宋渊, 等. 多发性骨髓瘤患者外周血 Th17 细胞的检测及其临床意义 461 反应自身免疫性疾病移植物抗宿主病和肿瘤等多种疾病中发挥重要作用 [1] 本研究通过检测 MM 患者外周血中 Th17 细胞及其相关细胞因子的表达, 以期进一步阐明 Th17 细胞在肿瘤免疫中的作用机制, 为 MM 患

Size: px

Start display at page:

Download "宋渊, 等. 多发性骨髓瘤患者外周血 Th17 细胞的检测及其临床意义 461 反应自身免疫性疾病移植物抗宿主病和肿瘤等多种疾病中发挥重要作用 [1] 本研究通过检测 MM 患者外周血中 Th17 细胞及其相关细胞因子的表达, 以期进一步阐明 Th17 细胞在肿瘤免疫中的作用机制, 为 MM 患"

徂路
7 years ago
Views:

1 460 临床研究 Clinical Research 肿瘤 2013 年 5 月第 33 卷第 5 期 TUMOR Vol. 33, May 2013 DOI: /j.issn Copyright 2013 by TUMOR 多发性骨髓瘤患者外周血 Th17 细胞的检测及其临床意义宋渊, 石庆之, 华建媛, 郭宁红, 吴琼, 魏秋蓉南昌大学第二附属医院血液内科, 江西南昌 [ 摘要 ] 目的 : 探讨多发性骨髓瘤 (multiple myeloma,mm) 患者外周血中辅助性 T 细胞 17(helper T cells 17, Th17) 细胞的检测及其临床意义方法 : 收集 39 例 MM 患者及 30 例健康对照者的外周血, 应用 FCM 法检测 Th17 细胞在 CD4 + T 细胞中所占的比例,RT-PCR 法检测 Th17 特异性转录因子维甲酸相关孤儿受体 γt(retinoid-related orphan receptors-γt,ror-γt) mrna 的表达水平,ELISA 法检测血浆中白细胞介素 -17(interleukin-17,IL-17) 的表达水平结果:MM 患者外周血中 Th17 细胞所占比例 ROR-γt mrna 和 IL-17 的表达水平 [(3.509±0.594)% 0.568±0.177 和 (27.200±4.666)pg/mL] 均明显高于对照组 [(2.913±0.846)% 0.468±0.163 和 (23.758±7.410) pg/ml](p 均 < 0.05) Th17 细胞比例与 MM 患者的性别年龄疾病分型球蛋白免疫球蛋白轻链 M 蛋白和浆细胞比例无明显相关性 (P > 0.05), 而与疾病国际分期系统 (international staging system,iss) 的分期 β2- 微球蛋白水平和疗效有关 (P < 0.05) 结论:Th17 细胞可能参与了 MM 的发生和发展, 检测 Th17 细胞的比例可能对判断 MM 患者的病情疗效和预后有一定意义 [ 关键词 ] 多发性骨髓瘤 ;T 淋巴细胞 ; 白细胞介素类 ; 辅助性 T 细胞 17 [ 中图分类号 ] R733.3 [ 文献标志码 ] A [ 文章编号 ] (2013) Detection of Th17 cells in peripheral blood of patients with multiple myeloma and its clinical significance SONG Yuan, SHI Qing-zhi, HUA Jian-yuan, GUO Ning-hong, WU Qiong, WEI Qiu-rong Department of Hematology, Second Affiliated Hospital of Nanchang University, Nanchang , Jiangxi Province, China [ABSTRACT] Objective: To examine the Th17 cells (helper T cells 17) in peripheral blood of patients with MM (multiple myeloma) and explore its clinical significance. Methods: The peripheral blood samples from 39 patients with MM and 30 healthy volunteers were collected. The proportion of Th17 cells in CD4 + T cells was determined by flow cytometry. The expression of ROR-γt (retinoid-related orphan receptor-γt) mrna, a specific transcription factor of Th17 cells, was detected by RT-PCR. The plasma concentration of IL-17 (interleukin-17) was measured by ELISA assay. Results: The proportion of Th17 cells, the expression level of ROR-γt mrna and the concentration of IL-17 in peripheral blood in patients with MM were higher than those in the healthy volunteers [(3.509±0.594)% vs (2.913±0.846)%, 0.568±0.177 vs 0.468± 0.163, ±4.666 vs ±7.410 pg/ml; all P values < 0.05). The proportion of Th17 cells was not correlated with the gender, age, disease type, globulin, immune globulin, light chain, M-protein and the proportion of plasmocytes of the patients with MM (P > 0.05), but correlated with ISS (international staging system) stage, β2-microglobulin level and the therapeutic response (P < 0.05). Conclusion: Th17 cells may be involved in the occurrence and development of MM. Detection of proportion of Th17 cells may contribute to the ajudgement of disease severity, therapeutic response and the prognosis of patients with MM. [KEY WORDS] Multiple myeloma; T-lymphocytes; Interleukins; Helper T cell 17 [TUMOR, 2013, 33 (05): ] 多发性骨髓瘤 (multiple myeloma,mm) 是血液系统常见的恶性肿瘤之一, 化疗是目前主要 Correspondence to: SHI Qing-zhi( 石庆之 ) qingshis@sohu.com Received Accepted 的治疗方法, 但部分患者对化疗存在原发或继发性耐药, 需要采取多元化的治疗方法辅助性 T 细胞 17(helper T cells 17,Th17) 细胞是新发现的一类 CD4 + T 细胞, 已有研究证实其能在炎性

2 宋渊, 等. 多发性骨髓瘤患者外周血 Th17 细胞的检测及其临床意义 461 反应自身免疫性疾病移植物抗宿主病和肿瘤等多种疾病中发挥重要作用 [1] 本研究通过检测 MM 患者外周血中 Th17 细胞及其相关细胞因子的表达, 以期进一步阐明 Th17 细胞在肿瘤免疫中的作用机制, 为 MM 患者的临床检测和免疫治疗提供新的思路 1 资料与方法 1.1 研究对象收集 2011 年 6 月 1 日 2012 年 6 月 1 日南昌大学第二附属医院血液内科收治的 MM 患者 39 例, 诊断及疗效判断符合血液病诊断及疗效标准 [2] 其中, 男性 25 例女性 14 例 ; 年龄 27 ~ 78 岁, 中位年龄 59 岁 ; 初治患者 16 例, 治疗后达完全缓解者 13 例, 治疗后未达完全缓解者 10 例 [ 包括部分缓解 (partial remission,pr) 微小缓解 (micro remission, MR) 无变化 (no change,nc) 平台期完全缓解 (complete remission,cr) 后复发和疾病进展 (progress disease,pd)];igg 型 26 例, IgA 型 11 例, 轻链型 2 例 ; 按疾病国际分期系统 (international staging system,iss) 进行分期, Ⅰ 期 6 例 Ⅱ 期 20 例和 Ⅲ 期 13 例收集同期健康体检人群 30 例作为对照组, 排除幽门螺旋杆菌乙型肝炎和巨细胞病毒等感染因素, 无自身免疫性疾病及恶性肿瘤病史 ; 男性 15 例女性 15 例, 年龄 39 ~ 72 岁, 中位年龄 61 岁本研究获得南昌大学第二附属医院伦理委员会批准并征得参与者的知情同意 1.2 主要试剂鼠抗人 CD4 单克隆抗体和鼠抗人白细胞介素 -17 单克隆抗体购自美国 BD 公司, 淋巴细胞分离液购自杭州四季青生物工程材料有限公司,RPMI 1640 培养液购自美国 Hyclone 公司, 佛波醇乙酯蓝菌素和离子霉素购自瑞士 Alexis 公司, 破膜剂购自中国联科生物技术有限公司,TRIzol 试剂和反转录试剂盒购自日本 TaKaRa 公司,RT-PCR 所需引物由上海生工生物工程有限公司合成, 酶联免疫检测试剂盒购自上海睿铂赛生物科技有限公司 1.3 实验方法 FCM 法检测外周血中 Th17 细胞所占的比例取 MM 患者及对照者外周血 3 ml, 肝素抗凝用淋巴细胞分离液分离单个核细胞, 以 RPMI 1640 培养液调整细胞密度为个 /ml, 接种于 12 孔板中 ; 分别加入终质量浓度为 50 ng/ml 的佛波醇乙酯 1 μg/ml 的离子霉素和 10 μg/ml 的蓝菌素, 置于 37 CO 2 体积分数为 5% 的培养箱中培养 4 ~ 6 h; 将培养后的细胞悬浮于 100 μl PBS 中, 加入 5 μl 鼠抗人 CD4 单克隆抗体, 室温避光反应 15 min;pbs 洗涤细胞后, 加入 50 μl 破膜剂, 室温避光反应 10 min;pbs 再次洗涤细胞, 加入 10 μl 鼠抗人白细胞介素 -17 抗体 ( 阴性对照组加入 IgG 10 μl), 避光反应 15 min;pbs 洗涤细胞 2 次后, 上流式细胞仪进行检测检测结果以 CD4 + IL-17 + 细胞占 CD4 + 细胞的百分率表示 RT-PCR 法检测外周血中维甲酸相关孤儿受体 γt(retinoid-related orphan receptors-γt, ROR-γt) mrna 的表达水平取 MM 患者及对照者外周血 3 ml, 肝素抗凝用淋巴细胞分离液分离出单个核细胞,TRIzol 法提取细胞总 RNA, 电泳检测 RNA 的质量取 3 μl RNA, 按反转录试剂盒说明书提供的方法将 RNA 反转录合成 cdna; 以 cdna 为模板, 加入 ROR-γt 特异性引物 ( 以 β-actin 为内参照 ) 进行 PCR 扩增 ROR-γt 上游引物序列为 5 -GCTGGTTAG- GATGTGCG-3, 下游引物序列为 5 -GGAT- GCTTTGGCGATGA-3,PCR 产物大小为 304 bp;β-actin 上游引物序列为 5 -ACGTT- GCTATCCAGGC-3, 下游引物序列为 5 -CAT- GTACGTTGCTATCCAGGC-3,PCR 产物大小为 250 bp PCR 反应条件 :94 4 min;94 1 min 60 1 min 72 1 min, 共 30 个循环 ; 72 6 min 取 PCR 产物进行 1.5% 琼脂糖凝胶电泳, 应用凝胶成像系统进行分析, 以 ROR-γt mrna 条带灰度值与 β-actin mrna 条带灰度值的比值表示 ROR-γt mrna 的相对表达水平 ELISA 法检测血浆中 IL-17 的表达水平取 MM 患者及对照者外周血 3 ml, 肝素抗凝离心 15 min 后, 取上清液, 空白对照孔只加入显色液和终止液, 阴性对照孔加入浓度为 0 pg/ml 的标准品稀释液, 按酶联免疫检测试剂盒说明书提供的方法检测外周血中 IL-17 的表达水平, 在酶联免疫检测仪上读取 450 nm 波长处各孔的吸光度 (D) 值, 依据标准曲线计算各样本的检测值 1.4 统计学方法采用 SPSS 17.0 统计软件对研究的结果数据进行分析计量数据以 ± s 表示, 2 组资料间的比较采用独立样本 t 检验, 多组数据间的比较采用单因素方差分析, 数据相关性分析采用 Spearson 回归分析 P < 0.05 为差异有统计学意义

3 462 宋渊, 等. 多发性骨髓瘤患者外周血 Th17 细胞的检测及其临床意义 2 结果 2.1 外周血中 Th17 细胞所占比例 FCM 法检测结果 ( 表 1) 显示,MM 患者外周血中 Th17 细胞所占比例明显高于对照组,2 组间差异有统计学意义 (t = 3.435,P = 0.001) Th17 细胞比例随着 ISS 分期的增高而上升,Ⅲ 期患者 Th17 细胞比例明显高于 Ⅰ 期和 Ⅱ 期患者, 差异有统计学意义 (t = , P = 0.01), 但 Ⅰ 期和 Ⅱ 期患者之间的差异无统计学意义 (t = ,P = 0.106) 表 1 MM 患者和健康对照者外周血中 Th17 细胞所占比例 ROR-γt mrna 和 IL-17 的表达 Table 1 The proportion of Th17 cells (helper T cells 17), the expression of ROR-γt (retinoid-related orphan receptor-γt) mrna and the concentration of IL-17 (interleukin-17) in peripheral blood in patients with MM (multiple myeloma) and the healthy volunteers ( ± s) Group Th17/% a ROR-γt mrna IL-17/(pg ml - 1 ) MM (N = 39) 3.509± ± ±4.666 ISS stage Ⅰ (n = 6) 3.047± ± ±4.527 ISS stage Ⅱ (n = 20) 3.407± ± ±3.627 ISS stage Ⅲ (n = 13) 3.880± ± ±5.063 Healthy controls (N = 30) 2.913± ± ±7.410 ISS: International staging system. a Th17 cells (helper T cells 17) /CD4 + cells. 2.2 外周血中 ROR-γt mrna 的表达水平 RT- PCR 检测结果 ( 表 1) 显示,MM 患者外周血中 ROR-γt mrna 的表达水平明显高于对照组,2 组间差异具有统计学意义 (t = 2.403,P = 0.019) ROR-γt mrna 的表达水平随着 MM 患者 ISS 分期的增高而增加,Ⅲ 期患者高于 Ⅱ 期患者,Ⅱ 期患者高于 Ⅰ 期患者,3 组之间的差异有统计学意义 (P < 0.05) 2.3 血浆 IL-17 的表达水平 ELISA 法检测结果 ( 表 1) 显示,MM 患者血浆 IL-17 的表达水平明显高于对照组,2 组之间的差异有统计学意义 (t = 2.359,P = 0.021) IL-17 的表达水平随着 MM 患者 ISS 分期的增高而增加,Ⅲ 期患者高于 Ⅱ 期患者,Ⅱ 期患者高于 Ⅰ 期患者,3 组间差异有统计学意义 (P < 0.05) 2.4 外周血中 Th17 细胞所占比例与 MM 患者临床病理特征之间的关系外周血中 Th17 细胞比例与 MM 患者的性别年龄疾病分型球蛋白免疫球蛋白轻链 M 蛋白和浆细胞比例无明显关系 (P > 0.05), 与 ISS 分期和 β2- 微球蛋白水平有关 (P < 0.05)( 表 2 和图 1) MM 初治患者外周血中 Th17 细胞所占比例为 (3.671±0.603)%, 治疗后达 CR 的患者外周血中 Th17 细胞所占比例 [(3.142±0.458)%] 较未达完全缓解患者 [(3.662 ±0.560)%] 下降更明显, 差异有统计学意义 (P = 0.020) 表 2 Th17 细胞比例与 MM 患者临床病理特征之间的关系 Table 2 The correlations of the proportion of Th17 cells (helper T cells 17) and the clinicopathologic characteristics of patients with MM (multiple myeloma) ( ± s) Characteristic N Th17/% P value Gender Male ±0.588 Female ±0.591 Age/year < ± ±0.635 Type IgG ±0.616 IgA ±0.584 Light-chain ±0.424 ISS stage Ⅰ ±0.424 Ⅱ ±0.441 Ⅲ ±0.680 State New-diagnosed ±0.603 CR ±0.458 NR ±0.560 ISS: International staging system; CR: Complete remission; NR: No-remission.

4 宋渊, 等. 多发性骨髓瘤患者外周血 Th17 细胞的检测及其临床意义 463 Fig. 1 The correlations of the proportion of Th17 cells (helper T cells 17) and the β2-microglobulin, globulin, immune globulin, light chain, M-protein and plasmocytes in peripheral blood of patients with MM (multiple myeloma). 图 1 MM 患者外周血中 Th17 细胞所占比例与 β2- 微球蛋白球蛋白免疫球蛋白轻链 M 蛋白和浆细胞间的关系 3 讨论 MM 是来源于浆细胞的恶性肿瘤, 骨髓中克隆性浆细胞异常增生, 分泌单克隆免疫球蛋白或其片段 (M 蛋白 ), 并导致相关器官或组织损伤, 常表现为骨痛贫血肾功能不全和感染等 [3] 随着硼替佐米和自体造血干细胞移植等治疗方法的应用,MM 的疗效比以前已有明显提升, 但疾病复发和难治仍是临床上面临的难题, 国际上仍认为 MM 属于不可治愈的疾病 [4] Th17 细胞是不同于 Th1 Th2 和 Treg 细胞的 CD4 + T 细胞新亚群, 因其特异性分泌 IL-17 而得名,IL-6 和转化生长因子 -β(transforming growth factor-β,tgf-β) 是其分化的始动因子, 但 TGF-β 单独存在时只能诱导初始 CD4 + T 细胞向 Treg 细胞分化 [5],IL-21 能通过正反馈作用使 Th17 细胞的分化不断扩大,IL-23 能作用于记忆性 T 细胞, 诱导其增殖 [6] 既往有研究认为, 肿瘤的发生主要与 Th1/ Th2 平衡失调有关 [7], 随着 Th1/Th2 模式逐渐被 Th1/Th2/Th17 模式取代, 越来越多的学者注意到 Th17 细胞在肿瘤中所起的作用, 但究竟起何作用仍存在争议 Zhang 等 [8] 发现, 进展期胃癌患者较早期患者和正常人外周血中 Th17 细胞增多, 且与疾病的 TNM 分期呈正相关 ;Zhang 等 [9] 发现, 随着 Th17 细胞数量的增多, 肝癌患者的 [10] 总生存期和无病生存期缩短 ;Sfanos 等却发现, 前列腺癌浸润细胞中 Th17 细胞所占比例与疾病 Gleason 分级呈负相关本研究应用 FCM RT- PCR 和 ELISA 法分别检测了 MM 患者外周血中 Th17 细胞及其特异性转录因子 ROR-γt mrna 和特异性分泌产物 IL-17 的表达, 结果发现 Th17 细胞在 MM 患者外周血中所占的比例高于对照组, 提示 Th17 细胞可能参与 MM 的免疫发病机 [11] 制并与 MM 的发病呈正相关王伟伟等认为, MM 的微环境中存在趋化因子配体 20(chemotaxis cytokine ligand 20,CCL20) 等趋化因子,Th17 细胞受趋化作用在肿瘤区聚集, 树突状细胞可将 Th17 细胞活化为 Th17-1 细胞, 起到抗肿瘤作用本研究发现,MM 患者外周血中 Th17 细胞比例与 MM 患者的性别年龄疾病分型球蛋白免疫球蛋白轻链 M 蛋白和浆细胞比例无明显关系, 提示 Th17 细胞比例的上升可能并不是 MM 患者体内瘤负荷升高的直接结果本研究也发现,Th17 细胞比例与 MM 患者 ISS 分期和 β2- 微球蛋白有关 ; 随着疾病进展,Th17 细胞比例明显增加,Ⅰ 期与 Ⅱ 期患者的 Th17 细胞比例间的差异无统计学意义,Ⅲ 期患者 Th17 细胞比例的增加较 Ⅰ 和 Ⅱ 期患者更为明显, 笔者推测 Ⅲ 期 MM 患者的肿瘤微环境中可能存在某些更

5 464 宋渊, 等. 多发性骨髓瘤患者外周血 Th17 细胞的检测及其临床意义利于 Th17 细胞分化的因素, 例如 IL-23 趋化细胞因子受体 8(chemotaxis cytokine receptors 8, CXCR8) 和干扰素诱导蛋白 10 等 [12] β2- 微球蛋白是评价 MM 患者 ISS 分期的主要指标, 这与 Th17 细胞比例与 ISS 分期和 β2- 微球蛋白明显相关是相符的 β2- 微球蛋白和 ISS 分期也是 MM 患者的重要预后因素, 笔者推测 Th17 细胞比例的高低可能部分反映 MM 患者的预后本研究也发现,MM 患者治疗后 Th17 细胞比例明显下降, 达完全缓解者较未达完全缓解者下降更为明显这一结果提示,Th17 细胞比例可能与 MM 患者的疗效有关,Th17 细胞比例高者可能代表着疗效欠佳, 但是 Th17 细胞比例下降是治疗有效的原因还是结果仍不能确定综上所述, 本研究从 Th17 细胞所占比例 Th17 的特异性转录因子 ROR-γt mrna 表达和 Th17 细胞的特异性分泌产物 IL-17 浓度等方面证实了 Th17 细胞可能参与了 MM 的发病, 为进一步探讨 Th17 细胞在 MM 的发生发展和预后中的作用提供了初步的实验依据由于 MM 患者机体的内环境十分复杂,Th17 细胞的具体作用机制仍不明确, 是否可以将 Th17 细胞作为靶点进行治疗以改善 MM 的疗效仍需更多的研究予以揭示 [ 参考文献 ] [1] CHEN X, VODANOVIC-JANKOVIC S, JOHNSON B, et al. Absence of regulatory T-cell control of TH1 and TH17 cells is responsible for the autoimmunemediated pathology in chronic graft-versus - disease[j]. Blood, 2007, 110(10): [2] 张之南, 沈涕. 血液病诊断及疗效标准 [M]. 3 版, 北京 : 科学出版社, 2007: [3] 中国医师协会血液科医师分会, 中华医学会血液学分会, 中国多发性骨髓瘤工作组. 中国多发性骨髓瘤诊治指南 (2011 年修订 )[J]. 中国内科学杂志, 2011, 50(10): [4] BLADÉ J, ROSIÑOL L, CIBEIRA M T, et al. Hematopoietic stem cell transplantation for multiple myeloma beyond 2010[J]. Blood, 2010, 115(18): [5] KORN T, BETTELLI E, GAO W, et al. IL-21 initiates an alternative pathway to induce proinflammatory T(H)17 cells[j]. Nature, 2007, 448(7152): [6] LANGRISH C L, CHEN Y, BLUMENSCHEIN W M, et al. IL-23 drives a pathogenic T cell population that induces autoimmune inflammation[j]. J Exp Med, 2005, 201(2): [7] SHARMA A, RAJAPPA M, SATYAM A, et al. Cytokines (TH1 and TH2) in patients with advanced cervical cancer undergoing neoadjuvant chemoradiation: correlation with treatment response[j]. Int J Gynecol Cancer, 2009, 19(7): [8] ZHANG B, RONG G, WEI H, et al. The prevalence of Th17 cells in patients with gastric cancer[j]. B i o c h e m B i o p h y s R e s C o m m u n, , 374(3): [9] ZHANG J P, YAN J, XU J, et al. Increased intratumoral IL-17-producing cells correlate with poor survival in hepatocellular carcinoma patients[j]. J Hepatol, 2009, 50(5): [10] SFANOS K S, BRUNO T C, MARIS C H, et al. Phenotypic analysis of prostate-infiltrating lymphocytes reveals TH17 and Treg skewing[j]. Clin Cancer Res, 2008, 14(11): [11] 王伟伟, 沈茜. Th17 细胞及其与肿瘤发生发展的关系 [J]. 肿瘤, 2009, 29(7): [12] CHARLES K A, KULBE H, SOPER R, et al. The t u m o r - p r o m o t i n g a c t i o n s o f T N F - a l p h a involve TNFR1 and IL-17 in ovarian cancer in mice and humans[j]. J Clin Invest, 2009, 119(10): [ 本文编辑 ] 张毅

< F63756D656E D2D796E2DB9A4D7F72D31C6DABFAF2D31D6D0D2BDD2A9CFD6B4FABBAF2D C4EA2DB5DA35C6DA2D30352D30322DBAFEC4CFBBF9B5D82DB8CEB2A12E6D6469>

< F63756D656E D2D796E2DB9A4D7F72D31C6DABFAF2D31D6D0D2BDD2A9CFD6B4FABBAF2D C4EA2DB5DA35C6DA2D30352D30322DBAFEC4CFBBF9B5D82DB8CEB2A12E6D6469> / 410007 HBV DCs DCs HBV PBMCs DCs DCs HLA-DR CD80 CD86 CD83 CD1 琢 DCs IFN- 琢 IL-4 HBV HBV DCs HLA-DR CD1 琢 CD83 CD80 CD86 P