摘 要 筋 骨 草 屬 植 物 (Ajuga), 為 唇 形 科 多 年 生 草 本 植 物, 分 佈 於 歐 洲 亞 洲 等 溫 帶 地 區, 其 主 要 的 活 性 成 分 為 黃 酮 類 化 合 物 以 及 蛻 皮 甾 酮, 兩 者 皆 具 有 抗 氧 化 活 性 改 善 心 血 管 疾 病

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1 行 政 院 農 業 委 員 會 林 務 局 屏 東 林 區 管 理 處 委 託 研 究 計 畫 成 果 報 告 期 末 進 度 報 告 台 灣 產 筋 骨 草 屬 植 物 護 肝 功 能 機 轉 及 其 活 性 成 分 之 研 究 The hepatoprotective activity and active components of Ajuga Species in Taiwan 計 畫 類 別 : 個 別 型 計 畫 整 合 型 計 畫 計 畫 編 號 : 執 行 期 間 : 99 年 06 月 01 日 至 100 年 03 月 31 日 計 畫 主 持 人 : 何 偉 真 共 同 主 持 人 : 謝 昌 衛 協 同 主 持 人 : 陳 兆 群 計 畫 參 與 人 員 : 陳 國 洲 黃 如 鴻 李 孟 崇 成 果 報 告 類 型 : 精 簡 報 告 完 整 報 告 執 行 單 位 : 大 葉 大 學 藥 用 植 物 與 保 健 學 系 中 華 民 國 100 年 03 月 31 日

2 摘 要 筋 骨 草 屬 植 物 (Ajuga), 為 唇 形 科 多 年 生 草 本 植 物, 分 佈 於 歐 洲 亞 洲 等 溫 帶 地 區, 其 主 要 的 活 性 成 分 為 黃 酮 類 化 合 物 以 及 蛻 皮 甾 酮, 兩 者 皆 具 有 抗 氧 化 活 性 改 善 心 血 管 疾 病 以 及 肝 臟 功 能 等 效 用 近 年 來 超 音 波 輔 助 萃 取 技 術 廣 泛 被 應 用 於 中 草 藥 活 性 成 分 萃 取, 具 有 萃 取 率 高 萃 取 時 間 短 以 及 成 本 低 等 優 點 因 此 本 研 究 以 超 音 波 萃 取 技 術 搭 配 L 9 直 交 實 驗 設 計, 進 行 筋 骨 草 活 性 成 分 的 萃 取, 並 探 討 其 最 適 化 萃 取 條 件 及 其 護 肝 之 效 果 從 實 驗 結 果 得 知, 時 間 (50 min) 溫 度 (60 ) 固 液 比 (1:20) 時, 為 黃 酮 類 化 合 物 與 蛻 皮 甾 酮 最 佳 萃 取 條 件 黃 酮 類 化 合 物 含 量 可 達 7.87 mg/g, 蛻 皮 甾 酮 含 量 可 達 0.73 mg/g, 在 DPPH 清 除 力 部 分, 清 除 力 可 達 84.85%, 發 現 與 活 性 成 分 含 量 成 正 相 關, 還 原 力 則 隨 著 萃 取 液 濃 度 增 加 而 有 上 升 趨 勢, 在 萃 取 液 濃 度 為 5 mg/ml 時, 其 還 原 力 相 當 於 0.1 mg/ml 人 工 合 成 抗 氧 化 劑 (BHA) 化 學 性 肝 損 傷 實 驗 部 分, 日 本 筋 骨 草 萃 取 液 組 相 較 於 control 組, GPT 與 GOT 指 數 有 顯 著 下 降, 分 別 為 53.9% 以 及 29.3%, 顯 示 日 本 筋 骨 草 萃 取 液 有 能 力 降 低 CCl 4 所 誘 導 之 急 性 肝 損 傷 效 用 酒 精 性 肝 損 傷 部 分, 日 本 筋 骨 草 萃 取 液 組 相 -i-

3 較 於 control 組, GPT 與 GOT 指 數 也 有 顯 著 下 降, 分 別 為 35.8% 以 及 28.5%, 顯 示 日 本 筋 骨 草 萃 取 液 對 於 酒 精 性 肝 損 傷 同 樣 具 有 抑 制 效 果 關 鍵 詞 : 日 本 筋 骨 草 黃 酮 類 化 合 物 抗 氧 化 超 音 波 萃 取. 直 交 試 驗 肝 損 傷 護 肝 -ii-

4 目 錄 中 文 摘 要... 目 錄... 圖 目 錄... 表 目 錄... i iii viii x 第 一 章 前 言... 1 第 二 章 文 獻 回 顧... 3 第 一 節 筋 骨 草 屬 (Ajuga) 植 物 簡 介 3 第 二 節 台 灣 產 筋 骨 草 屬 植 物 型 態 及 分 佈 簡 介. 4 一 匍 匐 筋 骨 草. 4 二 日 本 筋 骨 草. 4 三 矮 筋 骨 草. 5 四 台 灣 筋 骨 草. 5 五 網 果 筋 骨 草. 5 第 三 節 筋 骨 草 屬 植 物 研 究 況. 12 一 筋 骨 草 屬 植 物 生 理 及 藥 理 作 用 簡 介 12 ( 一 ) 降 血 糖 iii-

5 ( 二 ) 保 肝 功 能.. 12 ( 三 ) 降 血 脂 及 減 少 血 中 膽 固 醇. 13 ( 四 ) 抑 制 腫 瘤.. 13 ( 五 ) 治 療 燒 燙 傷.. 13 二 筋 骨 草 屬 植 物 相 關 成 分 研 究 進 展 14 ( 一 ) 植 物 性 蛻 皮 甾 體 類 化 合 物.. 14 ( 二 ) 環 烯 醚 萜 苷 類 化 合 物.. 14 ( 三 ) 黃 酮 類 化 合 物.. 14 ( 四 ) 二 萜 類 化 合 物.. 14 三 蛻 皮 甾 酮 四 黃 酮 類 化 合 物 五 自 由 基 之 定 義 六 自 由 基 來 源 第 四 節 中 草 藥 活 性 成 分 不 同 萃 取 方 法 介 紹. 18 一 超 音 波 輔 助 萃 取 熱 學 原 理 機 械 作 用 空 化 作 用.. 19 第 五 節 直 交 實 驗 設 計. 20 -iv-

6 一 直 交 表 二 因 素 分 析 第 六 節 肝 臟 介 紹. 23 一 肝 臟 二 血 液 生 化 指 標 第 七 節 抗 氧 化 活 性 評 估. 24 一 自 由 基 清 除 能 力 二 還 原 力 之 測 定 三 BHA 人 工 合 成 抗 氧 化 劑 26 第 八 節 研 究 目 的 建 立 筋 骨 草 活 性 成 分 萃 取 平 台 探 討 活 性 成 分 萃 取 之 最 適 化 條 件 探 討 萃 取 液 之 護 肝 成 效.. 26 第 三 章 材 料 與 方 法 第 一 節 材 料. 27 一 植 物 來 源 二 藥 品 清 單 三 儀 器 清 單 四 實 驗 動 物 v-

7 第 二 節 方 法. 28 一 樣 品 前 處 理 二 不 同 萃 取 實 驗 建 立 ( 一 ) 熱 水 萃 取.. 29 ( 二 ) 乙 醇 萃 取.. 29 ( 三 ) 超 臨 界 萃 取.. 29 ( 四 ) 超 音 波 輔 助 萃 取.. 30 三 活 性 成 分 含 量 分 析 ( 一 ) 總 黃 酮 含 量 分 析.. 32 ( 二 ) 總 黃 酮 標 準 曲 線 建 立.. 32 ( 三 ) 蛻 皮 甾 酮 含 量 分 析.. 33 ( 四 ) 蛻 皮 甾 酮 標 準 曲 線 建 立.. 33 ( 五 ) 抗 氧 化 試 驗 DPPH 自 由 基 清 除 活 性 評 估 還 原 力.. 34 ( 六 ) 動 物 試 驗 化 學 性 肝 損 傷 平 台 酒 精 性 肝 損 傷 平 台.. 35 ( 七 ) 回 應 值 計 算 vi-

8 第 四 章 結 果 與 討 論 第 一 節 日 本 筋 骨 草 活 性 成 分 含 量 測 定. 42 一 不 同 萃 取 方 法 二 超 音 波 萃 取 預 實 驗 三 以 直 交 實 驗 設 計 法 探 討 最 是 黃 酮 類 化 合 物 以 及 蛻 皮 甾 酮 萃 取 條 件. 46 四 統 計 分 析 ( 一 ) 萃 取 時 間 對 活 性 成 分 萃 取 之 影 響.. 50 ( 二 ) 萃 取 溫 度 對 活 性 成 分 萃 取 之 影 響.. 50 ( 三 ) 固 液 比 對 活 性 成 分 萃 取 之 影 響.. 50 第 二 節 樣 品 萃 取 液 之 抗 氧 化 活 性. 54 一 樣 品 萃 取 液 之 DPPH 清 除 率 54 二 樣 品 萃 取 液 之 還 原 力 第 三 節 樣 品 萃 取 液 護 肝 活 性. 58 一 化 學 性 肝 損 傷 結 果 二 酒 精 性 肝 損 傷 結 果 第 五 章 結 論 第 六 章 計 畫 成 果 自 評 第 七 章 延 續 計 劃 之 構 想 vii-

9 圖 目 錄 圖 1 匍 匐 筋 骨 草.. 7 圖 2 日 本 筋 骨 草.. 8 圖 3 矮 筋 骨 草.. 9 圖 4 台 灣 筋 骨 草.. 10 圖 5 網 果 筋 骨 草.. 11 圖 6 蛻 皮 甾 酮 結 構.. 15 圖 7 黃 酮 類 基 本 結 構.. 16 圖 8 研 究 架 構.. 31 圖 9 HPCL 蛻 皮 甾 酮 層 析 圖 49 圖 10 HPCL 日 本 筋 骨 草 層 析 圖 49 圖 11 正 交 實 驗 設 計 中 因 子 對 黃 酮 類 化 合 物 萃 取 的 影 響.. 53 圖 12 第 6 組 萃 取 條 件 對 DPPH 清 除 力 之 影 響 56 圖 13 第 6 組 萃 取 條 件 對 還 原 力 力 之 影 響 圖 14 日 本 筋 骨 草 萃 取 液 對 四 氯 化 碳 誘 導 小 鼠 的 GPT 值 上 升 的 抑 制 作 用.. 60 圖 15 日 本 筋 骨 草 萃 取 液 對 四 氯 化 碳 誘 導 小 鼠 的 GOT 值 上 升 的 抑 制 作 用 viii-

10 圖 16 日 本 筋 骨 草 萃 取 液 對 酒 精 誘 導 大 鼠 的 GPT 值 上 升 的 抑 制 作 用.. 62 圖 17 日 本 筋 骨 草 萃 取 液 對 酒 精 誘 導 大 鼠 的 GOT 值 上 升 的 抑 制 作 用 ix-

11 表 目 錄 表 1 不 同 萃 取 方 法 表 2 超 音 波 萃 取 預 實 驗 條 件 表 3 直 交 實 驗 設 計 中 各 因 子 與 水 準 之 定 義 表 4 實 驗 配 置 表 表 5 不 同 萃 取 方 法 之 比 較 44 表 6 超 音 波 萃 取 預 實 驗 條 件 結 果 45 表 7 L 9 (3 4 ) 直 交 表 實 驗 設 計 黃 酮 類 化 合 物 萃 取 實 驗 結 果 47 表 8 L 9 (3 4 ) 直 交 表 實 驗 設 計 蛻 皮 甾 酮 萃 取 實 驗 結 果 48 表 9 直 交 實 驗 設 計 法 - 級 差 分 析 結 果 x-

12 第 一 章 前 言 中 國 自 古 以 來 就 以 中 草 藥 治 療 各 種 症 狀 或 疾 病, 中 草 之 所 以 能 夠 治 病, 在 於 所 含 之 有 效 成 分 ( 吳,2006), 但 隨 著 西 方 醫 學 的 發 展, 導 致 中 草 藥 被 忽 視, 近 年 來 隨 著 科 技 的 日 益 進 步 以 及 養 生 觀 念 的 興 起, 使 的 中 草 藥 中 的 活 性 成 分 在 近 幾 年 來 又 慢 慢 受 到 重 視, 例 如 : 食 品 藥 物 化 妝 品 保 健 食 品 中 都 可 看 到 中 草 藥 萃 取 物 的 添 加 相 較 於 化 學 製 成 的 藥 劑, 中 草 藥 之 活 性 成 分 具 有 較 易 吸 收 較 無 刺 激 性 以 及 較 無 副 作 用 等 優 點, 再 加 上 目 前 有 許 多 西 方 醫 學 無 法 治 療 的 疾 病, 也 都 紛 紛 找 尋 其 他 方 法, 中 草 藥 即 是 其 中 一 種 此 外, 中 草 藥 植 物 或 天 然 物 化 學 成 分 分 析 領 域 中, 萃 取 是 一 項 重 要 的 環 節 ( 蕭,2007) 傳 統 的 萃 取 方 法, 例 如 : 熱 水 萃 取 溶 劑 萃 取 索 氏 萃 取 等 方 法, 都 具 有 萃 取 效 率 差 萃 取 時 間 長 萃 取 溫 度 高 毒 性 物 質 殘 留 等 問 題, 因 此 較 新 的 萃 取 方 法 也 漸 漸 取 代 傳 統 萃 取, 超 音 波 輔 助 萃 取 法 即 是 其 中 一 種 超 音 波 輔 助 萃 取 為 近 年 來 廣 泛 應 用 於 中 草 藥 活 性 成 分 萃 取 之 技 術, 其 原 理 為 利 用 超 音 波 在 震 盪 時 所 產 生 的 熱 能 機 械 作 用 以 及 空 化 作 用, 加 速 溶 劑 向 物 質 中 滲 透, 使 目 標 成 -1-

13 分 萃 取 效 率 提 高 並 縮 短 萃 取 時 間, 同 時 也 可 大 量 萃 取 以 降 低 成 本 本 研 究 目 的 在 於 比 較 不 同 萃 取 方 法 之 活 性 成 分 含 量, 在 超 音 波 輔 助 萃 取 法 的 研 究 上, 以 一 次 一 變 因 方 式 探 討 適 合 超 音 波 萃 取 溫 度 萃 取 時 間 乙 醇 濃 度 萃 取 功 率 以 及 固 液 比 等 變 因, 之 後 進 行 統 計 分 析 挑 選 出 顯 著 因 子, 並 搭 配 直 交 實 驗 設 計 法 ( 田 口 試 驗 法,Taguchi Method), 探 討 超 音 波 輔 助 萃 取 日 本 筋 骨 草 中 活 性 成 分 之 最 適 化 條 件, 並 與 其 他 萃 取 方 法 做 活 性 成 分 含 量 比 較, 再 進 行 萃 取 物 抗 氧 化 活 性 以 及 護 肝 活 性 之 測 定 -2-

14 第 二 章 文 獻 回 顧 第 一 節 筋 骨 草 屬 (Ajuga) 植 物 簡 介 筋 骨 草 屬 (Ajuga) 植 物 為 唇 型 花 科 多 年 生 草 本 植 物, 全 球 約 有 三 百 多 種, 主 要 分 布 於 歐 亞 非 三 大 洲, 也 有 部 份 的 品 種 分 佈 於 澳 洲 與 北 美 洲 (Flora of China, 2009) 其 特 徵 為 花 冠 假 單 唇, 上 唇 極 短, 二 深 裂 或 淺 裂, 不 為 盔 狀 ; 下 唇 大, 三 裂, 中 裂 片 及 發 達, 平 展 ; 子 房 四 淺 裂 ; 小 堅 果 四 粒, 倒 卵 狀 三 菱 型, 表 面 具 凹 陷 網 格 ( 謝,1998; 劉 等,2001) 台 灣 目 前 有 產 五 種 筋 骨 草, 分 別 為 : 匍 匐 筋 骨 草 (Ajuga decumbens) 日 本 筋 骨 草 (Ajuga nipponensis) 矮 筋 骨 草 (Ajuga pygmaea) 臺 灣 筋 骨 草 (Ajuga taiwanensis) 網 果 筋 骨 草 (Ajuga dictyocarpa) 在 其 他 國 家, 筋 骨 草 屬 植 物 也 被 最 為 藥 用 植 物 使 用, 此 屬 植 物 在 國 外 被 研 究 過 的 尚 有 九 味 一 支 窩 (Ajuga bracteosa) 紫 唇 花 (Ajuga reptans ) 等 (Terahara et al., 2001;Hilaly and Lyoussi, 2002;Hilaly et al., 2004) 筋 骨 草 屬 植 物 別 名 尚 有 百 症 草 散 血 草 白 尾 蜈 蚣 金 瘡 小 草 石 灰 菜 紫 貝 金 盤 白 毛 夏 枯 草 散 血 丹 破 血 -3-

15 丹 等 ( 鍾,1997; 邱 合 張,2001; 李,2005) 筋 骨 草 屬 植 物 也 因 地 區 年 代 不 同 而 其 別 名 又 有 所 差 異, 但 皆 稱 呼 為 筋 骨 草 ( 褚 和 王,1997) 第 二 節 台 灣 產 筋 骨 草 屬 植 物 型 態 及 分 佈 簡 介 一 匍 匐 筋 骨 草 Ajuga decumbens Thunb. ex Murray 莖 匍 匐, 基 生 葉 較 莖 生 葉 大, 倒 披 針 型 至 匙 型, 長 3-9 公 分, 寬 公 分, 粗 鋸 齒 緣 至 波 狀 緣 兩 面 疏 被 毛 花 冠 淡 藍 色 至 淡 紅 紫 色, 內 面 近 基 部 具 毛 環 此 種 在 台 灣 為 一 歸 化 種, 僅 分 布 於 奮 起 湖 鐵 道 附 近, 可 能 與 山 葵 一 起 引 進 至 台 灣 本 省, 由 於 氣 候 適 合 而 歸 化 於 此 本 種 尚 分 布 於 日 本 韓 國 中 國 中 部 ( 謝,1998; 楊 等,1999) 二 日 本 筋 骨 草 Ajuga nipponensis Makino 莖 直 立 或 斜 上, 無 基 生 葉 ; 葉 橢 圓 形 至 橢 圓 狀 挾 卵 型, 長 3-7 公 分, 寬 公 分, 粗 鋸 齒 狀 牙 齒 緣, 被 長 柔 毛 花 冠 白 色, 內 面 近 基 部 具 毛 環 在 台 灣 分 布 於 苗 栗 新 竹 等 北 部 西 岸 沿 海 沙 地, 尚 分 布 於 日 本 韓 國 中 國 大 陸 中 部 ( 謝, -4-

16 1998; 楊 等,1999) 三 矮 筋 骨 草 Ajuga pygmaea A. Gray 植 株 具 走 莖, 僅 具 基 生 葉 ; 葉 倒 披 針 型 至 長 橢 圓 狀 倒 披 針 型, 長 2-4 公 分, 寬 公 分, 疏 被 長 柔 毛, 波 狀 鋸 齒 緣 ; 葉 柄 公 分 花 冠 藍 紫 色, 內 面 近 基 部 具 毛 環 分 布 於 台 灣 北 部 沿 海 地 區, 尚 分 布 於 日 本 琉 球 ( 謝,1998; 楊 等,1999) 四 台 灣 筋 骨 草 Ajuga taiwanensis Nakai ex Murata 莖 直 立 或 斜 上, 具 基 生 葉 及 莖 生 葉 ; 葉 倒 卵 型 至 倒 披 針 型, 長 6-15 公 分, 寬 1-4 公 分, 波 狀 緣, 被 短 毛 ; 葉 柄 長 1-4 公 分 花 冠 淡 藍 紫 色 至 淡 紅 紫 色 本 種 在 台 灣 分 布 於 全 省 中 低 海 拔, 尚 分 布 於 琉 球 菲 律 賓 及 廣 東 ( 謝,1998; 楊 等,1999) 五 網 果 筋 骨 草 Ajuga dictyocarpa Hayata 莖 直 立 或 斜 上, 無 基 生 葉 ; 葉 橢 圓 形 或 菱 狀 卵 型, 長 3-6 公 分, 寬 2-5 公 分, 粗 鋸 齒 緣, 兩 面 被 短 毛 ; 葉 柄 長

17 公 分 花 冠 淡 藍 白 色 或 粉 紅 色 分 佈 於 台 灣 北 部 低 海 拔 開 闊 沙 質 潮 濕 地, 尚 分 佈 於 中 國 中 南 部 琉 球 與 越 南 ( 謝,1998; 楊 等,1999) -6-

18 圖 一 匍 匐 筋 骨 草 Ajuga decumbens ( 楊 等,1999) -7-

19 圖 二 日 本 筋 骨 草 Ajuga nipponensis ( 楊 等,1999) -8-

20 圖 三 矮 筋 骨 草 Ajuga pygmaea ( 楊 等,1999) -9-

21 圖 四 台 灣 筋 骨 草 Ajuga taiwanensis ( 楊 等,1999) -10-

22 圖 五 網 果 筋 骨 草 Ajuga dictyocarpa ( 楊 等,1999) -11-

23 第 三 節 筋 骨 草 屬 植 物 研 究 概 況 一 筋 骨 草 屬 植 物 生 理 及 藥 理 作 用 簡 介 筋 骨 草 屬 植 物 在 傳 統 用 藥 上 具 有 止 血 治 療 腹 瀉 痢 疾 肝 膽 疾 病 肺 部 疾 病 化 痰 抗 菌 抗 瘧 疾 治 療 牙 痛 頭 痛 發 燒 等 效 果 自 八 十 年 代 以 來, 對 於 抗 腫 瘤 減 少 心 血 管 疾 病 與 降 血 糖 具 有 一 定 療 效 而 被 重 視 在 動 物 實 驗 中 也 具 有 保 肝 降 血 糖 減 少 血 中 膽 固 醇 抗 腫 瘤 以 及 預 防 心 血 管 疾 病 等 功 效, 目 前 不 同 種 筋 骨 草 屬 植 物 的 生 理 作 用 簡 介 如 下 : ( 一 ) 降 血 糖 : Hilaly 等 人 (2000), 研 究 非 洲 摩 洛 哥 產 伊 娃 筋 骨 草 (Ajuga iva), 發 現 其 水 萃 物 可 有 效 降 低 鏈 尿 菌 素 誘 導 型 糖 尿 病 大 鼠 血 液 中 高 血 糖 情 形, 推 測 作 用 機 制 可 能 是 增 進 細 胞 組 織 對 血 糖 的 利 用, 進 而 降 低 血 糖 值 ( 二 ) 保 肝 功 能 : 馬 志 平 等 人 (2002), 在 匍 匐 筋 骨 草 的 初 步 實 驗 中, 發 -12-

24 現 匍 匐 筋 骨 草 粗 黃 酮 萃 取 物 可 治 療 CCl 4 誘 導 之 大 鼠 肝 損 傷 ( 三 ) 降 血 脂 及 減 少 血 中 膽 固 醇 : Chenni 等 人 (2007), 以 伊 娃 筋 骨 草 水 萃 物 可 有 效 降 低 血 中 膽 固 醇 及 低 密 度 膽 固 醇, 並 增 加 HDL 2 -cholesterol, 且 減 少 血 漿 及 組 織 中 脂 質 過 氧 化 反 應, 更 可 減 少 小 腸 對 膽 固 醇 的 吸 收 ( 四 ) 抑 制 腫 瘤 : 曾 等 人 (2003), 在 匍 匐 筋 骨 草 水 萃 物, 可 有 效 抑 制 小 鼠 S 180 肉 瘤, 抑 制 率 達 81%, 但 作 用 機 制 不 明 ( 五 ) 治 療 燒 燙 傷 : 王 等 人 (2003), 將 新 鮮 匍 匐 筋 骨 草 榨 汁 後, 稀 釋 成 不 同 濃 度, 塗 抹 於 二 度 燙 傷 小 鼠 皮 膚 連 續 25 天, 發 現 在 第 10 天 時 可 有 效 癒 合 嚴 重 燙 傷 之 傷 口 -13-

25 二 筋 骨 草 屬 植 物 相 關 成 分 研 究 進 展 目 前 筋 骨 草 屬 植 物 在 成 分 的 研 究 尚 未 完 整 了 解, 因 植 物 本 身 所 含 化 學 成 分 多 且 複 雜, 再 加 上 因 品 種 不 同 成 分 也 會 有 所 差 異 筋 骨 草 屬 植 物 在 化 學 成 分 的 研 究 可 歸 類 為 幾 大 類 ( 劉 等,2001): ( 一 ) 植 物 性 蛻 皮 甾 體 類 化 合 物 (Phytoecdysteroids) ( 二 ) 環 烯 醚 萜 苷 類 化 合 物 (iridoid glycosides) ( 三 ) 黃 酮 類 化 合 物 (Flavonoids) ( 四 ) 二 萜 類 化 合 物 (Diterpenoids) 三 蛻 皮 甾 酮 目 前 的 相 關 研 究 指 出, 蛻 皮 甾 酮 為 筋 骨 草 屬 植 物 中 較 主 要 的 活 性 成 分 之 一, 化 學 式 C 22 H 44 O 7, 分 子 量 為 , 存 在 於 植 物 中, 具 有 多 項 生 理 活 性, 例 如 : 調 節 免 疫 功 能 調 節 中 樞 神 經 系 統 改 善 治 療 缺 氧 和 缺 血 性 腦 損 傷 促 進 哺 乳 動 物 的 多 種 組 織 和 器 官 蛋 白 質 與 核 酸 的 合 成 增 進 醣 類 和 脂 質 代 謝 改 善 高 血 糖 和 高 血 脂 抗 氧 化 活 性 以 及 延 緩 老 化 等 效 用 ( 吳 等,2006) -14-

26 CH 3 HO OH CH 3 OH CH 3 CH 3 HO OH HO O 20-Hydroxyecdysone 圖 六 蛻 皮 甾 酮 結 構 四 黃 酮 類 化 合 物 黃 酮 類 化 合 物 (Flavonoids) 廣 泛 的 存 在 於 植 物 體 內, 幾 乎 所 有 的 植 物 都 含 有 黃 酮 類 物 質, 目 前 為 止 已 發 現 2000 多 種 黃 酮 類 物 質, 黃 酮 類 屬 多 酚 化 合 物, 在 結 構 上 有 C 6 -C 3 -C 6 的 基 本 結 構 經 由 苯 丙 胺 酸 (Phenylalanine) 經 一 連 串 代 謝 路 徑 衍 生 而 來, 黃 酮 類 化 合 物 為 天 然 的 抗 氧 化 物 質 之 一, 許 多 研 究 指 出, 黃 酮 類 化 合 物 具 有 許 多 生 理 活 性, 例 如 : 抗 氧 化 抗 菌 抗 病 毒 抗 突 變 和 抗 癌 等 效 果 黃 酮 -15-

27 類 化 合 物 之 抗 氧 化 活 性 與 其 構 造 之 排 列 有 關, 包 含 兩 個 苯 環 及 一 個 含 氧 酚 基, 其 中 羥 化 作 用 之 位 置 及 程 度 決 定 了 抗 氧 化 活 性, 使 得 類 黃 酮 具 有 抗 氧 化 性 在 相 關 的 研 究 中 也 發 現, 黃 酮 類 化 合 物 可 改 善 四 氯 化 碳 誘 導 大 鼠 之 肝 損 傷, 推 測 其 作 用 機 制 可 能 與 抗 氧 化 活 性 有 關 目 前 相 關 研 究 中 也 指 出, 蛻 皮 甾 體 類 化 合 物 為 筋 骨 草 屬 植 物 中 較 主 要 活 性 成 分 之 一, 存 在 於 植 物 中, 並 具 有 下 列 多 項 生 理 活 性 : 調 節 免 疫 功 能 治 療 缺 氧 性 腦 損 傷 促 進 脂 質 代 謝 改 善 高 血 糖 以 及 改 善 高 血 脂 等 效 果 圖 七 黃 酮 類 基 本 結 構 -16-

28 五 自 由 基 (Freer radicals) 之 定 義 自 由 基 是 氧 氣 在 體 內 新 陳 代 謝 後 所 產 生 的 產 物 (Finaud et al, 2006) 當 中 涉 及 的 化 學 反 應 過 程 稱 為 氧 化 作 用 人 的 身 體 週 遭 也 有 無 數 的 氧 化 作 用 在 進 行, 主 要 分 為 :(1) 內 生 性, 人 體 進 行 物 質 代 謝 過 程 中 產 生 ;(2) 外 生 性, 受 到 外 界 因 素 所 引 起 的, 例 如 藥 物 抽 菸 喝 酒 空 氣 污 染 或 是 輻 射 線 等 假 使 過 氧 化 物 質 產 生 而 體 內 的 抗 氧 化 機 制 未 能 達 成 平 衡 狀 態 而 造 成 壓 力, 稱 作 氧 化 壓 力 (oxidation stress) 結 果 會 產 生 大 量 有 害 的 自 由 基, 破 壞 身 體 的 重 要 組 成 分 子, 使 之 變 質, 最 終 導 致 衰 老 或 生 病 (Harman, 2003) 六 自 由 基 來 源 近 年 來 有 許 多 研 究 報 告 指 出 ( 施 等,1989), 自 由 基 在 癌 症 心 血 管 疾 病 及 老 化 上, 均 扮 演 極 重 要 的 角 色, 而 人 體 在 代 謝 過 程 中 亦 會 產 生 活 性 氧 與 自 由 基, 在 正 常 狀 態 下, 人 體 之 抗 氧 化 系 統 會 與 自 由 基 對 抗 取 得 一 個 平 衡, 以 維 持 生 體 正 常 生 理, 唯 當 此 平 衡 遭 到 破 壞 時, 活 性 氧 與 自 由 基 就 會 攻 擊 細 胞 組 織 細 胞 膜 及 危 害 基 因 物 質, 造 成 細 胞 變 異 傷 害, 甚 至 死 亡, 而 此 平 衡 之 破 壞, 日 積 月 累 不 斷 形 成 與 累 積, 亦 -17-

29 可 能 導 致 多 種 疾 病 之 發 生 ( 陳 等,1998) 第 四 節 中 草 藥 活 性 成 分 不 同 萃 取 方 法 介 紹 現 階 段 而 言, 萃 取 方 法 繁 多, 大 多 為 固 液 萃 取, 即 以 溶 劑 將 特 定 物 質 分 離 提 取 出 來, 常 見 的 萃 取 方 法 有 熱 水 萃 取 酒 精 萃 取 和 索 氏 萃 取 等 方 法, 但 這 些 傳 統 萃 取 方 法 耗 時 且 效 率 差, 因 此 漸 漸 被 新 穎 的 萃 取 方 法 取 代, 例 如 : 超 音 波 輔 助 萃 取 (Ultrasonic-assisted extraction) 超 臨 界 流 體 萃 取 (Supercritical fluid extraction) 和 加 速 溶 劑 萃 取 (Accelerated solcent extraction) 等, 由 於 超 臨 界 流 體 和 加 速 溶 劑 萃 取 受 限 於 設 備 成 本 和 技 術 複 雜, 因 此 超 音 波 輔 助 萃 取 則 較 為 蓬 勃 發 展 一 超 音 波 輔 助 萃 取 (Ultrasonic-assisted extraction) 超 音 波 輔 助 萃 取 為 近 年 來 廣 泛 應 用 於 中 草 藥 活 性 成 分 萃 取 之 技 術, 其 原 理 為 利 用 超 音 波 在 震 盪 時 所 產 生 的 熱 能 機 械 作 用 以 及 空 化 作 用, 加 速 溶 劑 向 物 質 中 滲 透, 使 目 標 成 分 萃 取 效 率 提 高 並 縮 短 萃 取 時 間, 同 時 也 可 大 量 萃 取 以 降 低 -18-

30 成 本 1. 熱 學 原 理 : 超 音 波 能 量 會 轉 化 為 熱 能, 其 震 動 能 量 不 斷 被 物 質 或 溶 劑 吸 收 進 而 轉 變 為 熱 能, 這 種 吸 收 聲 能 而 引 起 溫 度 稍 高 是 穩 定 的, 所 以 超 音 波 可 以 在 瞬 間 使 內 部 溫 度 升 高, 加 速 成 分 的 溶 解 ( 嚴 等,2002) 2. 機 械 作 用 : 超 音 波 產 生 屬 於 非 熱 學 原 理 的 線 性 交 變 震 動 作 用, 在 傳 播 過 程 中 可 因 起 介 質 質 點 的 交 替 壓 縮 和 伸 張, 雖 然 介 質 質 點 的 震 盪 位 移 及 速 度 不 大, 但 其 加 速 度 卻 非 常 大 ( 朱 等,2001) 此 作 用 可 以 造 成 天 然 物 細 胞 組 織 的 變 形 以 及 溶 劑 與 物 質 間 不 同 之 加 速 度 而 造 成 磨 擦, 加 速 化 學 成 分 的 分 離 ( 嚴 等, 2002) 3. 空 化 作 用 : 此 作 用 為 超 音 波 輔 助 萃 取 較 主 要 及 顯 著 的 作 用, 當 一 定 強 度 的 超 音 波 在 液 體 媒 質 中 傳 播 時, 使 液 體 中 的 微 氣 泡 震 盪 -19-

31 生 成 增 大 收 縮 崩 潰, 導 致 微 氣 泡 附 近 的 液 體 產 生 強 烈 的 激 波, 形 成 局 部 點 的 極 端 高 溫 高 壓 ( 嚴 等,2002) 第 五 節 直 交 實 驗 設 計 直 交 實 驗 設 計 (orthogonal experimental design) 是 於 1920 年 代 由 英 國 統 計 學 家 Fisher 所 提 出, 為 一 種 以 直 交 表 設 計 來 進 行 多 因 子 (factors) 與 多 水 準 (levels) 的 試 驗 設 計 法, 利 用 統 一 格 式 化 的 直 交 表 安 排 試 驗, 從 各 因 子 與 水 準 中 找 出 最 佳 試 驗 條 件 搭 配 組 合 ( 祝 等,2009) 一 直 交 表 透 過 直 交 表, 產 生 出 獨 立 且 均 衡 的 每 一 個 因 子, 再 藉 由 每 一 個 因 素 分 析 出 的 主 效 果 (main effect), 由 主 效 果 推 論 每 一 個 因 素 對 於 該 實 驗 結 果 的 優 劣 (Park, 1996) 以 直 交 實 驗 來 解 最 佳 化 問 題 時, 問 題 的 一 個 參 數 可 視 為 直 交 實 驗 中 的 一 個 因 素, 而 參 數 視 為 因 素 的 水 準 值 而 使 用 直 交 表 進 行 實 驗, 僅 是 在 進 行 部 份 因 素 實 驗 (fractional - factorial experiment), 所 以 與 會 以 全 部 水 準 值 的 排 列 組 合 進 -20-

32 行 實 驗 的 完 全 因 素 實 驗 (full-factorial experiment) 比 起 來 較 為 節 省 執 行 所 需 的 時 間 ( 陳,2002) 且 直 交 實 驗 具 有 系 統 推 理 的 特 性, 因 此 只 需 進 行 部 份 因 素 實 驗 就 可 以 求 得 最 佳 條 件 的 近 似 解, 因 而 可 節 省 大 量 執 行 的 時 間, 使 效 率 提 昇 ( 陳, 2001) 將 已 知 或 假 設 的 控 制 因 子 與 雜 訊 因 子 配 置 到 直 交 表 上, 利 用 最 少 次 數 的 實 驗 即 可 決 定 最 適 的 參 數 水 準 直 交 表 是 以 L n (X m ) 表 示,L 表 示 所 使 用 的 直 交 表,n 為 直 交 表 中 的 列 數 ( 各 組 參 數 水 準 組 合 ),X 為 因 子 的 水 準 數,m 則 為 直 交 表 的 行 數 在 直 交 表 進 行 完 畢 後, 可 根 據 實 驗 資 料 的 分 析 結 果 決 定 各 個 因 子 的 最 佳 水 準 ( 高,1992) 直 交 實 驗 設 計 的 種 類 很 多, 如 L 8 (2 3 ) L 9 (3 4 ) L 16 (2 15 ) L 18 ( ) 等, 以 L 9 (3 4 ) 直 交 表 為 例,4 項 控 制 因 子, 每 項 因 子 有 3 水 準, 共 需 進 行 9 次 實 驗, 若 採 用 全 因 子 實 驗 設 計, 則 會 有 3 4 = 81 個 實 驗 組 數 而 本 研 究 是 採 用 L 9 直 交 表 作 為 萃 取 醋 酸 的 實 驗 配 置 依 據, 而 各 實 驗 條 件 的 最 佳 組 合 判 定 方 法 為 直 觀 分 析 與 變 異 數 分 析 ( 陳,2001) -21-

33 二 因 素 分 析 直 交 表 實 驗 設 計 法 的 因 子 水 準 分 析, 是 為 了 解 實 驗 因 素 對 實 驗 結 果 影 響 的 效 果 為 如 何, 稱 為 因 素 分 析 或 主 效 果 (main effect) 評 估 主 效 果 即 為 計 算 該 因 素 的 某 一 水 準 在 不 同 實 驗 中, 對 目 標 函 數 的 貢 獻 程 度 有 多 少 ( 陳,2002) 主 效 果 S jk 的 定 義 為 : n S jk = t 1 y t F k yt 表 示 為 直 交 表 實 驗 中 第 t 次 實 驗 的 評 估 函 數 值,F k 為 一 個 旗 標 值, 若 第 t 次 實 驗 中 第 j 個 因 素 選 用 水 準 為 k, 則 F k =1 否 則 F k =0 若 適 應 函 數 是 求 maximal, 則 主 效 果 值 愈 大 表 示 對 適 應 函 數 具 有 較 佳 的 貢 獻 度 ; 若 適 應 函 數 是 求 minimal, 則 主 效 果 值 愈 小 者 貢 獻 度 較 佳 另 一 方 面 主 效 果 可 以 顯 示 因 素 中 水 準 的 各 別 影 響 例 如 主 效 果 計 算 出 S j1 > S j2, 則 表 示 在 第 j 個 因 素 水 準 值 1 對 於 整 體 最 佳 化 函 數 的 貢 獻 大 於 水 準 值 2, 若 情 形 相 反 S j1 < S j2, 則 表 示 水 準 值 2 較 佳 ; 由 此 可 知, 主 效 果 的 分 析 可 以 推 測 出 全 實 驗 的 可 能 最 佳 解 ( 高,1992; 祝 等,2009) -22-

34 第 六 節 肝 臟 介 紹 一 肝 臟 位 於 人 體 右 上 腹, 是 人 體 中 最 大 的 器 官 肝 臟 的 功 能 包 括 : 製 造 膽 汁 合 成 抗 凝 血 劑 維 持 血 糖 的 恆 定 儲 存 脂 溶 性 維 生 素 吞 噬 已 破 壞 之 紅 血 球 及 白 血 球 以 及 參 與 藥 物 的 代 謝 等 根 據 行 政 院 衛 生 署 的 統 計 資 料 顯 示, 慢 性 肝 病 及 肝 硬 化 等 肝 臟 疾 病 位 居 國 人 十 大 死 因 的 第 八 位 ( 衛 生 署,2009) 國 人 罹 患 肝 臟 疾 病 的 原 因 主 要 是 因 為 病 毒 的 感 染, 另 外 藥 物 的 濫 用 長 期 酗 酒 等 也 是 國 人 罹 患 肝 臟 疾 病 的 原 因 近 年 來, 台 灣 地 區 酒 精 類 飲 料 的 消 費 量 大 幅 提 昇, 使 酒 精 性 肝 臟 疾 病 罹 患 率 也 相 對 提 高 長 期 攝 取 酒 精 之 後, 在 人 體 內 引 起 之 生 化 以 及 病 理 學 上 之 傷 害 非 常 複 雜, 而 其 中 受 影 響 最 深 的 組 織 就 是 酒 精 代 謝 的 主 要 組 織 - 肝 臟 長 期 攝 取 酒 精 所 造 成 之 肝 臟 損 傷 包 括 : 脂 肪 肝 酒 精 性 肝 炎 以 及 肝 硬 化 等, 若 不 即 時 治 療 更 會 引 起 肝 癌 經 研 究 顯 示, 患 有 酒 精 性 肝 炎 的 病 人 容 易 受 到 病 毒 的 侵 入 而 併 發 病 毒 性 肝 炎, 其 中 又 以 酒 精 性 肝 炎 併 發 B 型 及 C 型 肝 炎 罹 患 率 最 高 (Anand et al, 2000), 而 病 毒 性 慢 性 肝 炎 的 病 人 攝 取 酒 精 後, 肝 臟 疾 病 也 會 快 速 惡 化, 增 -23-

35 加 併 發 症 及 死 亡 機 率 因 此, 在 病 毒 性 慢 性 肝 炎 罹 患 率 高 的 台 灣 地 區, 更 應 該 重 視 酒 精 攝 取 所 引 起 的 肝 臟 疾 病 問 題 二 血 液 生 化 指 標 肝 細 胞 疾 病 多 少 會 引 起 肝 臟 機 能 的 改 變, 由 此 可 作 為 評 估 肝 病 的 參 考 針 對 檢 查 肝 病 而 設 計 用 於 診 斷 治 療 及 預 後 之 判 斷 的 生 化 測 定 值, 可 當 作 肝 功 能 指 標 肝 功 能 指 標 之 酵 素 測 定 中, 血 漿 GOT 與 GPT 之 活 性 是 肝 功 能 檢 查 的 代 表 值 GOT 與 GPT 是 肝 臟 中 含 量 較 多 的 酵 素 肝 細 胞 破 壞 時, GOT 與 GPT 就 會 自 肝 臟 脫 逸 至 血 漿 中, 隨 肝 細 胞 損 害 程 度 即 時 反 映 出 高 或 低 值 ( 戴,2009) 第 七 節 抗 氧 化 活 性 評 估 一 自 由 基 清 除 能 力 (α,α-diphenyl-β-picrylhydrazyl, DPPH) 在 抗 氧 化 的 研 究 上, 通 常 使 用 DPPH 來 評 估 抗 氧 化 劑 的 供 氫 能 力, 實 驗 上 所 採 用 的 DPPH 甲 醇 溶 液 為 紫 蘿 蘭 色 (violet) 在 520nm 波 長 下 有 強 的 吸 光 值, 若 與 試 樣 結 合, -24-

36 將 會 降 低 吸 光 值, 由 此 藉 以 判 斷 試 樣 清 除 DPPH 自 由 基 的 能 力, 其 吸 光 值 愈 低, 表 示 試 樣 清 除 DPPH 自 由 基 的 能 力 愈 強 DPPH + AH DPPH - H + A (violet) (decolorized) 二 還 原 力 之 測 定 還 原 力 的 測 定 主 要 以 普 魯 士 藍 的 生 成 量 為 指 標 其 原 理 乃 利 用 所 加 入 的 赤 血 鹽 (patassium ferricanide, K 3 Fe(CN) 6 ) 提 供 Fe 3+, 當 水 萃 取 物 VitaminC 與 Fe 3+ 反 應, 還 原 成 Fe 2+ 黃 血 鹽 (K 4 Fe(CN) 6 ) 亞 鐵 氰 錯 離 子, 黃 血 鹽 再 與 FeCl 3 提 供 的 Fe 3+ 反 應 形 成 亞 鐵 氰 化 鐵, 即 所 謂 的 普 魯 士 藍 (Prussian blue, Fe 4 Fe(CN) 6 3 ), 並 以 分 光 光 度 計 在 620 nm 偵 測 普 魯 士 藍 的 含 量, 以 得 知 其 還 原 力 因 此 在 620 nm 吸 光 值 愈 高 表 示 其 還 原 力 愈 強, 利 用 電 子 的 提 供 使 氧 化 誘 導 因 子 還 原 成 較 穩 定 之 物 質, 進 而 達 到 抗 氧 化 之 效 果, 因 此 吸 光 值 越 高 表 示 樣 品 的 還 原 力 越 強 K3Fe(CN)6 + sample K4Fe(CN)6 + sample-oxide K4Fe(CN)6 + Fe3+ Fe4 Fe(CN)

37 三 BHA 人 工 合 成 抗 氧 化 劑 丁 羥 甲 醚 (butylated hydroxyanisole, BHA), 為 一 人 工 合 成 抗 氧 化 劑, 構 造 式 中 一 個 苯 環 接 上 一 個 -OH 基, 提 供 一 共 振 環 境,( 自 然 界 的 多 酚, 黃 酮 類 也 有 一 樣 的 構 造 ) 不 同 在 於 甲 基 ( 或 其 他 取 代 基 ) 取 代 的 位 置 不 同, 這 會 影 響 抗 氧 化 能 力, 對 不 同 的 東 西, 抗 氧 化 力 的 強 弱 也 不 一 樣, 合 成 的 抗 氧 化 力 比 自 然 存 在 的 強 ( 高 等,1998) 第 八 節 研 究 目 的 1. 建 立 筋 骨 草 活 性 成 分 萃 取 平 台 2. 探 討 活 性 成 分 萃 取 之 最 適 化 條 件 3. 探 討 萃 取 液 之 護 肝 成 效 -26-

38 第 三 章 材 料 與 方 法 第 一 節 材 料 一 植 物 來 源 : 1. 日 本 筋 骨 草 Ajuga nipponensis, 由 大 葉 大 學, 藥 用 植 物 與 保 健 學 系, 林 德 勳 老 師 提 供 二 藥 品 清 單 : 1. 95% 乙 醇, 分 析 級, 片 山 試 藥 2. 甲 醇, 分 析 級, 片 山 試 藥 3. CH 3 COOK 99.0%, 分 析 級, 片 山 試 藥 4. Alumimium Chloride 97%, 分 析 級, 片 山 試 藥 Hydroxyecdysone,98%,Sigma 6. Quercetin dehydrate,99%,sigma 7. 2,2-Dipheny1-1-picrylhydrazyl,99%,Sigma 三 儀 器 清 單 : 1. 高 速 均 質 機 : RT-08, 榮 聰 鐵 工 廠, 台 灣 -27-

39 2. 超 音 波 輔 助 萃 取 裝 置 : 台 超 科 技 股 份 有 限 公 司, 台 灣 3. 分 光 光 度 計 : U-2800A,HITACHI, 日 本 4. 冷 凍 乾 燥 機 : FD-5030/8530, 泛 群 科 技 有 限 公 司, 台 灣 5. 減 壓 濃 縮 機 : N-1000,Eyela, 日 本 6. 高 效 液 相 層 析 儀 :L-7400,HITACHI, 日 本 四 實 驗 動 物 本 實 驗 動 物 分 別 為 五 週 齡 20±0.5 g 之 ICR 雄 性 小 鼠 以 及 S.D. 雄 性 大 白 鼠, 國 家 實 驗 動 物 繁 殖 及 研 究 中 心, 以 福 壽 牌 實 驗 動 物 飼 料 餵 食, 飼 養 一 週 情 況 穩 定 後 進 行 實 驗 第 二 節 方 法 一 樣 品 前 處 理 將 日 本 筋 骨 草 葉 片 以 去 離 子 水 洗 淨 後, 以 冷 凍 乾 燥 機 進 行 乾 燥, 乾 燥 後 日 本 筋 骨 草 葉 片 分 別 以 不 透 氣 塑 膠 袋 封 閉 保 存, 此 為 未 經 粉 碎 之 母 樣 品, 備 用 自 母 樣 品 中 取 適 量 乾 燥 -28-

40 筋 骨 草, 以 均 質 機 粉 碎 後, 過 篩 (60 mesh) 保 存 於 密 閉 容 器 並 置 於 乾 燥 器 中 二 不 同 萃 取 實 驗 建 立 ( 一 ) 熱 水 萃 取 精 秤 磨 粉 樣 品 3.0 g, 加 入 RO 水 100 ml, 置 於 三 角 錐 形 瓶 中 密 封, 加 熱 至 70 萃 取 50 min, 萃 取 完 成 後 將 萃 取 液 以 抽 氣 過 濾 方 式 去 除 殘 渣, 所 得 之 濾 液 過 0.45μm 濾 膜, 樣 品 儲 存 於 4 下 備 用 ( 二 ) 乙 醇 萃 取 精 秤 磨 粉 樣 品 3.0 g, 加 入 溶 劑 100 ml (70% 乙 醇 ), 置 於 三 角 錐 形 瓶 中 密 封, 加 熱 至 50 萃 取 50 min, 萃 取 完 成 後 將 萃 取 液 以 抽 氣 過 濾 方 式 去 除 殘 渣, 所 得 之 濾 液 過 0.45μm 濾 膜, 樣 品 儲 存 於 4 下 備 用 ( 三 ) 超 臨 界 萃 取 精 秤 磨 粉 樣 品 3.0 g, 加 入 溶 劑 100 ml (70% 乙 醇 ), 置 於 萃 取 槽 體 中 密 封, 加 熱 至 50 萃 取 50 min, 萃 取 完 -29-

41 成 後 將 萃 取 液 以 抽 氣 過 濾 方 式 去 除 殘 渣, 所 得 之 濾 液 過 0.45μm 濾 膜, 樣 品 儲 存 於 4 下 備 用 ( 四 ) 超 音 波 輔 助 萃 取 參 考 ( 蕭,2007; 張 等,2010) 等 萃 取 方 法 並 搭 配 直 交 實 驗 設 計 ( 蘇,1999; 林,2004) 進 行 修 改 實 驗 先 採 一 次 一 變 因 方 式 進 行 探 討 活 性 成 分 產 量 較 適 條 件, 並 選 出 較 具 影 響 之 因 子, 再 搭 配 直 交 實 驗 設 計 探 討 活 性 成 分 最 適 化 萃 取 條 件, 如 圖 所 示 : -30-

42 日 本 筋 骨 草 冷 凍 乾 燥 取 葉 片 部 分 超 音 波 輔 助 萃 取 超 臨 界 流 體 萃 取 乙 醇 萃 取 熱 水 萃 取 直 交 實 驗 設 計 功 效 性 成 分 檢 測 總 黃 酮 蛻 皮 甾 酮 抗 氧 化 試 驗 動 物 試 驗 D P P H 清 除 力 還 原 力 總 抗 氧 化 力 血 液 生 化 指 標 肝 組 織 切 片 觀 察 圖 八 研 究 架 構 -31-

43 三 活 性 成 分 含 量 分 析 ( 一 ) 總 黃 酮 含 量 分 析 採 用 AlCl 3 呈 色 法 原 理, 分 析 流 程 參 考 (Lin and Tang, 2007) 之 總 黃 酮 分 析 步 驟 : 取 不 同 濃 度 之 萃 取 樣 品 ( mg/ml)0.5 ml 加 入 1.5 ml 95% 乙 醇, 再 加 入 0.1 ml (10%) AlCl ml (1M) CH 3 COOK 與 2.8 ml 去 離 子 水, 室 溫 下 靜 置 40 分 鐘, 利 用 分 光 光 度 儀 測 其 415 nm 吸 光 值 ( 二 ) 總 黃 酮 標 準 曲 線 建 立 不 同 濃 度 之 槲 皮 素 (Quercetin) 代 替 樣 品 以 上 述 方 式 作 標 準 曲 線, 不 同 濃 度 槲 皮 素 標 準 品 配 置 方 式 如 下 : 精 秤 10.0 mg 槲 皮 素, 以 分 析 級 甲 醇 定 量 至 10 ml, 即 得 槲 皮 素 母 液 (1.0 mg/ml), 再 自 母 液 分 別 精 密 吸 取 ml 至 10 ml 定 量 瓶 中, 加 入 甲 醇 稀 釋 至 刻 度, 即 得 不 同 濃 度 槲 皮 素 (0.01~0.09 mg/ml) 以 吸 光 值 (Y) 對 相 應 濃 度 (X) 作 標 準 曲 線 Y=ax+b, 並 計 算 R 2 值 -32-

44 ( 三 ) 蛻 皮 甾 酮 含 量 分 析 參 考 ( 蕭,2007) 之 蛻 皮 甾 酮 分 析 方 法, 條 件 如 下 : Column:RP-18 Column Mobile phase:methanol/water = 40:60(v/v) Detector:UV248 nm Flow rate:0.1 ml/min Injection volume:20 μl ( 四 ) 蛻 皮 甾 酮 標 準 曲 線 建 立 將 蛻 皮 甾 酮 標 準 品, 以 分 析 級 甲 醇 配 製 成 不 同 濃 度 (0.01~0.1 mg/ml), 以 前 述 HPLC 分 析 條 件 進 行 分 析, 以 面 積 (Y) 相 對 應 濃 度 (X) 做 標 準 曲 線 Y=ax+b, 並 計 算 R 2 值 ( 五 ) 抗 氧 化 試 驗 1. DPPH 自 由 基 清 除 活 性 評 估 a. 定 量 瓶 中 加 入 g DPPH, 加 入 甲 醇 溶 液 100 ml, 配 置 成 10 mm 之 DPPH 之 甲 醇 溶 液, 再 稀 釋 成 1 mm 溶 液 -33-

45 b. 取 等 20 μl 不 同 之 樣 品 溶 液, 加 入 80 μl 之 甲 醇 溶 液 中, 在 加 入 新 鮮 配 置 之 100 μl DPPH 溶 液 震 盪 混 合 均 勻, 並 室 溫 下 靜 置 30 分 鐘 c. 以 上 步 驟 三 個 重 複 d. 使 用 ELISA 檢 測 517 nm 之 吸 光 值, 吸 光 值 愈 低 表 示 樣 品 清 除 DPPH 自 由 基 之 能 力 愈 強 2. 還 原 力 a. 取 10 ml 不 同 濃 度 稀 釋 萃 取 液 及 10 ml 去 離 子 水 ( 為 空 白 ) b. 加 入 2.5 ml 之 0.2 M 磷 酸 鈉 緩 衝 溶 液 c. 加 入 2.5 ml 之 1% 赤 血 鹽 溶 液 d. 50 水 浴,20 分 鐘 e. 進 行 冷 卻 f. 加 入 2.5 ml 10 % 三 氯 醋 酸 溶 液 震 盪 均 勻 g. 取 5 ml Sample 加 5 ml 去 離 子 水 h. 加 入 1 ml 0.1 % 氯 化 鐵 溶 液 i. 混 合 均 勻, 靜 置 10 分 鐘 j. 於 700 nm 下 測 其 吸 光 值 -34-

46 ( 六 ) 動 物 實 驗 1. 化 學 性 肝 損 傷 平 台 主 要 參 考 (Tseng et al, 2007) 所 述 方 法 取 24 隻 小 鼠 (ICR), 每 組 6 隻, 胃 管 管 餵 樣 品 六 天 後, 以 四 氯 化 碳 誘 導 急 性 肝 損 傷, 分 組 方 式 如 下 : A 組 : 以 胃 管 管 餵 生 理 食 鹽 水 (1 ml/100 g) B 組 : 以 胃 管 管 餵 生 理 食 鹽 水 (1 ml/100 g) C 組 : 以 胃 管 餵 silymarin(100mg/kg) D 組 : 以 胃 管 管 餵 食 劑 量 (250 mg/kg) 之 日 本 筋 骨 草 萃 取 液 並 於 注 射 完 四 氯 化 碳 後 6 小 時, 以 剪 尾 採 血, 所 得 之 血 液 以 每 分 鐘 3000g 離 心 10 分 鐘, 取 上 層 血 清 部 分, 加 入 儀 器 中, 檢 測 血 清 glutamic oxaloacetic transaminase (GOT) 及 glutamic pyruvic transaminase (GPT) 2. 酒 精 性 肝 損 傷 平 台 主 要 參 考 (Zhang et al, 1998) 所 述 方 法, 取 40 隻 大 鼠 (S.D.), 每 組 8 隻, 以 酒 精 誘 導 急 性 肝 損 傷, 並 於 最 後 一 次 投 予 後 六 小 時 腹 腔 注 射 酒 精, 十 八 小 時 後 頸 動 脈 取 血 測 生 化 值 -35-

47 分 組 方 式 如 下 : A. 組 : 正 常 組 Normal saline (p.o. 10 ml/kg)+normal saline (i.p. 10 ml/kg) B. 組 : 負 對 照 組 ( 肝 損 傷 組 ) Normal saline (p.o. 10 ml/kg) + 酒 精 (i.p. 5.5 g/kg) C 組 : 正 對 照 組 (Silymarin 治 療 對 照 組 ) Silymarin(p.o. 200 mg/kg)+ 酒 精 (i.p. 5.5 g/kg) D 組 : 實 驗 組 - 日 本 筋 骨 草 萃 取 液 (p.o. 1 g/kg)+ 酒 精 (i.p. 5.5 g/kg) -36-

48 表 一 不 同 萃 取 方 法 Table 1.Effect of different extraction methods 溶 劑 時 間 (min) 溫 度 ( ) Flavonoids (mg/g) 超 音 波 萃 取 70% EtOH y 超 臨 界 萃 取 70% EtOH y 乙 醇 萃 取 70% EtOH y 熱 水 萃 取 H 2 O y -37-

49 表 二 超 音 波 萃 取 預 實 驗 條 件 Table 2. Ultrasonic extraction condition. 時 間 (min) 溫 度 ( ) 乙 醇 濃 度 (%) 固 液 比 頻 率 (KHz) : : : :

50 表 三 直 交 實 驗 設 計 中 各 因 子 與 水 準 之 定 義 Table 3. Definition and level of factors in orthogonal array experimental design. Factors level A B C : : :30 A: Extraction time (min) B: Extraction temperature ( ) C: Extraction proportions of sample / solvent -39-

51 表 四 實 驗 配 置 表 Table 4. Design of the orthogonal array experiment. EXP Factors Results A B C yi y y y y y y y y y9 A: Extraction time (min): (1) 45 min (2) 50 min (3) 55 min B: Extraction temperature ( ): (1) 40 (2) 50 (3) 60 C: Extraction proportions of sample / solvent:(1) 1:10 (2) 1:20 (3) 1:30-40-

52 回 應 值 計 算 (1) 實 驗 因 子 A: KA1= y1 +y2 +y3 KA2= y4 +y5 +y6 KA3= y7 +y9 +y9 ka1= (KA1)/3 ka2= (KA2)/3 ka3= (KA3)/3 (2) 實 驗 因 子 B: KB1= y1 +y4 +y7 KB2= y2 +y5 +y8 KB3= y3 +y6 +y9 kb1= (KB1)/3 kb2= (KB2)/3 kb3= (KB3)/3 (3) 實 驗 因 子 C: KC1= y1 +y5 +y9 KC2= y2 +y6 +y7 KC3= y3 +y4 +y8 kc1 = (KC1)/3 kc2 = (KC2)/3 kc3 = (KC3)/3-41-

53 第 四 章 結 果 與 討 論 第 一 節 日 本 筋 骨 草 活 性 成 分 含 量 分 析 一 不 同 萃 取 方 法 表 五 為 不 同 萃 取 方 法 活 性 成 分 產 量 比 較 結 果 顯 示, 活 性 成 分 的 產 量, 以 超 音 波 輔 助 萃 取 法 所 得 產 量 較 高, 黃 酮 的 總 萃 出 量 達 到 6.72 mg/g, 因 為 加 入 超 音 波 之 後, 能 夠 有 效 的 將 細 胞 壁 震 碎, 達 到 快 速 質 傳 的 效 果 而 以 水 做 為 萃 取 溶 劑 所 得 到 的 黃 酮 含 量 最 低, 從 結 構 式 來 看, 黃 酮 為 中 低 極 性 物 質, 故 以 高 極 性 的 水 做 為 萃 取 溶 劑 並 不 適 當 因 此 後 續 實 驗 以 超 音 波 輔 助 萃 取 做 為 萃 取 方 法, 並 搭 配 直 交 實 驗 設 計 探 討 活 性 成 分 最 適 化 萃 取 條 件 二 超 音 波 萃 取 預 實 驗 進 行 直 交 實 驗 設 計 之 前, 本 研 究 選 用 時 間 溫 度 乙 醇 濃 度 固 液 比 和 頻 率 等 5 種 不 同 變 因 進 行 萃 取, 並 個 別 探 討 各 變 因 較 佳 的 萃 取 區 間, 結 果 如 表 六 所 示, 當 萃 取 溫 度 提 高 到 60 時, 部 分 的 黃 酮 類 成 分 變 會 開 始 熱 衰 變, 以 致 於 測 -42-

54 得 的 總 黃 酮 量 偏 低 黃 酮 類 化 合 物 以 及 蛻 皮 甾 酮 較 佳 的 萃 取 條 件 分 別 為 : 時 間 50 min 溫 度 50 乙 醇 濃 度 70% 固 液 比 1:20 頻 率 28 KHz -43-

55 表 五 不 同 萃 取 方 法 之 比 較 Table 5.Effect of different extraction methods 溶 劑 時 間 (min) 溫 度 ( ) Flavonoids (mg/g) 超 音 波 萃 取 70% EtOH 超 臨 界 萃 取 70% EtOH 乙 醇 萃 取 70% EtOH 熱 水 萃 取 H 2 O

56 表 六 超 音 波 萃 取 預 實 驗 條 件 結 果 Table 6. Ultrasonic extraction condition. 時 間 (min) 溫 度 ( ) 乙 醇 濃 度 (%) 固 液 比 頻 率 (KHz) :

57 三 以 直 交 實 驗 設 計 法 探 討 最 適 黃 酮 類 化 合 物 以 及 蛻 皮 甾 酮 萃 取 條 件 一 般 有 機 溶 劑 萃 取 的 可 控 條 件 因 子, 大 多 以 萃 取 時 間 溫 度 以 及 固 液 比 為 主, 因 此 本 研 究 選 用 L 9 (3 4 ) 直 交 表 作 為 本 實 驗 設 計 模 式, 結 果 如 表 七 所 示, 第 6 (A2B3C2) 組 試 驗 的 黃 酮 類 化 合 物 含 量 較 高 於 其 他 組 別 (7.87 mg/g), 蛻 皮 甾 酮 因 含 量 較 少, 因 此 在 這 邊 選 擇 以 HPLC 進 行 分 析, 分 析 結 果 如 表 八 所 示, 同 樣 以 第 6 (A2B3C2) 組 試 驗 的 蛻 皮 甾 體 類 化 合 物 含 量 較 高 於 其 他 組 別 (0.73 mg/g),hplc 層 析 圖 譜 部 分 也 發 現, 如 圖 九 所 示, 蛻 皮 甾 酮 標 準 品 滯 留 時 間 約 在 12 min 出 現, 日 本 筋 骨 草 萃 取 液 在 12 min 也 有 滯 留 時 間 出 現, 如 圖 十 所 示, 因 此 推 測 在 12 min 偵 測 出 之 物 質 為 蛻 皮 甾 體 類 化 合 物 -46-

58 表 七 L 9 (3 4 ) 直 交 表 實 驗 設 計 黃 酮 類 化 合 物 萃 取 實 驗 結 果 Table 7. Extraction experimental results of the L 9 (3 4 ) orthogonal array. Factors Results EXP Flavonoids A B C (mg/g) A: Extraction time (min): (1) 45 min (2) 50 min (3) 55 min B: Extraction temperature ( ): (1) 40 (2) 50 (3) 60 C: Extraction proportions of sample / solvent:(1) 1:10 (2) 1:20 (3) 1:30-47-

59 表 八 L 9 (3 4 ) 直 交 表 實 驗 設 計 蛻 皮 甾 酮 萃 取 實 驗 結 果 Table 8. Extraction experimental results of the L 9 (3 4 ) orthogonal array. Factors Results EXP Ecdysterone A B C (mg/g) A: Extraction time (min): (1) 45 min (2) 50 min (3) 55 min B: Extraction temperature ( ): (1) 40 (2) 50 (3) 60 C: Extraction proportions of sample / solvent:(1) 1:10 (2) 1:20 (3) 1:30-48-

60 0.466' mv ' 7.261' 8.639' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' 3.202' 2.987' min 圖 九 HPLC 蛻 皮 甾 酮 層 析 圖 Figure 9. The HPLC chromatogram of ecdysterone. mv ' 1.327' min 圖 十 HPLC 日 本 筋 骨 草 層 析 圖 Figure 10. The HPLC chromatogram of Ajuga nipponensis. -49-

61 四 統 計 分 析 實 驗 所 得 之 萃 取 率 經 回 應 值 計 算 後 進 一 步 探 討 各 因 子 與 水 平 指 標 對 黃 酮 類 化 合 物 萃 取 率 的 影 響, 其 實 驗 結 果 如 表 九 與 圖 十 一 所 示, 由 實 驗 結 果 分 別 探 討 萃 取 時 間 溫 度 以 及 固 液 比 對 萃 取 效 果 的 影 響 與 找 出 最 適 萃 取 條 件 ( 一 ) 萃 取 時 間 對 活 性 成 分 萃 取 之 影 響 在 萃 取 時 間 為 45 分 鐘 至 50 分 鐘 時 回 應 值 呈 現 明 顯 上 升 之 現 象, 而 萃 取 50 分 鐘 至 55 分 鐘 時 回 應 值 呈 現 下 降 趨 勢, 推 測 可 能 原 因 是 活 性 成 分 在 50 分 鐘 後 遭 受 破 壞, 所 以 本 實 驗 選 擇 最 佳 萃 取 時 間 為 50 分 鐘 ( 二 ) 萃 取 溫 度 對 活 性 成 分 萃 取 之 影 響 在 萃 取 溫 度 為 40 至 60 時 回 應 值 皆 呈 現 明 顯 上 升 之 現 象, 但 考 慮 到 活 性 成 分 可 能 受 熱 破 壞 影 響, 所 以 本 實 驗 選 擇 最 佳 萃 取 時 間 為 60 ( 三 ) 固 液 比 對 活 性 成 分 萃 取 之 影 響 當 固 液 比 為 1: 10 至 1: 20 時, 回 應 值 呈 現 上 升 趨 勢, -50-

62 而 當 溶 劑 比 為 1:30 時, 回 應 直 呈 下 降 趨 勢, 顯 示 當 固 液 比 大 於 1: 20 時 會 導 致 萃 取 效 果 降 低, 因 此 本 實 驗 選 擇 最 適 的 固 液 比 為 1:

63 表 九 直 交 實 驗 設 計 法 - 級 差 分 析 結 果 Table 9. Analysis of the results from orthogonal array with the method of range analysis. A B C K K K k k k R A: Extraction time (min) B: Extraction temperature ( ) C: Extraction proportions of sample / solvent -52-

64 Flavonoids μ g/ml A1 A2 A3 B1 B2 B3 C1 C2 C3 Factors 圖 十 一 正 交 實 驗 設 計 中 因 子 對 黃 酮 類 化 合 物 萃 取 的 影 響 Figure 11. Effects of time, temperature, and solvent proportions on the orthogonal experimental design of extraction rate. A1-3: Extraction time: 45, 50, 55 min B1-3: Extraction temperature: 40, 50, 60 C1-3: Extraction proportions of sample / solvent: 1:10, 1:20, 1:30-53-

65 第 二 節 樣 品 萃 取 液 之 抗 氧 化 活 性 一 樣 品 萃 取 液 之 DPPH 清 除 率 抗 氧 化 的 研 究 上, 常 使 用 DPPH 來 評 估 抗 氧 化 物 的 供 氫 能 力 抗 氧 化 物 還 原 (DPPH-H) 時 吸 光 值 會 降 低, 吸 光 值 愈 低, 表 示 抗 氧 化 物 的 供 氫 能 力 愈 強, 本 實 驗 選 用 以 人 工 合 成 抗 氧 化 劑 (BHA) 作 為 對 照 組, 實 驗 結 果 如 圖 十 二 所 示, 當 日 本 筋 骨 草 萃 取 液 濃 度 為 5 mg/ml 時,DPPH 清 除 力 可 達 84.85%, 對 照 組 DPPH 清 除 力 則 為 93% 由 此 結 果 可 知, 天 然 筋 骨 草 之 萃 出 液 的 清 除 自 由 基 效 果 已 經 非 常 接 近 人 工 合 成 之 抗 氧 化 劑 而 筋 骨 草 為 天 然 物, 因 此 具 有 較 高 之 安 全 性 以 及 具 有 商 業 化 的 價 值 二 樣 品 萃 取 液 之 還 原 力 還 原 性 質 的 作 用 是 將 已 經 氧 化 的 物 質 還 原, 若 將 鐵 離 子 還 原 成 亞 鐵 離 子, 再 與 三 價 鐵 生 成 普 魯 士 藍 而 使 吸 光 值 上 升, 則 表 示 樣 品 之 還 原 力 愈 強 本 實 驗 選 用 以 人 工 合 成 抗 氧 化 劑 (BHA) 作 為 對 照 組, 實 驗 結 果 如 圖 十 三 所 示, 隨 著 萃 取 液 濃 度 增 加, 還 原 力 則 有 上 升 趨 勢, 在 萃 取 液 濃 度 為 5 mg/ml -54-

66 時, 其 還 原 力 相 當 於 0.1 mg/ml 人 工 合 成 抗 氧 化 劑 (BHA) -55-

67 % DPPH reduction Group 6 BHA Concentration (mg/ml) 圖 十 二 第 6 組 萃 取 條 件 對 DPPH 清 除 力 之 影 響 Figure 12. The effects of group 6 of DPPH reduction. -56-

68 Absorbance (nm) Concentration (mg/ml) Group 6 BHA 圖 十 三 第 6 組 萃 取 條 件 對 還 原 力 力 之 影 響 Figure 13. The effects of group 6 of reducing power. -57-

69 第 三 節 樣 品 萃 取 液 護 肝 活 性 當 肝 細 胞 受 到 傷 害 時, 肝 臟 中 的 GOT GPT 會 從 肝 中 脫 逸 到 血 清 中, 因 此 為 評 估 肝 損 傷 最 常 用 的 生 化 指 標 四 氯 化 碳 以 及 酒 精 為 目 前 較 常 使 用 的 誘 導 肝 損 傷 方 式, 具 有 快 速 且 有 效 的 優 點, 因 此 本 實 驗 選 用 四 氯 化 碳 和 酒 精 作 為 誘 導 老 鼠 肝 損 傷 之 方 法 一 化 學 性 肝 損 傷 結 果 CCl 4 誘 導 老 鼠 肝 損 傷 模 式 的 機 制 為 CCl 4 進 入 體 內 後 會 被 酵 素 影 響 產 生 氧 化 態 CCl 3, 之 後 CCl 3 會 氧 化 脂 肪 酸 等 長 鏈 碳 蛋 白 質 等, 進 而 影 響 酵 素 和 細 胞 膜, 導 致 肝 損 傷 本 實 驗 利 用 CCl 4 誘 發 老 鼠 肝 損 傷, 並 餵 食 日 本 筋 骨 草 萃 取 液, 觀 察 老 鼠 血 液 中 之 GOT 與 GPT 值 變 化, 實 驗 結 果 如 圖 十 四 十 五 所 示 日 本 筋 骨 草 萃 取 液 相 較 於 control 組, GPT 與 GOT 數 值 具 有 顯 著 (p<0.01) 下 降, 分 別 為 53.9% 以 及 29.3%, 證 明 日 本 筋 骨 草 萃 取 液 有 能 力 降 低 CCl 4 所 誘 導 之 肝 損 傷 -58-

70 二 酒 精 性 肝 損 傷 結 果 Alcohol 誘 導 老 鼠 肝 損 傷 模 式 的 機 制 為 Alcohol 進 入 體 內 後, 利 用 酵 素 (cytochrome P4502E1) 將 Alcohol 代 謝 成 乙 醛 而 除 了 有 毒 的 乙 醛 之 外, 在 代 謝 的 過 程 中 更 會 誘 導 大 量 的 自 由 基 產 生, 進 而 抑 制 細 胞 內 的 抗 氧 化 酵 素 的 產 生, 使 肝 臟 細 胞 的 氧 化 還 原 狀 態 不 平 衡, 造 成 肝 組 織 嚴 重 的 傷 害 實 驗 結 果 如 圖 十 六 十 七 所 示 日 本 筋 骨 草 萃 取 液 相 較 於 control 組,GPT 與 GOT 數 值 也 具 有 顯 著 下 降 (p<0.01), 分 別 為 35.8% 以 及 28.5%, 顯 示 日 本 筋 骨 草 萃 取 液 也 具 有 能 力 降 低 酒 精 所 誘 導 之 肝 損 傷 -59-

71 GPT GPT Blank Control Silymarin AN 250 mg CCl 4 induce 圖 十 四 日 本 筋 骨 草 萃 取 液 對 四 氯 化 碳 誘 導 小 鼠 的 GPT 值 上 升 的 抑 制 作 用 Fig 14.The GPT of Ajuga nipponensis prevent CCl4 induce mice. -60-

72 250 GOT GOT Blank Control Silymarin AN 250 mg CCl 4 induce 圖 十 五 日 本 筋 骨 草 萃 取 液 對 四 氯 化 碳 誘 導 小 鼠 的 GOT 值 上 升 的 抑 制 作 用 Fig 15.The GOT of Ajuga nipponensis prevent CCl4 induce mice. -61-

73 500 GPT GPT Blank Control Silymarin AN (1g/kg) Alcohol induce 圖 十 六 日 本 筋 骨 草 萃 取 液 對 酒 精 誘 導 大 鼠 的 GPT 值 上 升 的 抑 制 作 用 Fig 16.The GPT of Ajuga nipponensis prevent alcohol induce rats. -62-

74 1000 GOT GOT Blank Control Silymarin AN (1g/kg) Alcohol induce 圖 十 七 日 本 筋 骨 草 萃 取 液 對 酒 精 誘 導 大 鼠 的 GOT 值 上 升 的 抑 制 作 用 Fig 17.The GOT of Ajuga nipponensis prevent alcohol induce rats. -63-

75 第 五 章 結 論 本 研 究 利 用 不 同 方 法 進 行 日 本 筋 骨 草 活 性 成 分 萃 取, 從 實 驗 結 果 得 知, 相 較 於 其 他 萃 取 方 法, 超 音 波 輔 助 萃 取 技 術 可 有 效 萃 取 出 日 本 筋 骨 草 之 活 性 成 分, 搭 配 直 交 實 驗 設 計 可 有 效 減 少 萃 取 時 間 與 成 本 當 萃 取 條 件 為 時 間 (50min) 溫 度 (60 ) 固 液 比 (1:20) 時, 對 黃 酮 類 化 合 物 以 及 蛻 皮 甾 酮 具 有 最 佳 的 萃 取 效 果, 黃 酮 類 化 合 物 含 量 可 達 7.87 mg/g, 蛻 皮 甾 酮 含 量 可 達 0.73 mg/g 經 由 統 計 分 析 後, 發 現 時 間 對 於 日 本 筋 骨 草 活 性 成 分 萃 取 較 具 顯 著 性 影 響, 其 次 為 溫 度 與 固 液 比 抗 氧 化 部 分, 直 交 試 驗 9 組 不 同 萃 取 條 件 中, 以 上 述 最 適 化 條 件 所 得 之 萃 取 液 有 最 佳 抗 氧 化 效 果,DPPH 清 除 力 可 達 84.85%, 還 原 力 則 隨 著 萃 取 液 濃 度 增 加 而 有 上 升 趨 勢, 在 萃 取 液 濃 度 為 5 mg/ml 時, 其 還 原 力 相 當 於 0.1 mg/ml 人 工 合 成 抗 氧 化 劑 (BHA) 動 物 實 驗 化 學 性 肝 損 傷 部 分, 日 本 筋 骨 草 萃 取 液 相 較 於 control 組,GPT 與 GOT 數 值 具 有 顯 著 (p<0.01) 下 降, 分 別 為 53.9% 以 及 29.3%, 證 明 日 本 筋 骨 草 萃 取 液 有 能 力 -64-

76 降 低 CCl 4 所 誘 導 之 肝 損 傷 酒 精 性 肝 損 傷 部 分, 日 本 筋 骨 草 萃 取 液 相 較 於 control 組,GPT 與 GOT 數 值 也 具 有 顯 著 下 降 (p<0.01), 分 別 為 35.8% 以 及 28.5%, 顯 示 日 本 筋 骨 草 萃 取 液 也 具 有 能 力 降 低 酒 精 所 誘 導 之 肝 損 傷 -65-

77 第 六 章 計 畫 成 果 自 評 本 計 劃 至 今, 因 考 量 研 究 延 續 性 及 其 他 因 素, 因 此 計 畫 略 有 修 正, 但 仍 朝 研 究 目 標 進 行, 本 計 劃 已 順 利 完 成 筋 骨 草 活 性 成 分 萃 取 平 台 並 獲 得 相 當 正 面 的 結 論, 在 活 性 成 分 的 大 量 萃 取 與 肝 損 傷 的 動 物 實 驗 部 分 也 得 到 良 好 結 果, 下 一 階 段 期 望 可 以 接 續 先 前 研 究, 以 探 討 日 本 筋 骨 草 活 性 成 分 降 血 糖 之 功 效 -66-

78 第 七 章 延 續 計 畫 之 構 想 一 摘 要 糖 尿 病 (diabetes mellitus;dm) 乃 一 種 多 病 因 的 代 謝 性 疾 病 1999 年 世 界 衛 生 組 織 (WHO) 和 國 際 糖 尿 病 聯 盟 (IDF) 對 其 定 義 為 : 慢 性 高 血 糖, 伴 隨 因 胰 島 素 (insulin) 分 泌 或 作 用 缺 陷 所 引 起 的 糖 蛋 白 質 脂 肪 水 電 解 質 等 代 謝 紊 亂 (Harris et al., 1987) 根 據 行 政 院 衛 生 署 調 查 罹 患 糖 尿 病 的 病 患 有 日 益 增 加 的 趨 勢, 糖 尿 病 也 一 直 高 居 本 國 十 大 死 亡 病 因 之 列 ( 衛 生 署,2009) 國 際 上, 糖 尿 病 在 其 他 國 家 也 都 排 名 在 死 亡 原 因 的 前 七 名 ; 與 心 血 管 疾 病 併 列 為 醫 學 界 人 士 所 關 鍵 的 重 點 (King, 1993) 這 些 病 患 若 沒 有 接 受 適 當 的 治 療 與 控 制, 一 旦 出 現 併 發 症, 可 能 造 成 殘 障, 甚 至 死 亡 ; 這 對 個 人 家 庭 社 會 乃 至 於 國 家 都 是 相 當 沉 重 的 負 擔 與 損 失 因 此, 重 視 並 研 究 此 項 病 變 是 當 日 的 主 要 課 題 之 一 ( 蘇, 2001) 筋 骨 草 屬 植 物 為 多 年 生 植 物, 其 主 要 活 性 成 分 為 黃 酮 類 化 合 物, 具 有 抗 氧 化 活 性 改 善 心 血 管 疾 病 以 及 肝 臟 功 能 等 效 用 Hilaly 等 人 (2000), 研 究 非 洲 摩 洛 哥 產 伊 娃 筋 骨 草 (Ajuga iva), 發 現 其 水 萃 物 可 有 效 降 低 糖 尿 病 大 鼠 血 液 中 高 血 糖 情 形 因 -67-

79 此 本 計 畫 期 望 萃 取 筋 骨 草 屬 植 物 之 活 性 成 分, 並 探 討 其 最 適 化 萃 取 條 件 以 及 降 血 糖 之 效 用 二 計 劃 目 標 1. 降 血 糖 動 物 試 驗 平 台 建 立 2. 探 討 台 灣 產 筋 骨 草 屬 植 物 活 性 成 分 降 血 糖 之 效 用 3. 台 灣 產 筋 骨 草 屬 植 物 降 血 糖 活 性 成 分 之 鑑 定 三 計 畫 內 容 目 前, 臨 床 上 將 糖 尿 病 細 分 成 以 下 幾 類 (WHO): 第 一 型 胰 島 素 依 賴 型, 第 二 型 非 胰 島 素 依 賴 型, 第 三 型 妊 娠 糖 尿 病, 第 四 型 葡 萄 糖 耐 受 性 異 常, 第 五 型 其 他 型 糖 尿 病 臨 床 上, 常 用 的 口 服 降 血 糖 藥 物 為 sulfonylurea 和 biguanides 兩 大 類 型 (Thomas Thomas, 1997), 配 合 著 注 射 的 胰 島 素 在 控 制 著 病 人 的 血 糖 一 般 認 為 sulfonylurea 的 藥 物 : 由 早 年 的 tolbutamide 到 現 在 的 glipizide(glibenese) glibenclamide (Euglucon) 等, 乃 藉 由 刺 激 體 內 胰 島 素 分 泌, 增 強 胰 島 素 與 作 用 受 體 的 結 合, 較 適 合 於 非 胰 島 素 依 賴 型 糖 -68-

80 尿 病 病 人 的 控 制, 對 於 沒 法 分 泌 胰 島 素 的 糖 尿 病 則 無 效 另 外,biguanides 藥 物 則 是 以 改 善 葡 萄 糖 利 用 率 為 主, 但 不 刺 激 胰 島 素 的 分 泌, 例 如 metformin 目 前 已 有 研 究 指 出, 其 乃 藉 由 抑 制 體 內 糖 質 的 新 生 (gluconeogenesis) 來 降 低 血 糖 (Ripudaman et al., 2000), 故 適 宜 一 般 的 糖 尿 病 病 人 另 外, 還 有 一 類 屬 於 α-glycosidase 抑 制 劑, 如 acarbose 此 類 是 利 用 抑 制 α-glycosidase 的 作 用 來 使 寡 糖 不 被 分 解, 因 而 造 成 糖 類 的 吸 收 降 低, 達 到 控 制 血 糖 的 目 的 雖 然, 上 述 的 口 服 用 藥 效 果 皆 不 如 胰 島 素 注 射 但 是, 為 了 讓 病 患 有 更 多 用 藥 的 選 擇, 及 更 有 效 的 控 制 血 糖 來 防 止 併 發 症 的 發 生, 糖 尿 病 用 藥 的 研 發 是 目 前 眾 所 重 視 的 中 草 藥 活 性 成 分 在 近 幾 年 來 慢 慢 受 到 重 視, 例 如 : 食 品 藥 物 化 妝 品 保 健 食 品 中 添 加 中 草 藥 萃 取 物 相 較 於 化 學 製 成 的 藥 劑, 中 草 藥 之 活 性 成 分 具 有 較 易 吸 收 較 無 刺 激 性 以 及 較 無 副 作 用 等 優 點, 再 加 上 目 前 有 許 多 西 方 醫 學 無 法 治 療 的 疾 病, 也 都 紛 紛 找 尋 其 他 方 法, 中 草 藥 即 是 其 中 一 種 傳 統 的 萃 取 方 法, 例 如 : 熱 水 萃 取 溶 劑 萃 取 索 氏 萃 取 等 方 法, 都 具 有 萃 取 效 率 差 萃 取 時 間 長 萃 取 溫 度 高 毒 性 物 質 殘 留 等 問 題, 因 此 較 新 的 萃 取 方 法 也 漸 漸 取 代 傳 統 -69-

81 萃 取, 例 如 超 音 波 輔 助 萃 取 法 即 是 其 中 一 種 超 音 波 輔 助 萃 取 為 近 年 來 廣 泛 應 用 於 中 草 藥 活 性 成 分 萃 取 之 技 術, 其 原 理 為 利 用 超 音 波 在 震 盪 時 所 產 生 的 熱 能 機 械 作 用 以 及 空 化 作 用, 加 速 溶 劑 向 物 質 中 滲 透, 使 目 標 成 分 萃 取 效 率 提 高 並 縮 短 萃 取 時 間, 同 時 也 可 大 量 萃 取 以 降 低 成 本 超 臨 界 流 體 萃 取 為 近 年 來 廣 被 應 用 的 萃 取 技 術, 是 一 種 物 理 分 離 和 純 化 的 方 法, 利 用 氣 體 萃 取 劑 在 超 臨 界 狀 態 條 件 下, 將 液 體 或 固 體 中 特 定 的 成 分 萃 取 出 來, 再 透 過 減 壓 方 式 進 行 分 離 的 技 術, 特 別 適 合 量 小 高 附 加 價 值 及 困 難 分 離 的 製 程 上 筋 骨 草 屬 (Ajuga) 植 物 約 有 三 百 種, 主 要 分 布 於 歐 亞 非 三 大 洲, 也 有 部 份 的 品 種 分 佈 於 澳 洲 與 北 美 洲 (Flora of China, 2009) 各 民 族 也 將 此 屬 植 物 廣 泛 的 用 於 抗 發 炎 抗 菌 抗 虐, 在 中 國 大 陸 與 台 灣 等 地, 一 般 民 間 將 筋 骨 草 屬 植 物 稱 為 散 血 草, 常 用 於 治 療 上 呼 吸 道 感 染 扁 桃 腺 炎 肝 炎 胃 腸 炎 肺 炎 乳 腺 炎 等 疾 病 於 其 他 的 研 究 中 也 發 現, 筋 骨 草 屬 植 物 水 萃 物 可 有 效 降 低 因 鏈 尿 菌 素 誘 導 型 糖 尿 病 大 白 鼠 血 液 中 高 血 糖 情 形, 且 效 果 與 市 售 之 降 血 糖 藥 物 相 -70-

82 當, 長 期 餵 食 21 天 後, 更 能 有 效 控 制 高 血 糖 情 形, 但 其 詳 細 機 制 扔 不 清 楚, 推 測 應 是 增 進 細 胞 組 織 對 血 糖 的 利 用, 進 而 降 低 血 糖 值 (Hilaly, 2000) 因 此 本 計 畫 期 望 利 用 超 音 波 與 超 臨 界 流 體 兩 種 方 法 萃 取 筋 骨 草 中 活 性 成 分, 探 討 萃 取 方 式 對 活 性 成 分 與 產 量 之 影 響 並 以 直 交 實 驗 設 計 法 找 尋 最 適 化 萃 取 條 件, 進 行 活 性 成 分 大 量 萃 取, 並 搭 配 動 物 試 驗 探 討 日 本 筋 骨 草 活 性 成 分 降 血 糖 之 效 用 四 預 期 效 益 1. 鑑 定 出 日 本 筋 骨 草 降 血 糖 之 活 性 成 分 2. 建 立 大 規 模 活 性 成 分 萃 取 製 程 3. 抗 氧 化 活 性 檢 測 -71-

83 參 考 文 獻 1. 蘇 朝 墩 1999 產 品 穩 健 設 計 - 田 口 品 質 工 程 方 法 的 介 紹 和 應 用 中 華 民 國 品 質 學 會 台 北, 台 灣 2. 林 宏 穗 2004 設 計 一 種 新 型 的 直 交 粒 子 群 最 佳 化 演 算 法 逢 甲 大 學 碩 士 論 文 台 中, 台 灣 3. 張 劍 曾 虹 燕 及 黃 炎 2010 超 聲 波 協 同 提 取 魚 腥 草 黃 酮 及 其 抗 氧 化 性 廣 西 植 物 30(1): 朱 國 輝 邱 泰 球 及 黃 卓 烈 2001 超 音 波 在 萃 中 的 應 用 聲 學 技 術 20(4): 江 伯 源 練 怡 伶 陳 世 雄 及 林 宜 信 2007 超 音 波 輔 助 對 杭 菊 萃 取 液 酚 類 化 合 物 及 官 能 品 評 之 影 響 食 品 科 學 45(2): 吳 德 峰 1997 淺 析 筋 骨 草 的 藥 用 價 值 福 建 畜 牧 獸 醫 (1) 馬 志 平 和 黃 榕 2002 筋 骨 草 有 效 部 位 黃 酮 類 粗 品 的 保 肝 試 驗 海 峽 藥 學 14(5): 張 英 韋 異 及 粟 暉 2002 超 聲 提 取 - 反 相 高 效 液 相 色 譜 法 測 定 牛 膝 中 蛻 皮 甾 酮 光 譜 實 驗 室 19(5): 劉 斌 石 任 兵 葛 小 俠 周 瑩 和 周 靜 2001 筋 骨 草 屬 -72-

84 植 物 化 學 成 分 與 藥 理 活 性 國 外 醫 藥 ( 植 物 藥 分 冊 )16 (3) 謝 宗 欣 1998 台 灣 筋 骨 草 屬 植 物 介 紹 自 然 保 育 季 刊 21: 蕭 久 富 2007 不 同 萃 取 方 法 對 台 灣 筋 骨 草 及 匍 匐 筋 骨 草 活 性 成 分 之 分 析 比 較 研 究 12. 施 益 民 呂 峰 洲, 自 由 基 與 各 種 疾 病 當 代 醫 學,16(5), , 吳 旭 王 武 軍 張 軍 花 熊 俊 和 侯 量 2006 植 物 藥 有 效 成 分 β- 蛻 皮 激 素 抑 制 血 管 內 皮 細 胞 的 凋 亡 中 國 臨 床 康 復 14. 高 述 崙 1992 田 口 式 品 質 工 程 概 論 中 華 民 國 品 質 學 會 台 北, 台 灣 15. 陳 耀 茂 譯 安 部 季 夫 著 2002 直 交 表 實 驗 計 劃 法 五 南 圖 書 台 北, 台 灣 16. 陳 耀 茂 2001 實 驗 設 計 與 解 析 法 高 立 圖 書 台 北, 台 灣 17. 祝 國 強 劉 慶 歐 杭 國 明 周 第 云 張 學 良 丁 勇 楊 潔 郭 東 星 羅 明 奎 騰 海 英 王 培 承 2009 醫 藥 數 -73-

85 理 統 計 方 法 高 等 教 育 出 版 社 北 京, 中 國 18. 嚴 偉 李 淑 芬 和 田 松 江 2002 超 生 波 協 助 提 取 技 術 化 工 進 展 21(9): 楊 遠 波 劉 和 義 彭 鏡 毅 施 炳 霖 和 呂 勝 由 編 著 1999 台 灣 維 管 束 植 物 誌 第 四 卷 行 政 院 農 業 委 員 會 台 北 台 灣 20. 褚 小 蘭 和 王 漢 章 1997 筋 骨 草 的 本 草 考 証 中 藥 材 20(11): 李 岡 榮 2005 實 用 台 灣 草 藥 百 科 漢 字 國 際 文 化 有 限 公 司 台 北 台 灣 22. 邱 年 永 和 張 光 雄 2001 原 色 台 灣 藥 用 植 物 圖 鑑 南 天 書 局 有 限 公 司 台 北 台 灣 23. 鍾 錠 全 1997 青 草 世 界 - 彩 色 圖 鑑 協 聯 印 書 館 有 限 公 司 台 北 台 灣 24. 吳 立 軍 2006 中 藥 化 學 科 技 圖 書 館 台 北 台 灣 25. 陳 惠 英 顏 國 欽, 自 由 基 抗 氧 化 防 禦 與 人 體 健 康, 中 華 民 國 營 養 學 會 會 誌,23(1): , 衛 生 署 SEARCH_RESULT.aspx 27. Blosi, M.S Antioxidant determination by the use of a -74-

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