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- 士铅 翁
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1 誌 謝 本 論 文 之 完 成, 首 先 感 謝 恩 師 洪 敏 元 及 洪 千 雅 教 授 於 二 年 研 究 所 生 涯 期 間 視 如 己 出 般 細 心 的 指 導 及 關 愛, 使 論 文 得 以 順 利 完 成 文 稿 初 成, 承 蒙 東 海 大 學 食 品 科 學 系 蘇 正 德 教 授 於 百 忙 之 中 詳 閱 學 生 之 初 稿, 並 給 予 釜 正 與 建 議, 使 本 論 文 內 容 更 加 充 實 與 完 整, 謹 此 致 上 由 衷 之 謝 意 研 究 期 間, 感 謝 姜 泰 安 老 師 葉 怡 玲 老 師 廖 東 南 老 師 林 士 民 老 師 湯 雅 理 老 師 於 研 究 上 給 予 指 導 與 協 助 此 外, 感 謝 南 投 名 間 鄉 桂 花 森 林 提 供 所 需 研 究 材 料 成 功 大 學 王 志 堯 教 授 實 驗 室 南 海 檢 驗 所 吳 學 長 福 明 奇 美 醫 院 病 理 部 林 主 任 靖 南 及 李 醫 師 健 隆 在 病 理 組 織 切 片 上 之 協 助 與 判 讀, 方 使 得 研 究 能 順 利 進 行 兩 年 的 研 究 生 活, 感 謝 敬 愛 的 精 神 領 袖 國 玉 學 姊 慈 敏 學 姐 及 筱 青 學 姐 提 供 各 方 面 之 所 需, 使 得 實 驗 室 充 滿 家 的 感 覺 基 因 重 組 研 究 室 琬 甯 學 姊 芳 怡 小 畢 逸 諠 柏 淵 湘 庭, 正 妹 系 列 : 分 子 診 斷 實 驗 室 思 听 ; 遺 傳 檢 驗 實 驗 室 競 文 綉 雲 ; 食 品 保 健 營 養 研 究 室 慧 珊 學 姐 采 玲 培 倫 小 白 ; 生 科 所 辦 雅 筑 學 姐 ; 食 營 系 辦 全 體 人 員 於 實 驗 技 術 及 場 所 與 各 項 事 務 上 給 予 協 助 學 業 終 成, 感 謝 之 人 眾 多, 無 法 一 一 道 盡 謝 意, 在 此 一 併 致 謝 與 祝 福 最 後 要 感 謝 支 持 我 的 帥 老 爸 靓 老 媽, 謝 謝 你 們 的 用 心 栽 培, 小 犬 以 此 論 文 致 上 感 恩 之 心 終 於 畢 業 了!~ 真 ~ 爽 ~! i
2 總 目 錄 圖 次...v 表 次...vii 中 文 摘 要...viii 英 文 摘 要...x Abbreviation...xii 第 一 章 文 獻 整 理 一 自 由 基 與 抗 氧 化...1 二 過 敏 性 氣 喘...3 ( 一 ) 氣 喘 定 義...4 ( 二 ) 氣 喘 反 應 機 轉...4 ( 三 ) 氣 喘 成 因 與 症 狀...5 ( 四 ) 氣 喘 與 氧 化 壓 力.. 6 ( 五 ) 氣 喘 治 療..6 三 Acetaminophen (APAP)....7 ( 一 ) Acetaminophen 毒 性 機 制....7 ( 二 ) Acetaminophen 毒 性 與 氧 化 壓 力...8 四 桂 花 相 關 之 研 究 10 五 研 究 目 的...13 六 研 究 架 構...14 第 二 章 桂 花 萃 取 物 及 rutin 安 全 性 評 估 一 摘 要...16 二 材 料 與 方 法...17 ( 一 ) 桂 花 75 % 乙 醇 萃 取 物 製 備.17 ( 二 ) 動 物 實 驗 設 計 ( 急 性 毒 性 試 驗 慢 性 毒 性 試 驗 )...17 ( 三 ) 動 物 犧 牲 及 實 驗 檢 體 收 集 與 分 析.21 ( 四 ) 統 計 分 析 三 結 果 與 討 論 ( 一 ) 實 驗 劑 量 之 選 擇 ( 二 ) 臨 床 症 狀.27 ( 三 ) 試 驗 期 間 小 鼠 體 重 變 化.27 ii
3 ( 四 ) 臟 器 重 量 變 化 28 ( 五 ) 血 液 分 析 28 ( 六 ) 肺 沖 洗 液 血 球 變 化 29 ( 七 ) 臟 器 組 織 病 理 檢 查 30 ( 八 ) 臟 器 脂 質 過 氧 化 30 四 結 論 31 第 三 章 桂 花 萃 取 物 及 rutin 抗 致 敏 氣 喘 功 能 之 評 估 一 摘 要 46 二 材 料 與 方 法 47 ( 一 ) 桂 花 75 % 乙 醇 萃 取 物 製 備.47 ( 二 ) 動 物 實 驗 設 計.47 ( 三 ) 動 物 犧 牲 及 實 驗 檢 體 收 集 與 分 析.50 ( 四 ) 統 計 分 析. 58 三 結 果 與 討 論.59 ( 一 ) 試 驗 期 間 小 鼠 體 重 變 化..59 ( 二 ) 臟 器 重 量 變 化..59 ( 三 ) OVA 特 異 性 抗 體 IgE IgG1 IgG2a 分 析.59 ( 四 ) 肺 沖 洗 液 血 球 變 化...60 ( 五 ) 呼 吸 道 阻 力..60 ( 六 ) 臟 器 組 織 病 理 檢 查..61 ( 七 ) 臟 器 脂 質 過 氧 化..61 四 結 論.63 第 四 章 桂 花 萃 取 物 及 rutin 護 肝 功 能 之 評 估 一 摘 要 79 二 材 料 與 方 法 80 ( 一 ) 桂 花 75 % 乙 醇 萃 取 物 製 備.80 ( 二 ) 動 物 實 驗 設 計.80 ( 三 ) 動 物 犧 牲 及 實 驗 檢 體 收 集 與 分 析.82 ( 四 ) 統 計 分 析.85 三 結 果 與 討 論...86 ( 一 ) 試 驗 期 間 小 鼠 體 重 變 化.86 ( 二 ) 臟 器 重 量 變 化.86 ( 三 ) 血 液 分 析.86 iii
4 ( 四 ) 臟 器 組 織 病 理 檢 查.87 ( 五 ) 臟 器 脂 質 過 氧 化.87 四 結 論 88 第 五 章 參 考 文 獻 101 附 錄 ( 已 發 表 之 桂 花 相 關 研 究 ) 一 桂 花 萃 取 物 對 acetaminophen 誘 導 BALB/c 小 鼠 肝 毒 性 影 響 之 研 究 111 二 桂 花 市 售 製 品 抗 氧 化 能 力 總 多 酚 含 量 及 抗 氧 化 指 標 成 分 verbascoside 及 rutin 之 含 量 分 析 iv
5 圖 次 圖 一 本 研 究 使 用 之 桂 花 材 料 及 rutin 圖 片...xiv 圖 1-1 氧 化 壓 力 造 成 細 胞 傷 害 機 制...2 圖 1-2 Acetaminophen (APAP) 毒 性 機 制...9 圖 2-1 BALB/c 小 鼠 管 餵 食 桂 花 萃 取 物 及 rutin 72 小 時 後 之 肝 臟 病 理 切 片 觀 察...33 圖 2-2 管 餵 桂 花 萃 取 物 對 BALB/c 小 鼠 肝 臟 組 織 TBARs 值 之 影 響...34 圖 2-3 桂 花 萃 取 物 及 rutin 管 餵 食 期 間 各 組 小 鼠 之 體 重 變 化...35 圖 2-4 管 餵 食 桂 花 萃 取 物 及 rutin 28 天 BALB/c 小 鼠 肺 氣 管 沖 洗 液 之 分 析 細 胞 群...38 圖 2-5 BALB/c 小 鼠 管 餵 食 桂 花 萃 取 物 及 rutin 28 天 肝 臟 病 理 切 片 觀 察...39 圖 2-6 BALB/c 小 鼠 管 餵 食 桂 花 萃 取 物 及 rutin 28 天 脾 臟 病 理 切 片 觀 察...40 圖 2-7 BALB/c 小 鼠 管 餵 食 桂 花 萃 取 物 及 rutin 28 天 肺 臟 病 理 切 片 觀 察...41 圖 2-8 BALB/c 小 鼠 管 餵 食 桂 花 萃 取 物 及 rutin 28 天 腎 臟 病 理 切 片 觀 察...42 圖 2-9 管 餵 食 桂 花 萃 取 物 及 rutin 28 天 對 BALB/c 小 鼠 肝 臟 組 織 TBARs 值 之 影 響...43 圖 2-10 管 餵 食 桂 花 萃 取 物 及 rutin 28 天 對 BALB/c 小 鼠 腎 臟 組 織 TBARs 值 之 影 響...44 圖 3-1 致 敏 氣 喘 模 式 下 管 餵 食 桂 花 萃 取 物 及 rutin 對 OVA 致 敏 BALB/c 小 鼠 體 重 之 影 響...64 圖 3-2 致 敏 氣 喘 模 式 下 管 餵 食 桂 花 萃 取 物 及 rutin 對 OVA 致 敏 BALB/c 小 鼠 血 清 特 異 性 抗 體 IgE 之 影 響...66 圖 3-3 致 敏 氣 喘 模 式 下 管 餵 食 桂 花 萃 取 物 及 rutin 對 OVA 致 敏 BALB/c 小 鼠 血 清 特 異 性 抗 體 IgG1 之 影 響...67 圖 3-4 致 敏 氣 喘 模 式 下 管 餵 食 桂 花 萃 取 物 及 rutin 對 OVA 致 敏 BALB/c 小 鼠 血 清 特 異 性 抗 體 IgG2a 之 影 響...68 圖 3-5 致 敏 氣 喘 模 式 下 管 餵 食 桂 花 萃 取 物 及 rutin 對 OVA 致 敏 BALB/c 小 鼠 肺 氣 管 沖 洗 液 各 細 胞 總 數 (Eosinophil Lymphocyte Neutrophil Monocyte) 之 影 響...69 圖 3-6 致 敏 氣 喘 模 式 下 管 餵 食 桂 花 萃 取 物 及 rutin 對 OVA 致 敏 BALB/c 小 鼠 肺 氣 管 沖 洗 液 各 細 胞 總 數 (Eosinophil Lymphocyte Neutrophil Monocyte) 之 影 響...70 圖 3-7 致 敏 氣 喘 模 式 下 管 餵 食 桂 花 萃 取 物 及 rutin 對 OVA 致 敏 BALB/c 小 鼠 肺 氣 管 沖 洗 液 各 細 胞 總 數 (Eosinophil Lymphocyte Neutrophil v
6 Monocyte) 之 影 響...71 圖 3-8 致 敏 氣 喘 模 式 下 管 餵 食 桂 花 萃 取 物 及 rutin 對 OVA 致 敏 BALB/c 小 鼠 肺 氣 管 沖 洗 液 各 細 胞 總 數 (Eosinophil Lymphocyte Neutrophil Monocyte) 之 影 響...72 圖 3-9 致 敏 氣 喘 模 式 下 管 餵 食 桂 花 萃 取 物 及 rutin 對 OVA 致 敏 BALB/c 小 鼠 呼 吸 道 阻 力 之 影 響...73 圖 3-10 致 敏 氣 喘 模 式 下 管 餵 食 桂 花 萃 取 物 及 rutin 對 OVA 致 敏 BALB/c 小 鼠 肺 臟 組 織 之 影 響...75 圖 3-11 致 敏 氣 喘 模 式 下 管 餵 食 桂 花 萃 取 物 及 rutin 對 OVA 致 敏 BALB/c 小 鼠 肺 臟 組 織 TBARs 值 之 影 響...76 圖 3-12 致 敏 氣 喘 模 式 下 管 餵 食 桂 花 萃 取 物 及 rutin 對 OVA 致 敏 BALB/c 小 鼠 肝 臟 組 織 TBARs 值 之 影 響...77 圖 4-1 桂 花 萃 取 物 及 rutin 管 餵 食 期 間 各 組 小 鼠 之 體 重 變 化...89 圖 4-2 BALB/c 小 鼠 經 管 餵 食 桂 花 萃 取 物 及 rutin 對 腹 腔 內 注 射 APAP 之 肝 臟 病 理 切 片 觀 察...93 圖 4-3 BALB/c 小 鼠 經 管 餵 食 桂 花 萃 取 物 及 rutin 對 腹 腔 內 注 射 APAP 之 肺 臟 病 理 切 片 觀 察...95 圖 4-4 BALB/c 小 鼠 經 管 餵 食 桂 花 萃 取 物 及 rutin 對 腹 腔 內 注 射 APAP 之 腎 臟 病 理 切 片 觀 察...97 圖 4-5 BALB/c 小 鼠 經 管 餵 食 桂 花 萃 取 物 及 rutin 對 腹 腔 內 注 射 APAP 之 肝 臟 組 織 TBARs 值 之 影 響...98 圖 4-6 BALB/c 小 鼠 經 管 餵 食 桂 花 萃 取 物 及 rutin 對 腹 腔 內 注 射 APAP 之 肺 臟 組 織 TBARs 值 之 影 響...99 圖 4-7 BALB/c 小 鼠 經 管 餵 食 桂 花 萃 取 物 及 rutin 對 腹 腔 內 注 射 APAP 之 腎 臟 組 織 TBARs 值 之 影 響 vi
7 表 次 表 2-1 BALB/c 小 鼠 管 餵 食 5 g 及 10 g 桂 花 萃 取 物 72 小 時 之 存 活 率...32 表 2-2 BALB/c 小 鼠 經 管 餵 食 桂 花 萃 取 物 及 rutin 28 天 之 臟 器 相 對 重 量 百 分 比...36 表 2-3 管 餵 食 桂 花 萃 取 物 及 rutin 28 天 BALB/c 小 鼠 血 清 GOT GPT 及 BUN 值...37 表 3-1 致 敏 氣 喘 模 式 下 管 餵 食 桂 花 萃 取 物 及 rutin 對 OVA 致 敏 BALB/c 小 鼠 器 官 相 對 重 量 百 分 比 之 影 響...65 表 4-1 BALB/c 小 鼠 管 餵 食 桂 花 萃 取 物 及 rutin 對 腹 腔 內 注 射 APAP 臟 器 相 對 重 量 百 分 比...90 表 4-2 BALB/c 小 鼠 管 餵 食 桂 花 萃 取 物 及 rutin 對 腹 腔 內 注 射 APAP 血 清 GOT GPT 之 影 響...91 vii
8 摘 要 本 研 究 主 要 探 討 台 灣 產 桂 花 的 安 全 性 以 及 抗 致 敏 性 氣 喘 與 抑 制 acetaminophen 對 肝 細 胞 損 傷 的 效 果 第 二 章 是 桂 花 萃 取 物 安 全 性 評 估, 分 為 急 性 毒 性 試 驗 及 慢 性 毒 性 試 驗, 急 性 毒 性 試 驗 為 BALB/c 小 鼠 經 管 灌 分 別 餵 食 5.0 g/kg B.W. (5 g KFE) 及 10.0 g/kg B.W. (10 g KFE) 75 % 乙 醇 桂 花 萃 取 物, 觀 察 72 小 時 實 驗 結 果 顯 示 各 實 驗 組 小 鼠 均 無 死 亡 之 現 象 慢 性 毒 性 試 驗 為 BALB/c 小 鼠 連 續 28 天 經 管 灌 分 別 餵 食 低 劑 量 100 mg/kg B.W. (LEKF) 中 劑 量 800 mg/kg B.W. (MEKF) 高 劑 量 1000 mg/kg B.W. (HEKF) 75 % 乙 醇 桂 花 萃 取 物 及 低 劑 量 10 mg/kg B.W. (LR) 高 劑 量 100 mg/kg B.W. (HR) 抗 氧 化 城 分 rutin 實 驗 結 果 顯 示 各 實 驗 組 均 無 死 亡 之 現 象, 且 無 外 觀 上 之 中 毒 現 象 產 生 與 控 制 組 相 比 較 體 重 及 相 對 器 官 重 量 均 無 顯 著 性 差 異 肝 臟 及 腎 臟 無 脂 質 過 氧 化 現 象 產 生 於 肝 脾 肺 腎 臟 組 織 病 理 切 片 中, 發 現 無 特 殊 之 病 變 發 生 綜 合 以 上 結 果 顯 示, 桂 花 萃 取 物 及 其 抗 氧 化 成 分 rutin 經 管 灌 餵 食 BALB/c 小 鼠 連 續 28 天, 不 會 造 成 小 鼠 中 毒 之 現 象, 證 實 桂 花 萃 取 物 是 無 毒 性 的 物 質 第 三 章 是 桂 花 萃 取 物 抗 氣 喘 能 力 研 究 小 鼠 經 抗 原 誘 導 產 生 氣 喘 時 也 會 造 成 肺 肝 臟 氧 化 現 象 產 生 TBARs 值 上 升 連 續 28 天 管 灌 餵 食 viii
9 不 同 劑 量 75 % 乙 醇 桂 花 萃 取 物 及 不 同 劑 量 抗 氧 化 成 分 rutin, 可 以 改 善 經 OVA 抗 原 刺 激 誘 導 BALB/c 小 鼠 氣 喘 症 狀 的 能 力 實 驗 結 果 顯 示 各 實 驗 組 [ 桂 花 萃 取 物 組 : 100 mg/kg B.W. + OVA (LEKF) 800 mg/kg B.W. + OVA (MEKF) 1000 mg/kg B.W. + OVA (HEKF);rutin 組 : 10 mg/kg B.W. + OVA (LR) 100 mg/kg B.W. + OVA (HR) ] 與 控 制 組 [Positive control (PS) Negative control (NS) ] 相 比 較, 體 重 及 相 對 器 官 重 量 均 無 顯 著 差 異 於 血 清 中 檢 測 抗 體 發 現, 實 驗 組 均 能 明 顯 降 低 氣 喘 發 生 時 IgE 抗 體 的 產 生 Eosinophil 發 炎 細 胞 的 增 生 及 呼 吸 道 阻 力 現 象, 以 及 肺 細 胞 與 肝 細 胞 脂 質 氧 化 現 象, 並 從 肺 臟 組 織 病 理 切 片 顯 示, 能 降 低 氣 喘 小 鼠 支 氣 管 黏 膜 發 炎 細 胞 及 分 泌 物 沉 積 使 氣 喘 小 鼠 有 偏 走 向 Th1 分 泌 途 徑, 而 不 完 全 走 向 導 致 氣 喘 之 Th2 分 泌 途 徑 第 四 章 是 桂 花 萃 取 物 護 肝 能 力 研 究,BALB/c 小 鼠 管 灌 餵 食 75 % 乙 醇 桂 花 萃 取 物 (LEKF MEKF HEKF) 及 抗 氧 化 成 分 rutin (LR HR), 連 續 15 天, 於 小 鼠 犧 牲 前 三 小 時 腹 腔 注 射 acetaminophen (1.0 g/kg B.W. ), 實 驗 結 果 顯 示, 各 實 驗 組 能 明 顯 降 低 acetaminophen 所 導 致 GOT 值 的 上 升, 減 少 肝 臟 及 肺 臟 脂 質 過 氧 化 現 象 於 組 織 病 理 切 片 檢 驗 中, 實 驗 組 均 能 明 顯 降 低 acetaminophen 所 造 成 小 鼠 肝 臟 組 織 空 泡 化 之 傷 害 現 象 綜 合 以 上 結 果 顯 示, 桂 花 及 其 抗 氧 化 成 分 rutin 經 管 灌 餵 食 BALB/c 小 鼠 連 續 15 天, 確 實 能 夠 降 低 acetaminophen 藥 物 毒 性 ix
10 傷 害, 達 到 保 護 肝 細 胞 的 能 力 x
11 Abstract The aim of this study was to investigate the safety, anti-allergy asthma, and hepatic protection of Osmanthus fragrans flower in Taiwan on acetaminophen-induced hepatic damage in BALB/c mice. Chapter 2 was evaluates the acute and the 28 days subacute toxicities of O. fragrans flower extract (Kwei-Fah extract; KFE) by 75 % ethanol. In the acute toxicity study, BALB/c mice were single orally administered with 5.0 g/kg (5g KFE) and 10.0 g/kg B.W. (10g KFE) dosages of Kwei-Fah extract to obtain the LD50 value under 72 hr. According to the definition of acute toxicity, Kwei-Fah extract was practically nontoxic (LD50: >10 g/kg BW). In 28 days subacute toxicity study, the body and visceral organ weights of BALB/c mice administered with 100 mg to 1000 mg/kg B.W. dosages of KFE and its active compounds rutin (10 and 100 mg/kg B.W. mice) did not apparently change. The histopathology of visceral organ and the values of GOT, GPT and BUN in serum did not significantly different from those of the control group. There were no significant changes in lipid peroxidation in liver and kidney. The results suggested that the KFE and rutin had no obvious toxicity on BALB/c mice. Chapter 3 was evaluates the anti-allergic asthma of Kwei-Fah extract by 75 % ethanol in BALB/c mice. Ovalbumin (OVA)-induced asthma of BALB/c mice had significantly increased lung and liver TBARS value. The oral treatment with different dose of KFE (100, 800 and 1000 mg / kg B.W. mice) and rutin (10 and 100 mg/kg B. W. mice) had significantly reduced OVA-specific IgE in serum, the eosinophils percentage of total leukocytes from bronchoalveolar lavage fluid (BALF), methacholine-induced airway hyperresponsiveness (AHR), and decreased xi
12 lipid peroxidation in lung and liver cell of BALB/c mice. Therefore, the results suggest that KFE and rutin may decrease the Th2-related allergic disease on BALB/c mice. Chapter 4 was evaluates the hepatic protection of 75 % ethanol Kwei-Fah extract on acetaminophen-induced hepatic damage in BALB/c mice. BALB/c mice were single orally administered with different dosages of KFE (100, 800 and 1000 mg / kg B.W. mice) and rutin (10 and 100 mg/kg B. W. mice) for 15 days, and then injected with 1.0 g acetaminophen /kg B.W. (APAP). The result showed that KFE and rutin significantly decreased the GOT level in serum and lipid peroxidation in liver and lung cell. Liver histopathology showed that KEF and rutin reduced the incidence of liver lesions including cytoplasmic vacuolization. The results indicated that KFE and rutin could protect liver against acetaminophen-induced damage. xii
13 Abbreviation OVA PBS BSA SDS HBSS ABTS BALF ROS GOT GPT BUN Th1 Th2 BALB/c TBARS ELISA AHR PEnh i.p. Ovalbumin Phosphate-buffered saline Bovine serum albumin Sodium dodecyl sulfate Hank, s balanced salt solution 2, 2-azino-bis (3-ethylbenzth-azoline-6-sulfonic acid) Bronchoalveolar larvage fluid Reactive oxygen species Glutamate oxaloacetate transaminase Glutamate pyruvate transaminase Blood urea nitrogen Type 1 helper cell Type 2 helper cell BALB/cByJ Thiobarbituric acid-reactive substances Enzyme-linked immunosorbent assay Airway hyprresponsiveness Enhanced Pause Intra-peritoneal xiii
14 新 鮮 桂 花 乾 燥 桂 花 桂 花 萃 取 物 抗 氧 化 成 分 rutin 圖 一 本 研 究 使 用 之 桂 花 材 料 及 rutin Figure 1. The photograph of Osmanthus fragrans flower and rutin. xiv
<30332EAAFEA5F3A440A142A447A142A454A142A57CA147BEC7A5CDB14DB77EC3D2B7D3BEC7B2DFA661B9CF2E786C73>
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