临床肝胆病杂志 2011年 第27卷 第2期 材料 DMSO和胰蛋白酶(购自Sigm公司) CFSE(购自Invitrogen公司) Peroll淋巴细胞分 离液(购自中国医学科学院生物工程研究所) DMEM/F12培养基(购自Gio公司) 胎牛血清 (购自杭州四季青公司) 细胞周期试剂

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1 184 J Clini Heptol.Ferury 2011,Vol.27,No.2 骨髓间充质干细胞对大鼠减体积肝移植 术后肝细胞再生与修复的作用 宋晓静 宋红丽 郑卫萍 王政禄 龚慧宾 沈中阳 (天津市第一中心医院器官移植中心 天津 00192) 摘要 目的 探讨骨髓间充质干细胞(BMSCs)对大鼠减体积肝移植术后肝脏再生与修复的影响 方法 采用生化 免疫 组化等方法检测术后不同时间的血清和肝脏标本 (1)取同周龄Wistr大鼠骨髓体外培养BMSCs 标记CSFE荧光后制备悬 液 (2)建立大鼠50%减体积肝移植模型(供体鼠为SD大鼠 受体鼠为Wistr大鼠) 分为(取BMSCs悬液经门静脉植入) 和(取等量生理盐水经门静脉注射) 观察大鼠生存状态 测量肝再生的相关指标 结果 (1)成功分离培养BMSCs (2)术后2 h 大鼠均自由活动饮水 ()肝组织中存在大量BMSCs 术后第2 肝体比显著高于 病理 显示 肝细胞损伤较轻微 结论 植入BMSCs后 可以促进大鼠减体积肝移植术后肝细胞增殖和修复 关键词 骨髓细胞 间质干细胞 肝移植 肝再生 中图分类号 R657. 文献标识码 A 文章编号 The protetive effets of one-mrrow-erive mesenhyml stem ells on hepti regenertion n repir of rt liver grft fter reue-size liver trnsplnttion SONG Xio-jing, SONG Hong-li, ZHENG Wei-ping,et l.(deprtment of Orgn Trnsplnttion, Tinjin First Center Hospitl, Tinjin 00192, Chin) Astrt: Ojetive To explore the effet of one-mrrow-erive mesenhyml stem ells (BMSCs) in promoting regenertion n repir of rt liver fter reue-size liver trnsplnttion. Methos (1)BMSCS whih were tken from the one mrrow of the Wistr rts were ulture in vitro, then mrke y CSFE n prepre s suspension. (2)50% reue-size liver trnsplnttion moels (SD onor to Wistr reipient) were estlishe, whih were ivie into the experiment group (1ml BMSCs suspension ws injete into portl vein) n the ontrol group (1ml sline ws injete into portl vein). After opertion, the living stte of reipient ws oserve n the initors out hepti regenertion were etete through whih serum n liver smples were ollete n nlyze y iohemistry n immunohistohemistry respetively fter trnsplnttion. Results (1)BMSCs showe high purity n homogeneity. (2)2 hours fter liver trnsplnttion, ll rts were reovere moving freely n rinking wter. ()There were BMSCs in the liver grft. The rtio etween liver weight n oy weight in the experimentl group ws higher thn the ontrol group. Histopthology revele tht heptoyte injury ws minor in the experimentl group thn the ontrol group. Conlusion BMSCs trnsfuse into the liver grft n promote oth regenertion n repir of liver ells fter reue-size liver trnsplnttion. Key wors: one mrrow ells; mesenhyml stemells; liver trnsplnttion; liver regenertion 目前供体短缺的现象日益严重 减体积 肝移植(活体肝移植和劈裂式肝移植)是解决供 体短缺的较好的方法 如何减少移植肝的肝细 胞损伤和促进减体积肝移植的肝细胞再生是目 前亟待解决的问题 由于骨髓间充质干细胞 (porine one mrrow mesenhyml stem ells BMSCs)具有多向分化和免疫抑制的特点 故本 实验拟通过对不同品系大鼠减体积肝移植后门 静脉注射BMSCs 探讨BMSCs移植对不同品系 收稿日期 修订日期 基金项目 天津市科委自然基金资助项目(08JCYBJC08400) 作者简介 宋晓静(198-),男,硕士研究生, 主要从事肝脏外科学研究 通信作者 宋红丽 E-mil: hlsong26@yhoo.om.n 大鼠减体积肝移植术后肝细胞再生及修复的影 响 1 材料和方法 1.1 实验动物和材料 实验动物与分组 选用军事医学科学院实 验动物中心提供的SPF级的Wistr和SD雄性大 鼠 用6 8周龄 体重 g的wistr大鼠 20只提取BMSCs 减体积肝移植供体用SD雄 性8 10周龄大鼠 体重为 g 受体为 Wistr雄性8 10周龄大鼠 体重为 g 供受体相差10 20 g 随机分为和对照 组 每组18对 大鼠50%减体积肝移 植术后取准备好的BMSCs经门静脉植入 对照 组 门静脉注射等量生理盐水

2 临床肝胆病杂志 2011年 第27卷 第2期 材料 DMSO和胰蛋白酶(购自Sigm公司) CFSE(购自Invitrogen公司) Peroll淋巴细胞分 离液(购自中国医学科学院生物工程研究所) DMEM/F12培养基(购自Gio公司) 胎牛血清 (购自杭州四季青公司) 细胞周期试剂盒(购自 武汉博士德公司) PBS缓冲液(购自北京鼎国生 物科技公司) PCNA(购自武汉博士德公司) 生化检测仪(日本 日立7170S型) 荧光显微镜 (日本 奥林巴斯IX71型) 1.2 方法 BMSCs提取 培养及鉴定 (1)大鼠BMSCs 的获取及培养 取6 8周龄大鼠 水合氯醛腹 腔注射麻醉 阴囊上静脉注射含肝素的生理盐 水肝素化 无菌环境下 取出股骨 胫骨 保 留骨骺 置于碘伏中浸泡2 min PBS液冲 洗 用吸满PBS的注射器冲出骨髓腔内骨髓 收集于离心管内 用Peroll液分离 将Peroll 液先置于试管的底部 然后按照 2的比例缓 慢滴加获得的骨髓液 传代后 获得贴壁生长 的BMSCs 培养瓶底面积的大约80% 消化 洗涤 离心 悬浮 收集第代细胞 分别制成 个单细胞悬液 用1 ml PBS充分重悬 抽取备用 (2)取上述悬液1 ml(含 个细 胞) 分别加入0.05 mg的cd29和cd90 CD4 和CD4抗体 冰浴0 min 冲洗 离心次 上机检测 表达CD29 CD90及CD4而不表达 CD4者为BMSCs BMSCs荧光标记及追踪 (1)在BMSCs培养 基中加入CFSE 使其终浓度为5 μmol/l 在培 养箱中孵育0 min 用PBS洗两次 不同时间点 在490 nm激发波长 50 nm发射波长的荧光下 观察标记情况 (2)在术后24 h开腹 经门静脉 注射PBS将肝中血液冲出 制备肝脏冰冻切片 后在490 nm激发波长 50 nm发射波长的荧光 下观察BMSCs在肝脏中的分布 1.2. 减体积肝移植模型制备及干细胞移植 (1)50% 的减体积肝移植模型制作 参照Km 二 袖套法 稍作改良 ① 供体手术 水合氯醛麻 醉 十字切口进腹 游离肝脏 切开胆管插入 硬膜外导管固定 采用体内切肝法在灌注前将 左外叶 部分中叶和尾叶切除 切除50 的肝 脏 自肠系膜上静脉插管 灌注4 含肝素生 理盐水(10 U/m1)20 ml 安置门静脉袖套管和肝 185 下下腔静脉袖套管 完成供肝修剪 ② 受体手 术 水合氯醛麻醉后 正中切口进腹 游离肝 脏 结扎切断肝动脉 近肝侧切断胆管 游离 近肝段门静脉 结扎右肾上腺静脉 阻断门静 脉 用注射器自门静脉分叉处注入2 ml生理盐 水 钳夹肝上下腔静脉 切除肝脏 将供肝植 入 用7-0线连续缝合肝上下腔静脉 门静脉袖 套管 下腔静脉套管结扎固定 恢复肝血流 (2)BMSCs的移植 在手术结束后 迅速将准备 好的BMSCs从门静脉注入大鼠体内 经 门静脉注射1 ml生理盐水 止血后逐层关腹 术后自由进水 12 h后进食 各组分别在术后 1 5和7 4 个时间点经下腔静脉取血或断 尾取血 1500 r/min离心15 min保存血清 2 7 处死大鼠 留取肝脏标本 切取部分肝 脏标本投入4%的多聚甲醛中保存 另一部分新 鲜肝脏组织和血清样本直接存放于-80 深低温 冰箱中备用 细胞增殖与修复的检测方法及结果判定 (1)肝脏称重 拭去肝脏表面的血迹 以电子秤 称量肝脏湿重(精确到小数点后2位) 单位为 g 计算肝体比 公式如下 肝体比=肝脏湿重 /体重 100% (2)生化检测 分别测定血清中 ALT和AST ()组织HE染色 取甲醛保存肝组 织行HE染色 观察肝脏组织学变化 (4)免疫 组化法 观察增殖细胞核抗原(proliferting ell nuler ntigen PCNA)的表达水平 染色方法 按说明书进行 PCNA以细胞核呈界限清楚的 棕色反应为阳性 阳性结果分级按以下标准记 录 在6个高倍视野中 每个视野记数100个肝 细胞 然后计算其平均阳性率 (5)流式细胞检 测 取部分新鲜肝脏组织剪碎 透过200目滤网 制备单细胞悬液 用细胞周期试剂盒按照说明 书进行染色 上机 采用流式细胞技术检测细 胞周期 计算细胞增殖指数 1. 统计学分析 利用SPSS1.0软件进行统计学 处理 数据以均数±标准差(x±s)表示 组间比 较采用t检验 P 0.05为差异有统计学意义 2 结果 2.1 BMSCs的培养及鉴定 原代培养中细胞为 分散 克隆集落方式增殖 当相邻集落融合成 片达80%以上时 细胞排列呈漩涡状 细胞间 的界限不清 细胞呈长梭状 此外 还存在少

3 186 J Clini Heptol.Ferury 2011,Vol.27,No.2 数的小圆细胞 传代后 细胞不以集落形式生 长 而是均匀分布长梭形细胞平均生长 杂质 细胞明显减少 MSC纯度升高(图1) 流式细胞 仪结果表明 74.5%的细胞表达CD29 CD4 CD90 不表达CD4 此为BMSCs(图2) 图1 间充质干细胞培养结果 :原代细胞 :第三代细胞 2..2 荧光追踪 标记后的细胞经门静脉注入大 鼠移植肝内 24 h后取大鼠的肝脏冰冻切片荧 光分布显示 肝脏切片中 中央静脉扩 张 中央静脉周围 肝窦以及肝细胞索间可见 荧光标记的细胞 中央静脉周围的荧光强度较 肝细胞索间强(图) 2.4 对减体积肝移植术后肝细胞增殖的影响 肝体比 检测术后第2和 时肝体比 显著高于 且差异具有统计学意义 第7 时虽也增加 但差异无统计学意义(表1) 提示 BMSCs可促进减体积肝移植术后早期肝再生 表1 图2 间充质干细胞鉴定结果 :横坐标CD29 纵坐标 CD90 :横坐标CD4 纵坐标CD4 2.2 基本情况 两组大鼠术后2 h 均自由活动和 饮水 1周存活率均为100% 2. BMSCs荧光标记及体内追踪 2..1 荧光标记 两图比较可见一些小圆形细胞和 三角形细胞未着色或荧光强度较低 CFSE荧光 标记的BMSCs体外标记率为84%(图) 图 间充质干细胞荧光标记和追踪 :体外培养的第代 BMSCs :CFSE标记的体外第代BMSCs :移植术后 24 h肝脏中bmscs的分布( 100) :移植术后24 h肝脏中 BMSCs的分布( 400) 箭头为荧光标记的细胞 V为中央 静脉 BMSCs对术后肝体比的影响(x±s n=6) 术后2 (%).09± ± 术后 (%).16± ± 术后7 (%).6±0.0.29± 细胞周期流式细胞检测 在实验的2 7 时间点 对新鲜肝脏组织进行细胞周期检 测 两组处于G0/G1期的细胞在各时间点不 同 随着时间的推移 和中G0/ G1期细胞占细胞总数的百分比呈升高趋势 提 示术后早期肝细胞增殖活跃 在第2 两 组差异有统计学意义 在术后第7 和 间差异无统计学意义(表2) 提示BMSCs 可刺激术后早期的肝细胞增殖 表2 BMSCs对肝组织细胞周期的影响(G0/G1期)(x±s n=6) 术后2 (% 术后 (% 术后7 (% 1.68± ± ± ± ± ± PCNA染色 术后第2 时肝组织 PCNA阳性细胞数高于 且差异具有统 计学意义 第7 时虽也增加 但差异无统计学 意义(表 图4) 提示BMSCs可引起术后早期 肝细胞再生 表 BMSCs对肝组织细胞周期的影响 (PCNA阳性细胞个数)(x±s n=6) 术后 ± ± 术后 21.01± ± 术后7 5.0± ±

4 187 临床肝胆病杂志 2011年 第27卷 第2期 2.6 BMSCs在实验鼠肝细胞损伤修复中的作用 肝脏病理显示 两组大鼠肝细胞于术后2 基本 正常 第 时肝组织出现轻度水样变性 实验 组和未发现显著差异 第7 时 肝脏轻度水样变性 汇管区炎症轻微 未见淤 血 而大鼠肝细胞明显水样变性 汇管 区可见炎症 未见淤血(图7) 提示BMSCs有促 进肝细胞损伤修复的作用 e 2.5 BMSCs对实验鼠肝功能的影响 术后1 两组大鼠血清AST和ALT水平逐渐下降 7 时 血清酶学水平继续下降 而 血清AST和ALT水平缓慢上升 术后7 大 鼠血清AST水平为220 μmol/l ALT为600 μmol/ L左右(图5 6) 提示随着术后时间的延长 BMSCs有促进肝细胞损伤修复的作用 1400 血清AST水平(μmol/L) 肝移植术后时间() 图5 不同时间点和血清AST水平 1400 血清ALT水平(μmol/L) f 图4 BMSCs对肝组织细胞增殖的影响 400 分别为2 7 PCNA增殖情况 e f分别 为2 7 PCNA增殖情况 肝移植术后时间() 图6 不同时间点和血清ALT水平 图7 7 时与肝脏HE染色病理表现 :实验 组第7 可见肝细胞形态基本正常( 400) :第 7 可见肝细胞中重度水样变性( 400) :第7 汇管区炎症轻微( 400) :第7 可见汇管区炎症 ( 400) 讨论 骨髓间充质干细胞是存在于骨髓中的非 造血干细胞 可分化为各种特定细胞 [1,2] 有 明显可塑性 是组织工程理想的靶细胞 [] Oh 和Shwr等 [4,5]成功地在体外将BMSCs诱导为 肝细胞样细胞 周播江等 [6]于2004年成功地在 体内将BMSCs诱导为肝细胞样细胞 BMSCs 可分泌一些免疫抑制因子 抑制免疫细胞 [] BMSCs免疫原性较小 同种异体移植后排斥反 应少 适合细胞移植的研究 [7] 国内外BMSCs 相关研究多用于改善心肌和脑组织缺血-再灌注 损伤等 尚未发现其在肝移植术后相关报道 肝脏再生与修复是一个复杂的病理生理学 过程 多数学者认为有类细胞参与其中[8] 第 1类为成熟肝细胞 通过有丝分裂修复受损肝 脏 其修复能力有限 第2类细胞是肝内干细 胞 修复能力亦有限 第类细胞为多能干细 胞 来源于骨髓 数量少 自我复制能力强 可分化为肝前体细胞 参与肝脏损伤修复 细 胞更新等过程 [1,8] 本研究在建立50%大鼠减体

5 188 积肝移植模型的基础上 将BMSCs经门静脉植 入受鼠体内 研究其对该情况下肝细胞再生与 修复的影响 实验所采用的CFSE是一种可穿过细胞膜 的荧光染料 具有与细胞结合特异性的琥珀酰 亚胺酯基团 通过不可逆地与细胞内的氨基结 合偶联 进行荧光标记 [9] CFSE标记的BMSCs 经门静脉注入后1 时发现肝脏内仍有BMSCs 且在冰冻切片上可观察到中央静脉扩张 肝窦 以及肝细胞索间均可见荧光标记细胞 这说明 BMSCs在体内向肝细胞进行迁徙和定殖 术后第2 肝体比显著高于对照 组 术后第2 时肝组织G0/G1期细胞 (细胞静止期)比例显著低于 PCNA阳性 细胞数也增多 说明注射BMSCs可明显增加肝 组织细胞再生 PCNA是DNA多聚酶的辅助蛋 白 其合成与DNA的复制和细胞增殖有着直接 的关系 提示BMSCs有促进肝脏增殖作用 有研究表明SD对Wistr种系之间排斥反应 较轻 不会发生急性排斥反应 [10] 我们观察到 血清AST和ALT在术后 后呈缓慢上升 趋势 而血清AST和ALT明显降低 另 外肝脏HE染色显示 在第 时肝组织出现轻 度水样变性 和差异无统计学意 义 第7 时 肝组织水样变性程度轻 微 肝组织水样变性程度重 推测由实 验组中BMSCs对肝细胞损伤修复作用所致 总之 本研究显示 BMSCs能促进大鼠减 体积肝移植术后肝细胞再生与修复 其机制可 能与BMSCs在受体内增殖 分泌HGF等促肝细 胞增殖的特异因子相关 [11] BMSCs在肝脏微环 境的诱导下也可向受鼠肝细胞分化 并启动组 织修复 [12] 减轻排斥反应并降低组织炎症反应 进而保护移植肝脏 其确切机制有待进一步研 究 J Clini Heptol.Ferury 2011,Vol.27,No.2 参考文献 [1] Pelersen BE, Bowen WC, Ptrene KD, et l. Bone mrrow s potentil of hepti ovl ells [J]. Siene, 1999, 284 (5417): [2] Theise ND, Bve S, Sxen R, et l. Derivtion of heptoytes from one mrowells in mie fter rition inue myelohltion[j]. Heptology, 2000, l(1): [] Polehert D, Soinsky J, Dougls G, et l. IFN-gmm tivtion of mesenhyml stem ells for tretment n prevention of grft versus host isese [J]. Eur J Immunol, 2008, 8(6): [4] Oh SH, Miyzki M, Kouhi H, et l. Heptoyte growthftor inue ifferentition of ult rt one mrrow ells into heotoyte linege in vitro[j]. Biohem Biophys Res Commun, 2000, 279(9): [5] Shwrtz RE, Reyes M, Kooiel L, et l. Multipotent ult progenitor ells from one mrrow ifferentite into funtionl hepti like ells [J]. J Clin Invest, 2002, 109(10): [6] 周播江, 钟翠平, 顾云娣, 等. 肝再生大鼠血清诱导骨髓干 细胞向肝细胞分化的实验研究[J]. 中华肝脏病杂志, 2004, l2(12): [7] Kim HS, Lee HJ, Yeu IS, et l. The neovsulriztion effet of one mrrow stroml ells in temporl musle fter enephlomyosynngiosis in hroni ererl ishemi rts[j]. J Koren Neurosurg So, 2008, 44(4): [8] Sell S. Heterogeneity n plstiity of heptoyte linege ells[j]. Heptology, 2001, (): [9] Oostenorp RA, Auet J, Eves CJ, et l. High resolution trking of ell ivision suggests similrell yle kinetis of hemtopoieti stem ells stimultein vitronin vivo[j]. Bloo, 2000, 95(): [10] 邵永, 董家鸿, 王曙光, 等. 近交系大鼠肝移植急性排斥模型的建 立及排斥反应观察[J].徐州医学院学报, 2008, 28(9): [11] Kit M, Dezw M. Inution system of neurl n musle linege ells from one mrrow stroml ells; new strtegy for tissue reonstrution in egenertive iseses[j]. Histol Histopthol, 2009, 24 (5): [12] Li ZJ, Teng BX, Chen XH, et l. Leukemi one mrrow stroml ells in vitro protet leukemi ell line Jurkt ells from unoruiin-inue poptosis[j]. Ai Zheng, 2005, 24 (6): (本文编辑 王 莹)

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