生物通2008技术点评:慢病毒载体

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1 生 物 通 2008 技 术 点 评 : 慢 病 毒 载 体 近 几 年 来, 慢 病 毒 载 体 因 其 独 特 的 优 势, 逐 渐 成 为 表 达 载 体 中 的 大 热 慢 病 毒 载 体 与 其 他 表 达 载 体 相 比, 最 大 的 优 势 是 它 们 能 感 染 分 裂 和 非 分 裂 的 细 胞 这 对 于 众 多 干 细 胞 和 难 转 染 细 胞 的 研 究 者 而 言, 可 谓 是 一 根 及 时 的 救 命 稻 草, 能 解 决 令 人 头 疼 的 转 染 效 率 低 的 问 题 慢 病 毒 (lentivirus) 是 反 转 录 病 毒 的 一 种, 需 要 相 对 较 长 的 孵 育 时 间, 所 以 称 之 为 慢 病 毒, lenti 在 拉 丁 文 中 就 是 慢 的 意 思 它 包 括 HIV FIV ( 猫 免 疫 缺 陷 病 毒 ) 和 其 他 病 毒 先 来 谈 谈 反 转 录 病 毒 吧 反 转 录 病 毒 是 一 类 正 链 RNA 病 毒, 分 为 顺 式 功 能 基 因 和 反 式 功 能 基 因 由 于 反 转 录 病 毒 包 膜 上 有 env 编 码 的 糖 蛋 白, 能 被 许 多 哺 乳 动 物 细 胞 膜 上 特 异 性 受 体 所 识 别, 并 能 介 导 反 转 录 病 毒 的 遗 传 物 质 高 效 进 入 宿 主 细 胞 内 ; 并 且 病 毒 在 自 身 表 达 的 整 合 酶 催 化 作 用 下 可 高 效 地 整 合 进 宿 主 细 胞 染 色 体 中, 这 有 利 于 外 源 基 因 在 宿 主 细 胞 的 永 久 表 达 ; 成 熟 的 病 毒 颗 粒 以 芽 生 的 方 式 进 入 细 胞 培 养 液 上 清 液 中, 易 于 和 宿 主 细 胞 分 离 但 传 统 的 反 转 录 病 毒 载 体 没 有 组 织 特 异 性, 只 能 感 染 处 于 分 裂 期 的 细 胞, 而 且 滴 度 低, 并 可 能 产 生 具 有 复 制 能 力 的 反 转 录 病 毒, 因 此 不 能 作 为 理 想 的 表 达 载 体 慢 病 毒 病 毒 源 于 反 转 录 病 毒, 但 又 有 所 不 同 市 场 上 的 慢 病 毒 是 由 人 类 免 疫 缺 陷 病 毒 (HIV), 通 过 去 除 env vif vpr vpu nef 等 毒 性 基 因 改 造 而 来 复 制 缺 陷 型 HIV 载 体 通 常 用 水 泡 口 炎 病 毒 (vesicular stomatitis virus) G 糖 蛋 白 (VSV-G) 来 代 替 HIV-1 的 包 膜 进 行 包 装, 从 而 更 安 全, 宿 主 范 围 更 广, 还 能 增 加 病 毒 的 滴 度 慢 病 毒 载 体 可 以 将 外 源 基 因 有 效 地 整 合 到 宿 主 染 色 体 上, 从 而 实 现 持 久 性 表 达 在 感 染 能 力 方 面 可 有 效 地 感 染 神 经 元 细 胞 肝 细 胞 心 肌 细 胞 肿 瘤 细 胞 内 皮 细 胞 干 细 胞 等 多 种 类 型 的 细 胞, 又 很 少 引 发 机 体 的 免 疫 反 应, 能 达 到 良 好 的 基 因 治 疗 效 果, 具 有 广 阔 的 应 用 前 景 如 果 你 的 实 验 需 要 长 期 基 因 表 达 或 沉 默, 而 目 的 细 胞 又 很 难 转 染, 那 慢 病 毒 可 以 说 是 非 常 理 想 的 选 择 野 生 型 的 HIV 大 小 约 为 9.8 kb, 故 插 入 片 段 一 般 在 4-5 kb 左 右, 这 对 于 大 部 分 的 实 验 来 说 应 该 够 用 了 慢 病 毒 载 体 的 发 展 经 历 了 3 个 阶 段 : 第 一 代 慢 病 毒 载 体 系 统 是 以 三 质 粒 系 统 为 代 表 在 构 建 时 把 HIV-1 基 因 组 中 进 行 包 装 逆 转 录 和 整 合 所 需 的 顺 式 作 用 元 件 与 编 码 反 式 作 用 蛋 白 的 序 列 分 离, 分 别 构 建 在 三 个 独 立 的 质 粒 表 达 系 统 上, 即 包 装 质 粒 ( 一 个 强 启 动 子 如 CMV 作 用 下, 控 制 除 env 以 外 所 有 病 毒 结 构 基 因 的 表 达 ) 包 膜 质 粒 (VSV-G 基 因 ) 和 载 体 质 粒 ( 目 的 基 因 ), 用 这 三 种 质 粒 共 同 转 染 包 装 细 胞 如 人 胚 肾 293T 细 胞, 在 细 胞 上 清 中 即 可 收 获 只 有 一 次 感 染 能 力 而 无 复 制 能 力 的 慢 病 毒 颗 粒 第 一 代 慢 病 毒 载 体 系 统 的 特 点 是 在 构 建 三 种 包 装 质 粒 时, 为 了 降 低 产 生 有 复 制 能 力 的 病 毒 的 可 能 性, 尽 可 能 减 少 三 种 质 粒 之 间 的 同 源 序 列, 但 包 装 质 粒 中 仍 然 保 留 了 HIV 的 附 属 基 因 第 二 代 慢 病 毒 载 体 系 统 是 在 第 一 代 基 础 的 改 进, 在 包 装 质 粒 中 删 去 了 HIV 的 所 有 附 属 基 因 这 些 附 属 基 因 的 去 除 并 不 影 响 病 毒 的 滴 度 和 转 染 能 力, 同 时 增 加 了 载 体 的 安 全 第 1 页, 共 26 页 下 一 页 返 回

2 性 第 三 代 慢 病 毒 载 体 系 统 又 增 加 了 两 个 安 全 特 性 : 一 是 构 建 了 自 身 失 活 的 慢 病 毒 载 体, 即 删 除 了 U3 区 的 3 LTR, 使 载 体 失 去 HIV-1 增 强 子 及 启 动 子 序 列, 即 使 存 在 所 有 的 病 毒 蛋 白 也 不 能 转 录 出 RNA; 二 是 去 除 了 tat 基 因, 代 之 以 异 源 启 动 子 序 列, 这 样 原 始 的 HIV 基 因 组 中 的 9 个 基 因 在 慢 病 毒 载 体 中 只 保 留 了 3 个 ( gag pol 和 rev) 因 此 第 三 代 慢 病 毒 载 体 系 统 更 加 安 全 就 是 第 三 代 和 第 四 代 所 有 的 慢 病 毒 表 达 载 体 都 是 plenti 命 名, 后 面 加 上 数 字 4 6 7, 这 些 数 字 代 表 的 是 不 同 的 筛 选 标 记,4 意 味 着 用 Zeocin 筛 选,6 则 是 用 Blasticidin 筛 选,7 是 带 EmGFP 的 很 多 系 统 都 有 两 个 版 本, 其 实 只 是 克 隆 方 式 的 区 别, 一 部 分 是 采 用 Gateway 同 源 重 组 的 方 式 进 行 克 隆 的, 另 一 部 分 则 采 用 简 便 的 5 分 钟 TOPO 克 隆 安 全 性 始 终 是 大 家 最 关 心 的 问 题, 毕 竟 是 HIV 改 造 过 来 的, 不 容 许 有 一 点 闪 失 国 内 的 实 验 室 很 多 都 达 不 到 P2 的 级 别, 甚 至 是 一 堆 人 挤 在 一 个 房 间 里 做 各 种 各 样 的 实 验 无 论 是 为 人 为 己 考 虑, 慢 病 毒 的 安 全 性 都 应 该 特 别 关 注 Clontech 公 司 也 是 主 张 安 全 第 一 它 家 的 Lenti-X 系 统 对 广 泛 应 用 的 第 三 代 慢 病 毒 做 了 改 进, 将 pol 基 因 与 gag 基 因 分 离, 这 意 味 着 要 产 生 原 始 的 病 毒, 还 需 要 更 多 的 重 组 步 骤 完 整 的 系 统 包 含 5 个 载 体, 安 全 性 更 高 慢 病 毒 表 达 的 一 般 流 程 如 下 : 将 目 的 基 因 片 段 克 隆 到 表 达 载 体 上 ; 将 重 组 表 达 载 体, 与 包 装 混 合 物 (packaging mix, 通 常 是 几 个 质 粒 的 混 合 ) 共 转 染 293 细 胞 ; 收 集 病 毒 上 清, 测 定 滴 度 ; 感 染 目 的 细 胞, 瞬 时 表 达 目 的 蛋 白 或 用 抗 生 素 筛 选 稳 定 细 胞 株 ; 分 析 目 的 蛋 白 看 上 去 并 不 复 杂, 但 中 间 许 多 步 骤 需 要 不 断 优 化 而 且 慢 病 毒 有 一 个 软 肋, 就 是 病 毒 滴 度 不 高 你 可 能 还 需 要 纯 化 或 浓 缩, 才 能 得 到 108 TU/ml 的 慢 病 毒 当 然, 各 厂 家 也 注 意 到 了 这 个 问 题, 不 断 改 造 慢 病 毒 载 体, 使 其 滴 度 增 加 具 体 的 改 造 在 下 文 中 会 一 一 介 绍 市 场 上 最 为 成 熟 的 慢 病 毒 表 达 载 体 主 要 来 自 两 大 表 达 巨 头 Invitrogen 和 Clontech Invitrogen 就 有 十 余 种 之 多, 而 且 名 字 都 差 不 多, 乍 一 看 真 是 有 点 头 晕 不 过 主 要 分 为 两 大 类, 也 ViraPower Lentiviral Expression System 是 最 早 的 慢 病 毒 表 达 系 统, 价 格 在 元 左 右 (20 次 ) 系 统 中 共 涉 及 4 个 质 粒 : 插 入 目 的 基 因 的 plenti 表 达 载 体, 上 面 提 供 了 ψ 包 装 信 号 以 及 截 短 的 HIV 3 及 5 LTR, 便 于 病 毒 包 装 ;plp1 质 粒 表 达 形 成 慢 病 毒 结 构 所 必 需 的 gag 基 因 以 及 病 毒 复 制 和 整 合 必 需 的 pol 基 因 ; plp2 质 粒 表 达 Rev 蛋 白, 它 能 与 plp1 上 的 反 应 元 件 (RRE) 共 同 作 用 诱 导 Gag 和 Pol 表 达, 并 指 导 病 毒 RNA 的 核 运 输 ;plp/vsvg 表 达 水 泡 口 炎 病 毒 G 糖 蛋 白 (VSV-G), 让 宿 主 范 围 更 广 这 4 个 质 粒 必 须 共 同 作 用, 才 能 产 生 有 感 染 能 力 的 病 毒 粒 子, 缺 一 不 可 最 新 推 出 的 ViraPower HiPerform Lentiviral Expression System 则 是 上 述 系 统 的 升 级 版, 从 名 字 也 可 以 猜 个 大 概,HiPerform 也 就 意 味 着 High Performance 嘛 它 与 上 一 个 版 本 最 主 要 的 不 同 是 表 达 载 体 上 增 加 了 两 个 新 元 件 WPRE 和 cppt WPRE 来 自 土 拨 鼠 肝 炎 病 毒, 放 置 在 目 的 基 因 的 上 游, 能 加 强 转 基 因 的 表 达 cppt 来 自 HIV-1 整 合 酶 基 因, 能 增 加 慢 病 毒 在 宿 主 基 因 组 的 拷 贝 数, 从 而 使 病 毒 滴 度 增 加 两 倍 这 两 个 元 件 共 同 作 用, 能 使 大 多 数 细 胞 中 的 蛋 白 表 达 量 至 少 增 加 4 倍 其 中 有 两 个 kit 还 称 为 FastTiter, 因 为 它 的 载 体 含 有 EmGFP, 能 用 流 式 细 胞 仪 快 速 测 定 滴 度 升 级 版 的 价 格 当 然 也 会 升 级, 估 计 在 2 万 元 以 上 2008 年 10 月 23 日 第 44 期 第 2 页, 共 26 页 下 一 页 返 回

3 另 外, 还 有 一 些 特 别 的 载 体 比 如 说 不 带 启 动 子 的, 可 以 让 你 检 测 某 个 启 动 子 的 活 性 ; 还 有 四 环 素 诱 导 型 的, 能 严 格 控 制 表 达 的 时 间 Invitrogen 的 慢 病 毒 表 达 载 体 大 抵 就 是 这 些, 下 面 就 是 Clontech 闪 亮 登 场 Clontech 的 Lenti-X 慢 病 毒 表 达 载 体 与 Invitrogen 第 四 代 的 表 达 载 体 极 为 相 似, 有 ψ 包 装 信 号 和 LTR, 也 有 WPRE 和 cppt 两 个 元 件 除 了 克 隆 方 式 (Clontech 是 采 用 酶 切 连 接 克 隆 ) 和 筛 选 标 记 (Clontech 用 嘌 呤 霉 素 筛 选 ) 不 同 之 外, 这 两 家 的 载 体 几 乎 没 什 么 区 别, 可 能 都 是 看 了 相 同 的 文 献 受 的 启 发 吧 不 过 packaging mix 就 有 一 些 区 别 了 Lenti-X HT 包 装 系 统 利 用 了 反 式 激 活 级 联 反 应 来 高 水 平 表 达 病 毒 蛋 白, 因 此 病 毒 滴 度 更 高 HT 即 high Titers 的 缩 写 一 般 来 说, 慢 病 毒 表 达 的 滴 度 约 为 TU/ml, 而 Clontech 的 滴 度 达 到 108 TU/ml 这 就 意 味 着 你 不 必 浓 缩 和 纯 化, 就 能 直 接 感 染 细 胞 不 过 需 要 特 别 注 意 的 是, 胎 牛 血 清 中 常 常 含 有 四 环 素 及 其 衍 生 物, 会 干 扰 反 式 激 活 反 应, 因 此 要 特 别 订 购 不 含 四 环 素 的 FBS Lenti-X 系 列 还 包 含 了 荧 光 表 达 载 体 你 的 目 的 蛋 白 可 以 在 N 端 或 C 端 融 合 AcGFP1( 绿 色 ) 或 DsRed( 红 色 ) 荧 光 蛋 白, 这 样 就 很 容 易 观 察 到 蛋 白 的 表 达 和 转 运 四 环 素 诱 导 表 达 本 来 就 是 Clontech 的 强 项,Lenti-X 系 列 当 然 也 有 可 诱 导 表 达 的 版 本 慢 病 毒 载 体 还 在 RNA 干 扰 研 究 中 发 挥 着 巨 大 的 潜 能 慢 病 毒 载 体 Sigma Dharmacon Invitrogen Clontech 公 司 都 有, 各 有 特 色 Sigma 公 司 的 Mission TRC shrna 慢 病 毒 提 供 的 是 已 经 设 计 好 克 隆 并 测 序 验 证 过 包 装 好 的 病 毒 颗 粒, 保 证 滴 度 达 到 106 TU/ml, 实 际 滴 度 常 大 于 107 TU/ml 买 回 来 即 可 马 上 用 于 转 导 难 对 付 的 细 胞, 可 谓 超 级 方 便 Mission TRC shrna 库 是 由 麻 省 理 工 和 哈 佛 等 11 个 著 名 研 究 所 及 制 药 公 司 组 成 的 RNAi 联 盟 (The RNAi Consortium, TRC) 的 科 学 家 共 同 研 发 的, 其 中 包 括 靶 向 人 类 个 基 因 对 应 的 个 shrna 克 隆, 以 及 小 鼠 个 基 因 对 应 的 个 克 隆 Mission 慢 病 毒 颗 粒 属 于 第 三 代, 除 了 shrna 转 移 载 体 外,Packaging Mix 中 还 含 有 两 个 质 粒 : 包 装 载 体 提 供 必 要 的 慢 病 毒 基 因, 来 形 成 病 毒 粒 子 的 结 构 蛋 白 和 包 装 功 能 ; pcmv-vsv-g 载 体 提 供 了 包 膜 蛋 白, 让 宿 主 范 围 更 广 shrna 转 移 载 体 不 仅 表 达 shrna, 还 提 供 了 包 装 信 号 和 顺 式 作 用 元 件 它 以 U6 为 启 动 子, 用 G418 进 行 筛 选, 或 通 过 GFP 发 出 的 绿 光 来 挑 选 如 果 你 的 研 究 对 象 是 人 或 小 鼠 的 基 因,Mission 是 再 合 适 不 过 了 Dharmacon 现 在 与 和 慢 病 毒 载 体 的 专 业 公 司 Lentigen 合 作, 强 强 联 手 提 供 全 方 位 的 服 务 你 只 需 要 提 供 基 因 的 ID,Dharmacon 就 会 帮 你 设 计 出 shrna, 再 由 Lentigen 合 成, 克 隆 到 载 体 上 并 测 序, 转 染 包 装 细 胞, 收 集 纯 化 并 浓 缩 送 达 你 手 上 的 就 是 滴 度 高 于 108 ifu/ml 的 病 毒 粒 子, 直 接 拿 去 感 染 细 胞 就 OK 了 不 过 具 体 实 验 前 也 需 要 摸 索 条 件, 包 括 感 染 复 数 (MOI) 细 胞 密 度 等 如 果 你 对 自 己 的 实 验 技 术 很 有 信 心, 也 不 妨 自 己 制 备 病 毒 粒 子 Clontech 的 Lenti-X shrna 表 达 系 统 和 上 面 的 蛋 白 表 达 体 统 类 似, 不 过 启 动 子 换 成 了 U6 高 效 的 Lenti-X HT 包 装 系 统 对 shrna 研 究 来 说 尤 其 有 用 慢 病 毒 的 高 转 导 效 率, 加 上 高 的 滴 度, 对 基 因 沉 默 研 究 有 着 明 显 的 优 势 你 原 本 想 干 扰 每 个 细 胞 中 的 基 因, 但 如 果 你 只 转 导 了 50% 的 细 胞, 那 就 算 你 的 shrna 非 第 3 页, 共 26 页 下 一 页 返 回

4 常 棒, 你 的 干 扰 效 果 也 肯 定 不 会 好 这 对 非 分 裂 细 胞 尤 其 重 要, 因 为 你 本 来 就 没 有 太 多 的 克 隆 可 供 选 择 Invitrogen 的 mirna 干 扰 载 体 与 以 上 都 不 同, 它 是 模 拟 体 内 microrna 的 加 工 和 干 扰 过 程, 所 以 载 体 上 的 启 动 子 也 与 shrna 不 同, 用 的 是 CMV, 而 不 是 U6 或 H1 CMV 启 动 子 的 活 性 比 U6 H1 这 些 可 强 多 了, 因 此 干 扰 RNA 的 表 达 量 更 高, 干 扰 效 率 自 然 也 就 更 胜 一 筹 如 果 你 不 喜 欢 CMV, 想 换 成 组 织 特 异 的 启 动 子, 也 没 问 题, 可 以 用 同 源 重 组 的 方 法 将 其 替 换 而 且 这 个 载 体 还 有 个 特 别 的 地 方, 就 是 它 将 几 个 干 扰 RNA 串 联 起 来, 同 时 干 扰 2-3 个 基 因 这 样 工 作 量 可 就 大 大 减 轻 了 另 外, 这 个 载 体 现 在 也 升 级 到 第 四 代, 病 毒 滴 度 更 高 由 于 是 新 产 品, 中 国 的 价 格 还 暂 未 查 到, 不 过 估 计 在 3 万 元 左 右, 好 货 不 便 宜 啊 尽 管 人 们 对 基 于 H IV-1 的 慢 病 毒 载 体 已 经 做 了 种 种 安 全 性 结 构 改 造, 要 产 生 有 复 制 力 的 HIV, 必 须 在 不 同 的 质 粒 上 发 生 多 次 非 同 源 重 组 事 件 即 便 如 此, 基 于 AIDS 的 病 源 学 基 础 仍 然 不 能 打 消 人 们 对 于 HIV 的 顾 虑 这 也 意 味 着 慢 病 毒 载 体 要 应 用 于 临 床, 还 有 很 长 的 路 要 走 ( 生 物 通 余 亮 ) 2008 年 10 月 23 日 第 44 期 第 4 页, 共 26 页 下 一 页 返 回

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