因此 RG19 為 7 種染料中脫色速率最低者 而將 RB171 與 RR141 相比較,RB171 之脫色速率略低於 RR141, 這是因為 RB171 於磺酸基對位位置具有一推電子基 (-H-triazyl), 使其缺電子程度不如 RR141, 因此 RB171 之脫色速率低於 RR141(Pearcea et al., 2003) 總結上述幾點結論, 大致上可推論出 : 偶氮鍵結之電子雲密度越低則越有利於脫色, 因此偶氮鍵結處若有能穩定偶氮染料還原時之負電荷之官能基 ( 如 : 磺酸基 ), 可加速偶氮染料還原脫色, 另外越少立體阻礙越有利脫色 ( 如對位比鄰位 ) 60

75 OH H 2 R= SO 2 CH 2 CH 2 OSO 3 a Reactive Black 5 (RB 5) ao 3 S SO 3 a ( H acid ) diazo coupling reaction H R= ao 3 S H Reactive Blue 171 (RB 171) R ao 3 S OH H 2 R SO 3 a (Azo Dyes) R= ao 3 S H Cl Cl H SO 3 a SO 3 a Reactive Green 19 (RG 19) ao 3 SOH 2 CH 2 CO 2 S ao 3 S OH H Cl H SO 3 a SO 3 a Reactive Red 198 (RR 198) ao 3 S SO 3 a OH ao 3 S H Cl H SO 3 a Cl H ao 3 S H ao 3 S OH SO 3 a SO 3 a Reactive Red 141 (RR 141) 圖 4.3-a 萘酚類偶氮染料 (RR198, RB5, RR141, RB171, RG19) 之染料結構圖 R' H R'= SO 3 a R' C H 3 H 3 C H HCH 2 CH 2 OH Direct Yellow 86 (DY 86) SO 3 a OMe H H SO 3 a R' R' CH 3 CH 3 Cl Cl CH CH Reactive Yellow 84 (RY 84) OMe H H SO 3 a 圖 4.3-b 非萘酚類偶氮染料 (DY86, RY84) 之染料結構圖 61

76 ao 3 SOH 2 CH 2 CO 2 S SO 2 CH 2 CH 2 OSO 3 a OH H 2 ao 3 S SO 3 a ao 3 SOH 2 CH 2 CO 2 S H O H 2 SO 2 CH 2 CH 2 OSO 3 a ao 3 S SO 3 a 圖 4.4 萘酚類染料之偶氮 - 腙互變異構 (azo- hydrazone tautomerism), 以 RB5 為例 (Libra et al., 2004) 圖 4.5 以 RR198 模擬共振效應之染料結構變化, 磺酸基位於偶氮鍵之鄰 - 位,SO 2 (CH 2 ) 2 SO 4 於偶氮鍵之對位, 兩者皆為高電負度之基團, 這些基團可穩定還原時中間物所產生之負電荷, 因而偶氮染料可藉由感應效應及共振效應來還原 62

77 4.1.2 非萘酚類染料非萘酚類染料 ( 如圖 4.3-b 之 DY86, RY84) 雖在偶氮鍵之鄰位具有甲基 (methyl), 但此甲基對偶氮染料之脫色速率較萘酚類染料之羥基脫色速率低 (RG19 除外 ),igam et al.(1996) 提及, 偶氮化合物之羥基或氨基較甲基 甲氧基 磺酸基或硝基更易被降解, 這是由於前述之萘酚類偶氮染料, 其偶氮鍵結鄰位之羥基所造成之偶氮 - 腙互變異構 (azo- hydrazone tautomerism) ( 如圖 4.4) 效應所導致 而 DY86 及 RY84 皆由 sulfonaphthalene 所合成, 但 DY86 之脫色速率略高於 RY84, 這是因為 RY84 於偶氮鍵間位上有推電子基甲氧基 (methoxy group), 不利於 RY84 之生物脫色 結論在考慮上述 7 種染料之結構以及 A. hydrophila 之脫色速率後, 由相似之偶氮染料結構可知, 單偶氮染料較多偶氮染料易生物脫色 (Hsueh et al., 2007, Pearcea et al., 2003), 偶氮染料之偶氮鍵鄰位具有羥基者較有利於 A. hydrophila 脫色 (Zimmermann et al., 1982), 偶氮鍵結之電子雲密度越低則越有利於還原脫色 文獻 (Zimmermann et al., 1982, Hsueh et al., 2008) 亦證實, 偶氮染料具拉電子基將更較推電子基更能穩定還原脫色, 另外, 拉電子基與偶氮鍵之位置會對脫色產生顯著影響, 其脫色速率為對位 > 鄰位 > 間位, 鄰位及對位可更有效的以共振效應吸引偶氮鍵結處之電子, 使偶氮鍵 63

78 更加的具親電性有利於脫色, 但因鄰位具有立體阻礙效應, 因此其脫色速率略低於對位, 本研究更加系統化的探索化學結構對 A. hydrophila 偶氮染料生物脫色之影響, 而研究結果與先前研究之 P. luteola (Hsueh et al., 2008) 及純化之偶氮還原酵素 (Zimmermann et al., 1982) 相符 64

79 4.2 固定化生物反應器 固定化實驗之停滯時間決定 Dye Concentration (mg L -1 ) tu=6.27 h tu ' =5.67 h t d =6.25 h td ' =5.67 h Flow rate:60 ml hr -1 shift-up shift-down Dye Concentration (mg L -1 ) tu=10.90 h td=10.70 h Flow rate:45 ml hr -1 tu ' =7.56 h td ' =7.56 h shift-up shift-down Dye Concentration (mg L -1 ) tu=14.30 h t d =14.40 h Flow rate: 30 ml hr -1 tu ' =11.33 h td ' =11.33 h shift-up shift-down Time (hr) 圖 4.6 各流速 (30, 45, 60 ml hr -1 ) 之空白實驗 t u, t d 為理論吸附及脫附所需 時間,t u, t d 為實際之吸附及脫附所需時間 由於流出延遲之非理想行為發生 可發現 t u >t u 及 t d >t d 之普遍延遲現象 65

80 由於本研究使用天然珊瑚作為載體, 而載體之孔洞大小不一, 因此在質傳之擴散過程中仍存在非理想層流流動 (non-ideal plug flow) 之情況 因此為決定出此誤差以空白實驗 ( 亦即附著死菌 ICS) 修正各流速下之水力停留時間差異 實驗中分別以 30, 45, 60 ml hr -1 三種流速進行空白實驗, 就圖 2.4 之示意圖可知, 由於非理想層流現象, 因擴散及回混等作用之發生, 導致有流出滯留延遲之結果發生 ( 如理論值 t u < 實驗值 t u 及 t d <t d ), 為求後續精確計算最大染料處理濃度容量, 需作此流出停留時間偏差之校正計算 再者, 如圖 4.6 所示, 其中之流出停留時間 (t u ; t d ) 為測量管柱填充載體之體積後計算之理論出料時間, 但管柱中填入之載體為不規則隨機堆積, 且由於固定管柱非理想層流現象之流動發生, 因此以空白實驗中吸附及脫附所需之停留時間 (t u ; t d ) 作為校正值, 而由三種不同流速之實驗值 ( 表 4.2) 可知管柱中實存在非穩態流動之情況 (t u t u ; t d t d ), 而就空白實驗之校正結果發現 t u t d (30 ml hr -1 :t u =6.27 h t d =6.25 h 45 ml hr -1 :t u =10.90 h t d =10.70 h 60 ml hr -1 :t u =14.30 h t d =14.40 h), 且 t u >t u, t d >t d 如 ( 表 4.3) 所示, 因此基於上述實驗結果, 將以校正值 (t u ; t d ) 分別校正各流速 ICS 之實際出料時間 66

81 表 4.2 三種不同流速之實驗值 t u = t u t d = t d 30 ml hr -1 t u : 6.27 h t u : 5.67 h t d : 6.25 h t d : 5.67 h 45 ml hr -1 t u : h t u : 7.56 h t d : h t d : 7.56 h 60 ml hr -1 t u : h t u : h t d :14.40 h t d : h t u, t d 為為實際測量值 ;t u, t d 理論計算值 表 4.3 三種不同流速之校正比較 t u >t u t d >t d 30 ml hr -1 t u : 6.27 h> t u : 5.67 h t d : 6.25 h> t d : 5.67 h 45 ml hr -1 t u : h> t u : 7.56 h t d : h> t d : 7.56 h 60 ml hr -1 t u : h> t u : h t d : h> t d : h t u, t d 為理論計算值 ;t u, t d 為實際測量值 67

82 4.2.2 於不同基質濃度 ( X LB) 之最大極限處理濃度實驗 2500 Phase (I) Phase (II) 2000 Dye in (mg L -1 ) OD 600nm 2 1 Reactive Red 141 (mg L -1 ) X LB 0.3X LB 0.2X LB 0.1X LB Time (hr) 圖 4.7 不同濃度 (0.5X,0.3X,0.2X,0.1X LB) 基質於 60 ml hr -1 下刺激之固定化脫色處理效果, 其中 0.3X LB 與 0.5X LB 之處理容量相似 68

83 a 0.1X a 0.2X b0.1x b 0.2X a 0.3X a 0.5X b 0.3X b 0.5X 1400 Dye Concentration (mg L -1 ) X LB 0.3X LB 0.2X LB 0.1X LB Time (hr) 圖 4.8 不同濃度基質 (0.5X, 0.3X, 0.2X, 0.1X LB) 刺激之固定化最大處理容 量 表 4.4 不同濃度基質刺激之固定化脫色處理容量 Isoclines of ICSs DC=(25/6) (t-β) a(maic a ) b(maic b ) P. luteola a(maic) Staircase input β=384.0 Output response(i) β=389.6 L 0.5X β=782.0~ (1635) 1227 (1738) 2449(2559) L 0.3X β=764.1~ (1560) 1126 (1675) 1784(1848) L 0.2X β=702.6~ (1304) (1503) 1503(1530) L 0.1X β=622.5~ (970.2) (1182) 599(622.6) DC: 處理容量 (mg L -1 );t:time (h);a, b: 最大處理容量 (mg L -1 );MAIC:(Maximum allowable inlet concentration ) 最大容許起始濃度 (mg L -1 ) 69

84 由圖 4.7 可知當固定化床於染料適應期 (Phase I) 時, 出口菌體濃度震盪幅度較大, 顯示固定化床尚處於一未平衡之動態情況, 因此此時出口菌體濃度不穩定, 但經過適應期後 ( 約 340 小時左右 ) 可由出口菌體濃度看出固定化床之固定效果開始穩定, 因此出口菌體濃度維持一穩定之情況 (OD 600 約 ), 且基質濃度越營養者 ( 如 0.5X LB) 其出口菌體濃度亦相對高於其他基質濃度 ( X LB), 而基質濃度與出口菌體濃度亦具有成正比關係, 基質濃度越高者其出口菌體濃度亦較高 ( 相關學理證明列於附錄 3), 而當進入正式進料期時, 由於染料濃度每隔 24 小時即上升 100 mg L -1, 因此至實驗末期 (t>640 h) 由出口菌體濃度開始上升推論由於所供給之基質濃度 ( X LB) 不足夠菌體抵抗染料毒性, 導致固定化之菌體逐漸脫落, 因此造成出口菌體濃度上升且不穩定震盪, 且出口染料濃度亦快速累積, 導致操作失敗 而圖 4.8 表 4.4 為各濃度基質刺激下所得之最大處理容量, 於 0.5X LB 與 0.3X LB 基質刺激下, 所得之處理容量相似, 因此可推論約在 0.3X LB 之基質刺激下菌體可達到最大處理容量約為 976~1126 mg L -1, 其經濟可行性較高 而將本次實驗結果與過去研究所使用之染料脫色菌株 Pseudomonas luteola(chen et al., 2007) 相比較 ( 如表 4.4), 可發現 A. hydrophila 較 P. luteola 具更良好之染料脫色能力及更佳之毒性容忍能力, 這與先前之研究 (Chen et al., 2009b) 具相符合之結果 70

85 4.2.3 不同流速於固定染料種類及基質濃度之固定化最大處理容量 2500 Phase I Phase II 2000 Dye in (mg L -1 ) F =60 ml hr -1 F =45 ml hr -1 F =30 ml hr -1 4 OD 600nm Reactive Red 141 (mg L -1 ) Time (hr) 圖 4.9 不同流速 (30, 45, 60 ml hr -1 ) 於固定染料種類 (RR141) 及基質濃度 (0.5X LB) 下之固定化處理效果 由圖中結果顯示流速對處理效果影響顯著, 流速 45~60 ml hr -1 間處理效果較佳 71

86 1000 Flow rate =30 ml hr -1 Flow rate = 45 ml hr -1 Flow rate =60 ml hr -1 b30 a30 ml hr -1 ml hr -1 a 60 ml hr -1 b 60 ml hr -1 a 45 ml hr -1 b 45 ml hr -1 Dye Concentration (mg L -1 ) Time (hr) 圖 4.10 以固定染料 (RR141) 於固定基質濃度 (0.5X LB) 下, 各不同流率 (30, 45, 60 ml h -1 ) 之固定化脫色處理容量 ( 數據已經校正停滯時間 ) 原則上本研究基於一假設為當系統於穩定狀態, 此時菌體之吸附 ( 正反應 ) 及脫附 ( 逆反應 ) 應達到一動態平衡, 因此綜觀三種流速之處理效果 ( 圖 4.9), 可得一共通性結論, 當進入染料適應期 (Phase I) 時, 初期 (t<280) 菌體較易流失, 因此系統出料之菌體濃度上下劇烈震盪, 但於染料適應期末期 (t 72

87 >280) 時可發現菌體流出濃度逐漸趨近穩定 ( 各流速分別約為 30 ml hr -1 (1.24 ±0.46), 45 ml hr -1 (0.90±0.53), 60 ml hr -1 (1.08±0.45), 顯示系統可約略達到一動態平衡 ( 即吸附及脫附速率相等 ) 由低出口菌體濃度可確保大量脫色菌能可穩定固定於載體上以維持高處理活性 ; 反之, 會因大量菌體流失而降低 ICS 脫色效能 圖 4.9 所示可知, 於流率在 30 ml hr -1 之染料適應期初期, 菌體可能受限於流率過緩, 造成能量基質濃度無法及時補充, 導致菌體可能趨於老化而造成系統菌體濃度無法呈現穩定而持續震盪, 而於 t>280 時可知菌體逐漸適應該操作條件, 因而系統出口菌體濃度趨於穩定而下降, 而在進入正式階梯式進料期時, 可能因染料漸次上升而造成菌體無法即時反應而造成基質提供已不足已反應染料遞增之處理環境, 因而造成脫色逐漸失敗亦即因為能量基質增加而造成 ( 出口濃度上升 ) 且出口菌體濃度持續大幅震盪, 顯示系統中固定化菌體可能由於逆反應 ( 脫附 ) 逐漸大於正反應 ( 吸附 ), 而造成菌體逐漸流失而導致處理效果下降且較不穩定, 而最終導致整體系統操作失敗 藉由操作失敗過程中來定量評估固定床之最大處理脫色容量 73