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1 有 机 化 学 DI: /cjoc Chinese Journal of rganic Chemistry 红 霉 素 的 生 物 合 成 与 组 合 生 物 合 成 吴 杰 群 a,b 刘 文 b 张 嗣 良 *,a ( a 华 东 理 工 大 学 生 物 反 应 器 工 程 国 家 重 点 实 验 室 上 海 ) ( b 中 国 科 学 院 上 海 有 机 化 学 研 究 所 生 命 有 机 化 学 国 家 重 点 实 验 室 上 海 ) 摘 要 组 合 生 物 合 成 在 筛 选 和 发 展 新 型 药 物 方 面 日 益 被 生 物 化 学 和 医 药 界 所 关 注. 红 霉 素 作 为 组 合 生 物 合 成 发 展 的 模 式 化 合 物 一 直 是 人 们 研 究 的 热 点. 概 述 了 红 霉 素 的 生 物 合 成 机 制 及 近 年 来 在 此 基 础 上 采 用 组 合 生 物 合 成 获 得 红 霉 素 衍 生 物 的 研 究 进 展, 并 对 此 方 面 存 在 的 问 题 应 用 前 景 作 了 展 望. 关 键 词 红 霉 素 ; 生 物 合 成 ; 组 合 生 物 合 成 Biosynthesis and Combinatorial Biosynthesis of Erythromycin Wu, Jiequn a,b Liu, Wen b Zhang, iliang*,a ( a tate Key Laboratory of Bioreactor Engineering, East China University of cience and Technology, hanghai ) ( b tate Key Laboratory of Bio-rganic and atural Products Chemistry, hanghai Institute of rganic Chemistry, Chinese Academy of ciences, hanghai ) Abstract Combinatorial biosynthesis plays a growing role of drug discovery and development in the fields of biology, chemistry and medical sciences. Erythromycin, as the model molecule, has long been appreciated for the investigations into the biosynthesis of natural products and their associated structural diversity by pathway engineering. In this paper the progress regarding erythromycin in biosynthesis and combinatorial biosynthesis is reviewed. The problems and application prospects are also discussed. Keywords erythromycin; biosynthesis; combinatorial biosynthesis 在 化 学 结 构 方 面 具 有 丰 富 多 样 性 的 天 然 产 物, 一 直 是 人 类 治 疗 疾 病 的 主 要 药 物. 寻 找 和 开 发 新 的 天 然 产 物 药 物, 也 是 化 学 界 与 医 药 界 关 注 的 重 点 领 域. 20 世 纪 20 年 代 末 弗 莱 明 偶 然 从 青 霉 菌 里 发 现 青 霉 素, 不 仅 标 志 着 人 类 历 史 上 第 一 个 抗 生 素 的 诞 生, 同 时 也 掀 起 了 人 们 从 微 生 物 代 谢 产 物 中 寻 找 药 物 的 大 潮. 在 这 期 间, 不 仅 成 千 上 万 的 抗 生 素 被 发 现, 具 有 其 它 生 物 活 性 的 微 生 物 天 然 产 物 如 抗 真 菌 的 两 性 霉 素 (Amphotericin B) 抗 肿 瘤 的 柔 红 霉 素 (Daunorubicin) 及 免 疫 抑 制 剂 FK506 等 也 被 发 展 成 为 各 式 各 样 的 药 物. 到 20 世 纪 末 已 发 现 的 天 然 产 物 中 有 2/3 来 源 于 微 生 物 [1]. 然 而 随 着 这 些 天 然 产 物 特 别 是 抗 生 素 的 广 泛 使 用, 细 菌 对 它 们 的 耐 药 性 也 越 来 越 强. 万 古 霉 素 曾 经 很 长 一 段 时 间 被 认 为 是 抗 耐 甲 氧 西 林 金 黄 色 葡 萄 球 菌 的 最 后 一 道 防 线. 最 近 耐 万 古 霉 素 的 超 级 细 菌 也 出 现, 显 然 细 菌 对 抗 生 素 产 生 耐 药 性 是 不 可 逆 转 的 [2]. 人 类 对 感 染 性 疾 病 面 临 无 药 可 治 的 困 境, 寻 找 和 开 发 新 的 抗 生 素 显 然 成 为 人 类 迫 不 急 待 的 任 务. 然 而, 新 型 抗 生 素 发 现 的 黄 金 时 代 已 经 过 去. 近 几 十 年 来 从 常 规 环 境 中 筛 选 的 活 性 天 然 产 物 大 多 和 以 前 发 现 的 抗 生 素 具 有 相 同 或 类 似 的 结 构, 或 者 具 有 相 同 的 抗 菌 机 制 [3]. 从 极 端 环 境 微 生 物 代 谢 产 物 中 筛 选 新 的 天 然 产 物, 成 为 当 前 研 究 的 一 个 方 向 [4]. 人 们 开 发 新 来 源 活 性 天 然 产 物 的 同 时, 往 往 忽 视 了 一 个 已 经 存 在 的 活 性 天 然 产 物 宝 库. 据 估 计 目 前 大 概 有 10 5 种 的 抗 生 素 被 发 现, 但 是 只 有 10 2 种 的 抗 生 素 被 用 于 临 床 [2], 其 余 的 抗 生 素 因 为 毒 副 作 用 或 者 水 溶 性 差 或 者 抑 菌 活 性 不 高 等 原 因 而 不 能 成 为 临 床 药 物. 以 活 性 天 然 产 物 为 母 体 进 行 化 学 结 构 修 饰 合 成 新 的 衍 生 物, 与 从 环 境 中 随 机 筛 选 新 的 天 然 产 物 相 比 更 具 有 针 对 性, 因 此 也 成 为 目 前 新 药 发 展 的 重 要 途 径 之 一 [5]. 由 于 大 部 分 天 然 产 物 的 结 构 十 分 复 杂, 采 用 化 学 方 法 进 行 合 成 或 结 构 修 饰 往 往 非 常 困 难 [6]. 近 年 来 发 展 的 组 合 生 物 合 成 (Combinatorial biosynthesis) 技 术 为 复 杂 天 然 产 物 及 其 类 似 物 的 获 得 提 供 了 一 条 生 物 合 成 的 方 法 [7]. 在 掌 握 了 某 个 天 然 产 物 的 生 * siliangz@ecust.edu.cn Received ctober 8, 2011; revised January 16, 2012; published online February 8, Chinese Chemical ociety & IC, CA Chin. J. rg. Chem. 2012, 32, 1232~1240

2 Chinese Journal of rganic Chemistry 物 合 成 机 制 后, 我 们 可 以 特 异 性 地 从 遗 传 水 平 上 操 纵 天 然 产 物 的 代 谢 途 径, 以 此 获 得 基 因 重 组 菌 株 来 合 成 特 定 的 天 然 产 物 及 其 类 似 物 ; 或 者 从 基 因 水 平 对 天 然 产 物 的 生 物 合 成 途 径 进 行 重 组, 建 立 结 构 复 杂 的 天 然 产 物 类 似 物 库, 以 利 于 从 中 发 现 和 发 展 更 具 应 用 价 值 的 药 物. 目 前, 组 合 生 物 合 成 无 论 是 在 学 术 研 究 还 是 工 业 领 域, 对 于 新 药 开 发 和 生 产 的 巨 大 影 响 力 正 逐 渐 为 科 学 家 们 所 认 同. 它 们 的 成 功 运 用, 关 键 是 在 基 因 和 蛋 白 功 能 水 平 上 认 识 和 理 解 复 杂 天 然 产 物 的 生 物 合 成 及 其 调 控 机 制, 这 是 对 代 谢 途 径 进 行 针 对 性 改 造 的 分 子 和 生 化 基 础. 红 霉 素 是 一 类 用 于 治 疗 革 兰 氏 阳 性 细 菌 感 染 的 广 谱 大 环 内 酯 类 抗 生 素, 最 早 于 1952 年 从 红 色 糖 多 孢 菌 (accharopolyspora erythraea, 当 时 命 名 为 红 霉 素 链 霉 菌 treptomyces erythreus) 的 发 酵 产 物 里 分 离 得 到 [8]. 红 霉 素 A (1) 是 发 酵 液 的 主 要 产 物, 结 构 上 由 一 个 十 四 元 环 内 酯 及 在 大 环 内 酯 上 接 合 两 个 糖 基 组 成. 目 前 以 红 霉 素 A 为 基 础 开 发 出 来 的 第 二 代 红 霉 素 如 阿 齐 霉 素 (2) 克 拉 霉 素 (3) 罗 红 霉 素 (4) 以 及 第 三 代 红 霉 素 泰 利 霉 素 (5) 等 是 临 床 上 广 泛 使 用 的 抗 生 素 之 一 [9]. 这 些 对 红 霉 素 进 行 结 构 修 饰 所 产 生 的 新 一 代 药 物 不 仅 能 提 高 它 的 临 床 疗 效, 甚 至 对 原 本 红 霉 素 的 抗 菌 谱 也 有 较 大 的 扩 展 [10]. 显 然, 通 过 组 合 生 物 合 成 对 红 霉 素 进 行 结 构 改 造 在 新 药 开 发 上 具 有 巨 大 的 潜 力. 目 前 关 于 红 霉 素 的 生 物 化 学 方 面 的 研 究 有 许 多 报 道, 包 括 生 物 合 成 途 径 的 阐 明 [11] 关 键 酶 结 构 的 鉴 定 和 催 化 机 制 的 推 导 [12~14], 以 及 产 生 菌 的 全 基 因 组 测 序 等 [15], 这 为 红 霉 素 的 组 合 生 物 合 成 提 供 了 丰 富 的 理 论 基 础. 也 正 因 为 如 此, 红 霉 素 成 为 当 今 组 合 生 物 合 成 研 究 最 为 热 点 的 模 式 化 合 物. 本 文 综 述 了 近 年 来 红 霉 素 生 物 合 成 机 制 的 相 关 研 究 以 及 其 组 合 生 物 合 成 取 得 的 进 展. 1 红 霉 素 的 生 物 合 成 机 制 在 目 前 发 现 的 具 有 良 好 生 物 活 性 的 天 然 产 物 中, 聚 酮 类 化 合 物 占 据 了 很 大 的 比 例. 这 类 化 合 物 是 以 小 分 子 羧 酸 为 前 体, 通 过 聚 酮 合 酶 (polyketide synthase, PK) 催 化 合 成 的. 根 据 催 化 模 块 是 否 重 复 利 用 以 及 功 能 域 的 不 同, PK 可 分 为 I 型 II 型 和 III 型 [16]. 红 霉 素 属 于 I 型 PK 合 成 的 聚 酮 化 合 物. I 型 PK 聚 酮 合 酶 是 一 个 巨 大 的 多 功 能 蛋 白. 该 蛋 白 包 含 有 多 个 模 块 (Module), 每 个 模 块 由 不 同 功 能 的 结 构 域 组 成. 这 些 结 构 域 按 功 能 可 分 为 : 酰 基 转 移 酶 (acyltransferase, AT), 酰 基 载 体 蛋 白 (acyl carrier protein ), β- 酮 基 硫 酯 合 成 酶 (ketosynthase, K), β- 酮 基 还 原 酶 (ketoreductase, ), 脱 水 酶 (dehydratase, DH) 和 烯 醇 还 原 酶 (enoylreductase, ER) 等 功 能 域. H H H 红 霉 素 A (1) Erthromycin A H H H CH 3 H H H H H 泰 利 霉 素 (5) Telithromycin H H 阿 齐 霉 素 (2) Azithromycin H H H H 克 拉 霉 素 (3) 罗 红 霉 素 (4) Clarithromycin Roxithromycin H 红 霉 素 的 生 物 合 成 的 起 始 步 骤 是 由 1 分 子 的 丙 酰 辅 酶 A 和 6 分 子 的 甲 基 丙 二 酸 单 酰 辅 酶 A 通 过 I 型 PK 聚 酮 合 酶 复 合 酶 系 缩 合 而 成 6- 脱 氧 红 霉 内 酯 (6-deoxyerythronolide B, 6-dEB, 6) [17]. 该 复 合 酶 系 包 含 三 个 酶 蛋 白 亚 基 : DEB1, DEB2 和 DEB3, 共 由 1 个 起 始 模 块 和 6 个 延 伸 模 块 组 成 [18]. 6- 脱 氧 红 霉 内 酯 的 合 成 首 先 通 过 起 始 模 块 中 的 酰 基 转 移 酶 AT 0 特 异 性 识 别 丙 酰 辅 酶 A, 将 其 转 移 到 酰 基 载 体 蛋 白 0 上 作 为 合 成 的 起 始 单 元. 随 后 起 始 单 元 被 转 移 到 第 一 个 延 伸 模 块 的 β- 酮 基 硫 酯 合 成 酶 K 1 上, 同 时 第 一 个 延 伸 模 块 中 的 AT 1 特 异 识 别 甲 基 丙 二 酸 单 酰 辅 酶 A 为 底 物 并 将 其 转 移 到 第 一 个 延 伸 模 块 的 酰 基 载 体 蛋 白 1 上. 在 1 上 K 1 催 化 起 始 单 元 丙 酰 基 与 延 伸 单 元 物 甲 基 丙 二 酸 单 酰 基 缩 合 形 成 β- 酮 完 成 第 一 轮 延 伸. 其 它 5 个 延 伸 模 块 采 用 类 似 的 机 理 依 次 线 性 完 成 缩 合. 在 每 一 轮 延 伸 后, 主 链 骨 架 都 增 加 两 碳 单 元, 最 终 形 成 一 个 十 四 碳 骨 架 的 单 元 链. 在 DEB3 的 羟 基 端 有 一 个 硫 酯 酶 域 (Thioesterase, TE), 负 责 将 合 成 的 长 链 脂 肪 酸 从 PK 上 水 解 下 来 环 化 形 成 一 个 十 四 元 环 的 化 合 物 6- 脱 氧 红 霉 内 酯 ( 图 1). 从 该 合 成 过 程 可 以 看 出 β- 酮 基 硫 酯 合 成 酶 K 酰 基 转 移 酶 AT 和 酰 基 载 体 蛋 白 是 每 个 延 伸 模 块 所 必 须 H H Chin. J. rg. Chem. 2012, 32, 1232~ Chinese Chemical ociety & IC, CA

3 有 机 化 学 的 基 本 功 能 域, 模 块 含 有 的 β- 酮 基 还 原 酶 脱 水 酶 DH 和 烯 醇 还 原 酶 ER 等 功 能 域, 会 对 单 元 链 进 行 修 饰 [18]. 在 合 成 6- 脱 氧 红 霉 内 酯 后, 红 霉 素 的 生 物 合 成 进 入 了 大 环 内 酯 环 的 后 修 饰 阶 段. 内 酯 环 的 后 修 饰 首 先 是 通 过 一 个 细 胞 色 素 P450 系 的 羟 化 酶 (EryF) 在 6- 脱 氧 红 霉 内 酯 大 环 骨 架 C-6 位 接 上 一 个 羟 基 形 成 红 霉 内 酯 (erythronolide B, EB, 7). 然 后 再 在 红 霉 内 酯 大 环 骨 架 C-3 羟 基 的 位 置 上 由 糖 基 转 移 酶 (EryBV) 连 接 上 一 个 L- 碳 霉 糖 (mycarose) 形 成 3-- 碳 霉 糖 基 红 霉 内 酯 (3-α-mycarosyl erythronolide B, MEB, 8). 紧 接 着 又 通 过 另 外 一 个 糖 基 转 移 酶 (EryCIII) 在 C-5 羟 基 的 位 置 上 连 接 一 个 D- 德 胺 糖 (desosamine), 从 而 形 成 红 霉 素 合 成 中 间 代 谢 产 物 中 第 一 个 有 生 物 活 性 的 物 质 红 霉 素 D. 红 霉 素 D 在 一 个 C-12 羟 化 酶 (EryK) 的 催 化 下 合 成 红 霉 素 C, 然 后 红 霉 素 C 在 一 个 由 AM 依 赖 的 甲 基 化 酶 (EyG) 作 用 下 在 C-3 的 碳 霉 糖 上 加 上 一 个 甲 基 合 成 最 终 产 物 红 霉 素 A. 此 外, 红 霉 素 D 也 可 以 先 在 甲 基 化 酶 (EryG) 的 作 用 下 在 C-3 碳 霉 糖 的 糖 基 上 得 到 一 个 甲 基 合 成 红 霉 素 B, 再 通 过 羟 化 酶 (EryK) 在 C-12 位 置 羟 化 合 成 红 霉 素 A. 此 条 途 径 催 化 效 率 较 低, 为 红 霉 素 A 合 成 的 副 途 径 [19] ( 图 2). 在 红 霉 素 工 业 生 产 的 发 酵 液 里 有 大 量 中 间 产 物 红 霉 素 B 和 红 霉 素 C 积 累 [20]. 红 霉 素 B 和 红 霉 素 C 的 抗 菌 活 性 要 比 红 霉 素 A 低, 毒 副 作 用 却 比 红 霉 素 A 大, 在 红 霉 素 工 业 生 产 过 程 中 属 于 很 难 除 去 但 又 必 须 除 去 的 杂 质. 本 实 验 室 通 过 增 加 优 化 红 色 糖 多 孢 菌 eryk 和 eryg 基 因 拷 贝 数 来 调 控 对 应 酶 的 活 性, 成 功 地 在 细 胞 内 把 红 霉 素 B 和 红 霉 素 C 完 全 转 化 为 红 霉 素 A, 为 红 霉 素 的 工 业 生 产 带 来 了 便 利 [21,22]. 2 红 霉 素 的 组 合 生 物 合 成 研 究 红 霉 素 的 生 物 合 成 可 以 简 单 地 归 为 内 酯 环 的 形 成 和 内 酯 环 的 后 修 饰 两 部 分. 对 红 霉 素 的 组 合 生 物 合 成 研 究, 也 可 以 分 为 两 个 方 向 : 一 个 方 向 是 对 合 成 红 霉 素 大 环 内 酯 的 PK 进 行 遗 传 操 作, 改 变 大 环 内 酯 的 结 构 ; 另 一 个 方 向 是 对 红 霉 素 合 成 的 后 修 饰 途 径 进 行 改 造, 合 成 具 有 不 同 糖 基 的 红 霉 素 类 似 物. CH CoA (2)-methylmalonyl-CoA DEB1 DEB2 DEB3 Loading AT K Module 1 Module 2 Module 3 Module 4 DH AT K AT K AT K AT K AT K AT TE ER Module 5 Module 6 H H H H H H H H H CoA Propionyl-CoA H H H H H H H H 6-dEB (6) 图 1 红 霉 素 DEB 蛋 白 的 模 块 组 成 Figure 1 Modular organization of deoxyerythronolide B synthase (DEB) Chinese Chemical ociety & IC, CA Chin. J. rg. Chem. 2012, 32, 1232~1240

4 Chinese Journal of rganic Chemistry 6 EryF H H Er-D (9) H H EB (7) H H H H EryK EryBV H EryG H H MEB (8) H H H Er-C (10) H H H Er-B (11) H H H H H H EryCIII H EryG EryK 图 2 合 成 红 霉 素 A 的 后 修 饰 步 骤 Figure 2 Post-PK pathway in erythromycin A biosynthesis I 型 PK 聚 酮 合 酶 是 以 模 块 组 合 形 式 存 在, 每 一 模 块 含 有 一 套 非 重 复 使 用 的 催 化 功 能 域, 催 化 反 应 与 功 能 域 呈 一 一 对 应 的 线 性 关 系. 在 PK 的 亚 基 模 块 或 者 结 构 域 中 任 何 一 点 功 能 上 的 改 变, 都 将 对 大 环 内 酯 合 成 线 性 顺 序 反 应 中 的 某 一 步 产 生 影 响, 使 合 成 的 大 环 内 酯 结 构 发 生 细 微 的 变 化, 最 终 将 产 生 结 构 类 似 但 又 不 完 全 相 同 的 聚 酮 化 合 物. 目 前 对 红 霉 素 大 环 内 酯 组 合 生 物 合 成 研 究 主 要 集 中 在 模 块 功 能 域 的 改 变 上, 常 用 的 分 子 生 物 学 操 作 手 段 包 括 结 构 域 的 点 突 变 失 活 替 换, 模 块 的 替 换 或 插 入, 不 同 蛋 白 亚 基 之 间 的 杂 交 等 [23]. 2.1 酰 基 转 移 酶 AT 酰 基 转 移 酶 AT 负 责 特 异 性 识 别 底 物, 替 换 识 别 不 同 底 物 的 模 块, 可 以 使 不 同 的 底 物 掺 入 内 酯 环 的 合 成 中. 在 6- 脱 氧 红 霉 内 酯 合 成 过 程 中 6 个 延 伸 模 块 的 酰 基 转 移 酶 AT 都 特 异 识 别 甲 基 丙 二 酸 单 酰 辅 酰 A 为 底 物, 将 特 异 识 别 丙 二 酰 辅 酶 A 的 AT 结 构 域 分 别 替 换 模 块 1 到 模 块 6 的 AT 结 构 域, 将 分 别 产 生 在 内 酯 环 C-12, C-10, C-8, C-6, C-4 和 C-2 位 置 缺 少 甲 基 的 红 霉 素 结 构 类 似 物 12~17 [24~27]. 1 H H H H H H H H H H H H H H H H H H H H H H 同 样 采 用 一 个 识 别 乙 基 丙 二 酰 辅 酶 A 为 底 物 的 AT 功 能 域 ( 来 自 iddamycin 的 PK 模 块 7) 替 换 红 霉 素 PK 模 块 5, 则 可 获 得 C-6 位 上 的 乙 基 取 代 类 似 物 18 [28]. H H H 18 对 于 红 霉 素 聚 酮 合 酶 PK 起 始 模 块 中 的 酰 基 转 移 酶 AT, 其 本 身 在 红 色 糖 多 孢 菌 体 内 选 择 性 识 别 丙 酰 辅 酶 A 为 底 物. 而 阿 维 菌 素 合 成 PK 中 起 始 模 块 的 AT 具 有 广 泛 底 物 选 择 性 的, 把 后 者 的 AT- 区 域 替 换 原 本 红 霉 素 合 成 PK 所 对 应 的 区 域 后, 杂 合 的 PK 能 够 识 别 异 丁 酰 辅 酶 A 或 者 2- 甲 基 丁 酰 辅 酶 A 为 起 始 单 元, 合 成 C-13 位 上 带 异 丙 基 或 2- 丁 基 的 红 霉 素 结 构 类 似 物 19~24 [29]. 红 霉 素 PK 的 起 始 模 块 仅 含 有 AT- 结 构 域, 但 是 许 多 I 型 PK 聚 酮 化 合 物 如 泰 乐 菌 素 (tylosin) [30] 苦 霉 素 (pikromycin) [31] 多 杀 菌 素 (spinosyn) [32] 等 的 起 始 模 块 AT- 结 构 域 的 前 端 还 含 有 KQ 功 能 域. 这 种 结 构 单 元 的 起 始 模 块 AT 首 先 识 别 的 是 二 Chin. J. rg. Chem. 2012, 32, 1232~ Chinese Chemical ociety & IC, CA

5 有 机 化 学 酸 单 酰 辅 酶 A, 结 合 到 酰 基 载 体 蛋 白 后 并 不 是 直 接 转 移 到 延 伸 模 块 的 K 结 构 域 中, 而 是 由 其 自 身 模 块 的 酮 基 硫 酯 合 成 酶 KQ 结 构 域 催 化 脱 羧, 再 转 移 到 第 一 个 延 伸 模 块 的 酮 基 硫 酯 合 成 酶 K1 上 进 行 下 一 步 的 合 成 ( 图 3). 2.2 红 霉 素 PK 结 构 修 饰 功 能 域 的 改 变 在 I 型 PK 的 某 些 模 块 组 合 有 β- 酮 基 还 原 酶 脱 水 酶 DH 和 烯 醇 还 原 酶 ER 等 功 能 域, 这 些 功 能 域 非 PK 催 化 反 应 往 下 延 伸 的 必 须 基 团, 但 它 们 的 存 在 会 影 响 大 环 骨 架 上 β- 羰 基 的 还 原 水 平. 这 些 结 构 域 的 功 能 如 cheme 1 所 示 [34]. R 2 H H H R 1 R 1 R 2 R 1 H R 2 DH A B H R 3 H 19 R 1 = iso-propyl, R 2 = H, R 3 = CH 3 20 R 1 = iso-propyl, R 2 = H, R 3 = CH 3 21 R 1 = iso-propyl, R 2 = H, R 3 = H 22 R 1 = sec-butyl, R 2 = H, R 3 = CH 3 23 R 1 = sec-butyl, R 2 = H, R 3 = CH 3 24 R 1 = sec-butyl, R 2 = H, R 3 = H 25 R 1 = CH 3, R 2 = H, R 3 = CH 3 26 R 1 = CH 3, R 2 = H, R 3 = CH 3 CoA CoA KQ AT H KQ AT AT K1 K1 K1 AT KQ AT H K1 K1 ER R 1 R 1 R 2 R 2 cheme 1 分 别 对 红 霉 素 PK 延 伸 模 块 6 中 酮 基 还 原 酶 功 能 域 和 模 块 4 中 烯 醇 还 原 酶 ER 功 能 域 失 活, 可 以 得 到 相 应 的 C-3 酮 基 类 似 物 27 和 C-6-C-7 不 饱 和 类 似 物 28 [35,36]. 此 外, 直 接 删 除 红 霉 素 PK 延 伸 模 块 6 中 酮 基 还 原 酶 结 构 域 将 影 响 与 之 相 连 的 AT 结 构 域 的 底 物 识 别 特 异 性, 结 果 除 了 产 生 化 合 物 27 外, 还 产 生 预 料 不 到 的 化 合 物 29 [23]. 对 红 霉 素 PK 唯 一 DH( 延 伸 模 块 4) 活 性 中 心 的 点 突 变, 将 导 致 DEB 蛋 白 的 完 全 失 活 [37], 可 见 组 合 生 物 合 成 过 程 中 基 因 操 纵 的 方 法 也 起 关 键 作 用. H H H H H H H 图 3 聚 酮 链 起 始 单 元 的 不 同 催 化 机 制 Figure 3 Alternative mechanisms for polyketide chain initiation (A) Erythromycin DEB chian initiation: transfer of propionate group from CoA to. (B) Chain initiation on KQ-containing loading modules: transfer methylmalonyl gourp from CoA to then decarboxylation by KQ [33] 把 oleandomycin 起 始 模 块 KQ 结 构 域 与 雷 帕 霉 素 rapamycin 延 伸 模 块 2 中 的 AT2 结 构 域 ( 识 别 丙 二 酰 辅 酶 A) 相 连, 用 此 结 构 域 替 换 红 霉 素 PK 起 始 模 块 的 AT 结 构 域 ( 识 别 丙 酰 辅 酶 A), 能 够 使 该 杂 合 模 块 最 终 把 丙 酰 基 传 递 到 红 霉 素 PK 第 一 个 延 伸 模 块 的 酮 基 硫 酯 合 成 酶 K 上, 从 而 产 生 内 酯 环 C-13 带 有 甲 基 的 红 霉 素 类 似 物 25, 26 [33] 除 了 对 这 些 功 能 域 的 删 除, 在 红 霉 素 的 PK 中 增 加 相 关 的 功 能 域, 同 样 能 产 生 红 霉 素 的 一 些 结 构 类 似 物. McDaniel 等 采 用 合 成 雷 帕 霉 素 PK 延 伸 模 块 4 的 DH/ 结 构 域 分 别 替 换 红 霉 素 PK 延 伸 模 块 2 模 块 6 中 的 结 构 域, 分 别 产 生 内 酯 环 上 含 有 烯 键 的 化 合 物 30, 31. 而 采 用 雷 帕 霉 素 PK 中 的 延 伸 模 块 1 的 DH/ER/ 结 构 域 分 别 替 换 红 霉 素 PK 延 伸 模 块 2 模 块 5 中 的 结 构 域 则 产 生 内 酯 环 脱 羟 基 的 化 合 物 32, 33. 但 令 人 意 外 的 是 采 用 此 结 构 域 替 换 红 霉 素 PK 延 伸 模 块 6 时, 并 未 发 现 脱 羟 基 化 合 物 34 出 现, 反 而 有 较 多 的 化 合 物 27 和 31 积 累 [25], 可 见 替 换 后 的 模 块 ER 无 活 性, 功 能 不 完 全. 这 点 可 以 反 映 插 入 模 块 的 功 能 受 整 体 结 构 的 影 响. 同 时 基 于 这 个 酶 学 催 化 基 础, 作 者 把 Chinese Chemical ociety & IC, CA Chin. J. rg. Chem. 2012, 32, 1232~1240

6 Chinese Journal of rganic Chemistry 各 种 聚 酮 类 的 结 构 域 或 模 块 互 相 组 合, 分 别 得 到 多 种 组 合 突 变 的 重 组 子, 表 达 得 到 近 60 种 6- 脱 氧 红 霉 内 酯 类 似 物 库. 这 占 当 时 已 知 的 所 有 聚 酮 化 合 物 数 量 的 3%, 而 且 已 经 超 过 之 前 自 然 界 所 发 现 的 不 同 大 环 内 酯 环 结 构 的 总 量. 值 得 注 意 的 是, 这 些 复 杂 的 结 构 类 似 物 采 用 化 学 合 成 的 方 法 都 是 很 难 获 得 的. 这 些 研 究 充 分 体 现 了 组 合 生 物 合 成 在 扩 展 天 然 产 物 结 构 多 样 性 方 面 的 巨 大 潜 力. H H H H H H H H H H 内 酯 环 单 元 数 的 改 变 红 霉 素 大 环 内 酯 合 成 单 元 链 完 成 延 伸 后 在 DEB3 的 羟 基 端 有 一 个 硫 酯 酶 酶 域 TE, 负 责 将 合 成 的 长 链 脂 肪 酸 从 PK 上 水 解 下 来, 并 与 PK 的 其 它 部 位 共 同 作 用, 将 产 物 环 化 成 一 个 十 四 元 环 的 化 合 物 6- 脱 氧 红 霉 内 酯 [38]. 硫 酯 酶 酶 域 TE 对 聚 酮 链 的 长 度 有 较 高 的 容 忍 性, 能 够 识 别 环 化 不 同 数 目 碳 链 原 子 形 成 数 目 不 同 元 环. 如 把 TE 结 构 域 连 到 DEB1 的 羟 基 末 端 能 够 产 生 6 元 环 内 酯 化 合 物 35 [39]. 有 趣 的 是 直 接 把 含 有 红 霉 素 合 成 延 伸 模 块 5 和 模 块 6 及 TE 的 DEB3 基 因 导 入 到 天 蓝 色 链 霉 菌. coelicolor CH999 中, 在 不 含 loading domain 的 情 况 下, 该 蛋 白 识 别 甲 基 丙 二 酸 单 酰 辅 酶 A 为 底 物 脱 羧 形 成 丙 酰 基 往 下 继 续 延 伸 环 化 形 成 6 元 环 内 酯 36 [40]. 这 种 合 成 机 制 与 前 面 所 述 起 始 模 块 含 有 Q 结 构 域 的 催 化 机 制 相 似 ( 图 3). 化 合 物 36 的 构 型 与 35 不 同 在 于 β- 酮 基 还 原 酶 功 能 域 催 化 的 立 体 选 择 性 : 红 霉 素 合 成 延 伸 模 块 1 的 1 功 能 域 把 聚 酮 中 间 产 物 β- 酮 基 催 化 还 原 成 羟 基 时 专 一 地 产 生 R 构 型 产 物, 而 其 它 模 块 的 β- 酮 基 还 原 酶 如 2, 5, 6 都 产 生 构 型 的 产 物 [41,42]. 功 能 域 属 于 一 类 短 链 还 原 酶 (short-chain dehydrogenase/reductase, DR) 家 族 的 酶 系 [43], 此 家 族 酶 系 活 性 位 点 中 含 有 非 常 保 守 的 赖 氨 酸 丝 氨 酸 及 酪 氨 酸 残 基, 活 性 中 心 的 结 构 具 有 较 高 的 相 似 性. 但 催 化 产 生 R 构 型 化 合 物 的 活 性 中 心 一 侧 含 有 一 个 高 度 保 守 的 天 冬 氨 酸 残 基, 而 还 原 产 生 构 型 化 合 物 的 活 性 中 心 则 缺 少 此 天 冬 氨 酸 残 基, 但 在 活 性 中 心 相 反 的 一 侧 含 有 一 个 色 氨 酸 残 基. 这 些 活 性 中 心 结 构 上 细 微 差 异 使 聚 酮 类 化 合 物 ( 底 物 ) 进 入 活 性 中 心 时 的 方 向 不 同, 从 而 最 终 使 还 原 产 物 形 成 不 同 的 立 体 构 型 [36,41,44]. 把 TE 结 构 域 连 到 延 伸 模 块 5 的 羟 基 端 能 够 产 生 12 元 环 内 酯 [45], 把 合 成 雷 帕 霉 素 rapamycin PK 模 块 2 或 模 块 5 插 入 到 红 霉 素 PK 延 伸 模 块 1 后 面 后, 能 够 产 生 16 元 环 化 合 物 38, 39 及 在 C-13 位 环 化 的 十 四 元 环 产 物 40, 41 [46]. 2.4 后 修 饰 途 径 过 程 中 的 组 合 生 物 合 成 红 霉 素 生 物 合 成 的 后 修 饰 过 程 包 括 在 6- 脱 氧 红 霉 内 酯 环 上 羟 基 化 糖 基 化 以 及 在 糖 基 上 的 甲 基 化. 对 这 些 修 饰 途 径 关 键 基 因 的 敲 除, 都 会 导 致 前 面 中 间 代 谢 产 物 的 积 累, 从 而 在 细 胞 中 合 成 红 霉 素 A 的 一 系 列 类 似 物 ( 化 合 物 6~11). 目 前 人 们 在 红 霉 素 合 成 后 修 饰 途 径 组 合 生 物 合 成 中 最 感 兴 趣 的 是 内 酯 环 的 糖 基 化, 这 些 糖 基 是 红 霉 素 生 物 活 性 的 关 键 所 在. 有 报 道 显 示 德 胺 糖 (desosamine) 存 在 于 所 有 14 元 大 环 内 酯 活 性 天 然 产 物 中, 是 红 霉 素 与 核 糖 体 接 合 从 而 抑 制 细 菌 生 长 的 一 个 关 键 因 素 [23,47]. C-3 上 的 L- 碳 霉 糖 (mycarose) 并 不 是 红 霉 素 抗 菌 活 性 所 必 须 的, 而 且 去 除 以 后 的 红 霉 素 衍 生 物 对 一 些 原 本 对 红 霉 素 有 耐 药 性 的 细 菌 产 生 抗 性 [48]. 这 些 发 现 都 显 示 着 糖 基 在 红 霉 素 生 物 活 性 上 的 重 要 作 用, 因 此 糖 基 的 改 变 也 成 为 红 霉 素 组 合 生 物 合 成 研 究 的 一 个 热 点. 糖 基 转 移 酶 EryBV 催 化 红 霉 素 内 酯 环 C-3 羟 基 上 的 糖 基 化, 对 其 体 外 测 活 实 验 表 明, EryBV 能 够 识 别 一 系 列 其 它 的 糖 基 作 为 底 物 合 成 红 霉 素 类 似 物, 虽 然 目 前 从 [49] 催 化 效 率 上 看 还 比 较 低. 糖 基 转 移 酶 EryCIII 催 化 C-5 羟 基 上 的 糖 基 化, 相 对 而 言 有 较 高 的 底 物 特 异 性 [50]. 但 目 前 仍 然 有 报 道 显 示 EryCIII 能 够 把 D-mycaminose 转 移 到 内 酯 环 的 C-5 羟 基 上 从 而 形 成 新 的 红 霉 素 类 似 物 红 霉 素 M (53) [51], 此 外 在 缺 乏 底 物 D-desosamine 时, EryCIII 还 能 再 识 别 一 个 mycarose 催 化 形 成 化 合 物 54 [52]. 某 些 外 源 的 糖 基 转 移 酶 对 底 物 容 忍 性 比 较 高, 能 够 将 糖 基 转 移 至 红 霉 素 内 酯 环 上. 如 来 自. eurythermus 的 AngMII 是 泰 乐 菌 素 合 成 中 糖 基 化 酶, 利 用 tylactone (55) 作 为 天 然 底 物 在 C-5 羟 基 上 糖 基 化 D-mycaminose 产 生 化 合 物 56 (Eq. 1). 研 究 发 现 AngMII 糖 基 化 酶 能 够 识 别 以 十 四 元 环 的 erythronolide B (7) 为 底 物, 催 化 合 成 化 合 物 57 (Eq. 2) [52]. 令 人 意 外 的 是 该 酶 在 十 六 元 环 中 糖 基 化 的 位 置 是 C-5 的 羟 基, 可 是 在 红 霉 素 14 元 环 中 糖 基 化 的 位 置 却 是 C-3 的 羟 基. Chin. J. rg. Chem. 2012, 32, 1232~ Chinese Chemical ociety & IC, CA

7 有 机 化 学 A Loading Module 1 Module 2 H B Module 5 Module 6 H AT K AT K AT TE 35 K AT K AT TE 36 C Loading AT K Module 2 Module 4 Module 1 Module 3 Module 5 ER DH AT K AT K AT K AT K AT TE H H Me H R H H R = Et 40 R = Et 39 R = Me 41 R = Me R H H H H D Loading AT K Module 1 Rap Module 2 Module 4 Module 2 or 5 Module 3 Module 5 ER AT K AT Module 6 DH K AT K AT K AT K AT K AT TE 图 4 杂 合 PK 的 结 构 与 其 催 化 合 成 的 产 物 Figure 4 Domain organization of hybrid PKs and their products H 3 R = H (7), H (42), H (43), H H H H H H (44), H H (45), H (46), H H H H H2 H 2 H H H H H H (47), H H (48), H 3 H H H R 7, 42 ~ 52 (50), H H H H (49), H (51), (52) H H 还 有 报 道 显 示, 与 红 霉 素 结 构 非 常 相 似 的 另 外 一 个 天 然 产 物 苦 霉 素 picromycin C-5 羟 基 的 德 胺 糖 转 移 酶 对 底 物 的 容 忍 性 也 比 较 宽 泛, 能 够 识 别 一 系 列 6- 脱 氧 红 霉 H H H H H H H H H H H 53 H 54 (1) H H H H H H (2) 7 H H Chinese Chemical ociety & IC, CA Chin. J. rg. Chem. 2012, 32, 1232~1240

8 Chinese Journal of rganic Chemistry 内 酯 的 结 构 类 似 物. 用 这 种 方 法 可 以 合 成 超 过 20 种 以 上 的 新 化 合 物 [53]. 3 问 题 和 展 望 在 新 药 的 研 发 领 域, 通 过 组 合 生 物 合 成 优 化 先 导 化 合 物 的 结 构 与 随 机 合 成 化 合 物 库 筛 选 相 比 具 有 明 显 的 优 势. 综 合 使 用 上 述 方 法 对 红 霉 素 进 行 组 合 生 物 合 成 理 论 上 几 乎 可 以 产 生 无 数 种 红 霉 素 的 结 构 类 似 物. 但 是 在 实 际 操 作 过 程 中 新 化 合 物 能 否 被 催 化 合 成 取 决 于 酶 对 于 底 物 的 容 忍 性. 一 个 不 容 忽 视 的 问 题 是 绝 大 多 数 经 过 组 合 生 物 合 成 手 段 合 成 的 结 构 类 似 物 产 量 要 比 原 始 的 天 然 产 物 低, 很 多 情 况 得 到 目 标 产 物 的 量 甚 至 没 有 利 用 价 值. 产 生 这 种 现 象 的 根 本 原 因 在 于 酶 的 结 构 与 底 物 的 关 系 发 生 改 变. 在 自 然 界 中 存 在 的 酶 催 化 反 应 都 是 由 千 百 万 年 进 化 而 来, 天 然 的 酶 与 天 然 的 底 物 在 进 化 过 程 中 已 经 处 于 一 个 相 对 最 适 的 状 态. 一 方 面 通 过 人 为 的 方 法 产 生 新 杂 合 酶 从 概 率 上 来 说 是 很 难 比 天 然 的 酶 对 底 物 更 加 匹 配. 另 一 方 面 由 新 的 杂 合 酶 催 化 合 成 的 新 化 合 物 也 很 难 比 天 然 的 代 谢 中 间 产 物 更 易 被 后 续 合 成 途 径 的 酶 所 识 别. 解 决 这 个 问 题 可 以 从 两 个 思 路 出 发 : 一 个 思 路 是 从 酶 结 构 与 功 能 的 关 系 考 虑, 在 构 建 杂 合 酶 的 过 程 中 尽 量 对 酶 的 结 构 破 坏 最 小. 采 用 关 键 活 性 位 点 突 变 的 方 法 对 I 型 PK 中 某 个 功 能 域 的 失 活 能 减 少 对 聚 酮 合 酶 整 体 结 构 的 破 坏, 获 得 较 高 产 量 的 目 标 产 物 [34]. 在 功 能 域 之 间 的 替 换 或 者 插 入 过 程 中, 新 的 结 构 域 与 原 来 结 构 域 之 间 连 接 边 界 的 选 择 是 杂 合 酶 有 否 有 活 性 的 关 键 所 在, 这 主 要 是 因 为 新 插 入 或 者 删 除 的 肽 段 对 整 体 蛋 白 结 构 的 破 坏 [23]. 这 种 破 坏 更 多 的 体 现 在 蛋 白 质 三 级 结 构 的 破 坏 上, 有 报 道 显 示 利 用 合 成 苦 霉 素 PK 的 pikai, pikaii 亚 基 与 合 成 红 霉 素 PK 的 DEB3 亚 基 形 成 组 合 蛋 白 [54], 要 比 直 接 在 红 霉 素 PK 的 DEB2 进 行 功 能 域 [25] 替 换 产 生 的 杂 合 蛋 白 催 化 产 生 化 合 物 58 的 量 高 出 100 多 倍. 第 二 个 思 路 是 从 酶 催 化 反 应 动 力 学 的 角 度 出 发, 增 加 反 应 体 系 中 酶 和 底 物 的 浓 度. 在 生 物 合 成 的 过 程 中, 反 应 体 系 即 细 胞 宿 主. 改 善 细 胞 中 红 霉 素 合 成 前 体 底 物 丙 酰 辅 酶 A 及 甲 基 丙 二 酸 单 酰 辅 酶 A 的 供 应 量 [55,56], 能 够 显 著 提 高 红 霉 素 的 产 量. 同 时, 采 用 红 霉 素 高 产 菌 株 作 为 宿 主 来 生 产 红 霉 素 的 结 构 类 似 物, 目 标 产 物 的 量 同 样 有 明 显 提 高 [57]. 由 于 在 大 肠 杆 菌 中 可 以 方 便 的 进 行 基 因 操 作, 强 化 外 源 蛋 白 的 表 达 以 及 控 制 前 体 合 成, 也 是 一 个 较 佳 的 组 合 生 物 合 成 宿 主. 最 近 红 霉 素 A 及 其 组 合 生 物 合 成 得 到 的 结 构 类 似 物 在 大 肠 杆 菌 内 异 源 表 达 成 功, 这 为 I 型 PK 聚 酮 类 化 合 物 的 生 物 合 成 开 辟 了 一 条 新 的 道 路 [58]. 目 前 第 二 代 第 三 代 红 霉 素 药 物 是 人 类 使 用 最 为 广 58 泛 的 抗 生 素 之 一, 需 求 量 巨 大. 这 些 药 物 的 合 成 都 是 以 红 霉 素 A 为 原 料 通 过 对 大 环 内 酯 骨 架 的 化 学 修 饰 来 获 得 的, 工 艺 较 为 复 杂, 容 易 造 成 环 境 污 染. 但 是 从 化 学 结 构 来 看, 红 霉 素 A (1) 并 非 是 这 些 药 物 2~5 化 学 合 成 的 最 佳 起 始 物. 由 于 红 霉 素 A 可 以 从 细 菌 发 酵 液 里 直 接 提 取, 是 目 前 市 场 上 唯 一 可 以 提 供 的 14 元 大 环 内 酯 类 大 宗 原 料 药, 所 有 红 霉 素 类 药 物 的 化 学 合 成 均 由 红 霉 素 A 衍 生 而 来. 采 用 组 合 生 物 合 成 的 方 法 在 细 胞 中 生 产 更 佳 的 红 霉 素 类 药 物 中 间 体 或 者 直 接 生 产 新 一 代 的 红 霉 素 将 是 开 发 红 霉 素 新 合 成 路 线 的 新 思 路. 综 上 所 述, 随 着 组 合 生 物 合 成 技 术 的 成 功 应 用, 化 学 合 成 与 生 物 合 成 将 更 加 紧 密 地 联 系 在 一 起, 从 而 促 进 新 药 的 开 发 和 发 展, 成 为 人 类 战 胜 各 种 疾 病 的 有 力 武 器. References [1] Demain, A. L. Appl. Microbiol. Biotechnol. 1999, 52, 455. [2] pizek, J.; ovotna, J.; Rezanka, T.; Demain, A. L. J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 2010, 37, [3] Walsh, C.; Wright, G. Chem. Rev. 2005, 105, 391. [4] Li, J. W.; Vederas, J. C. cience 2009, 325, 161. [5] ewman, D. J.; Cragg, G. M.; nader, K. M. J. at. Prod. 2003, 66, [6] hen, B.; Liu, W.; onaka, K. Curr. Med. Chem. 2003, 10, [7] Walsh, C. T. ChemBioChem 2002, 3, 125. [8] McGuire, J. M.; Bunch, R. L.; Anderson, R. C.; Boaz, H. E.; Flynn, E. H.; Powell, H. M.; mith, J. W. chweiz Med. Wochenschr. 1952, 82, [9] Bosnar, M.; Kelneric, Z.; Munic, V.; Erakovic, V.; Parnham, M. J. Antimicrob. Agents Chemother. 2005, 49, [10] Ma, Z.; emoto, P. A. Curr. Med. Chem. Anti-Infective Agents 2002, 1, 15. [11] taunton, J.; Wilkinson, B. Chem. Rev. 1997, 97, [12] avino, C.; Montemiglio, L. C.; ciara, G.; Miele, A. E.; Kendrew,. G.; Jemth, P.; Gianni,.; Vallone, B. J. Biol. Chem. 2009, 284, [13] Cupp-Vickery, J. R.; Poulos, T. L. at. truct. Biol. 1995, 2, 144. [14] Keatinge-Clay, A. J. Mol. Biol. 2008, 384, 941. [15] liynyk, M.; amborskyy, M.; Lester, J. B.; Mironenko, T.; cott,.; Dickens,.; Haydock,. F.; Leadlay, P. F. at. Biotechnol. 2007, 25, 447. [16] hen, B. Curr. pin. Chem. Biol. 2003, 7, 285. [17] Donadio,.; taver, M. J.; McAlpine, J. B.; wanson,. J.; Katz, L. cience 1991, 252, 675. [18] taunton, J.; Weissman, K. J. at. Prod. Rep. 2001, 18, 380. [19] Weber, J. M.; Leung, J..; wanson,. J.; Idler, K. B.; McAlpine, J. B. cience 1991, 252, 114. H H Chin. J. rg. Chem. 2012, 32, 1232~ Chinese Chemical ociety & IC, CA

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