厦门大学学位论文原创性声明本人呈交的学位论文是本人在导师指导下, 独立完成的研究成果本人在论文写作中参考其他个人或集体已经发表的研究成果, 均在文中以适当方式明确标明, 并符合法律规范和厦门大学研究生学术活动规范 ( 试行 ) 另外, 该学位论文为 () 课题 () 的研究成果, 获得

Size: px

Start display at page:

Download "厦门大学学位论文原创性声明本人呈交的学位论文是本人在导师指导下, 独立完成的研究成果本人在论文写作中参考其他个人或集体已经发表的研究成果, 均在文中以适当方式明确标明, 并符合法律规范和厦门大学研究生学术活动规范 ( 试行 ) 另外, 该学位论文为 () 课题 () 的研究成果, 获得"

扶瓜尔佳
7 years ago
Views:

1 学校编码 :10384 分类号密级学号 : UDC 硕士学位论文硝酸甘油对大鼠骨折愈合的影响 Effects of nitroglycerin on bone healing in rats 郭长勇指导教师姓名 : 丁真奇教授专业名称 : 外科学论文提交日期 :2013 年 05 月论文答辩时间 :2013 年 05 月学位授予日期 : 答辩委员会主席 : 评阅人 : 2013 年 05 月

2 厦门大学学位论文原创性声明本人呈交的学位论文是本人在导师指导下, 独立完成的研究成果本人在论文写作中参考其他个人或集体已经发表的研究成果, 均在文中以适当方式明确标明, 并符合法律规范和厦门大学研究生学术活动规范 ( 试行 ) 另外, 该学位论文为 () 课题 () 的研究成果, 获得 ( 金 ) 课题 () 经费或实验室的资助, 在 () 实验室完成 ( 请在以上括号内填写课题或课题组负责人或实验室名称, 未有此项声明内容的, 可以不作特别声明 ) 年月日声明人 ( 签名 ):

3 厦门大学学位论文著作权使用声明本人同意厦门大学根据中华人民共和国学位条例暂行实施办法等规定保留和使用此学位论文, 并向主管部门或其指定机构送交学位论文 ( 包括纸质版和电子版 ), 允许学位论文进入厦门大学图书馆及其数据库被查阅借阅本人同意厦门大学将学位论文加入全国博士硕士学位论文共建单位数据库进行检索, 将学位论文的标题和摘要汇编出版, 采用影印缩印或者其它方式合理复制学位论文本学位论文属于 : ( )1. 经厦门大学保密委员会审查核定的保密学位论文, 于年月日解密, 解密后适用上述授权 ( )2. 不保密, 适用上述授权 ( 请在以上相应括号内打或填上相应内容保密学位论文应是已经厦门大学保密委员会审定过的学位论文, 未经厦门大学保密委员会审定的学位论文均为公开学位论文此声明栏不填写的, 默认为公开学位论文, 均适用上述授权 ) 声明人 ( 签名 ): 年月日

4 摘要目的 : 一氧化氮 (NO) 在骨折愈合的过程中发挥重要作用, 有研究显示提高 NO 浓度有促进成骨作用, 但尚无相关文献报道提高 NO 浓度是否能对骨折愈合产生影响本实验通过使用 NO 载体类药物硝酸甘油, 观察提高 NO 浓度对大鼠骨折愈合的影响方法 : 选取 54 只健康雌性 SD 大鼠, 采用开放截骨骨折模型, 造模成功后随机分为三组,A 组为空白对照组 B 组予硝酸甘油 0.2mg/Kg/d 涂抹 5 周 ( 低剂量组 ) C 组予硝酸甘油 1.2mg/Kg/d 涂抹 5 周 ( 高剂量组 ) 各组于术后 2 5 周行 X 线检查, 对骨痂生长情况进行评估, 并采用盲法进行骨折愈合评分 X 线检查完毕后, 每组随机处死 6 只大鼠行 Micro-CT 评估, 检测参数包括 : 骨小梁体积 (BV) 样本的体积 (TV) 及骨体积分数 (BVF) Micro-CT 扫描完毕后的样本继续行组织学分析, 使用 Image-pro 软件测量各组样本骨折端骨小梁密度术后 5 周处死剩余大鼠, 留取股骨标本行三点弯曲力学实验, 对比各组骨痂生物力学强度所得实验数据采用 SPSS17.0 统计学软件分析结果 :8 只大鼠由于内固定失效死亡等遭剔除并重新补充 (1) 放射学检查 : 术后 2 5 周可见低剂量组骨痂生成量均比对照组及高剂量组多, 高剂量组骨痂生成量明显不足三组骨折愈合评分对比均有显著性统计学差异 (P<0.05) (2)Micro-CT: 术后 2 周及 5 周低剂量组 TV BV BVF 的定量值较其他两组高, 而高剂量组 TV BV 及 BVF 值最低, 三组对比有显著的统计学差异 (P <0.05) (3) 组织学检查 : 术后 2 周低剂量组较其他两组形成更多的骨小梁, 高剂量组骨小梁生长稀疏, 术后 5 周低剂量组骨小梁融合成片, 有大量的编织骨形成, 高剂量组骨小梁较 2 周致密, 无编织骨形成软件分析比较三组间的骨小梁密度值, 结果显示术后 2 5 周组间均有有显著性统计学差异 (P<0.05) (4) 生物力学检测 : 术后 5 周低剂量组的最大载荷高于对照组 6.4%, 两组数据比较无显著性差异 (P>0.05) 而对照组的最大载荷高于高剂量组 58%, 两组数 I

5 据比较具有显著性差异 (P<0.01) 结论 : 1 硝酸甘油作为 NO 载体能影响大鼠骨折的愈合 2 低剂量的硝酸甘油能增加骨小梁的密度, 有益于大鼠骨折的愈合 ; 高剂量的硝酸甘油会显著降低骨痂愈合的强度, 抑制大鼠骨折的愈合关键词 : 一氧化氮, 硝酸甘油, 骨折愈合, 大鼠模型 II

6 Abstract Objective :NO plays an important role in the process of fracture healing. To our knowledge, there has been no study to date on the assess the effectiveness of NO on bone healing. The purpose of this study was to identify the impact of NO via donor nitroglycerin(ng) on the bone healing in rats. Methods:Fifty-four female S-D rats, aged twelve weeks, were enrolled in this study.the open osteotomy model was choosen.the rats were then randomly assigned to three groups, Group A were treated with placebo, Group B were treated with NG(0.2mg/Kg/d) after surgery, Group C were treated with NG (1.2mg/Kg/d) after surgery. Bone callus and average healing scores were evaluated by radiographs in 2,5 weeks after operation.six rats of every group were killes at 2, 5 weeks after radiographs and checked with micro-ct,the parameters of micro-ct included BV,TV,BVF.Subsequently,the specimen were performed with histomorphometry, to evaluate the density of mean trabecular plate of each group. 6 rats of every group at five weeks were killed and the bones were tested mechanically by a three-point bending test.the results of group were compared with each others. All results were analysed with statisical software SPSS Results:Eight rats had to be eliminated due to failure of fixation and death before the study endpoint.then, we supplement the rats again. (1)Radiological examination:x-ray film of 2,5 weeks after operation of fracture showed the bone callus in low-does groups were more plentiful than other groups.while,the callus of high-does groups grew later and less. The average fracture healing score of group were shown to be significantly differences between with three groups(p<0.05). (2)Micro-CT:In the low-does groups,tv BV and BVF was higher than the others at 2 weeks and 5 weeks.in the high-does groups,the values of these parameters were lowest.there were significant differences in groups at 2 weeks,5 weeks(p< 0.05). VI

7 (3)Histological examinations:compared with other groups, the low-does groups got more the formation of trabeculae at 2,5weeks. The trabeculae bone grew very sparse in high-does groups. the bone trabeculae density showed there were statistically significant differences between with three groups(p<0.05). (4)Biomechanics test:at 5 weeks, the maximum load of the low-does groups was higher than the control groups as percentage as 6.4%, there were no significant difference between two groups (P>0.05).While, the control groups was higher than the high-does groups as percentage as 58%.The biomechanics date showed there were statistically significant differences between with them (P<0.05). Conclusion : 1 NG can affect on the bone healing in rats. 2 The low-does NG can improve the volume of the bony callus after fracture,which is beneficial to fracture healing ; The high-does NG is significantly reduce callus growth,delay fracture healing and increase the rate of nounion. key words: NO,nitroglycerin,fracture healing,rat model VII

8 目录中文摘要... I 英文摘要... Ⅳ 第一章前言... 1 第二章材料与方法试剂与仪器实验主要试剂实验主要仪器实验动物建立大鼠骨折模型分组及干预措施观察指标及方法一般情况影像学观察 Micro-CT 检测组织学观察生物力学测定统计学处理... 7 第三章结果一般情况放射学结果 Micro-CT 测定结果组织学检测生物力学检测结果第四章讨论动物骨折模型的制作 VI

9 4.2 大鼠骨折愈合评价标准给药途径及剂量的选择硝酸甘油对骨折愈合影响的机制展望与不足第五章结论附录参考文献致谢 VII

10 Table of Contents Abstract in Chinese... I Abstract in English... Ⅳ Chapter 1 Introduction... 1 Chapter 2 Materials and Methods material and equiment experimental materials experimental equipments Experimental Animals Fracture model Group and intervention Main Outcome Measures General Condition X-ray Anaylysis Micro-CT Anaylysis Histological analysis Biomechanical testing Statistical Anaylysis... 7 Chapter 3 Results analysis General Condition Analysis X-ray Anaylysis Micro-CT Anaylysis Histological analysis Biomechanical testing Chapter 4 Discussion Fracture model of the rats VIII

11 4.2 Assessment of bone healing in rats Route of administration and dosage The mechanism of nitroglycerin on bone healing Future perspectives and disadvantages Chapter 5 Conclusion Appendix References Acknowledgement IX

12 第一章前言第一章前言骨折是一种十分常见的创伤, 尽管能自我修复, 但愈合时间漫长随着人口老龄化及高能量创伤的增加, 骨折延迟愈合及不愈合发生率逐步增高, 研究报道有 5%~20% 的骨折患者会发生延迟愈合或者不愈合 [1] 因此, 如何能缩短骨折愈合时间提高骨折愈合率至关重要当前促进骨折愈合的药物主要为骨形成蛋白 (BMP) 等细胞因子 BMPs 能刺激骨髓干细胞及前体细胞的有丝分裂, 并促使其向成骨细胞分化 [2, 3],BMP-2 及 BMP-7 已经分别在 2002 及 2001 年被 FDA 批准用于临床但 BMP 促进骨折愈合的最佳治疗剂量不明确,BMP 的并发症如异位骨化潜在的致癌性等受到越来越多的关注, 临床上使用仍受限制 [4] 其他的细胞因子如血小板来源生长因子转化生长因子 -β(tgf- β) 胰岛素样生长因子 -1 血管内皮生长因子 (VEGF) 及纤维细胞生长因子等虽具有明显的骨诱导作用 [5-7], 但由于昂贵的费用及疗效的不确切性, 目前只限制于基础研究如何找到安全有效价格低廉的药物依旧是一个难题一氧化氮 (NO) 是一种结构简单分布广泛的信息分子, 参与体内众多生理病理过程它是由 L- 精氨酸在一氧化氮合成酶 (NOS) 的催化下与氧分子作用形成 NOS 是体内 NO 合成的限速酶,NOS 有三种不同的表型, 分别为神经型 NOS (nnos) 内皮型 NOS(eNOS) 及诱导型 NOS(iNOS) 研究证明 NO 在组织修复过程中发挥重要作用 NOS 广泛存在于骨骼系统, 有研究显示在骨折后 24 小时内可观察到 inos 的表达, 其表达与初始炎性反应的阶段一致, 随后 enos 的表达也逐渐增多, 而在正常的骨皮质未能检测到 NOS 的表达 [8, 9] 体外实验证实在骨折的愈合过程中 NO 的合成可以刺激 BMPs 等生长因子的表达 [10], 增强成骨细胞的活性 [11], 促进局部血液循环及毛细血管的生成 [12], 而且 NO 能通过多条途径促进软骨细胞肥大 [13], 还有的学者认为机械应力诱导的新骨形成, 有部分是通过 NO 诱导的 [14-16] [8] 有文献报道增加 NO 的合成有促进成骨的作用 Diwan 等在不同组的大鼠截骨断端分别放置单纯壳聚糖或携带 10µmolNO 的壳聚糖, 术后 17 天发现使用 1

13 第一章前言 [17] NO 组的大鼠骨痂横截面积增大 20% Sinha 等发现在兔的尺骨截骨模型中, 增加赖氨酸与精氨酸等 NO 合成的原材料, 能促进截骨端的血管生成及骨基质的 [18] 矿化 ;Baldik 等在骨缺损的大鼠模型实验中移植物携带 NO 供体的亚硝基牛血清白蛋白, 结果显示其成骨水平明显好于未携带 NO 供体的骨缺损大鼠 CJ Wang [19] 等用微波治疗骨折不愈合的患者, 监测不同时间段 NO TGF- β1 VEGF 及 BMP-2 等实验指标, 结果发现只有术后 1 个月血清 NO 水平明显升高的患者, 在 6 个月后能成功愈合以上证据显示提高 NO 合成可能有利于骨折的愈合, 但尚缺乏有关 NO 载体类药物应用于骨折愈合的动物实验研究硝酸甘油作为 NO 的最常使用的载体类药物, 是防治冠心病心绞痛的特效药品之一近年来发现硝酸甘油等心血管药物有益于骨的代谢调节 [20, 21] 因其价格低廉副作用少用药方法简单, 而且作为 NO 载体类药物能较为稳定的维持 NO 的血液浓度, 因此本研究拟使用硝酸甘油观察对大鼠骨折愈合的影响 2

14 第二章材料与方法第二章材料与方法 2.1 试剂与仪器 2.11 实验主要试剂试剂硝酸甘油软膏注射用青霉素钠 80 万单位 / 支速眠新注射液 2ml/ 支盐酸氯胺酮注射液 2ml/ 支产地加拿大 Paladin 公司福建汇天生物药业有限公司吉林省华牧动物保健品有限公司福建古田药业有限公司 0.9% 氯化钠注射液 500ml/ 袋青岛华仁药业股份有限公司 0.5% 碘伏 250ml/ 瓶福清安阳消杀药械有限公司 75% 酒精 500ml/ 瓶江西草珊瑚消毒用品有限公司 2.12 实验主要仪器仪器名称 X 线摄片机 ( 日本 ) 万能力学材料试验机 Micro-CT( 中国 ) 光学显微镜 ( 德国 ) Image-pro5.0 软件厦门东南附属医院放射科提供南方医科大学生物力学重点实验室广州中科恺盛医疗科技有限公司厦门东南附属医院病理科提供 SPSS17.0 软件组织学图片分析软件统计学分析软件 2.2 实验动物选取 12 周营养状况良好的成年雌性 Sprague-Dawley(SD) 大鼠 54 只, 体重 g(250±15g) 所有大鼠均由厦门大学实验动物中心提供, 许可证号 : 3

15 第二章材料与方法 SYKK( 闽 ) 建立大鼠骨折模型 [22] 参考 Zhu, W 等方法制作大鼠骨折模型麻醉方式采用速眠新 (10mg/kg) 与氯胺酮 (50mg/kg) 混合肌肉注射, 麻醉满意后将大鼠固定于手术台, 右侧股骨备皮并常规消毒铺巾沿髌骨内侧做一长约 1cm 的切口, 顺着髌骨内侧缘切开内侧支持带, 将髌骨向外翻转, 暴露股骨髁, 选取股骨髁间偏前为进针点, 予 10ml 注射器针头行开口, 后采用 1mm 直径克氏针沿着开口逆行插入髓腔直至针尖触及股骨大转子固定牢靠后, 紧贴关节面剪断针尾取股骨外侧中段为手术入路, 做一长约 2cm 切口, 沿着肌间隔钝性分离暴露股骨, 于中段处以锋利骨剪横行剪断股骨, 逐层缝合切口 ( 图 2.1) 术后送至影像中心行 X 线透视, 剔除非中段横行骨折模型大鼠图 2.1 骨折模型制作简易模拟图 :110ml 针头开口 2 逆行插入克氏针 3 锋利骨剪剪断股骨中段 2.4 分组及干预措施将所有已造模成功的大鼠采用随机方法分为三组, 其中 A 组 18 只, 为对照组, 单纯骨折模型, 不作处理 ;B 组 18 只, 为小剂量组硝酸甘油组, 剂量为 0.2mg/Kg/d;C 组 18 只, 为高剂量硝酸甘油组, 剂量为 1.2mg/Kg/d 药剂均匀 4

16 第二章材料与方法涂抹于大鼠的背部皮肤, 面积为 7.5cm 2, 连续使用 5 周所有大鼠术后给予肌肉注射 80 万单位青霉素钠, 术后让其在笼内自由活动, 常规使用碘伏对切口进行擦拭消毒, 定期更换垫料并进行消毒, 所有大鼠均在解放军一七五医院实验动物中心饲养 2.5 观察指标及方法一般情况术后观察大鼠的生命征手术切口愈合情况及肢体活动情况, 记录造模失败的资料影像学观察术后第 2 5 周将所有大鼠进行 X 线摄片, 投照体位要求 : 仰卧位, 右侧股骨屈髋屈膝尽量成 90 角曝光条件 :45KV,1KV, 间隔 0.08s,50mA 根据 X 线影像学资料评估其骨折愈合情况, 骨折愈合评分指标参考 Garrett 等 [23] ( 表 2.1) 提出的 X 线评分系统采用盲法及随机方法, 由三位经验丰富的骨科医师进行评分, 所得的结果进行组内相关系数检验分析, 当评测信度系数大于 0.75 时认为组间一致性良好, 取平均值为样本的单次评分而系数低于 0.75 时则认为组间一致性欠佳, 需重新进行评估 Micro-CT 检测术后第 2 5 周, 行 X 线检查后的大鼠每组随机选取 6 只并处死, 留取右侧股骨, 拔出股骨髓内克氏针, 仔细剔除周围软组织, 同时注意保护骨痂, 切取中段的骨组织置于 10% 福尔马林溶液固定, 固定 24-48h 后行 Micro-CT 检测将样本置于 Micro-CT 系统中, 沿标本的长轴方法扫描, 能量设为 55KVP, 电流设为 145uA, 间隔 200ms, 获取连续的 Micro-CT 图像扫描完成后在主机上手动圈出兴趣区域 (range of interests,roi), 兴趣区范围为骨折部位上下 5mm 由于不同的组织衰减系数范围不一样, 我们设定衰减系数范围在为新生骨及钙化的软骨, 内为高密度皮质骨, 而衰减系数小于 225 时则为非矿化组织 5

17 Degree papers are in the Xiamen University Electronic Theses and Dissertations Database. Full texts are available in the following ways: 1. If your library is a CALIS member libraries, please log on and submit requests online, or consult the interlibrary loan department in your library. 2. For users of non-calis member libraries, please mail to etd@xmu.edu.cn for delivery details.

2

10384 -------- 9601008 UDC---------------------- 1999 1999 1999 ------------------------ ------------------------ 1 2 .4...4 7 14.14..18..22..22..24 3 4.27.32.39 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 5 12 6 1 2 3 4