生物技术通报 Biotechnology Bulletin 206 市场 pacgfp1-n1 表达载体购自 Clontech 公司 E. 在荧光显微镜蓝光的激发下在 40 和视野 coli DH5α 由本实验室保存显微注射装置由中科下观察绿色荧光蛋白基因表达的情况院水生所自主研制基因

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牝段
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1 生物技术通报 BIOTECHNOLOGY 研究报告 BULLETIN 斑马鱼两种转基因方法的比较柳晓瑜王豪博仇雪梅于旭蓉刘洋王秀利大连海洋大学生命科学与技术学院大连摘要: 对斑马鱼 Danio rerio 的两种转基因方法进行比较分别采用显微注射和电脉冲导入法将携带有 GFP 报告基因的表达载体质粒导入斑马鱼受精卵得出电脉冲最佳导入条件为最适电压 125 V/cm 电阻 50 Ω 最佳导入时期为 1-2 细胞期 min 以及最佳外源基因浓度为 00 ng/μl 利用两种方法均得到转 GFP 基因的斑马鱼而两种方法对比的结果表明显微注射法耗时费力但转基因阳性率高电脉冲法一次可以处理大批量受精卵但转基因阳性率远低于显微注射法关键词: 斑马鱼显微注射电脉冲导入法转基因效率 Studies on Two Methods for Tansgenic Zebrafish Liu Xiaoyu Wang Haobo Qiu Xuemei Yu Xurong Liu Yang Wang Xiuli College of Life Science and Technology Dalian Ocean University Dalian Abstract: This paper compared and research the relative efficiency of gene transfer into zebrafish by microinjection and electroporation. The electroporation conditions field strength of 125 V/cm resistance of 50 Ω optimal period of one and two cell stage min of fertilized fish eggs and foreign DNA concentration of 00 ng/μl were applied for mass gene transfer. We can obtain transenic zebrafish by microinjection and electroporation. The result showed that the microinjection have high positive rate but difficult and time-consuming.while the electroporation can handle a large number of zygotes one time but have low positive rate. Key words: Zebrafish Microinjection Electroporation Transgenic efficiency 自 20 世纪 80 年代首批转基因鱼诞生以来 1 此外反转录病毒介导法 7 脂质体介导法 8 世界范围内掀起了转基因鱼研究的热潮很多实验基因枪法 9 等方法各有优点但也存在诸多不足之室都进行了一系列的转基因鱼的研究 2 目前已处 10 就显微注射法而言虽然转基因阳性率高有多种转基因技术应用于转基因鱼的培育和品种改但对实验者技能要求高需要精密的仪器和设备良其中显微注射应用的最为广泛 1984 年我国耗时费力 11 而相比电脉冲基因导入法虽然其基 1 应用显微注射的方法将人的生长激因导入阳性率低但一次可以处理大批量的卵对素基因注射到了鱼的受精卵原核获得了生长速度实验者技能要求低省时省力 12 本试验使用显微快的转基因鱼之后显微注射技术被广泛应用并注射和电脉冲导入法将外源基因导入斑马鱼的受精科学家朱作言日益改进和完善其次电脉冲基因导入法和精子介导法在鱼类转基因的研究中也被大量使用 Aliye 等应用电脉冲基因导入法将 Cecropins 基因导入青鳉受精卵中得到了少量的转基因个体但检测结果显示这些阳性个体的抗菌活性明显高于对照组应用精子 - 电脉冲导入法则得到了较高阳性率的转基因贝类 4,5 和鲍类 6 卵中对电脉冲导入法所需的条件进行了优化并与显微注射法进行了比较旨在找出电脉冲导入法的最佳导入条件为大批量生产转基因鱼奠定基础 1 材料与方法 1.1 材料斑马鱼 Danio rerio 购自大连香炉礁花鸟鱼收稿日期作者简介 : 柳晓瑜女硕士研究生研究方向生物化学与分子生物学 liuxiaoyu1961@16.com 通讯作者 : 仇雪梅女博士教授研究方向海洋生物技术 xmqiu@dlou.edu.com

2 生物技术通报 Biotechnology Bulletin 206 市场 pacgfp1-n1 表达载体购自 Clontech 公司 E. 在荧光显微镜蓝光的激发下在 40 和视野 coli DH5α 由本实验室保存显微注射装置由中科下观察绿色荧光蛋白基因表达的情况院水生所自主研制基因导入仪 SCIENTZ-2C 购 PCR 反应检测 GFP 基因的整合自宁波新芝生物科技股份有限公司荧光显微镜用普通酚仿抽提法进行 Eclipse 50i 购自尼康映像有限公司 1.2 鱼苗基因组的提取方法转基因鱼的 PCR 检测根据质粒上带有的试验用斑 GFP 基因的序列设计一对引物 G1 5'-CATCCTGATC 马鱼饲养于水族箱中投喂饵料控制温度于 GAGCTGAATG-' G2 5'-GCTCACTTGTACAGCTCA 繁殖时雌雄分开暂养产卵前一天晚上将 TC-' 以提取的转基因胚胎或仔鱼的基因组为模板斑马鱼的喂养及受精卵的获得 1 尾雌鱼和 2 尾雄鱼配对于一孵化盒中并用隔板隔开严格控制光照为即 14 h 光照 10 h 黑暗次日去除孵化盒中隔板让其自然产卵表达载体的大量扩增与线性化将 pacgfp1- N1 转化大肠杆菌 DH5α 感受态细胞大量扩增提取质粒并用 Ase Ⅰ线性化载体用紫外分光光度计反应体系 25 µl 在 0.2 ml PCR 管中加入以下溶液 10 PCR buffer 2.5 µl dntp 2 µl Taq 酶 0.2 µl 基因组 DNA µl 上下游引物各 1 µl ddh2o 15. µl 反应程序 94 预变性 5 min 94 变性 0 s 52 退火 1 min 72 延伸 0 s 28 个循环最后 72 延伸 7 min 1% 琼脂糖凝胶检测扩增结果测定浓度定量到 200 和 00 ng/μl 个不同 2 浓度保存于 -20 备用 2.1 注射胚胎的成活率 1.2. 显微注射导入外源基因与荧光检测在浓度结果试验对斑马鱼注射胚胎和对照组胚胎的存活率为 ng/μl 的载体质粒中加入微量的酚红溶液用作了统计将本试验分批注射的斑马鱼受精卵和对 0.02 μm 的滤器过滤除菌后装入显微注射针在立照组的受精卵分别培养在 28 曝气的自来水中亲体解剖镜下挑选质量好的受精卵进行显微注射鱼每次产卵为一批以确定显微注射对胚胎存活时间控制在受精后 min 内注射后的受精卵率的影响表 1 为某批次显微注射胚胎存活的情投入的水中培养 48 h 后观察 GFP 基因况其中 1 和 2 为试验组为对照组统计数据的表达情况和成活率表明在囊胚期时试验组斑马鱼胚胎的成活率和对电脉冲转基因试验在做基因导入前须先预照组相比较低之后随着胚胎发育在仔鱼和幼鱼热基因导入仪 min 受精卵用去离子水冲洗 2- 时期与试验组相比成活率并无明显差别但获得的遍在其他条件一定的情况下分别进行脉冲单因成鱼尾数都较少在解剖镜下观察可发现注射后子试验电阻单因子试验导入时期的探索以及随着时间的延长尤其是注射后 8-9 h 囊胚期胚外源基因浓度的单因子试验每次导入试验重复胎大量死亡此后胚胎的死亡变得缓慢到 48 h 约次并设一个对照组 70%-80% 的胚胎存活但与对照组相比发育延迟了电击后约 50 枚受精卵放置于直径 10 cm 的培 2-4 h 孵化率可达到 95% 出膜后 2- d 鱼苗死亡养皿中温度为 28 每 6 h 更换一次水仔鱼孵率不高开始觅食之后鱼苗的死亡率升高与对化 2 d 后开始喂食蛋黄斑马鱼胚胎发育到 48 h 时照组相比并无差别表1 组别实体解剖镜下观察结果注射受精卵数枚囊胚期 8-9 h 受精卵数枚仔鱼尾 48 h 幼鱼尾成鱼尾对照

3 柳晓瑜等斑马鱼两种转基因方法的比较表5 电脉冲导入法条件优化结果外源基因浓度对导入率和成活率的影响外源基因浓度 ng/μl 着电压的升高导入率上升但存活率和孵化率下降.0 0 兼顾导入率和孵化率最适电压为 125 V/cm 脉冲电压单因子试验结果表2 如表 2 所示随脉冲电压对导入率和成活率的影响 2. 绿色荧光蛋白在胚胎中整合的检测脉冲电压 V/cm 育 48 h 后在荧光显微镜下观察图 1 通过蓝光的激发观察到绿色荧光有的胚胎表现为整卵发光电阻单因子试验结果如表所示随着电在上述显微注射和电脉冲导入试验中胚胎发有的胚胎表现为躯体的某些部位发光但随着时间的推移 GFP 的表达逐渐变弱整卵发光的个体在孵化后随着卵黄囊的消失绿色荧光也随之消失阻的逐渐增大相应的电流减小进而导入率减低成活率有所提高就导入率而言最佳电阻值应为 50 Ω 表 2.2. 电阻对导入率和成活率的影响电阻 Ω 导入时期摸索结果在斑马鱼胚胎发育的不同时期进行电脉冲导入试验结果表 4 显示在受精初期导入率较高但成活率低随着时间的 A, B. 受精 25 h 肌肉效应期胚胎 40 C, D. 受精 25 h 肌肉效应期胚胎 A, C 为加蓝色滤光片照片 B, D 为未加蓝色滤光片照片图1 延长成活率提高导入率有所降低但幅度不大表4 导入时期对导入率和成活率的影响 GFP 在斑马鱼胚胎和仔鱼中的表达 2.4 两种方法外源基因表达率的比较比较显微注射和电脉冲导入法的导入率由图导入时间 min 可知就 GFP 基因表达率而言显微注射法明显高于电脉冲法外源基因浓度单因子试验结果外源基因浓度对导入率和孵化率的影响见表 5 当外源基表达率 % = 表达荧光的受精卵或鱼苗的数量转导 GFP 基因后的总胚胎数或总鱼苗数 PCR检测外源基因的整合斑马鱼胚胎基因组 DNA 的提取 % 基因组因浓度由 ng/μl 上升到 200 ng/μl 时导入率 DNA 提取结果如图所示明显的提高当外源基因浓度由 200 ng/μl 上升到 GFP 基因在斑马鱼胚胎中的 PCR 检测结 00 ng/μl 时对导入率影响不大对孵化率而言外果源基因浓度的影响不大胎并且提取基因组根据质粒上携带的绿色荧光蛋选取了有荧光的斑马鱼胚胎和对照组斑马鱼胚

4 生物技术通报 Biotechnology Bulletin 208 白的序列设计引物进行 PCR 检测结果图 4 这与 Inoue 等 1 的研究结果一致 Aliye Sarmasik 显示在 700 bp 左右处有特异性条带大小与质粒等将 Cecropins 抗菌基因通过电穿孔法导入青上描述的 GFP 基因序列的大小一致证明外源质粒 Oryzias latipes 的受精卵中约有已成功整合到斑马鱼的基因组中的晶胚能够存活下来利用 PCR 技术检测发现基因整合率也较低只有大约 5-11 的青鳉具有 Cecropins 抗菌基因 Symonds 等 14 应用精子电脉冲的方法获得了转基因的鲑鱼但表达率相对较高原因可能是鲑鱼卵卵膜较坚韧不容易受到电场的破坏其次采用精子做载体外源基因可通过受精孔随精子一起进入卵子 Buono 等 15 用电脉冲法将 RSVCAT 基因导入斑马鱼的受精卵结果有 68% 图2 显微注射与电转导表达率的比较的个体存活在之后的斑点杂交试验中检测到了 65% 的个体表现出基因转移阳性与之相比上述试验得到的存活个体较少阳性率也偏低其主要原因是试验过程中电压电阻电容的设置分组参数较少使得导入电流偏大或偏小没有找到合适的导入电流从而导致畸形胚胎的出现或导入阳性率极低的情况 1-. 转基因斑马鱼胚胎基因组 4, 5. 对照组基因组 M.λ-Hind Ⅲ Marker 图斑马鱼胚胎基因组提取而显微注射法在本试验中则表现出较高的转基因表达率这也与梁利群等 16 的研究结果一致 1998 年 Garcia-Pozo 等 17 将 CAT lacz GFP 转入金鲷 1-2 细胞期的胚胎中获得了转基因的胚胎和幼鱼通过 Soutern 杂交和 PCR 检测证明外源基因已经整合到鱼苗的基因组上且注射胚胎的成活率较试可达 50% 但对两种方法优缺点作比较发现显微注射虽然阳性率高但对试验人员技能要求较高耗时费力并且导入动作需要在卵膜变硬之前进行斑马鱼受精卵在 40 min 左右细胞开始分裂随之卵膜开始变硬所以显微注射时间很短因此在得到受精卵时可以将其投入较低的水温中低于最适温度以延 1.GFP 基因 PCR 扩增结果 2. 对照组 M.DL2000 Marker 图4.1 PCR 产物的检测结果讨论缓胚胎发育延长注射时间其次显微注射针的硬度和尖锐度决定了胚胎受到的机械损伤程度所以注射使用针的拉制也至关重要而电脉冲导入法尽管阳性率低但一次可以处理大批受精卵省时省力操作简单能够进行大规模基因转移是未两种转基因方法的比较来转基因方法研究的重要方向在上述转基因试验中分别采用了显微注射和.2 电脉冲导入法两种转基因方法通过比较发现显微注射的基因导入阳性率和孵化率均高于电脉冲法 GFP基因在转基因斑马鱼胚胎中的整合与表达 GFP 基因在胚胎发育中整合过程最早从囊胚后

5 209 柳晓瑜等斑马鱼两种转基因方法的比较期开始并且持续了相当长的时间而且能够瞬时 with increased resistance to bacterial pathogens. Mar Biotechnol 表达试验选择处于出膜期胚胎做 PCR 检测在一 : 定程度上说明外源 DNA 整合到受体鱼基因组 DNA 中在显微注射的过程中大部分受精卵属于胞质注射这对外源基因的整合率有一定影响而应用电脉冲法生产转基因泥鳅 18 研究中表明电脉冲 4 胡炜喻达辉汪亚平等. 大珠母贝精于介导外源基因转移研究. 生物工程学报 z : 贾晓平. 南海海洋渔业可持续发展研究 M. 北京 : 科学出版社 200. 法导入的外源基因在受体内的整合行为与用微量注 6 Tsai HJ Laj CH Yang HS. Sperm as a carrier to introduce an 射法导入外源基因基本一致但这种基因导入是否 exogenous DNA fragment into the oocyte of Japanese abalone 能稳定的遗传给后代需要进一步的试验证明此外表达载体所携带的 CMV 启动子特异性不强对外源基因的整合部位和表达时间并不能有效地调控但 CMV 为强启动子能使整合到受体鱼的外源基因大量的转录在本试验中最初观察到荧光是注射后 h 开始表达微弱之后逐渐增强到肌肉效应期时达到高峰在荧光显微镜下观察到有的个体为镶嵌型表达全身布满绿色的斑块有的个体整个卵黄囊发光但随着卵黄囊的消失绿色荧光也消失造成这种结果的原因可能为外源 DNA 未整合到受体染色体上而是以游离形式存在随着胚胎的发育内源的核酸酶会逐渐将其降解殆尽所以这种个体出膜后很少能再观察到荧光 4 结论 Haliotis divorsicolor suportexta. Tralsgelic R : Villalobos P Rojas MV Conejeros P et al. Lipopolyaminemediated transfection of reporter plasmids into a fish cell line. Electron. J Biotechnol : Houdebine LM. The methods to generate transgeneic animals and to control transgene expression. J Biotechnol : 刘志毅相建海周国瑛等. 用基因枪将外源 DNA 导入中国对虾. 科学通报 : 徐美蝓陈松林戴继勋. 鱼类基因转移技术研究进展海洋水产研究 : 吴勇区又军. 鱼类转基因技术综述. 海洋通报 : Hostetler HA Peck SL William MM. High efficiency production of germ-line transgenic Japanese medaka Oryzias latipes by electroporation with direct current-shifted radio frequency pulses. 本研究比较了显微注射和电脉冲导入两种不同的转基因方法并对后者进行了条件摸索和优化得到优化电转导条件为最适电压 125 V/cm 电阻 50 Ω 最佳导入时期为 1-2 细胞期 min Transgenic Res : Inoue K Yamashita S Hata J et al. Electroporation as a new technique for producing transgenic fish. Cell Difer Dev : 以及最佳外源基因浓度为 00 ng/μl 两种方法比较 14 Symonds JE Walker SP Siu FYT. Development of a mass gene 表明显微注射法生产转基因鱼的阳性率和孵化率 transfer method in chinook salmon: optimization of gene transfer by 较高但耗时耗力对试验者技能要求较高电脉 electroporated sperm. Mol Mar Bio Biotechnol 1994 : 冲法适合大规模基因导入导入参数随受精卵的不 15 Buono RJ Linser PJ. Transgenic zebrafish by electroporation. Bio- 同而变化但阳性率和孵化率较低需要进一步研究 RAD Research Report. 16 梁利群孙效文. 转基因超级鲤的构建. 高技术通讯参考文献 Zhu Z Li G He L et al.novel gene transfer into fertilized eggs of 17 Garcia-Pozo S, Béjar J, Shaw M, et al. Effect of exogenous DNA goldfish Carassius auratus. Z Angew Ichthyol :1-4. microinjection on early development response of the seabream 2 Chourrout DG Houdebine L. High efficiency genetransfer in rainbow trout Salmo gairdncri by microinject into egg cytoplasm. Aquaculture : Sarmasik A Warr G Chen TT. Production of transgenic medaka (Sparus aurata). Mol Mar Bio and Biotech, 1998,7(4): 谢岳峰刘东邹钧等. 泥鳅受精卵的电脉冲基因转移. 水生生物学报 : 责任编辑马鑫

材料! 方法! # 基因的扩增及其序列分析

材料! 方法! # 基因的扩增及其序列分析生物技术通报黄艳燕黄靖华卢福芝孙靓彭立新周兴黄日波利用的方法从鼠李糖乳杆菌基因组中扩增到乳酸脱氢酶基因并连接到载体上构建表达质粒将重组质粒转化大肠杆菌重组菌株经诱导表达电泳分析表明在大肠杆菌中实现了表达表达产物的分子量约为同时采用紫外分光光度法测定乳酸脱氢酶的酶活测得重组菌株的乳酸脱氢酶活力为最适反应温度为最适乳酸脱氢酶克隆表达鼠李糖乳杆菌

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生物技术通报 Biotechnology Bulletin 206 市场 pacgfp1-n1 表达载体购自 Clontech 公司 E. 在荧光显微镜蓝光的激发下在 40 和视野 coli DH5α 由本实验室保存显微注射装置由中科下观察绿色荧光蛋白基因表达的情况院水生所自主研制基因