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夕杖范
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1 ICS B 01 DB37 山东省地方标准 DB 37/T 德州驴冷冻精液生产技术规程 Technical Specification for Dezhou Donkey Frozen Semen Producing 发布实施山东省质量技术监督局发布

2 前言本标准按照 GB/T 给出的规则起草本标准由山东省畜牧兽医局提出本标准由山东省畜牧业标准化技术委员会归口本标准起草单位 : 山东省农业科学院奶牛研究中心山东天龙牧业科技有限公司山东省畜牧总站山东奥克斯生物技术有限公司本标准主要起草人 : 王长法高运东张燕张思聪王玲玲朱涛涛张瑞涛黄金明仲跻峰侯明海王银朝闫金华沈善义 I

3 德州驴冷冻精液生产技术规程 1 范围本标准规定了公驴要求冷冻精液生产的术语和定义器械清洗和消毒离心液及稀释液配制采精精液处理精液冷冻冻精解冻冻精活率检查和检验规则包装贮存及运输本标准适用于德州驴冷冻精液生产, 其它品种驴冷冻精液生产可参照执行 2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的凡是注日期的引用文件, 仅所注日期的版本适用于本文件凡是不注日期的引用文件, 其最新版本 ( 包括所有的修改单 ) 适用于本文件 GB/T 5458 液氮生物容器 GB/T 德州驴 NY/T 牛冷冻精液生产技术规程 3 术语和定义下列术语和定义适用于本文件 3.1 德州驴 dezhou donkey 原产地为山东省鲁北平原沿渤海各县肉挽兼用的大型地方驴品种 3.2 德州种公驴 dezhou jack 符合 GB/T 中种用标准且等级评定二级以上的公驴种公驴体质健康, 性能力旺盛, 生殖系统无异常, 无传染性疾病种公驴外周血检测染色体正常无遗传性疾病 3.3 台驴 teaser jenny 能引诱德州公驴性欲勃起以供其爬跨的同种动物或模型 3.4 假阴道 artificial vagina 1

4 模拟母驴阴道环境条件人工制作的采精器具其形状呈圆筒形, 由外壳内胎内衬和集精杯等组成, 主要部件构造与牛用的基本相同, 但大小有别外壳长约 55 cm, 形似暖水瓶, 内径 14 cm; 中部有 15.5 cm 长的手柄, 便于采精时把握 ; 侧面有注水孔采精杯为一广口不锈钢保温杯, 容量 300 ml 3.5 原精 raw semen 采集后未经离心稀释的精液 3.6 精液品质检查 semen examination 鉴定精液质量的一种手段, 即对影响精液质量的各项指标进行检查分析 3.7 精液离心液 semen centrifugate 保护精子在离心时不受损伤延长其存活时间的液体 3.8 精液稀释液 semen diluent 保护精子延长其存活时间及增加精液容量的液体 3.9 细管冻精 straw frozen semen 精液冷冻类型之一, 将精液分装到塑料细管中进行冷冻保存, 常用的为 0.5 ml 4 器械清洗和消毒 4.1 玻璃器皿的清洗和消毒参照 NY/T 的 4.1 执行 4.2 假阴道的清洗假阴道的清洗参照 NY/T 的 4.2 执行内胎的清洗 : 使用后的内胎可用加有家用洗涤剂的 30 ~40 温水洗涤正反两面, 洗去表面的润滑剂, 并用自来水清洗 3 遍 ~5 遍, 至冲洗干净, 再用蒸馏水逐个冲洗 3 遍 ~5 遍用两个吊在厨柜顶部的夹子对称夹住内胎一端, 光滑面向内, 使内胎垂直悬挂在厨内晾干不得在阳光下曝晒或在干燥箱中加热干燥不宜将内胎平放在盒内或袋内内胎应挂在厨柜内, 直到下次使用时取出使用前, 用 75 % 酒精棉球消毒内胎内壁 4.3 其它器械的消毒制作冷冻精液所用的器械事先要进行消毒漏斗金属镊子药匙胶塞和吸管胶头等都用 75 % 的酒精棉球擦拭消毒, 待酒精挥发尽后方能使用, 细管用冷冻架, 使用前放置在紫外灯下消毒 30 min 2

5 4.4 载玻片和盖玻片的清洗检查精液质量时所使用的载玻片和盖玻片, 用后应立即浸泡于 75 % 酒精中, 清洗后用洁净的纱布擦拭干净备用 4.5 纱布的清洗消毒生产用的纱布在使用后要定期进行清洗消毒塑料细管细管包装用塑料管及纱布袋放置在紫外灯下照射消毒 30 min 后方可使用 5 离心液稀释液配制 5.1 离心液稀释液配方参见附录 B 5.2 离心液稀释液配制方法稀释用水配制离心液稀释液应使用双蒸水或超纯水 (18.2 兆欧 ) 药品称取及保存称量药品应使用万分之一电子天平, 天平应放置在平稳的工作台上, 保持清洁干燥称取药品时, 盘内垫以称量纸, 校零后方可称量称量时应按照使用说明进行操作化学药品称量取用后, 应立即将瓶口盖严, 以免灰尘杂菌等污染, 防止分解和潮解称量时药匙应一对一使用卵黄的取用参照 NY/T 的执行离心液稀释液的配制所用试剂均为分析纯离心液稀释液的配制步骤如下 : 离心液配制 : 按附录 B 称取 Tirs 柠檬酸和葡萄糖, 放入烧杯中, 用量筒量取双蒸水约 800 ml, 倒入烧杯中, 加入青霉素链霉素, 用磁力搅拌器充分搅拌均匀后, 定容至 1000 ml, 定容后经 0.22 μm 滤器过滤除菌, 置于 4 冰箱中备用, 存放时间不宜超过两周 ; 稀释液配制 : 用量筒取适量离心液, 加入 20 % 卵黄, 用封口膜封好口后, 上下颠倒混匀, 置于 4 冰箱中过夜分层之后, 去除上层泡沫, 将稀释液中层倒入烧杯中, 下层沉淀弃去稀释液经 4000 rpm/min 离心 3 次, 每次 30 min, 去除离心后的稀释液表层杂质及底层沉淀, 取中层倒入盐水瓶或蓝口瓶中, 加入甘油, 用磁力搅拌器充分搅拌均匀后, 置于 4 冰箱中备用, 但存放时间不宜超过 24 h 6 采精 6.1 德州种公驴的要求 3

6 采精前将种公驴全部体表擦拭干净, 阴茎龟头用自来水冲洗干净, 并用蘸有 84 消毒液或者新洁尔灭的消毒毛巾擦干 6.2 采精准备采精场所的要求采精场所应保持宽敞 ( 面积在 100 m 2 以上 ) 安静, 地面保持清洁卫生并铺以防滑设施, 以免种公驴采精时滑倒台驴的准备选择健壮性情温顺无疫病的发情母驴做台驴将台驴保定于采精架 ( 高 80 cm, 长 1.2 m) 内台驴的外阴臀部应擦洗干净, 尾巴用消毒纱布包裹仪器设备的准备预热恒温箱和水浴锅, 使其处于 45 ~50 工作状态, 将采精用具规则地摆放在操作台上, 假阴道润滑剂 ( 可用离心液代替 ) 水浴加热到假阴道的准备安装假阴道前应先洗净双手, 并用 75 % 的酒精消毒在安装假阴道时, 首先将清洁的内胎安装固定在假阴道壁上, 松紧适中, 外套一层塑料薄膜把集精杯安装在假阴道的下端, 上覆 4 层无菌纱布, 并适当固定向内胎内注入 4500 ml~5000 ml 45 ~47 的温水, 内腔温度为 40 ~ 根据公驴阴茎差异, 适当的调整内腔压力和温度, 温度最高不得超过 43 通过气卡向内胎内充气, 使假阴道有适度 ( 假阴道口呈三角形状为宜 ) 的压力, 锁住气卡采精前在假阴道内胎的前三分之二处用消毒纱布均匀涂抹适量离心液 6.3 采精方法采精操作采精时把待采公驴牵到采精室内的台驴处, 阻止其爬胯 2~3 min, 使其阴茎充分勃起采精员右手持假阴道, 假阴道外口端斜朝向地面, 站在公驴右前侧, 待公驴爬跨时, 左手轻扳阴茎, 并与持假阴道的右手配合, 迅速将阴茎引入假阴道中, 假阴道条件适宜, 公驴阴茎抽动并贴紧台驴臂部, 尾根有节奏摆动即开始射精, 完成射精后, 公驴随即而下, 此时, 采精员右手紧握假阴道, 随公驴阴茎而下, 待公驴前肢落地时, 缓慢地把假阴道脱出, 立即将假阴道外口斜向上方, 打开气卡放水, 使精液尽快地流入集精杯内, 然后小心地取下集精杯, 迅速转移至精液处理室安装好的假阴道只能使用一次, 不得重复使用采精频率成年公驴可施行隔日采精一次, 每周采精 3 次 ~4 次采精后的处理采精后应及时清扫场地并用水冲洗干净假阴道等采精器械清洗干净后应尽快消毒 6.4 精液处理准备 4

7 接触精液的器皿 ( 包括离心稀释用玻璃及塑料器材 ) 应提前 2 h 放在 37 恒温箱中, 离心液 ( 配方见附录 B) 提前 2 h 放在 37 恒温水浴箱中备用, 稀释液置于室温备用预处理采集的原精液传递入精液处理室后, 把集精杯放入 34 的恒温水浴箱中精液用 4 层消毒纱布过滤, 然后用肉眼观察原精液的颜色, 正常精液色泽呈乳 ( 灰 ) 白色或淡黄色, 记录原精液量 (ml) 精液质量检查取精液一滴, 滴于载玻片上, 加盖盖玻片, 然后在配有 38 恒温装置的相差显微镜上评定活率活率用百分率表示, 例如 70 % 或 0.7 合格精液的精子活率 70 %( 即 0.70), 镜检活率合格后方可进行稀释密度测定按精液密度测定仪的操作规程准确测定精液的密度, 合格精液的精子密度 ml 根据射精量精子活率密度离心回收率 (80 %), 计算出制作的细管数和应加稀释液用量填写冻精生产记录 6.5 离心稀释封装和平衡向原精液中, 按 1:1 的比例加入离心液, 然后在 22 放置 10 min, 之后按 1850 rpm/min, 离心 15 min, 去掉上清液, 将各离心管中的粥状精液用稀释液进行最后稀释精液稀释按两步法进行 : 先加入最终稀释量的 1/4, 经初步稀释的精液先在 22 下放置 10 min, 然后, 加入剩余的稀释液最终稀释完的精液移入一大的容器内, 用预先按附录 A 的规定打印好的 0.5 ml 细管分装精液, 然后超声波封口把分装后的细管精液放入不透明的开盖的塑料盒内, 再把塑料盒放入 4 的冷藏柜中平衡 3 h~4 h 也可用细管一体机进行分装操作, 可在完成灌装与封口后即刻进行喷墨印字 6.6 精液冷冻上架参照 NY/T 的 8.1 规定执行如同一架上有不同公驴的细管精液, 应分开码放, 两头公驴之间要隔开一些距离, 以免混淆冷冻建议使用全自动冷冻仪使用时首先在电脑中设置好冷冻的最佳温度曲线, 冷冻仪与低温柜应尽量靠近, 开启液氮罐阀门把冷冻仪降温至 4, 关闭风扇电源, 待风扇完全停止后把已排满待冻细管精液的冷冻架迅速放入冷冻仪, 盖严盖子按电脑预先设定好的最佳冷冻曲线程序自动完成冷冻过程如果冻精细管数量不足时, 要填充备用塑料管和细管架以保持最佳冷冻曲线程序自动完成冷冻过程, 确保冻精质量收集冷冻完成后, 打开冷冻容器盖子, 冻精按公驴号投入盛满液氮的不同提筒中, 细管的超声波封口端在上, 棉塞封口端在下, 不得倒置, 以免细管棉塞端的爆脱, 并迅速浸泡在液氮中 6.7 冻精解冻 5

8 按 NY/T 的 9 规定执行 6.8 冻精质量检验冻精质量检验冻精质量检验采用镜检方法冻精镜检所用设备器材和检查方法同合格的种公驴冷冻精液应符合以下标准 : a) 冻精细管无裂痕, 两端封口严密, 印制的标志清晰 ; b) 每管细管冻精保证 0.5 ml 的精液量 ; c) 精子活率 0.35; d) 呈直线前进运动的精子数 ( 有效精子数 ) 0.25 亿 / 支 ; e) 精子畸形率 20 %; f) 细菌菌落数 1000 个不合格冻精应废弃 ; 合格后的冻精方可进行包装细菌菌落数按 NY/T 的 10.2 规定执行每二个月抽检一次检验规则冻精产品的质量应由相对独立的技术人员负责检测与监督, 配种使用前按每头公驴每批号的产品进行外观和活率的检验, 经质检员检验合格并出具合格证后, 才可作为合格品使用每季度对每头公驴的冻精产品型式进行 1~2 次的检验当生产冻精的重要原材料器件 ( 如冷冻仪分装机等 ) 等有重大改变影响到产品质量时必须做型式检验 6.9 冻精包装细管冻精有两种包装方法指姆管包装用细管计数分装机进行包装时, 包装应在 -140 以下的环境中进行, 包装后的细管冻精其棉塞端应在指拇管 ( 塑料管 ) 的底部, 不得倒置指拇管的内径应均匀一致将装有细管冻精的指拇管放入液氮灌中的提筒内纱布袋包装用纱布袋进行包装时, 在其上预先填写冻精内容 ( 生产单位公驴编号支数活率生产日期 ), 浸入液氮预冷后再装入细管冻精, 然后将其放入液氮罐中 6.10 冻精贮存冻精应贮存于液氮罐的液氮中, 贮存冻精的低温容器应符合 GB/T 5458 标准的规定设专人保管, 每周定时加一次液氮, 冻精应始终浸在液氮中冻精保管人员应经常检查液氮罐的状况, 如发现液氮罐外壳结白霜, 立即将精液转移入其它液氮罐内保存包装好的冻精由一个液氮罐转换到另一个液氮罐时, 在液氮罐外停留时间不得超过 5 s 6

9 取存冻精后要盖好液氮罐盖塞, 在取放盖塞时, 要垂直轻拿轻放, 不得用力过猛, 防止液氮罐盖塞折断或损坏移动液氮罐时, 不得在地上拖行, 应提握液氮罐手柄抬起罐体后再移动, 要轻拿轻放, 严禁震荡撞击置于阴暗凉爽处, 并注意室内通风不同个体公驴的冻精可用不同颜色包装加以区别贮存冻精的容器每年至少清洗一次 6.11 冻精运输冻精运输过程中要有专人负责, 液氮罐不得横倒碰撞及强烈振动冻精应始终浸在液氮中 7

10 A A DB37/T 附录 A ( 规范性附录 ) 德州驴细管冷冻精液标记方法细管冷冻精液标记由十八位数四部分组成, 排列顺序如下 : a) 第一部分 : 公驴站代号四位数 ; b) 第二部分 : 品种代号三位数 ; c) 第三部分 : 冻精生产日期六位数 ; d) 第四部分 : 公驴编号五位数第三部分冻精生产日期六位数按年月日顺序排列, 年月日各占二位数字, 年度的后两位数组成年的二位数, 月日不够二位的, 月日前分别加 0 补充为二位数第四部分公驴编号取该驴编号的后五位数部分与部分之间空一个汉字 ( 二个字节 ), 第一第二部分用汉语拼音大写字母表示标记的字迹必须清晰易认标记示例 : 棉塞封口端 SDOX DZL 超声波封口端注 :SDOX 为山东省奥克斯生物技术有限公司代号 ; DZL 为德州驴的品种代号 ; 为 2012 年 3 月 16 日的生产日期代号 ; 为该公驴编号 8

11 B B DB37/T 附录 B ( 资料性附录 ) 德州驴精液离心液和冷冻精液稀释液配方成份及其浓度 B.1 精液离心液配方成份及其浓度见表 B.1 表 B.1 离心液配方 ( 总体积为 1000 ml) 成分含量 Tris g 柠檬酸 18.8 g 葡萄糖 g 甘油 70.5 ml 青霉素 5 万单位链霉素 5 万单位注 : 配置完成后经 0.22 μm 滤器过滤除菌,4 保存, 保存时间不超过 14 d B.2 稀释液配方用量筒取适量离心液, 加入 20 % 卵黄, 用封口膜封好口后, 上下颠倒混匀, 置于 4 冰箱中过夜分层之后, 去除上层泡沫, 将稀释液中层倒入烧杯中, 下层沉淀弃去稀释液经 4000 rpm/min 离心 3 次, 每次 30 min, 去除离心后的稀释液表层杂质及底层沉淀, 取中层倒入盐水瓶或蓝口瓶中, 加入甘油, 用磁力搅拌器充分搅拌均匀后, 置于 4 冰箱中备用, 但存放时间不宜超过 24 h 9

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标准名称 ICS 65.020.01 B 01 DB37 山东省地方标准 DB 37/T 2309-2013 德州驴冷冻精液生产技术规程 Technical Specification for Dezhou Donkey Frozen Semen Producing 2013-04 - 01 发布 2013-05 - 01 实施山东省质量技术监督局