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1 Science Discovery 2016; 4(2): doi: /j.sd ISSN: (Print); ISSN: (Online) Feasibility Study on Dye Decolorization Using Microbial Cultures Supplemented with Decolorized Metabolites of Hylocereus polyrhizus Jen-Hung Yuan, Chung-Chuan Hsueh, Bor-Yann Chen * Department of Chemical and Materials Engineering, Nation Ilan University, Ilan, Taiwan address: filly2468@gmail.com (Jen-Hung Yuan), cchsueh88@gmail.com (Chung-Chuan Hsueh), boryannchen@yahoo.com.tw (Bor-Yann Chen) * Corresponding author To cite this article: Jen-Hung Yuan, Chung-Chuan Hsueh, Bor-Yann Chen. Feasibility Study on Dye Decolorization Using Microbial Cultures Supplemented with Decolorized Metabolites of Hylocereus polyrhizus. Science Discovery. Vol. 4, No. 2, 2016, pp doi: /j.sd Received: February 28, 2016; Accepted: May 13, 2016; Published: May 18, 2016 Abstract: This feasibility study used indigenous microbes to implement assessment upon capabilites of dye decolorization with supplementation of decolorized metabolites () of Hylocereus polyrhizus. As indicated, ca. 5% of Hylocereus polyrhizus could clearly exhibit reversible redox peak potentials via cyclic voltammetric analysis, revealing its significant capability as electron-shuttling mediators. Compared to -supplemented decolorization, the ranking of dye-decolorizing capabilities of bacteria was Shewanella putrefaciens WLP72> Enterobacter cancerogenus BYm30> Aeromonas hydrophila NIU01~ A. hydrophila YTl1> Klebsiella pneumoniae ZMd31. The ranking of biodegradability of azo dyes was RB160 > RBk5 > DY86 RG19 > RR141. Evidently, the presence of significantly stimulated bacterial decolorization performance of WLP72, BYm30, ZMd31. However, possibly due to inhibitory characteristics of to A. hydrophila, its dye decolorization was delayed. That is, using to enhance dye decolorization, biodecolorizers should be acclimated in such envionments for effective expression. The findings also pointed out that supplementation of to YTl1, WLP72 at ca. 10~15 % for decolorization of RR141 could effectively increase dye-decolorizing efficiency ca. 2.33~2.88 fold. Such augmentation inevitably could autocatalytically stimulate electron transfer capabilities for optimal wastewater decolorization with sustainable development. Keywords: Electron-shuttles, Dye decolorization, Hylocereus polyrhizus 袁任宏, 薛仲娟, 陳博彥火龍果脫色代謝物應用於染料脫色之可行性評估化學工程與材料工程學系, 國立宜蘭大學, 宜蘭, 台灣 * 邮箱 illy2468@gmail.com( 袁任宏 ),cchsueh88@gmail.com( 薛仲娟 ),boryannchen@yahoo.com.tw( 陳博彥 ) 摘要 : 基於環境友善考量, 本研究自台灣本土天然混菌, 分別進行火龍果汁液之脫色相關可行性降解評估發現添加其中以狀圍水域混菌生物降解之脫色液, 並當添加火龍果汁液劑量達一定閥值 (5%) 時, 其脫色代謝物才具顯著之氧化還原峰, 並具有促進電子轉移之特性就脫色效率排序, 可得菌株 Shewanella putrefaciens WLP72> Enterobacter cancerogenus BYm30> Aeromonas hydrophila NIU01~ A. hydrophila YTl1> Klebsiella pneumoniae ZMd31, 而不同菌株對染料脫色由易至難排序則為 RB160 > RBk5 > DY86 RG19 > RR141 將脫色代謝物應用於染料脫色中, 可使 WLP72 BYm30 ZMd31 有效提升其電子轉移速度, 大幅提高對染料還原脫色速率但對菌種 NIU01 及 YTl1, 則發現產生延滯現象, 因此脫色前須經有效馴化作用就批式脫色而言, 菌株 YTl1 以 15% 來進行 RR141 脫色, 能有效提升其脫色降解速率 2.33

2 Science Discovery 2016; 4(2): 倍, 就菌株 WLP72 而言添加脫色代謝物之脫色降解速率皆遠大於未添加者, 並當添加 10% 時, 即有效提升其脫色降解速率 2.88 倍此種天然染料脫色代謝物之添加策略可用於染料廢水處理自催化促進處理之工程優化上關鍵字 : 電子中介體, 染料脫色, 火龍果 1. 引言 2.2. 火龍果汁液萃取染料工業廢水中所殘留之染料色素等汙染物, 由於顯而易見之特性, 不可避免地其處理儼然已是環保單位必查之重點項目之一由於利用化學物理 ( 例如 : 吸附凝聚氧化電化學 )[1-3] 等非生物方法進行分解處理時, 仍存諸多缺點 : 如高能量成本高汙泥產量有二次污染之虞等因此基於綠色永續理念, 環境生態友善之生物處理技術, 已成汙染處理之熱點尤其由原汙染場址篩選之本土微生物菌相 ( 株 ) 富集培養來進行降解汙染染料或色素, 取之於自然, 回歸於自然, 更是一種普遍公認綠色友善之處理方法 [4] 工業染料由於生物分解性低, 不易被氧化因此脫色處理多以厭氧條件進行先前研究更發現 [1], 脫色產生之芳香胺中間物具有電子中介作用, 可有效促進染料脫色及電子移轉之能力, 因此更深入探索在 -OH, -NH2, -N(CH3)H, -N(CH3)2 等官能基存在下之電子傳遞能力差異進行比較其中此類中間物於電化學特性上, 具有可逆之氧化還原峰, 亦以此點為指紋辨識指標, 再深入研究脫色代謝物亦可能具有此特性本研究基於環境友善考量, 更進一步深入針對果菜公司可能產生果菜汁廢水進行可行性處理初探研究, 期盼自廢液中取出具有此種特性之成份富集, 再深入應用於染料廢水處理生物刺激上之運用本研究取定有色蔬果個案火龍果為例, 因含有天然色素 - 甜菜苷 (Betanin), 具有天然抗氧化水溶性色彩鮮艷等特性, 因此是極佳研究對象, 若進行處理染料廢水時, 可予以環境友善地添加來促進脫色基於此, 首先自東北台灣本土選定狀圍水域宜蘭大學大學池等三處水體樣本混合菌相, 分別對紅肉火龍果所萃取出之汁液進行初步可行性降解評估研究中發現以狀圍水域混菌確實對火龍果汁液產生有效生物降解, 更發現脫色中間物, 具有促進電子轉移之可逆氧化還原峰之特性更可有效運用於生物電化學方式處理上 ( 例如 : 微生物燃料電池 (MFC)), 並同時應用於染料脫色中, 來有效提升電子轉移速度, 大幅提高其對污染染料降解速度 [5] 本研究發現要有效對火龍果進行脫色, 可能不少微生物皆可進行, 但是論及產生具有可逆氧化還原峰之特性產物, 則僅特定微生物方可行之, 因此本研究更將提出較可行之生物處理操作模式來做實際應用以利於廣泛應用於工業廢水處理之生物刺激相關應用 2. 材料與方法 2.1. 水樣前處理將取得之壯圍水域宜蘭大學大學池三種不同的水體水樣分別取 100ml, 添加 0.1g 紐黴素, 取用 NO.2 試紙進行粗顆粒之初篩取紅肉火龍果 (Hylocereus polyrhizus) 約 200g, 去除果皮後, 將果肉約 170g 研磨成果泥後, 再以高速離心機 (11000rpm 25 15min) 進行離心, 後取其上層液 120ml, 再以 0.24µm 孔徑濾紙濾除顆粒固體, 以利於後續作初步分析 2.3. 微生物前培養將經前處理取得之壯圍水域宜蘭大學大學池三種不同的水體水樣, 分別取 0.5ml 加入預先經滅菌 LB 培養基培養液 50ml, 進行搖瓶 (30 125rpm) 前培養十二小時後活化後, 再以凍管形式保存於 50%(v/v) 甘油, 並庫存於 -85 超低溫冷凍櫃中, 以利後續研究應用 2.4. 搖瓶脫色測試將活化後之菌液取 (1%, 即 0.5ml), 置入含 50ml LB 培養基之搖瓶, 並加入相對於培養基為 1% 5% 10% 含量之火龍果濾汁原液 ( 分別於 0.5ml 2.5ml 5ml) 後, 以 rpm 條件下搖瓶培養 6 小時後, 開始靜置脫色至其脫色, 並追踪量測率達 95% 2.5. 循環伏安法分別針對本脫色菌液原果汁液, 以及脫色完之濾菌上清液, 進行高速離心 (11000rpm 25 10min) 取其上澄液, 利用循環伏安法掃描電位之特色搜尋氧化還原電位, 確認氧化還原電位後, 將液體備份保存, 由峰電位與峰電流的變化情形來推測電化學特性, 作為是否有促進電子轉移的電子梭可能應用性 ( 掃描範圍 0.4~ - 0.6V; 掃描速率 10 mv s -1 ; 循環次數 3 cycles) 3. 結果與討論 3.1. 定性分析比較表 1 三種水樣 (a) 分別對火龍果汁液進行脫色 (b) 經 1% 火龍果汁液馴養後分別對 1% 火龍果汁液進行脫色 (c) 經 1% 火龍果汁液馴養後分別對 5% 火龍果汁液進行脫色 (d) 經 5% 火龍果汁液馴養後分別對 10% 火龍果汁液進行脫色之分析比較 (a) 大學池 Xu +/- +/- +/- Xu+ 火龍果汁液 ( 未脫色前 ) Xu+ 火龍果汁液 ( 脫色後 ) +/- +/- ++ (b)1% 1% 大學池 Xa+ 火龍果汁液 ( 脫色後 ) +/- +/- +/- 1% 1%(PBS) Xa+ 火龍果汁液 ( 脫色後 ) +/- +/- +/-

3 118 袁任宏等 : 火龍果脫色代謝物應用於染料脫色之可行性評估 (c)1% 5% 大學池 Xa+ 火龍果汁液 ( 脫色後 ) +/- +/- +/- 1% 5%(PBS) Xa+ 火龍果汁液 ( 脫色後 ) +/- +/- ++ (d)5% % 10 10% 大學池 Xa+ 火龍果汁液 ( 未脫色前 ) - - NT Xa+ 火龍果汁液 ( 脫色後 ) +/- +/- NT 5% 10%(PBS) Xa+ 火龍果汁液 ( 未脫色前 ) - - NT Xa+ 火龍果汁液 ( 脫色後 ) +/- +/- NT ++ 表具脫色能力且有氧化還原峰 - 表無氧化還原峰 +/- 表具脫色能力但無氧化還原峰 Xu 表未經火龍果汁液馴養 Xa 表已經火龍果汁液馴養 NT 表未試驗 * 火龍果汁液 LB 培養基無氧化還原峰圖 1 三種水樣 (a) 分別對火龍果汁液進行脫色 (b) 經 1% 火龍果汁液馴養後分別對 1% 火龍果汁液進行脫色 (c) 經 1% 火龍果汁液馴養後分別對 5% 火龍果汁液進行脫色 (d) 經 5% 火龍果汁液馴養後分別對 10% 火龍果汁液進行脫色之分析比較 ( 箭頭所指為 E 0 約 V) 圖 2 壯圍混菌經添加 1% 5% 火龍果汁液脫色後之循環伏安圖 E 0=(Epa+Epc)/2, (vs.sce) (1) n c =( Epc-Epa )/57(mV) (2) E 0 應介於主要電子供體與與最終電子受體之間, 才具備電子轉移之功效, 而 NADH 的氧化還原電位是 -0.32V(vs. NHE), 因此氧化還原電位需高於 -0.32V 方具備從生物體上轉移電子之能力 [6] [7] 而公式 (2) 為電子轉移 n c 之值為 2.3 與文獻 [8] 例如 :Azure A(2.94) > 火龍果脫色代謝物 (2.3)>Azure C (2.05)>Thionine (1.16) 表 1(a) 可判斷就單純三處水源混菌以 LB 培養基活化後, 所生代謝物並不具電子移轉氧化還原峰亦即原生菌本身並不具有電子梭物質之可能, 表 1(b) 則可看出以三處水源混菌對添加相對其 LB 培養基 1% 火龍果汁液行脫色, 其脫色代謝物, 僅狀圍混菌對火龍果汁液行脫色後之脫色代謝物可能具些微氧化還原峰此結果有可能是火龍果汁液添加濃度不足脫色, 因此提高劑量至少需達到 5% 汁液再次進行測試表 1(c) 及圖 2 中可知, 當火龍果汁液添加至 5% 後, 狀圍混菌對火龍果汁液行脫色後之脫色代謝物其氧化還原峰更為明顯, 因此可知添加劑量實是一重大因素但是大學池兩者混菌添加在火龍果汁液 5% 脫色, 其

4 Science Discovery 2016; 4(2): 脫色代謝物卻不具備氧化還原峰表 4 更指出添加火龍果汁液達 10%, 大學池兩者其脫色代謝物仍不具氧化還原峰上述之結果可知, 以狀圍混菌對火龍果汁液 5%, 進行脫色之代謝物確實具有顯著氧化還原峰而且若脫色汁液欲顯出顯著電子轉移特性, 仍須有相當劑量反應才能起作用, 亦即至少含量要達到一臨界閥值以上, 所分解代謝物才能有顯著氧化還原峰特性, 以利於後續染料廢水之相關應用表 2 不同菌種添加 5% 火龍果後之脫色反應 WLP72 BYm30 RB h +, 0.3h h h +, 0.3h h ++ RBk5 0.25h +, 0.3h h h +, 1.25h h ++ RG h +, 0.3h h h +, 1.25h h ++ RR h +, 0.3h h h +, 1.25h h ++ DY h +, 0.3h h h +, 1.25h h ++ ZMd31 NIU01 RB160 12h +, 24h ++ 12h ++ 1h ++ 1h +, 2h ++ RBk5 24h -, 36h ±, 60h ± 24h +,36h ++ 1h ++ 1h +, 2h ++ RG19 36h ±, 48h ±, 60h ± 36h + -,48h ++ 1h ++ 1h +, 2h ++ RR141 48h ±, 60h ± 48h +,60h ++ 1h ++ 1h +, 2h ++ DY86 36h -, 48h + -, 60h ++ 36h + -,48h ++ 1h ++ 1h +, 2h ++ YTl1 RB h h +,1.75h ++ RBk5 3.5h +, 4.5h h ++ RG19 3.5h + -, 5 +, 7h h +, 5h ++ RR141 4h + -, 5h +, 6h ++ 4h +, 5h ++ DY86 4h + -, 5h +, 6h ++ 4h +, 5h Color removal > 95% + Color removal ca.75% + - Color removal ca.50% ± Color removal ca.25% - Insignificant color removal 在以化學結構眼光來看, 文獻 [5] 指出, 若於苯環羥基的鄰位或對位下, 具有官能基 ( 如羥基或胺基 ) 當接受端, 能接受在苯環內的自由電子或正電荷, 且能以共振形式使電子得以有效轉移並傳遞, 即具備成為電子梭之基本條件由文獻 [9] 火龍果主要成分色素 Betanin 的可能代謝降解途徑中, 推測可能產生 Betanidin Isobetanidin cyclo-dopa 三種化合物, 本研究推論可能具有電子梭之條件, 因 -OH 官能基鄰位存在可能具氧化還原峰之能力, 後續研究將再深入 GC-MS 進行解析比對, 判斷是何種物質可能是狀圍混菌圖 3 Betanin 降解可能途徑圖 [9] 對火龍果汁液進行脫色反應後之脫色代謝物可能電子轉移之產物 (betanin 不具氧化還原峰, 數據未列 ) 根據先前研究 [10], 添加具電子梭效果之脫色中間物後, 菌株對染料之脫色效率可有明顯提升, 表 5 更得知除 NIU01 YTl1 外, 其於菌株在添加過脫色中間物後, 其脫色效率皆明顯提升而由表 2 得知菌株對染料脫色難易為 (RB160>RBk5>DY86 RG19>RR141), 與文獻 [11] 中表 1, 染料 RB160 最易脫色, 而 RR141 則較難脫色現象相符在文獻 [12] 中菌株 ZMd44 之染料脫色 SDR 為 RBu160 (14.62) > RG19 (3.47) > RBk5 (3.40) > RR141 (2.22) ; 菌株 NIU01 之染料脫色 SDR 為 RBk5 (80.9) > RR141 (66.5) > RG19 (23.2), 同樣可看出 RB160 最易脫色, 再者是 RBk5 而在菌株對染料脫色能力大小依序 (Shewanella putrefaciens WLP72> Enterobacter cancerogenus BYm30> Aeromonas hydrophila NIU01 > Aeromonas hydrophila YTl1> Klebsiella pneumoniae ZMd31), 文獻 [4] 中菌株 NIU01>ZMd31 對染料 RB160 明顯脫色能力相符 3.2. 狀圍混菌之火龍果應用於脫色處理之成效為深入探討添加脫色中間物之促進效果, 取定與 NIU01 同為 Aeromonas hydrophila[11] 之 YTl1 來進行脫色研究, 發現未經馴養之菌株 YT11, 會產生延滯現象 ( 數據未列 ) 故圖 4 為菌株 YT11 經壯圍混菌的火龍果脫色中間物馴養 12 小時後, 分別添加不同濃度 (5% 10% 15%) 的壯圍混菌之火龍果脫色中間物, 對染料 RR141 進行脫色試驗, 由結果得知其 SDR( 單位 : mg L -1 h -1 ODU -1 ) 為 (15%(8.31) >blank(3.57) 10%(3.19) >5%(2.18)), 代表要促進脫色, 至少劑量需提高至 15%, 能使脫色速率提升 2.33 倍, 有效劑量下發現當添加較高濃度的脫色中間物 ( 具電子梭能力 ) 顯示出脫色速率越快之劑量影響關係如此結果代表於染料廢水處理添加天然有色蔬果生體或微生物, 確實是可行之操作策略

5 120 袁任宏等 : 火龍果脫色代謝物應用於染料脫色之可行性評估圖 4 經壯圍混菌脫色之火龍果脫色中間物添加於經脫色中間物馴養之 YT11 進行 RR141 脫色曲線圖圖 5 經壯圍混菌之火龍果中間物添加於 RR141 之 WLP72 搖瓶培養液之脫色成效圖

6 Science Discovery 2016; 4(2): 由於脫色效率最佳為菌株 WLP72, 因此取定來進行脫色比較, 自圖 5 可發現, 隨著添加之脫色物濃度提升, 對菌種生長抑制效果越強 ( 亦即菌體量下降 ), 但就 SDR 而言為 ( 單位 : mg L -1 h -1 ODU -1 ) 為 (10%(167.84) >15%(96.45) >5%(90.05) >blank(58.22)), 顯示添加脫色代謝物能有效提升降解速率 4. 結論及未來展望以本土大學池兩處水源混菌對火龍果汁液進行脫色, 其脫色代謝物不具氧化還原峰, 只有以狀圍水源混菌對火龍果汁液進行脫色, 且在添加劑量達一定閥值 (5%) 時, 其脫色中間物才具顯著氧化還原峰而其脫色代謝物, 因具備電子梭效果, 可有效提升電子轉移速度, 並提高大多數微生物對污染染料降解速度結果發現菌株 WLP72 BYm30 ZMd31 在添加 5% 濃度之脫色中間物時, 對染料降解具有顯著之提升而菌株 NIU01 YTl1 則產生延滯現象, 與菌株 NIU01 同為 Aeromonas hydrophila 之菌株 YTl1, 搖瓶脫色結果顯示, 添加火龍果脫色代謝物濃度達 15% 可更明顯提升其脫色速率, 但菌體 YTl1 需先經過脫色中間物之適應, 以避免延滯現象而就菌體 WLP72 搖瓶脫色結果顯示, 火龍果脫色代謝物, 雖會抑制菌體生長, 但添加火龍果脫色代謝物確實能有效提升脫色效率未來將進行當菌體 WLP72 達到一定濃度時, 再進行添加染料及火龍果脫色代謝物之搖瓶脫色試驗, 並以 GC-MS 檢測, 確定脫色代謝物中為何種物質, 以及是否具氧化還原峰, 以利用於染料廢水處理致謝感謝科技部計畫 :MOST E MY3 與 MOST E CC3 之經費補助參考文獻 [1] Lin, S. H., Peng, C. F., Continuous treatment oftextile wastewater by combined coagulation,electrochemical oxidation and activated sludge, Volume 30, 1996, p [2] Lin, S. H., Peng, C. F., Treatment of textilewastewater by electrochemical method, Volume 28, 1994, p azo dyes in a sequential naerobic aerobic ystem, Volume 99, Issue 2,2004,p [4] Chen, B. Y., Chen, W. M., Wu, F. L., Chen, R. K., Yen, C. Y., Revealing azo-dye decolorization of indigenous Aeromonas hydrophila from fountain spring in Northeast Taiwan, Volume 39, Issue 5, 2008, p [5] Chen, B. Y., Hsueh, C. C., Liu, S. Q., Ng, I. S., Wang, Y. M., Deciphering mediating characteristics of decolorized intermediates for reductive decolorization and bioelectricity generation, Volume 145, 2013, p [6] Chen, B. Y., Xu, B., Yueh, P. L., Han, K., Qin, L., Hsueh, C. C., Xia, Y., Exploring Microbial Fuel Cell-assisted Bioremediation of Textile Dyes: Energy Conversion, Volume 1, 2015, p [7] Sun, J., Li, W., Li, Y., Hu, Y., Zhang, Y., Redox mediator enhanced simultaneous decolorization of azo dye and bioelectricity generation in air-cathode microbial fuel cell, Volume 142, 2013, p [8] Chen, B. Y., Xu, B., Yueh, P. L., Han, K., Qin, L., Hsueh, C. C., Deciphering electron-shuttling characteristics of thionine-based textile dyes in microbial fuel cells, Volume 51, 2015, p [9] Naoko, K., Jürgen, S., Victor, W., Willibald, S., Formation and occurrence of dopamine-derived betacyanins, Volume 56, Issue 5, 2001, p [10] Xu, B., Chen, B. Y., Hsueh, C. C., Qin, L.J., Chang, C. T., Deciphering characteristics of bicyclic aromatics mediators for reductive decolorization and bioelectricity generation, Volume 163, 2014, p [11] Zhang, M. M., Chen, W. M., Chen, B. Y., Chang, C. T., Hsueh, C. C., Ding, Y., Lin, K. L., Xu, H., Comparative study on characteristics of azo dye decolorization by indigenous decolorizers, Volume 101, Issue 8, 2010, p [12] Chen, B. Y, Zhang, M. M., Changc, C. T., Ding, Y., Lin, K. L., Chiou, C.S., Hsueha, C. C., Xu, H., Assessment upon azo dye decolorization and bioelectricity generation by Proteus hauseri, Volume 101, Issue 12, 2010,p [3] Nuttapun, S., Kanchana, J., Somsak, D., Delia, M. L., Pierre, S., Microbial decolorization of reactive

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10.11648.j.sd.20160403.18 Science Discovery 2016; 4(3): 202-206 http://www.sciencepublishinggroup.com/j/sd doi: 10.11648/j.sd.20160403.18 ISSN: 2331-0642 (Print); ISSN: 2331-0650 (Online) Construction for the Engineering Application-Oriented