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1 第 34 卷第 7 期西南大学学报 ( 自然科学版 ) 2012 年 7 月 Vol.34 No.7 JournalofSouthwestUniversity (NaturalScienceEdition) Jul 文章编号 : (2012) 双液相萃取离子交换层析法纯化猪硫酸软骨素 陆钊 1, 潘淑霞 2, 董树国 1, 曹宏梅 3, 赖红伟 1, 勾龙啸 4 1. 吉林医药学院药学院化学教研室, 吉林吉林 ;2. 吉林医药学院生物医学工程系数学教研室, 吉林吉林 ; 3. 吉林医药学院实验中心基础化学实验室, 吉林吉林 ;4. 吉林医药学院药学院 08 级临床药学本科班, 吉林吉林 摘要 : 采用聚乙二醇 (PEG)/ 硫酸铵双液相萃取离子层析法纯化猪硫酸软骨素, 红外光谱法测定结构, 咔唑分光光度法测定含量. 以 PEG 的相对分子质量和质量分数 (NH4) 2SO4 的质量分数 ph 值和萃取次数为考察因素, 以猪硫酸软骨素的回收率和纯度为考察指标, 正交设计法优化双液相萃取条件.IRC50 离子交换树脂对萃取液纯化, 红外光谱法和咔唑分光光度法鉴定纯化后猪硫酸软骨素的含量和结构. 最佳纯化条件为 :PEG 相对分子量为 4000, 质量分数为 30%,(NH4) 2SO4 的质量分数为 26%,pH 值为 10, 萃取 3 次. 萃取样品经 IRC50 离子交换树脂纯化后, 质量浓度在 0~250mg/L 范围内线性关系良好, 相关系数 r=0.9997, 样品含量为 90.49%, 相对标准偏差为 0.58%. 红外吸收光谱比较纯化后猪硫酸软骨素和标准品硫酸软骨素 A, 其特征吸收峰均在 3400, 1620,1560,1240,860cm -1 处. 该方法精确度和准确度都较高, 可用于猪硫酸软骨素的纯化. 关键词 : 猪硫酸软骨素 ; 双液相萃取法 ; 离子交换层析法 ; 红外光谱法 ; 咔唑分光光度法中图分类号 :S828 文献标志码 :A [1] 硫酸软骨素, 属酸性粘多糖 糖胺聚糖, 现在已经广泛用于临床 医用材料和保健食品等领域. 主要用于治疗冠心病 心绞痛 心肌缺氧 心肌梗塞等疾病. 双液相萃取技术是针对生物活性物质提取而 [3] 开发的一种新型液液萃取分离技术. 离子交换层析法是利用溶液中各种带电粒子与离子交换剂之间结 合力的差异进行物质分离的方法. 目前国产硫酸软骨素的原料纯度受技术水平及市场无序竞争的驱动, 纯 度大多达不到 90% [2] [4]. 为提高产品的纯度, 本实验采用聚乙二醇 / 硫酸铵双液相萃取离子交换层析法对 自制猪硫酸软骨素纯化, 咔唑分光光度法测定含量, 红外光谱法测定其结构. 该方法具有准确度和精确度 较高等特点, 可为检测本地区猪硫酸软骨素的含量提供可靠技术保证. 1 仪器与试剂 1.1 仪器 T6 新世纪紫外可见分光光度计 ( 北京普析通用仪器有限公司 );FA1104N 电子天平 ( 上海精密科学仪 器有限公司 );AVATAR-360 红外光谱仪 (NICOLET.USA). 1.2 试剂 标准品硫酸软骨素 A 咔唑试剂 ( 中国医药集团上海化学试剂公司, 进口分装 ); 猪硫酸软骨素 ( 自 1 收稿日期 : 基金项目 : 吉林市科技局科研课题 ( ). 作者简介 : 陆钊 (1972 ), 男, 黑龙江哈尔滨人, 副教授, 高级工程师, 主要从事高分子材料的研究.

2 2 西南大学学报 ( 自然科学版 ) htp://xbbjb.swu.cn 第 34 卷 制 ); 聚乙二醇 :PEG2000,PEG4000 和 PEG6000 (AR);IRC50 离子交换树脂 (ROHMHAAS.USA). 2 方法 2.1 精制方法 取自制猪硫酸软骨素粗品溶液 5 ml(10 mg/ml), 加入 PEG 和 (NH4) 2SO4 溶液各 5 ml, 调节至相 应的 ph 值, 充分振荡, 静止分相, 离心分离, 除去上清液. 下相脱盐, 用 95% 乙醇沉淀, 过滤, 真空干燥. 得到萃取样品, 测定其回收率和纯度 : 下相中猪硫酸软骨素的浓度回收率 下相的体积 = 猪硫酸软骨素的初始质量 下相沉淀产物中硫酸软骨素的质量纯度 = 下相沉淀产物的质量 然后上离子层析柱, 离子交换, 得精制猪硫酸软骨素, 以咔唑分光光度法检测纯度, 红外光谱法检测结构. 2.2 双液相萃取条件的优化 经过预实验, 正交设计法方案确定 PEG 的分子量和质量分数 (NH4) 2SO4 的质量分数 ph 值和萃取 次数等 5 个因素作为双液相萃取猪硫酸软骨素的主要影响因素, 选定 L19( ) 的正交表. 因素水平设 定见表 1(5 个因素分别用 A,B,C,D 和 E 表示 ) 分别以回收率和猪硫酸软骨素的纯度为指标来评定, 试验安 排及结果见表 2. 水 平 表 1 因素与水平 因 A B C D E 素 表 2 正交设计试验安排及结果 水平 A B C D E 回收率 /% 纯度 /%

3 第 7 期陆钊, 等 : 双液相萃取离子交换层析法纯化猪硫酸软骨素 离子交换层析 将处理好的 IRC50 离子交换树脂装于 2.5cm 50cm 层析柱中, 用 0.2 mol/l 乙酸乙酸钠缓冲液 (ph=4.0) 平衡树脂, 加入双液相萃取得到的样品溶液 10 ml, 用乙酸 乙酸钠缓冲液洗脱, 流速 10 ml/h, 收集洗脱液 75 ml, 以 95% 乙醇沉淀, 抽滤, 真空干燥, 得纯化的猪硫酸软骨素. 2.4 含量测定 [5] 以硫酸软骨素 A 为对照品, 咔唑分光光度法测定猪硫酸软骨素的含量. 精密量取 0,0.2,0.4,0.6, 0.8,1.0mL 硫酸软骨素标准 ( 样品 ) 溶液, 分置 6 支 15mL 具塞试管中, 加蒸馏水至 1.00mL, 冰水浴中 冷却, 再加入 6mL 浓硫酸, 盖塞振荡均匀后置于沸水浴中加热 20min, 取出, 置于冰水浴. 向水解后的溶 液中加入 0.20mL 咔唑溶液, 摇匀后置于沸水浴中加热 15 min, 显色, 取出迅速于冰水浴中冷却至室温. 以 95% 乙醇作空白溶液,λ=526nm 处测定硫酸软骨素溶液的吸光度, 绘制标准曲线. 2.5 纯度鉴定 红外吸收光谱 :400cm~4000cm 波数范围内扫描,KBr 压片. 3 结果和分析 3.1 正交设计试验结果 应用 SPSS14.0( 中文版 ) 计算, 得出正交设计方差分析结果. (1) 因变量 : 回收率 : 方差分析结果 :PEG 分子量 (F1) 与质量浓度 (F2) (NH4) 2SO4 的浓度 (F3) ph 值 (F4) 和萃取次数 (F5) 及回收率的 P 值分别为 : F1=6.157,P1=0.01;F2=7.308,P2=0.003;F3=28.688,P3=0.000;F4=16.368,P4=0.000; F5=10.151,P5= 由结果可知,A,B,C,D,E5 个因素对猪硫酸软骨素的回收率的 P 值均小于等于 0.01, 说明 A,B,C, D,E5 个因素对猪硫酸软骨素的回收率有显著的影响. (2) 因变量 : 纯度 : 方差分析结果 :PEG 分子量 (F1) 与质量浓度 (F2) (NH4) 2SO4 的浓度 (F3) ph(f4) 和萃取次数 (F5) 及回收率的 P 值分别为 : 0.000; F1=50629,P1 =0.014;F2 =50878,P2 =0.007;F3 =21.793,P3 =0.000;F4 =14.385,P4 = F5=8.634,P5= 由结果可知,A,B,C,D,E5 个因素对猪硫酸软骨素纯度的 P 值均小于 0.01, 说明 A,B,C,D,E5 个因 素对猪硫酸软骨素纯度均有非常显著的影响. 综上所述, 聚乙二醇 / 硫酸铵双液相萃取猪硫酸软骨素的最佳条件是 :PEG 相对分子量为 4000, 质量 分数为 30%,(NH4) 2SO4 的质量分数为 26%,pH 值为 10, 萃取 3 次. 3.2 最佳萃取条件的验证 为验证萃取条件的正确性, 按上述优化的最佳条件, 制备 7 批样品, 按 2.1 测定方法测定猪硫酸软骨 素的回收率和纯度, 结果 ( 表 3) 表明该萃取条件有较强的重复性和可靠性. 表 3 萃取条件测试结果 批号 回收率 /% 纯度 /% 批号 回收率 /% 纯度 /% 平均值 相对标准偏差 (RSD)/% 离子交换层析曲线 将双液相萃取得到的样品溶液进行柱层析, 进一步除去残留杂蛋白. 猪硫酸软骨素属酸性黏多

4 4 西南大学学报 ( 自然科学版 ) htp://xbbjb.swu.cn 第 34 卷 糖, 分子中含有己糖醛酸, 在 ph=4.0 附近带有 负电荷, 所以采用 IRC50 离子交换树脂分离, 猪硫 酸软骨素分子进入其颗粒内部进行交换, 并从柱中 流出, 将杂蛋白留于柱上. 图 1 为采用 IRC50 离子 交换树脂, 用 ph=4.0 乙酸乙酸钠缓冲液进行离 子交换的结果. 3.4 咔唑分光光度法测定含量 绘制标准曲线 以吸光度 A 对浓度 C 进行回归, 回归方程为 : Y= X(r=0.9997) 结果表明, 猪硫酸软骨素的质量浓度在 0~250 mg/l 范围内与吸光度线性关系良好. 图 1 猪硫酸软骨素的离子交换层析曲线图 含量测定 将测定吸光度值代入回归方程, 按照标准曲线法计算样品含量, 结果见表 4. 表 4 硫酸软骨素样品测定结果 批号 质量分数 平均值 RSD/% 红外吸收光谱 红外吸收光谱检测纯化后猪硫酸软骨素, 结果表明在 3400cm -1 附近 ( OH, 存在多糖羟基 ) 1620cm -1 附近 ( 大于 C=O) 1560cm -1 附近 (C N, 存在乙酰氨基 ) 1240cm -1 附近及 860cm -1 附近 ( 存在硫酸基 ) 有特征吸收峰 ( 图 3). 与标准品硫酸软骨素 A 的红外吸收光谱 ( 图 2) 基本一致. 图 2 标准品硫酸软骨素 A 的红外吸收光谱图 3 纯化后猪硫酸软骨素的红外吸收光谱 4 结论 本实验利用聚乙二醇 / 硫酸铵双液相萃取离子交换层析法对猪硫酸软骨素纯化, 正交设计优化萃取条件为 :PEG 的相对分子量为 4000, 质量分数为 30%,(NH4) 2SO4 的质量分数为 26%,pH 值为 10, 萃取 3 次. 萃取样品再经 IRC50 离子交换树脂纯化, 咔唑分光光度法测定纯度为 90.49%, 红外光谱法测定结构与标准品硫酸软骨素 A 结构基本一致. 该方法具有准确度和精确度高等特点, 为本地区猪硫酸软骨素的纯化提供了新的方法.

5 第 7 期陆钊, 等 : 双液相萃取离子交换层析法纯化猪硫酸软骨素 5 参考文献 : [1] 徐庆阳, 黎兴荣, 石墨, 等. 硫酸软骨素研究现状 [J]. 生物技术通讯,2006,15(6): [2] 张天民. 国外硫酸软骨素类膳食补充剂现状及其对我国相应产业可持续发展的启示 [J]. 食品与药品,2008,10(1): 4-7. [3] 董树国, 赖红伟, 陆钊. 双水相萃取在黄酮类化合物分离分析中的应用 [J]. 广东化工,2009,37(7): [4] 喇文军, 刘冬, 张丽君. 离子交换层析法分离纯化玉米降血压肽的研究 [J]. 食品工程,2007,3: [5] 陆钊, 杨亚楠. 咔唑分光光度法测定猪硫酸软骨素含量 [J]. 安徽农业科学,2008,36(33): PurificationofPorcineChondroitinSulfatewith Double-LiquidExtraction-Ion-ExchangeChromatography LU Zhao 1, PANShu-xia 2, DONGShu-guo 1, CAO Hong-mei 2, LAIHong-wei 1, GOU Long-xiao 4 1. DepartmentofChemistry,ColegeofPharmacy,JilinMedicalColege,JilinJilin132013,China; 2. MathDepartmentofBiomedicalEngineeringDepartment,JilinMedicalColege,JilinJilin132013,China; 3.ExperimentalCenterofBasicChemistryLaboratory,JilinMedicalColege,JilinJilin132013,China; 4. ColegeofPharmacy08ClinicalPharmacy,JilinMedicalColege,JilinJilin132013,China Abstract:Purpose:Topurifyporcinechondroitinsulfatewithpolyethyleneglycolammoniumsulfatedoubleḻiquid extractioṉioṉexchangechromatography,determineitsstructurewithinfraredspectroscopyanddetermineitscoṉ tentwithcarbazolespectrophotometry.methods:withtherelativemolecularmassandmassfractionofpolyethyleneglycol(peg),themassfractionofammoniumsulfate,phandextractiontimesasthefactorstobeexamined,theconditionsofdoubleḻiquidextractionwereoptimizedwiththeorthogonaldesign,theextractwaspurified withirc50ionexchangeresins,itscontentwasdeterminedwithcarbazoleanditsstructurewasexaminedwith spectrophotometry.results:thebestextractionconditionswereasfolows:relative molecularmassand mass fractionofpegbeing4000and30%,massfractionof(nh4) 2SO4being26%,pHbeing10andextractionbeing made3times.themassconcentrationofextractionsamplespurifiedwithirc50ionexchangeresinswasinagood linearrelationshipwithin0-250mg/l,withacorrelationcoeficientof thecontentofthesample was90.49% andrsd=0.58%.theinfraredabsorptionspectraofthepurifiedporcinechondroitinsulfate andthestandardchondroitinsulfate-ashowedthatbothhadtheircharacteristicabsorptionpeaksat3400, 1620,1560,1240and860cm -1.Conclusion:Thismethodispreciseandaccurateandcanbeusedtopurifyporcinechondroitinsulfate. Keywords:porcinechondroitinsulfate;doubleḻiquidextraction;ioṉexchangechromatography;infrared spectroscopy;carbazolespectrophotometry 责任编辑 潘春燕

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