244 第 37 卷第 3 期 diuresisandnatriuresisinwkyrats,whichwereimpairedinshrs(urineflow:11.23±2.16vs3.49± 132,P<0.05;urinesodiumexcretion: ±393.47vs60

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1 243 DOI: /j 论著 G 蛋白偶联受体激酶 4 对内皮素 B 型受体的异常调节在原发性高血压发生中的作用 李美香, 郑硕, 姚勇刚, 陈彩宇, 任红梅, 曾春雨, 周林 ( 重庆, 第三军医大学大坪医院野战外科研究所心血管内科, 重庆市心血管病研究所 [ 摘要 ] 目的探讨 G 蛋白偶联受体激酶 4(Gproteincoupledreceptorkinase4,GRK4 对内皮素 B 型受体 (endothelinreceptorb,etb 的异常调节在原发性高血压中的作用及机制 方法选用 12~ 14 周龄, 体质量 300g 左右的雄性自发性高血压大鼠 (spontaneouslyhypertensiverats,shrs 及其对照鼠 (WistarKyoto,WKY 各 10 只, 通过无创鼠尾测压仪测定血压, 采用右肾上腺静脉插管灌注 ETB 受体特异性激动剂 BQ3020 后观察尿流速及尿钠排泄率, 荧光定量 PCR 检测大鼠肾脏 GRK4mRNA 水平, Westernblot 测定大鼠肾脏 GRK4 及 ETB 受体的蛋白表达差异, 免疫共沉淀法检测 ETB 受体磷酸化情况, 在动物水平观察高血压状态下 ETB 受体的功能情况 结果 ETB 受体激动剂 BQ3020 对 WKY 大鼠有明显利尿排钠作用, 且这种利尿排钠作用可以被 ETB 受体抑制剂 BQ788 阻断, 但在 SHR 大鼠 BQ3020 的利尿排钠作用受损 [ 尿流速 :(11.23±2.16vs(3.49±1.32,P<0.05]; 尿钠排泄率 : [( ±393.47vs(601.16±128.15,P<0.05]; 在 SHR 大鼠肾皮质 GRK4 的蛋白水平及 mrna 水平均较 WKY 大鼠高 [ 蛋白 :(1.38±0.10vs(0.85±0.07,P<0.05];mRNA:[(2.23±0.15vs (078±0.16,P<0.05],SHR 大鼠 ETB 受体总蛋白水平与 WKY 大鼠相比差异无统计学意义 (P> 005, 但 ETB 受体磷酸化水平增高 结论 GRK4 可能通过对内皮素 B 型受体的异常调节, 参与了原发性高血压发生与发病 [ 关键词 ] 内皮素 B 型受体 ;G 蛋白偶联受体激酶 4; 尿钠排泄 ; 原发性高血压 [ 中图法分类号 ] R345.57;R363.21;R544.1 [ 文献标志码 ] A RoleofG protein coupled receptorkinase4 in regulation ofrenalendothelin receptorbinesentialhypertensionrats LiMeixiang,ZhengShuo,YaoYonggang,ChenCaiyu,RenHongmei,ZengChunyu,ZhouLin(Departmentof Cardiology,InstituteofCardiovascularDiseases,InstituteofSurgeryResearch,DapingHospital,ThirdMilitaryMedical University,Chongqing,400042,China [Abstract] Objective TodeterminetheefectofGproteincoupledreceptorkinase4(GRK4on theregulationofrenalendothelinreceptortypeb (ETB andinvestigateitsroleinthepathogenesisof esentialhypertension.methods Spontaneouslyhypertensiverats(SHRsandWistarKyoto(WKYrats (male,12weeksold,andweightingabout300gweresubjectedinthisstudy(n=10foreachgroup. Bloodpresure(BPwasdetectedbyusinganoninvasivetailcufmethod.ThenETBantagonist,BQ3020, wasperfusedthroughsuprarenalarteryadministration,thenatriuresisanddiuresisweredeterminedinshrs andwkyrats.themrnalevelsofgrk4intherenaltisuewasmeasuredbyqrtpcr.theproteinlevels ofrenalgrk4andetb weredetectedbywesternbloting.theserinephosphorylationlevelofetb was measuredbycoimmunoprecipitation.results ETBagonistBQ3020resultedinsignificantincreasesinthe [ 基金项目 ] 国家自然科学基金面上项目 ( [ 通信作者 ] 周林, ;linzhou65@hotmail.com [ 优先出版 ] htp://

2 244 第 37 卷第 3 期 diuresisandnatriuresisinwkyrats,whichwereimpairedinshrs(urineflow:11.23±2.16vs3.49± 132,P<0.05;urinesodiumexcretion: ±393.47vs601.16±128.15,P<0.05.TheGRK4 expresionwasobviouslyhigherintherenalcortexfrom SHRsthanfrom WKY rats(proteinexpresion: 1.38±0.10vs0.85±0.07,P<0.05;mRNA:2.23±0.15vs0.78±0.16,P<0.05.Thoughtherewas nosignificantdiferenceinrenaletbpreteinlevelbetweenshrsandwkyrats,theserinephosphorylation levelofetbrwashigherinshrsthanwkyrats.conclusion GRK4participatesinthepathogenesisand developmentofesentialhypertension,probablyviaregulatingrenaletb. [Keywords] endothelinreceptorb;g proteincoupledreceptorkinase4;natriuresis;esential hypertension SupportedbytheGeneralProgramofNaturalScienceFoundationofChina( Corespondingauthor:ZhouLin, linzhou65@hotmail.com 原发性高血压 (esentialhypertensioneh 及其并发症已成为影响人类健康的主要原因 在我国 EH 的发病率达 18.8% [1],EH 影响的人口超过 2.0 亿人, 循证医学表明控制血压可明显减少心 肾功能衰竭, 冠心病, 脑卒中等多种疾病的发生, 因此明确 EH 的发生机制以及寻找有效的防治措施显得尤为重要 肾脏是人体负责尿钠排泄的主要器官, 它可以通过对尿钠重吸收的调控达到调节血压的目的 EH 患者体内钠潴留为一普遍现象, 因而肾脏在 EH 研究中的地位得到人们的重视 [2] 肾脏的利尿 排钠作用受到多种内分泌因子的影响, 其中包括内皮素 越来越多的证据显示内皮素在调节尿钠排泄中发挥重要的作用, 内皮素的利钠 排尿作用经由内皮素 B 型受体 (endothelinreceptorb,etb 完成,ETA 受体发挥完全不同的作用 [3] ETB 受体属于 G 蛋白偶联受体, 受 G 蛋白偶联受体激酶 (Gproteincoupledreceptorkinases, GRKs 的调节 [4], 在 G 蛋白偶联受体家族中鉴于 G 蛋白偶联受体激酶 4(G proteincoupledreceptor kinase4,grk4 在机体的局限性分布, 且 GRK4 的改变先于血压的升高而变化 的现象,GRK4 在 EH 发病中的重要性得到人们的重视 [2,5-6] 本实验一方面通过在体观察 ETB 受体激动剂 BQ3020 刺激 ETB 受体后其所介导的利尿钠排泄作用, 以及这种作用在 SHR 大鼠及 WKY 大鼠之间的差异 ; 另一方面探索形成这种差异的原因及机制, 从而探索 GRK4 对 ETB 受体的异常调节在原发性高血压发生中的作用 1 材料与方法 1.1 材料 实验动物 12~14 周龄雄性 SHR 大鼠及 WKY 大鼠各 10 只, 体质量约 300g, 购自北京维通利华公司, 大鼠自购买后于清洁级条件下, 给予标准饲料, 自由进食及进水, 在 12h 明暗交替环境下喂养 1 周后进行实验, 所有实验符合实验动物伦理法案 实验器械无创鼠尾测压仪购自中国北京软隆公司, 尿液分析仪购自瑞士的罗氏公司,Yz20T4 手术显微镜购自中国苏州 66 视觉公司, 微量注射泵购自中国浙江史密斯公司, 血压监护仪购自中国西安巨田公司, 导管 PE240 PE50 PE10 购自美国 Becton Dickinson 公司, 显微手术镊购自美国 Smis 公司 实验试剂 ETB 受体激动剂 (BQ3020 ETB 受体拮抗剂 (BQ788 以及戊巴比妥钠均购自美国 Sigma 公司, 兔抗 GRK4 单克隆抗体 内参 GAPDH 抗体以及 proteingagarose 均购自美国 SantaCruz 公司, ETB 抗体为兔抗大鼠多克隆抗体, 购自以色列 AlomoneLabs, 多克隆磷酸丝氨酸抗体购自香港 Ab cam 公司,RNAPCRKit(AMVVer3.0 购自 TaKaRa 公司, 所有 PCR 引物由上海生工公司合成 1.2 方法 大鼠血压测定采用无创鼠尾测压仪测定 12~14 周龄 WKY 大鼠与 SHR 大鼠血压 [7], 首先在安静环境中, 将大鼠置于仪器配套的固定笼中, 放于 37 加热筒中预热 15min, 在大鼠完全安静后, 将鼠尾套袖放置于鼠尾的根部, 套袖以 20~30mmHg/s 的速度自动重启加压直至脉搏波消失, 维持数秒后套袖自动放气, 出现的第 1 个血压波即为收缩压, 每只大鼠至少测量 3 次取平均值, 记录大鼠的收缩压 (systolic bloodpresure,sbp 舒张压 (diastolicbloodpresure, DBP 平均动脉压 (meanbloodpresure,mbp 大鼠肾功能分析 SHR 大鼠与 WKY 大鼠各 4 只, 首先将大鼠以 2.5% 戊巴比妥钠按体质量予以腹腔麻醉, 脱毛备皮后将其固定于 36 恒温加热毯上 做颈部纵切口, 于手术显微镜下分离 暴露并切开气管, 予导管 PE240 插管, 辅助呼吸 分离颈静脉, 切开并置入 PE50 管 ( 输液管 及 PE10 管 ( 麻醉维持管 继续分离颈动脉, 切开颈动脉, 连接血压监护仪 做腹部纵切口, 暴露右侧肾动脉, 并寻找起源于右肾动脉的右侧肾上腺动脉, 切开并置入 PE10 管以输

3 245 入溶剂或药物 最后, 暴露左, 右侧输尿管, 切开并插入 PE10 管以收集尿液 手术期间, 麻醉按 0.1mL/h 维持, 输液按 1% 体质量维持 手术结束后, 平衡 1~ 1.5h 平衡结束后, 开始通过右侧肾上腺动脉灌注溶剂或药物, 输入溶剂或者药物的速率控制在 40μL/h, ETB 受体激动剂 BQ3020 浓度分别为 [ μg/ (kg min], 实验分 5 段, 分别为对照组, 即输入溶剂 ( 生理盐水, 药物段, 即输入 BQ3020[ μg/ (kg min], 恢复期, 即输入溶剂 ( 生理盐水, 每段收集时间为 40min 并同时记录动脉血压 收集每段尿液, 测量尿流速 (urineflow(μl/min, 尿钠排泄率 (UNaV(nEq/min [8-9] PCR 大鼠肾皮质经过匀浆,TRIzol 和三氯甲烷抽提离心, 异丙醇沉淀过夜, 无水乙醇纯化后提取肾脏皮质总 RNA, 据所测浓度, 依据 TaKaRa 公司 RNA PCR Kit(AMVVer3.0 说明步骤进行逆转录 用 SYBRGreenⅡ 荧光染料定量 PCR 检测系统, 反应体系 20μL, 反应条件 : 预孵育 s; 扩增 95 10s, 58 30s,65 5s,40 个循环 ; 最后延伸阶段结束 大鼠 GRK4 引物序列上游 :5 TGTCCTGATCCTGAG GC3 ; 下游 5 ACACACCCTGTCGCAAAT3 大鼠 GAPDH 引物序列, 上游 5 GACATGCCGCCTGGA GAAAC3 ; 下游 :5 AGCCCAGGATGCCCTTTAGT 免疫印迹大鼠肾皮质通过匀浆, 超声破碎, 冰上裂解, 高速离心后取上清提取肾皮质总蛋白, 用考马斯亮蓝法, 在 BioRad 分光光度计测定蛋白浓度后,95~100 水浴 10min 使蛋白变性, 于 10% SDSPAGE 电泳后, 用半干转膜法将蛋白转至硝基纤维素膜上并于室温予 5% 脱脂奶粉封闭 1h, 分别与抗 GRK4 抗体 (1 500, 抗 ETB 抗体 (1 500, 抗 GAPDH 抗体 ( 孵育过夜, 次日取出室温下复温 30min,TBST 摇床洗涤 3 次, 每次 15min, 室温避光孵育荧光二抗 ( h, 避光洗涤 3 次后, 每次 15min, 荧光扫膜仪扫描后, 用 QuantityOne 软件对 SHR 大鼠与 WKY 大鼠肾皮质 GRK4 及 ETB 受体表达进行分析 免疫沉淀免疫沉淀法确定 ETB 受体的磷酸化程度 将多克隆磷酸丝氨酸抗体加入到 1mg 肾脏皮质膜提取液中,4 下孵育 1h, 再与 protein Gagarose 作用 12h, 免疫沉淀物离心 用裂解液反复洗涤 4 次, 每次洗涤 3min, 洗涤后的沉淀颗粒在样本缓冲液中煮沸 10min, 再用 ETB 受体多克隆抗体行免疫印迹检查为确定检查方法的特异性, 正常的兔 IgG ETB 受体抗体分别代替磷酸丝氨酸抗体作为阴性和阳性对照 [10] 1.3 统计学分析 应用 SPSS13.0 统计软件分析, 计量资料数据以 珋 x±s 表示, 两组间采用单因素方差分析, 组间采用 LSD 多重比较 2 结果 2.1 大鼠基础血压 通过体外无创鼠尾测压法测定同周龄 (12~ 14 周 的 SHR 大鼠和 WKY 大鼠基础血压 ( 图 1! " a:p<0.05, 与 WKY 大鼠比较 图 1 WKY 大鼠与 SHR 大鼠基础状态下血压比较 2.2 BQ3020 介导的利尿钠排泄作用 通过大鼠右肾上腺动脉灌注 ETB 受体激动剂 BQ3020[ μg/(kg min], 其中 μg/ (kg min 对 WKY 大鼠有显著的利尿排钠作用, 但这种排钠利尿作用在 SHR 大鼠受损 ( 图 2 在整个手术期间, 大鼠的血压及心率均无显著改变 (P>0.05 (!"!" $%& '!" $%& '!" A: 尿流速 ;B: 尿钠排泄率 a:p<0.05, 与 SHR 大鼠比较 图 2 WKY 大鼠与 SHR 大鼠右肾上腺动脉插管灌注 ETB 受体激动剂 BQ3020 后尿流速及尿钠排泄率比较

4 246 第 37 卷第 3 期 2.3 大鼠肾皮质 ETB 受体的表达 SHR 大鼠肾皮质 ETB 受体蛋白表达 (0.87± 014 与 WKY 大鼠 (0.90±0.11 相比, 无统计学差异 (P>0.05;SHR 大鼠 (29.5±3.5ETB 受体磷酸化水平较 WKY 大鼠显著增加 (15.7±3.2(P<0.05, 图 3 A:ETB 受体蛋白表达 1:WKY 大鼠 ;2:SHR 大鼠 ;B: 磷酸化 ETB 受体蛋白表达 1: 阴性对照 ;2: 阳性对照 ; 3:WKY 大鼠 ;4:SHR 大鼠图 3 WKY 大鼠与 SHR 大鼠肾皮质 ETB 受体及磷酸化 ETB 受体的表达 2.4 大鼠肾皮质 GRK4 受体的表达 SHR 大鼠肾皮质 GRK4 蛋白表达 (1.38±0.10 与 WKY 大鼠 (0.85±0.07 相比有统计学差异 (P< 005;SHR 大鼠肾皮质 GRK4mRNA 水平表达 (223± 015 与 WKY 大鼠 (0.78±0.16 相比有统计学差异 (P<0.05, 图 4 1:WKY 大鼠 ;2:SHR 大鼠图 4 Westernblot 检测 WKY 大鼠与 SHR 大鼠肾皮质 GRK4 受体的表达 3 讨论高血压患者普遍存在尿钠排泄障碍, 而肾脏是人体负责尿钠排泄的主要器官 越来越多的证据显示内皮素在调节尿钠排泄中发挥重要的作用, 内皮素的利钠 排尿作用经由 ETB 受体完成,ETA 受体发挥完全不同的作用 阻断 ETB 受体后, 内皮素介导的利钠 排尿作用消失 [11] ; 长时间喂饲大鼠 ETB 受体拮抗剂可使大鼠的尿钠排泄能力下降 血压呈现盐敏感性增高 [9] ; 在敲除小鼠肾脏 ETB 受体后, 小鼠血压亦呈现盐敏感性升高 [12] ; 在亨氏环髓质部粗段升支和集合管, 刺激 ETB 受体可抑制尿钠重吸收 [13] ; 在 RPT 细胞长时间刺激 ETB 受体能抑制 NHE3 的表达和活性 [14] ETB 受体对尿钠排泄的影响除其自身的作用以外, 还可通过与其他受体的交互影响达到间接影响尿钠排泄 的作用 我们既往的研究发现, 刺激 ETB 受体可抑制 RPT 细胞 AT 1 受体 增加 D 3 多巴胺受体的表达 [10] ; 在肾脏,AT 1 受体发挥保钠作用 D 3 受体发挥排钠作用, 因而 ETB 受体可通过对 AT 1 D 3 受体的影响间接影响尿钠排泄 从而发挥调控血压的结果 在 RPT 细胞, 刺激 ETB 受体可抑制 Na + K + ATPase 活性 [15], 在预先刺激 D 3 受体的情况下,ETB 受体对 Na + K + ATPase 活性的抑制作用明显增强 [16], 也从另一个侧面说明了 ETB 受体与其他受体的相互作用与血压调节的关系 以上证据说明 ETB 受体在调控尿钠排泄方面发挥重要的作用 本研究以 SHR 大鼠与 WKY 大鼠尾作为研究对象, 通过右肾上腺动脉急性灌注 ETB 受体激动剂 BQ3020, 观察了其对 WKY 及 SHR 大鼠尿钠排泄的影响, 从而在体研究肾脏 ETB 受体的功能 肾上腺动脉连接肾动脉, 可以保证灌注药物直接进入单侧肾脏 [17] 结果显示 WKY 大鼠灌注 BQ3020 后, 尿流速及尿钠排泄率明显高于 SHR 大鼠, 提示高血压状态下 ETB 受体功能受损 在整个灌注过程中, 大鼠平均动脉压保持稳定, 说明药物未影响整个循环血容量 我们发现 ETB 受体总蛋白水平在 WKY 大鼠与 SHR 大鼠肾皮质之间无统计学差异, 但 SHR 大鼠肾脏 ETB 磷酸化水平增高 说明高血压状态下 ETB 受体功能受损, 不是由于其蛋白表达水平降低, 而是由于高血压状态下 ETB 受体的磷酸化水平升高, 进而导致其功能受损 ETB 受体是一种 G 蛋白偶联受体 (Gproteincou pledreceptor,gpcr [4], 磷酸化和去磷酸化水平决定其功能及表达 磷酸化水平增高会使 ETB 受体功能降低 [18] GRK 是调控 ETB 受体磷酸化过程重要的酶, 进一步研究发现,GRK 为一种丝氮酸 / 苏氨酸蛋白磷酸酶, 共有 7 个亚型 (1~7 [5,19] GRK1 和 GRK7 属于视紫质家族,GRK1 和 GRK7 属于 β 肾上腺素能受体家族,GRK4 5 和 6 属于 GRK4 家族 GRK1/7 仅在视网膜部分有表达,GRK2/3 和 GRK5/6 在机体各组织中普遍存在, 只有 GRK4 仅存于肾脏 脑 子宫肌层和睾丸等少数组织中 EH 状态下 GRK 的活性增加 GRK2/3 和 GRK5/6 的表达也增加, 但随后的研究发现 GRK2/3 和 GRK5/6 的发改变为 EH 的继发现象, 研究发现 SHR 大鼠肾皮质 GRK4 无论是蛋白表达水平还是 mrna 水平均较 WKY 大鼠明显升高 说明高血压状态下 GRK4 表达增高可能是引起 ETB 受体功能障碍的原因

5 247 目前自发性高血压的机制尚不完全清楚, 肾脏 ETB 受体介导的尿钠排泄作用在血压调控中发挥重要作用, 高血压状态下肾脏 ETB 受体功能障碍伴有磷酸化水平升高, 但其发生的原因尚不明了, 究竟 GRK4 是通过与 ETB 受体直接连接, 还是通过 PLC 等中间信号间接影响 ETB 受体的表达和功能的, 此问题的解决将有助于揭示肾脏 ETB 受体功能障碍的机制, 为恢复高血压状态下肾脏 ETB 受体的功能提供理论基础 参考文献 : [1] 中华人民共和国卫生部 科技部 国家统计局. 中国居民营养与健康状况调查报告 -2002[R]. 北京 : 人民卫生出版社,2005:1-25. [2]ZengC,ArmandoI,LuoY,etal.Dysregulationofdopa minedependentmechanismsasadeterminantofhyperten sion:studiesindopaminereceptorknockoutmice[j].am J PhysiolHeartCircPhysiol,2008,294(2:H551-H569. [3]NaserSA,ElMasM M.EndothelinETAreceptorantago nismincardiovasculardisease[j].eurjpharmacol,2014, 737: [4] MazucaM Q,KhalilRA.Vascularendothelinreceptortype B:structure,functionanddysregulationinvasculardisease [J].BiochemPharmacol,2012,84(2: [5]JosePA,SoaresdaSilvaP,EisnerGM,etal.Dopamine andgproteincoupledreceptorkinase4inthekidney:rolein bloodpresureregulation[j].biochim BiophysActa,2010, 1802(12: [6]BelmonteSL,BlaxalBC.Gproteincoupledreceptorkina sesastherapeutictargetsincardiovasculardisease[j].circ Res,2011,109(3: [7] WangX,LuoH,ChenC,etal.Prenatallipopolysaccharide exposureresultsindysfunctionoftherenaldopamined1recep torinofspring[j].freeradicbiolmed,2014,76: [8] 罗浩, 王新全, 王甲良, 等.Tempol 通过降低氧化应激下调肥胖相关性高血压大鼠肾脏 AT1 受体表达 [J].,2014,36(9: [9]ChenY,AsicoLD,ZhengS,etal.GastrinandD1dopa minereceptorinteracttoinducenatriuresisanddiuresis[j]. Hypertension,2013,62(5: [10] ZengC,ZhengW,AsicoLD,etal.AberantETBreceptor regulationofat1receptorsinimmortalizedrenalproximal tubulecelsofspontaneouslyhypertensiverats[j].kidney Int,2005,68(2: [11] SpeedJS,GeorgeE M,AranyM,etal.Roleof20 hydroxyeicosatetraenoicacidinmediatinghypertensioninre sponsetochronicrenalmedularyendothelintypebreceptor blockade[j].plosone,2011,6(10:e [12]KirkbyNS,HadokePW,BagnalAJ,etal.Theendothe linsystemasatherapeutictargetincardiovasculardisease: greatexpectationsorbleakhouse[j].brjpharmacol, 2008,153(6: [13] HyndmanKA,PolockJS.NitricoxideandtheAandBof endothelinofsodium homeostasis[j].curopinnephrol Hypertens,2013,22(1: [14] KohanDE,RosiNF,InschoEW,etal.Regulationof bloodpresureandsalthomeostasisbyendothelin[j].phys iolrev,2011,91(1:1-77. [15]LiuY,YangJ,RenH,etal.InhibitoryefectofETBre ceptoronna + K + ATPaseactivitybyextracelularCa 2+ en tryandca 2+ releasefromtheendoplasmicreticuluminrenal proximaltubulecels[j].hypertensres,2009,32(10: [16] 石伟彬, 于长青, 杨剑, 等. 内皮素 B 受体对自发性高血压大鼠肾脏近曲小管上皮细胞多巴胺 D 3 受体的异常调节 [J]. 中华高血压杂志,2008,16(7: [17] HuangH,RenH,ChenC,etal.D3dopaminereceptor regulationofd5receptorexpresionandfunctioninrenal proximaltubulecels[j].hypertensres,2012,35(6: [18]DuQH,HanL,JiangJJ,etal.Increasedendothelinre ceptorbandgproteincoupledkinase2inthemesenteryof portalhypertensiverats[j].worldjgastroenterol,2013, 19(13: [19]ZengC,VilarVA,EisnerGM,etal.Gproteincoupled receptorkinase4:roleinbloodpresureregulation[j].hy pertension,2008,51(6: ( 收稿 : ; 修回 : ( 编辑栾嘉

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