第期赵娜等钙离子对猪精子蛋白酪氨酸磷酸化及活力影响 7,-**%+ +! /-+21,6+/+%+ +0+ /,,/+,1 ,,0+,01,-1-0+,7//+,1/+/, **+0 + +//+,4 1* *,,0 +01, -1-0+,5- -,2- //+,

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亢沿农
7 years ago
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1 第卷第期年月上海交通大学学报农业科学版! "#!$ %!%#%# " 文章编号 (( (((( 钙离子对猪精子蛋白酪氨酸磷酸化及活力影响赵娜甄林青姜红菊严国祥李新红上海交通大学农业与生物学院上海市兽医生物技术重点实验室上海上海市祥欣畜禽有限公司上海摘要研究主要探究钙离子 %+ 对猪精子蛋白酪氨酸磷酸化及活力的作用利用计算机辅助精子活力分析仪 % 检测蛋白免疫印迹测定不同 %+ 浓度对精子活力指标及蛋白酪氨酸磷酸化水平的影响并对精子样品的酪氨酸磷酸化蛋白的分布情况进行观察结果显示当 %+ 浓度 ** 时精子活力和蛋白酪氨酸磷酸化水平增高然而当 %+ 浓度 ** 时则明显抑制精子活力和蛋白酪氨酸磷酸化水平尤其分子量约为和 + 的高丰度蛋白磷酸化程度明显降低高浓度 %+ ** 明显抑制鞭毛处蛋白酪氨酸磷酸化因此细胞外钙离子对猪精子活力和蛋白磷酸化起到重要调节作用低浓度 %+ 促进精子活力及蛋白酪氨酸磷酸化高浓度 %+ ** 抑制精子活力及蛋白酪氨酸磷酸化本研究初步明确了 %+ 浓度对猪精子蛋白磷酸化及精子活力的影响为进一步研究精子获能提供参考关键词 %+ 猪精子活力酪氨酸磷酸化中图分类号文献标识码 2$1"#1#" "$6 $ 54 1!( -+2-+,=0+5+0",+03,/-20/-2,/+3, ,,+2,41,0-+2-+,%-, ,,+26,,41/0%!-+2-+,%-,+!#!-+,* ,//+/,*%+ 1*,01, -1-0+,+*,,0,5+1* *,,0++*17*+11,2/*+11,1 1* ++01,1 %+-401, -1-0+, 7+1 / ,,1,5,01,-1-0+,+21,5+1* ,2,**1///-,! * *,,0 +, 01, -1-0+,7*507//+,1%+ **-/+0+- +,40-,2-//+,1%+ **-1* *,,0!+/4,,+ 4/,0 "%71,2,,/+0/+1 +01,-1-0+, 7+1,-,5, 1/,+0-,-1-0+,-*/+7,2-+5++!-11 +1,,/+-+-,1,5,01,-1-0+, ,2,,/+0/ 收稿日期基金项目农业部公益性行业专项 ( 上海市科技兴农攻关项目沪农科攻字 ( 第号作者简介赵娜 ( 女硕士生研究方向动物繁殖生物技术研究 #*+,:-++40/* 李新红 ( 为本文通讯作者男博士副教授研究方向动物繁殖生物技术 #*+,,6,-21/

2 第期赵娜等钙离子对猪精子蛋白酪氨酸磷酸化及活力影响 7,-**%+ +*! /-+21,6+/+%+ +0+ /,,/+,1* *,,0+,01,-1-0+,7//+,1/+/,* **+0 + +//+,4 1* *,,0 +01, -1-0+,5- -,2- //+,1/+/,***-+4+,-,5,0/!-,1106,/+-2+, %+ //+,15+1*,-1-0+,+1* *,,0,*,+,04,,2+ 1/-/4,2*/+*/-+,1*/++/,+, *"+#%+ 5+1* *,,001,-1-0+, 哺乳动物精子尾部是完成超激活运动及能量! 产生的主要部位其中被称作 ( 轴丝微管和中央微管构成尾部的主体支架亦是完成受精作用的动力源精子与卵子结合之前需要在雌性生殖道内或体外培养过程中发生一系列生理变化即获能过程才能完成受精有研究报道获能是由一系列分子事件组成并把这一系列变化事件分为快速事件和慢速事件其中精子获能过程中蛋白酪氨酸磷酸化的发生被认为是相对较晚的慢速事件亦是精子获能及产生超激活运动的标志性事件精子鞭毛处轴丝和纤维鞘蛋白酪氨酸磷酸化使鞭毛呈高度不对称的快速鞭打运动同时精子头部显现类似字型的运动轨迹促进精子运动使精子获得穿透输卵管粘稠介质和放射冠弹性基质的能力顺利完成受精因此精子鞭毛处蛋白酪氨酸磷酸化对于精子运动非常重要精子靠鞭毛不断的拍打获得前进性运动的能力精子鞭毛中段包含有外周致密度蛋白和线粒体鞘线粒体氧化磷酸化提供能量! 以供精子鞭毛运动鞭毛主段主要包含纤维鞘蛋白最主要的是激酶锚定蛋白例如 = 和 = 它主要通过锚定聚集细胞内信号分子以调节鞭毛拍打和运动方式的改变尾段主要包含轴丝蛋白可见精子鞭毛处不同部位的蛋白酪氨酸磷酸化水平的发生和精子运动密切相关在体外培养过程中介质中存在的 3 % > 和 %+ 等调节因子可以促进精子获能据报道猪精子获能过程依赖于 3% > 和 %+ 的存在而 + 蛋白的酪氨酸磷酸化只依赖于 %+ 另有报道认为 %+ 参与精子获能超激 ( 活运动以及顶体反应等多个过程在与鼠获能相关的蛋白酪氨酸磷酸化过程中细胞内增加的钙离子可以促进蛋白酪氨酸磷酸化也有报道证实细胞内增加的 %+ 对蛋白酪氨酸磷酸化起到相反的作用本研究目的是明确 %+ 在猪精子获能过程中对蛋白尤其是!, 非溶解性蛋白酪氨酸磷酸化的调节作用以期为精子获能机制的研究和猪精子体外获能培养提供参考依据材料与方法试验试剂,-1-01,+,50 和,*1 2 /2+1/+0+,50 购买于 %! 公司 6+ /2+ +,+55, +,50 购买于 4,2 其他试剂无特殊说明均购买于,2*+ 试剂公司, 试验材料及设计试验所用精液样品来自于浦东新区祥欣种猪二场头具有繁殖能力且饲养条件相同的优质杜洛克种公猪采用假母猪模具法诱导采精选取精液颜色为乳白色活力大于顶体完整性超过 ( 的精液样品用于试验条件下快速运回实验室精子未获能培养液或 %+** 氯化钾 ** 磷酸二氢钾 ** 磷酸二氢钠 ** 氯化钠 ** 葡萄糖 ** 丙酮酸钠精子获能培养液 %+ 在未获能液中加入 ** 碳酸氢钠 ** 氯化钙牛血清白蛋白 %+ 培养介质 %+%+ 在未获能培养液中加入不同浓度钙离子 %+ 使细胞内 %+ 终浓度为 ** 本试验分为未获能组获能组和钙离子处理组在设计组别中按照 * 的比例加入精子细胞悬浮液 % 恒温培养箱中培养 - 或按试验设计培养不同时间精子活力测定利用计算机辅助精子活力分析仪 % 分析

3 上海交通大学学报农业科学版第卷精子活力指标精子样品培养后取精子悬浮液于精子活力测试专用载玻片上用 % 测定各处理组精子活力指标精子活力指标主要包括精子能动性 1* *,,0! 平均路径速度 /,0" 平均直线运动速度 1+,2-,4/,0" 和平均曲线运动速度 /4,,+4/,0"% 项指标每个视野观察细胞数不少于个 - 蛋白提取全蛋白提取培养后的预处理精子样品用冷的磷酸缓冲液 3 清洗遍 *,*, 用蛋白裂解液悬浮细胞沉淀沸水浴煮沸 *, 离心 *,*, 后取上清液于新的 # 管中按的比例加入巯基乙醇沸水浴煮沸 *, 冰上冷却后进行蛋白定量操作!, 处理蛋白提取按上述步骤用冷的 3 洗遍 *,*, 后加入!, 裂解液悬浮细胞沉淀冰上裂解 *, 然后离心 *, 弃上清液沉淀部分即为!, 非溶解性蛋白骨架蛋白剩余步骤同全蛋白提取方法提取好的蛋白用 +!-* /,,,/ 分光光度计按照使用说明检测蛋白浓度根据蛋白浓度统一上样量后上样或 >@ 储存备用聚丙烯酰胺凝胶电泳 ((0 " 和蛋白免疫印迹 * 配制分离胶浓缩胶统一上样量为 2 进行电泳和电转移室温封闭 A!3! 3- 将 " 膜,, 浸入适量的一抗溶液振荡孵育过夜再加入抗鼠二抗溶液振荡孵育 - 将化学发光检测试剂盒 #% # 公司 %+ 按使用说明配制好后进行底物孵育 *, 尽量避光操作在暗室中根据条带亮度进行 6 胶片曝光观察并分析条带变化情况 / 免疫荧光试验取精子样品用冷的 3 缓冲液清洗遍 *,*, 后均匀涂于擦拭干净的载玻片上自然风干加入的甲醛固定 *, 洗脱液 3!7 清洗次加入渗透液 3!, 室温渗透 *, 洗脱液清洗次室温封闭 3!7 3 - 按的比例加入一抗孵育 - 再按的比例加入 6+ /2++,+55,+,50 荧光探针室温下避光孵育 - 后加入静置过夜最后用荧光显微镜观察拍照,/+A 7 数据处理试验数据用 #6/ 进行初步整理然后采用软件进行方差分析显著性水平为, 结果分析, 不同钙离子浓度处理对猪精子活力的影响不同浓度 %+ 处理后用 % 测定精子活力当 %+ 浓度为和 ** 时! 增强但并没有达到显著性增加然而当 %+ 浓度为 ** 时! 明显降低 "%" 和 " 表示精子运动速率指标随着 %+ 浓度不断增加 "%" 和 " 增强当 %+ 浓度增加到 ** 时 "%" 和 " 达到最大而当 %+ 浓度为 ** 时 "%" 和 " 明显降低表不同钙离子浓度处理对猪精子活力的影响,$ 2 $$% 精子活力 * *,,0 组别 1! + + (( + ( + ( + 5 " *"1 > (( ( + + ( 5 " *"1 > ( + ( + ( "% *"1 > + + ( 5 + ( + ( 5 注在同一横行中上标小写字母不相同者差异显著下同 +/-7,7/+1,11/,1-71,2,,/+,/1!-1+*,157

4 赵!娜#等钙离子对猪精子蛋白酪氨酸磷酸化及活力影响第 "期 1!不同时间培养对精子活力的影响在未获能介质中添加终浓度为 $: $- 的 #BB % B 时^(3(47- 以及 4,[ 显著性增加! #: #%"%培养时间达到 $"#B 时 4/- 达到显著性 7"n 培养不同时间后测定猪精子活力参数!表 "" 结果表明随着培养时间不断增加^(3( 47-( 4/- 增加! %#: #%"而当超过 $"# B 后^(3( 47-( 4/- 和 4,[ 活力指标基本维持不变和 4,[ 活力指标不断增加当培养时间达表P!1 N>%P^ 培养不同时间对精子活力的影响 X--/ * N$/ % A1 P!J 6 0/, ( =A % / + - >%P^ # 1 X--/ * +0 (- -/ * 7 精子活力 /; B B ^(3$` 时间$B 3 B %!# $"# $%# $A# "#l%: %# =A: =#l%: $! >=: ##l>: "#S >=: "#l!: "S >%: =#l>: %#S >!: =#: #l: A% =": b$ 4,[$! $B4 " %!: #Al: $ %: Al: "> =#: $#l=: A$ =!: %#l=: >S >#: %Al=: "@S =@: ="l: >"S =A: =#l>: $$S b$ 4/-$! $B4 "!#: #Al!:!A!": >"l: >=!=:!l!: %% $: $"l!: >$S : A#l%: >=S b$ 47-$! $B4 " $##: #=l>: A $$#: >la: %@ $$: #Al=: A% $"#:!#l>: >!S =S $$>: >#la:!s $$=: $#la: #S 1 =!不同浓度钙离子处理对猪精子蛋白酪氨酸磷酸化的影响采用不同钙离子浓度! #: %( $: ":!: : # "n $-"处理猪精子蛋白酪氨酸磷酸化与 7 浓 BB 度密切相关低浓度 7"n 促进蛋白酪氨酸磷酸化氨酸磷酸化水平随着 7"n 浓度呈现先增加后降低 $- 时骨的趋势当 7"n 浓度达到!: #和: #BB 架蛋白的酪氨酸磷酸化水平明显减弱! %#: #%" 1!不同培养时间对猪精子蛋白酪氨酸磷酸化的影响而!: $-7"n 则明显抑制其磷酸化水 #和: #BB 获能过程具有时间依赖性在未获能介质中加平!图$,"并且全蛋白中发生酪氨酸磷酸化的蛋白入$: $-7"n 随着培养时间不断增加蛋白 #BB 大部分是非溶解性蛋白即骨架蛋白结果显示酪氨酸磷酸化水平不断增加!图!"图, 和Q 显 $- 时可增强蛋白酪 7 浓度为#: % 和 $: #BB 氨酸磷酸化水平而当 7"n 浓度大于!: $#BB 示分子量为">和!\V的骨架蛋白的酪氨酸磷酸化水平随着培养时间的不断增加酪氨酸磷酸化水时蛋白酪氨酸磷酸化水平明显受到抑制图 ", 平不断增强当培养时间为 $"#B!含以上"时酪和"Q 显示分子量为 "> 和!\V的骨架蛋白的酪氨酸磷酸化水平差异显著! %#: #%" "n 图$!钙离子不同浓度处理对猪精子蛋白酪氨酸磷酸化的影响全蛋白% 3 非溶解性蛋白 "n $!5 7 ; ; S B ; ; + # 3 ; % 3 ; :

5 ># 上海交通大学学报!农业科学版" 图"!不同 7"n 浓度处理分子量为">和!\V的蛋白酪氨酸磷酸化水平灰度值测定全蛋白% 3 非溶解性蛋白%j!与对照组 +?7;相比$: %#: #% "!3 N B P L ; ;! "> N!\V"U R ; N 7"n + # 3 ; % 3 ; : j! B; NU P L;! +?7;"$: %#: #%: 图!!不同培养时间处理对猪精子蛋白酪氨酸磷酸化的影响全蛋白% 3 非溶解性蛋白!!5 N BU 7"n; ; S B ; ; + # 3 ; % 3 ; : 图!培养不同时间分子量为">和!\V的蛋白酪氨酸磷酸化水平灰度值测定全蛋白% 3 非溶解性蛋白%j!与培养时间%B 相比$: %#: #%!3 N B P L ; ;! "> N!\V"U R ; N B + # 3 ; % 3 ; : %j! B; NU B %B $: %#: #%: 第!!卷

6 第期赵娜等钙离子对猪精子蛋白酪氨酸磷酸化及活力影响, 不同处理组的酪氨酸磷酸化蛋白的免疫荧光定位采用免疫荧光技术分析猪精子样品进行不同处理后酪氨酸蛋白的分布情况结果显示酪氨酸磷酸化的蛋白主要分布在赤道段颈部和整个精子鞭毛处图和 % 免疫荧光强度在获能介质中明显增强尤其是鞭毛主段图 % 然而高浓度 %+ ** 处理样品后酪氨酸磷酸化蛋白主要定位在赤道段而精子颈部和鞭毛处的磷酸化蛋白明显减少图 # 图猪精子获能过程中酪氨酸磷酸化蛋白的免疫荧光定位,2 **/+,:+,01,-1-0+,+21,5+1* 讨论本研究显示 %+ 对猪精子活力和蛋白!, 非溶解性蛋白酪氨酸磷酸化起调节作用较低浓度 %+ 促进精子活力和蛋白酪氨酸磷酸化而当 %+ 浓度达到和 ** 时明显抑制其精子活力和酪氨酸磷酸化水平其中分子量为和 + 蛋白酪氨酸磷酸化明显受到抑制,/-++ 等也报道在人精子中 ** %+ 促进精子蛋白酪氨酸磷酸化而 ** %+ 则明显抑制蛋白酪氨酸磷酸化当细胞内 %+ 浓度低于 * 时对牛精子超激活运动的起始和维持起到促进作用当 %+ 浓度为 ** 时精子活力受到抑制从研究结果来看无论是精子活力及参数指标变化还是蛋白酪氨酸磷酸化程度的变化均与 %+ 有直接关联性在本研究中低浓度 %+ ** 有利于提高猪精子活力及酪氨酸磷酸化而高浓度 %+ ** 则明显抑制猪精子活力和蛋白酪氨酸磷酸化发生酪氨酸磷酸化的蛋白主要分布在顶体后区和鞭毛区其中获能组酪氨酸磷酸化蛋白在鞭毛主段明显增强高浓度 %+ ** 处理后酪氨酸磷酸化的蛋白主要分布在头部赤道段鞭毛处蛋白几乎没有发生酪氨酸磷酸化或者认为是高浓度 %+ 完全抑制鞭毛处蛋白的酪氨酸磷酸化有研究认为在猪精子获能过程中鞭毛主段和中段的蛋白酪氨酸磷酸化被认为是同时发生的而在小鼠鞭毛主段和中段也都会发生蛋白酪氨酸磷酸化并且认为主段发生磷酸化后中段才有可能发生研究还发现一些蛋白的酪氨酸磷酸化在精子 ( 获能过程中起着非常重要的作用部分种类的酪氨酸磷酸化蛋白已鉴定出来人和小鼠精子中鉴定的酪氨酸磷酸化蛋白主要是离子通道代谢相关酶和一些结构蛋白例如外周致密度蛋白和激酶锚定蛋白 = 和 = 这些蛋白基本都是!, 非溶解性蛋白骨架蛋白精子细胞骨架支持精子运动可见蛋白的酪氨酸磷酸化修饰变化与精子活力密切相关本研究还发现 %+ 调节骨架蛋白酪氨酸磷酸化水平变化与全蛋白磷酸化水平变化相一致而荧光定位显示高浓度 %+ 抑制鞭毛处一些蛋白的酪氨酸磷酸化推测 %+ 可以调节鞭毛处一些骨架蛋白的酪氨酸磷酸化此外结果显示高浓度 %+ ** 抑制!"%" 和 " 活力参数水平进一步揭示高浓度钙离子可能通过抑制鞭毛主要是中段和主段处一些骨架蛋白的酪氨酸磷酸化进而抑制精子活力 %+ 在猪精子蛋白磷酸化和活力方面起重要调节作用低浓度 %+ ** 促进猪精子蛋白酪氨酸磷酸化和精子活力而高浓度 %+ ** 则可能会通过抑制鞭毛处一些骨架蛋白的酪氨酸磷酸化从而抑制精子活力同时在体外获能培养液中 %+ 是重要的添加物质之一鉴于 %+ 对猪精子蛋白酪氨酸磷酸化和精子活力的重要调节作用也为体外获能培养液中 %+ 添加剂量的筛选提供参考参考文献 +*,+#+-0%*+/,4+,

7 上海交通大学学报农业科学版第卷 +/,46021/,1+,+111$$ 1%$"$ ",1/1+,2- */+5+1,1 1*/++/,+,-2-,+11,2 $!"$($("( /7,/:,1,3,5+/-+,1* 1*/++/,+,+-+/1*+/,,,+11"-" #0#!1-,*,=3,, *+**+,+1*+:+$$%#$,$!!+1*-+, * *,,0 -"0 %( ++1,-1-0+,,*+* *+,+1*+:+#$ ++0+*+1,+/+/0/,/1,2+ +1/,,-/++/,+, /,4+,*1+5+1*+:+, -#$/(!+,/,1*/++/,+,+01,, +1+/,4,0+5,/+5++/+/, *5,01,-1-0+,,10+11 /,+ 7,- /+/,* 1% #$ (,+ %+/,* 1,2+,2-2- %+ /-+1, *+**+,+,,:+, %% 1 3,5++/+/+/,*2+,,1* /++/,+,++/1*++/,$ $%( 宫璀璀刘影韩玉春钙离子在精子获能和顶体反应中的作用国外医学临床生物化学与检验学分册 ",1/3+,0*%++/,+,*11*+:+,01,-1-0+, + /++/,+, /+-7+0 /(( ( /,=+1:%,*#6+/+/+ /,* 2+,40 *+101,-1-0+, +01,,+1+/,4,0,2/++/,+,- *+1*+:+1%#$(( 3+ -,2#/0*+0 1,1-*/-+,1*507-,/-/+/,*2+, ,-1-0+,/+1/++11/,+ 7,-1*/++/,+, -($$ /,=+1:%,*#6+/+/+ /,* 2+,40 *+101,-1-0+, +01,,+1+/,4,0,2/++/,+,- *+1*+:+ 1%$(( %- +,1-=++:0+/, 4+*,,051*,1, *50%+ +//0 % 张旭成袁慧敏金一酪氨酸磷酸化蛋白在体外获能猪精子上的分布畜牧与兽医 ( +:=+1-301,-1-0+,,1*/++/,+,+/1*+/,#0 $/1%$%#1 (",1/ /*1 5,/+5+/+,01,-1-0+,/++/,+,+-1+1+/1* +/,-+*11* 1%#$0 ((( 周思畅倪崖石其贤获能期间精子蛋白的酪氨酸磷酸化生命科学 (,/+%-,-,;15" *-1 -*++01,1/++/,+-*+1*#4,/01,-1-0+,+,+1+/-,2,+4+1,/+,,2,(,2/++/,+, -1$% (( /+0#+,/,, ;-,*#*,,/+,,12,201,-1-0+,,2*11*/++/,+,,0 -/1%

第期黄雪莲等响应面优化绿色木霉菌培养基材料与方法菌种仪器与试剂菌种的活化单因素试验响应面优化试验优化工艺的验证数据处理结果与分析

第期黄雪莲等响应面优化绿色木霉菌培养基材料与方法菌种仪器与试剂菌种的活化单因素试验响应面优化试验优化工艺的验证数据处理结果与分析第卷第期年月食品与生物技术学报响应面优化绿色木霉菌培养基黄雪莲于新仲恺农业工程学院轻工食品学院广东广州利用响应面分析法对绿色木霉菌的培养基进行优化通过测量不同营养条件下绿色木霉菌落生长直径研究其生物学特性在单因素实验的基础上选定葡萄糖添加量丙氨酸添加量和磷酸二氢钾添加量个因素进行中心组合实验建立二次回归方程并应用响应面分析法进行优化结果表明绿色木霉菌最佳培养基为葡萄糖

第 期 赵 娜 等 钙离子对猪精子蛋白酪氨酸磷酸化及活力影响 7,-**%+ +*! /-+21,6+/+%+ +0+ /,,/+,1* *,,0+,01,-1-0+,7//+,1/+/,* **+0 + +//+,4 1* *,,0 +01, -1-0+,5- -,2- //+,

第期赵娜等钙离子对猪精子蛋白酪氨酸磷酸化及活力影响 7,-**%+ +! /-+21,6+/+%+ +0+ /,,/+,1 ,,0+,01,-1-0+,7//+,1/+/, **+0 + +//+,4 1* *,,0 +01, -1-0+,5- -,2- //+,